Teresa de Diego Puente 2007 - UM · Reemplazamiento de pares iónicos internos Reemplazamiento...

Teresa de Diego Puente2007

ESTABILIZACIÓN ENZIMÁTICA POR

INGENIERÍA PROTEICA

ESTABILIZACIÓN ENZIMÁTICA POR

INGENIERÍA PROTEICA

ASIGNATURA SíNTESIS BIOCATALÍTICAAlumnos: Segundo Curso de la Licenciatura de Bioquímica

TEMA: ESTABILIZACIÓN ENZIMÁTICA POR INGENIERÍA PROTEICA

SÍNTESIS BIOCATALÍTICA

BIOQUÍMICA INDUSTRIAL

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR “B” E INMUNOLOGÍADEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR “B” E INMUNOLOGÍA

DESCRIPTORES

ASIGNATURA SíNTESIS BIOCATALÍTICA

► Tipos de Biocatalizadores.

► Estabilidad y Estabilización.

► Diseño del Medio de Reacción.

► Aplicaciones en Síntesis Orgánica, Química

Fina y Biomedicina.

Biocatalizador Medio Reactor

OBJETIVOS GENERALES

1. Fundamentos de la estructura y estabilidad de losbiocatalizadores.

2. Estabilización de los biocatalizadores.3. Catalizadores semisintéticos4. Empleo de Medios no convencionales5. Diseño de un proceso biocatalítico de intéres

industrial.


OBJETIVOS GENERALES

2. Estabilización de los biocatalizadores.

Tema 4. Modificación química de biocatalizadores.

Tema 5. Inmovilización de biocatalizadores. Enzimas. Células. Orgánulos.

Tema 6. Estabilización enzimática por ingeniería proteica


⇒ Conocimientos de estructura de proteínas y función de enzimas, de termodinámica y de química orgánica.

⇒ Conocimientos básicos de las técnicas de ingeniería genética o DNA recombinante.

CONOCIMIENTOS PREVIOS

ESTABILIZACIÓN ENZIMÁTICA POR INGENIERÍA PROTEICA

Estabilización enzimáticapor ingeniería proteica.

EnzimologíaMetodologías de

investigaciónbioquímica

Estructura demacromoléculas

Dinámica deMacromoléculas

Técnicas de experimentación

bioquímica

Genética molecular eingeniería genética

BioquímicaIndustrial

Primer curso Segundo curso

CONOCIMIENTOS TRANSVERSALES

OBJETIVOS

1. Definir la estabilización enzimática por Ingeniería de Proteínas.

2. Conocer las tecnologías que se precisan para el desarrollo de un proceso de Ingeniería Proteica por diseño racional.

3. Comprender las bases de un procedimiento de evolución molecular dirigida de proteínas termoestables .

4. Aplicaciones y Perspectivas Futuras.


ENZIMAESTABILIZADA

Ingeniería del Medio

de ReacciónInmovilización Modificación

QuímicaIngeniería Proteica

ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS


ENZIMAS ESTABLES

INTRÍNSECAMENTE

LPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLGYTPCWISPPPFMLN DTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGL VAQWGLTFFPSIRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPL DALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPT TNLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQA VCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSALRSTTGQAR SADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPAAAA IVAGPKQNCEPDLMPYARPFAVGKRTCSGIVTP

MODIFICACIÓN DE SU SECUENCIA AMINOACÍDICA


ENZIMAS ESTABLES INTRÍNSECAMENTE

LPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLGYTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPSIRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTTNLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQACGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSALRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPAAAAVAGPKQNCEPDLMPYARPFAVGKRTCSGIVTP

Rediseño de Proteínas

I. Diseño Racional por Mutagénesis dirigida

II. Evolución Molecular dirigida

ESTRATEGIAS PARA LLEVAR A CABO UNA MODIFICACIÓN ENZIMÁTICA POR INGENIERÍA PROTEICA

DISEÑOY PREDICCIÓN

2

DNARECOMBINANTE

3

PURIFICACIÓN4

FUNCIÓNCONFORMACIÓN

5

ANÁLISISESTRUCTURAL

1

INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR DISEÑO RACIONAL


2

DNARECOMBINANTE

3

PURIFICACIÓN5


6


1


ANÁLISIS ESTRUCTURAL

ESTRUCTURA FUNCIÓNTRIDIMENSIONAL ESTABILIDAD

► Difracción de rayos X

► Resonancia Magnética Nuclear

Difracción de rayos X

Patrón de difracción de Rayos X

Cristal de la lisozima


Difracción de Rayos X


Resonancia Magnética Nuclear► Proteínas en disolución► RMN multidimensional► 800 MHz► [1mM] de proteína► < 40 kDa

NATIVA DESNATURALIZADA


Mioglobina

Lisozima


Cápsida de un Adenovirus humano (2 BVI)

Ribozima


HYDROLASE (CARBOXYLIC ESTERASE) 11-JUL-95LIPASE (E.C.3.1.1.3) (TRIACYLGLYCEROL HYDROLASE) ORGANISM_SCIENTIFIC: CANDIDA ANTARCTICA;

CRYST1 95.100 50.200 99.500 90.00 90.60 90.00 P 21 4 1LBT 173

ORIGX1 1.000000 0.000000 0.000000 0.00000 1LBT 174

ORIGX2 0.000000 1.000000 0.000000 0.00000 1LBT 175

ORIGX3 0.000000 0.000000 1.000000 0.00000 1LBT 176

SCALE1 0.010515 0.000000 0.000110 0.00000 1LBT 177

SCALE2 0.000000 0.019920 0.000000 0.00000 1LBT 178

SCALE3 0.000000 0.000000 0.010051 0.00000 1LBT 179

MTRIX1 1 -0.033200 0.007500 -0.999400 46.86330 1LBT 180

MTRIX2 1 -0.005700 -1.000000 -0.007300 48.28900 1LBT 181

MTRIX3 1 -0.999400 0.005500 0.033200 49.58020 1LBT 182

ATOM 1 N LEU 1 -13.383 6.632 8.895 1.00 22.02 1LBT

ATOM 2 CA LEU 1 -12.982 7.995 8.460 1.00 22.02 1LBT

ATOM 3 C LEU 1 -13.953 8.446 7.381 1.00 22.02 1LBT

ATOM 4 O LEU 1 -14.331 7.657 6.515 1.00 22.02 1LBT

ATOM 5 CB LEU 1 -11.563 7.960 7.903 1.00 10.93 1LBT

ATOM 6 CG LEU 1 -10.630 9.123 8.203 1.00 10.93 1LBT

ATOM 7 CD1 LEU 1 -10.577 9.382 9.693 1.00 10.93 1LBT

ATOM 8 CD2 LEU 1 -9.251 8.791 7.653 1.00 10.93 1LBT

ATOM 9 N PRO 2 -14.417 9.706 7.454 1.00 18.56 1LBT

1LBT

Banco de Datos de Proteínas (Protein Date Bank, .pdb)

Información de parámetros cristalográficos

Información de átomo,residuo y cadena

Coordenadas atómicas

Factor de poblaciónFactor Térmico


Banco de Datos de ProteínasANÁLISIS ESTRUCTURAL

Diagrama de Ramanchandran Estructura Tridimensional

1LBT

Banco de Datos de ProteínasANÁLISIS ESTRUCTURAL

Rayos X38.253 42.668 proteínas RMN

5.628

>46.000 Totales5000 Por año

19762007

RasMolhttp://www.umass.edu/microbio/rasmol/getras.htm

Protein Explorer

http://proteinexplorer.org

PyMolhttp://pymol.sourceforge.net

ANÁLISIS ESTRUCTURALProgramas de visualización de moléculas


Porelemento

Aminoácidos

Por cadena, por estructura secundaria

COLOR

MOVIMIENTO : Rotar, trasladar, ampliar, reducir, cortar, etcFORMA: varillas, bolas, cintas, etc


2

DNARECOMBINANTE

3

PURIFICACIÓN4


5


1


INVESTIGACIÓNBÁSICA

OBJETIVO: ESTABILIZACIÓN DEL

BIOCATALIZADOR

INTERÉS INDUSTRIAL

DISEÑO RACIONAL

DISEÑO RACIONAL

Proteínas Extremófilas:● Temperatura: termófilos y psicrófilos• pH: alcalófilos y acidófilos• [sal]: halófilos• Presión: barófilos o piezófilos...

Taq Polimerasa

Las proteínas son más compactas

Aislada del hipertermófiloThermus aquaticus

Tª óptima: 72-75ºC

REGLAS DE DISEÑO PROTEÍNAS TERMOESTABLES

DISEÑO RACIONAL

INCREMENTO

● Empaquetamiento intramolecular● Aminoácidos formadores de hélice α● Pro● Puentes salinos● Enlaces carga-neutro● Estabilización de dipolos en hélices● Estabilización por redes de carga superficial

DISMINUCIÓN● Bucles superficiales● Asn● Movilidad extremo N-terminal

●Reemplazamiento de pares iónicos internos

●Reemplazamiento interno de la His, Cys y Tyr

●Alteración de los grupos cargados de la superficieEstabilidad frente

al pH

●Alteración de los grupos carboxilo de la superficie

●Conversión de Met por Gln, Val, Ile o Leu

●Conversión de Cys por Ala o SerEstabilidad frentea metales pesados

● Conversión de Trp por Phe o Tyr● Conversión de Met por Gln, Val, Ile o Leu

● Conversión de Cys por Ala o SerEstabilidad frentea la oxidación

● Incremento de las interacciones iónicas

● Incremento de las interacciones hidrofobicas

● Incremento de puentes de hidrogenoTermoestabilidad

● Introducción de puentes disulfuro

EstrategiaObjetivo

DISEÑO RACIONAL

TERMOESTABILIZACIÓN ENZIMÁTICA

ΔG =ΔH-TΔS

ΔG

ΔH

ΔS

POR RIGIDIFICACIÓN DE LA ESTRUCTURA

PROTEICA

DISEÑO RACIONAL

MUTACION [1] Phe 123 Trp –1 MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 59 60 DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRH 119 120 PGDWGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 153

MUTACIÓN [2] Ser 108 Leu –1 MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 59 60 DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFILEAIIHVLHSRH 119 120 PGDFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 153 STABILITY

MUTACIÓN [3] Ser 108 Lys1 MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 5960 DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFIKEAIIHVLHSRH 119

120 PGDFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 153

MUTACIÓN [4] Ala 130 Lys –1 MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 59 60 DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRH 119 120 PGDFGADAQGKMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 153

Mioglobina (1mlm) .Proteína globular con 153 aaAfectan a la estabilidad de la proteína frente a altas presiones

Bases de datos de proteínas mutadashttp://pmd.ddbj.nig.ac.jp/ 218,873 entradasINSTITUTO DE INGENIERÍA PROTEICA (Japón)

DISEÑO RACIONAL

http://pmd.ddbj.nig.ac.jp/

BIOINFORMÁTICA

PREDICCIÓN

1ª GENERACIÓNFiabilidad: 50-60%

2ª GENERACIÓNFiabilidad: 70%

MODELADO COMPARATIVO

Programas de modelado proteicoPREDICCIÓN

Programas de modelado proteicoPREDICCIÓN

Modelado comparativo y Teoría evolutiva3ª GENERACIÓN

Fiabilidad: > 70%

Selección evolutivade proteínas

Visualización y manipulación de proteínas y péptidos

Visualización y análisis de la proteína nativa

Simulación de la influencia de una mutación concreta sobre el plegamiento proteico.

Predicción de bucles en la estructura

Interpretación de de cambios sobre la dinámica de la proteína

Comparación de estructuras proteicas

Cálculo de las interacciones atómicas y moleculares que ocurren en la conformación de la proteína nativa y mutada

Programas de modelado proteico

PREDICCIÓN

DISEÑO Y PREDICCIÓN

Homología en secuencia primaria


2

DNARECOMBINANTE

2

PURIFICACIÓN3


4


1


DNA Vector de clonación

Enzimas de restricción

Ligasas

DNA recombinante

Introducción en una célula hospedadora Selección de células con el gen clonado

Expresión de los fragmentos clonados:

Proteínas recombinantes

Gen de interés

Proteínas recombinantes mutadas

DNA RECOMBINANTE

MUTAGÉNESIS DIRIGIDA

TCTAGA

ACAACA

ACA

TCT

TCTTCT

TCTAGA

TCT

TCTAGA

ACATGT

PROTEÍNAS NATIVAS

PROTEÍNASMUTADAS

AATGCGCGTCTAAGCCGAATATTACGCGCACATTCGGCTTATObjetivo: Ser→Cys

Fragmento sintético

(M. Smith, 1993)DNA RECOMBINANTE

Secuenciación de genes

DNA RECOMBINANTE

Base de datos de genes

DNA RECOMBINANTE

Base de Datos Internacional de Secuencias Nucleotídicas

DNA RECOMBINANTE

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez /.

PubMed All Databases BLAST OMIM Books TaxBrowser Structure

Search All Databases

for Go

SITE MAP Alphabetical List Resource Guide About NCBI An introduction to NCBI GenBank Sequence submission support and software Literature databasesPubMed, OMIM, Books, and PubMed Central Molecular databasesSequences, structures, and taxonomy Genomic biology The human genome, whole genomes, and related resources Tools Data mining Research at NCBI People, projects, and seminars Software engineering Tools, R&D, and databases Education Teaching resources and on-line tutorialsHow to reach us

What does NCBI do?

Established in 1988 as a national resource for molecular biology information, NCBI creates public databases, conducts research in computational biology, develops software tools for analyzing genome data, and disseminates biomedical information - all for the better understanding of molecular processes affecting human health and disease. More...

National Center for Biotechnology Information U.S. National Library of Medicine

8600 Rockville Pike, Bethesda, MD 20894 Copyright, Disclaimer, Privacy, Accessibility

Hot Spots

Assembly Archive

Clusters of

orthologous groups

Coffee Break, Genes & Disease, NCBI Handbook

Electronic PCR

Entrez Home

Entrez Tools

Gene expression omnibus (GEO)

Human genome resources

Influenza Virus Resource

Map Viewer

dbMHC

Mouse genome resources

My NCBI

ORF finder

Rat genome resources

Centro Nacional de Información de Biotecnología, USAhttp//www.ncbi.nlm.nih.gov

DNA RECOMBINANTE

» Base de datos de secuencias de DNA y proteínas.GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)EMBL (http://www.ebi.ac.uk/ebi_docs/embl_db/ebi/topembl.html)PIR (http://www-nbrf.georgetown.edu/)SWISS-PROT (http://www.ebi.ac.uk/swissprot/)

» Base de datos de estructuras de 3D y análisis de estructuras 3D.PDBSUM (http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/)SCOP (http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/)CATH (http://www.cathdb.info/latest/index.html)DALI (http://www.ebi.ac.uk/dali/)SWISS-MODEL (http://swift.cmbi.kun.nl/swift/servers/moddssp-ubmit.html)

» Otras bases de datos de interés en ingeniería de proteínas.PMD (http://pmd.ddbj.nig.ac.jp/)Brenda (http://www.brenda.uni-koeln.de/)

DNA RECOMBINANTE

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

http://www.ebi.ac.uk/ebi_docs/embl_db/ebi/topembl.html

http://www-nbrf.georgetown.edu/

http://www.ebi.ac.uk/swissprot/

http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/

http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/

http://www.cathdb.info/latest/index.html

http://www.ebi.ac.uk/dali/

http://swift.cmbi.kun.nl/swift/servers/moddssp-ubmit.html

http://pmd.ddbj.nig.ac.jp/

http://www.brenda.uni-koeln.de/

DNA RECOMBINANTEBase de datos de Enzimas


2

DNARECOMBINANTE

3

PURIFICACIÓN4


5


1


Grado de purificación Aplicación

DNA recombinante:

- Sobreexpresión del gen- Introducción ligandos

PURIFICACIÓN


2

DNARECOMBINANTE

3

PURIFICACIÓN4


5


1


FUNCIÓN Y CONFORMACIÓN

EFECTOS DE LA MODIFICACIÓN

FUNCIÓNACTIVIDAD

NATIVA

MUTANTE

FUNCIÓN Y CONFORMACIÓNTERMOESTABILIDAD CONFORMACIONAL

Temperatura (ºC)

ΔGFr

acci

ón d

esna

tura

lizad

a (%

)

ProteinaNatural

ProteínaMutada 1

Proteínamutada 2

ΔΤm

ΔΤm

A280

λ m

ax (

nm )

330

332

334

336

338

340

342

Inte

nsid

ad F

luor

esce

ncia

( %

)

0

20

40

60

80

100

(

)

( )

λ emision ( nm )

300 350 400

Inte

nsid

ad d

e Fl

uore

scen

cia

Imax, λ max A B

40 50 60Temperatura (ºC)

Espectroscopía de Fluorescencia. Espectroscopía de Fluorescencia.


Dicroísmo Circular. Dicroísmo Circular.

MioglobinaM1M2M3

M1M2M3

Δε28

0 [M

-1cm

-1]

Temperatura (ºC)


Calorimetría Diferencial de barrido Calorimetría Diferencial de barrido

FUNCIÓN Y CONFORMACIÓN

Temperature (ºC)

30 40 50 60 70 80 90 100-30

-20

-10

0

Exo

Cp

(kJº

C-1

mol

-1)

TERMOESTABILIDAD CONFORMACIONAL

DISEÑO RACIONAL

TERMOESTABILIZACIÓN

ENZIMÁTICA

Introducción depuentes disulfuro

Estabilización de la hélice alfa

Lisozima Proteína de Drosophila

1. Conocimiento de estructura, función y el gen

Nicholson, H., Tronrud, D.E., Becktel, W.J., Matthews, B.W. Analysis of the effectiveness of prolinesubstitutions and glycine replacements in increasing the stability of phage T4 lysozyme. Biopolymersv32 pp.1431-1441 , 1992

DISEÑO RACIONAL: EJEMPLO 1

Lisozima del fago T4 (164 aa)

1L56.pdb

164 aa

+

Difracción de rayos X

1,8Å

Termoestabilidad: Introducción de puentes disulfuroLisozima del fago T4

4 puentes disulfuro naturales


Lisozima del fago T44 puentes disulfuro naturales

Ile3 - Cys97

Cys3 - Cys97

2. Modelado Proteico

3. Mutagénesis Dirigida

pAGAATTATGAATTGTTTTGAAATGTTACys

Oligonucleótido sintético (Ile:TAT)

Termoestabilidad: Introducción de puentes disulfuro


Nicholson, H., Tronrud, D.E., Becktel, W.J., Matthews, B.W. 1992. Analysis of the effectiveness of proline substitutions and glycine replacements in increasing the stability of phage T4 lysozyme. Biopolymers, 32, 1431-1441.

Lisozima del fago T4

5. TermoestabilidadSustrato: Pared celular de M. Luteus (A540)Actividad Especifica :U/mg enzima

NATIVA = MUTANTE

Termoestabilidad conformacional

T e m p e r a tu r a ( o C )

3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 6 50 .4 9

0 .5 0

0 .5 1

0 .5 2

0 .5 3

0 .5 4

0 .5 5

0 .5 6

Δε28

0 [M

-1cm

-1]

Desactivación termica: t1/2Nativa: 11min < Mutante: 28 min

Dicroismo circular

1.270MUTANTE065NATIVA

ΔΔG(kcaL mol-1)

Tm

(ºC)

Dicroismo Circular



Nicholson, H., Tronrud, D.E., Becktel, W.J., Matthews, B.W. 1992. Analysis of the effectiveness of proline substitutions and glycine replacements in increasing the stability of phage T4 lysozyme. Biopolymers, 32, 1431-1441.

4 puentes disulfuro naturales7-97

9-164Ile-Leu21-142Thr-Thr

Lisozima del fago T4

ILE 7 – Cys 97

Cys 7- Cys 97

Mutagénesisdirigida

+23+16+15+12+7+5Oxidante

-8-5-10-3-6-2Reductor

3-97, 9-164 y 21-142

9-164 y 21-1427-97 y 9-16421-1429-1647-97Ambiente

Pares de residuos mutados

Determinación de la temperatura de fusión (DSC) Tm (ºC)


Matthews, B.W., Nicholson, H. and Becktel, W.J. 1987. Enhanced Protein Thermostability from Site-Directed Mutations that Decrease the Entropy of Unfolding. Biochemistry, 84, 6663-6667.


Amino terminal

Carboxilo terminal

N-terminal

His, Lys y Arg

Ser, Thr, Asn o Asp.

C-terminal

Asp y Glu

Termoestabilidad:Estabilización de la hélice α


Dominio Proteína de Drosophila: Modelo Todo α

A

B

C

Marsall et. al., 2002


Cadena ASer 5 ⇒ Glu 5Leu 8 ⇒ Lys 8

Cadena BThr 22 ⇒ Glu 22Gln 28 ⇒ Asp 28

Cadena CAsn 36 ⇒ Arg 36Ile 42 ⇒ Arg 42

Termoestabilidad: Estabilización de la hélice α

DISEÑO RACIONAL: EJEMPLO 2Termoestabilidad: Estabilización de la hélice αDominio Modelo Todo α Nativa Mutantes

AA

B

C

B

C

Marsall et. al., 2002Marsall et. al., 2002

Dominio Modelo Todo α Nativa Mutantes

AA

B

C

B

C

Marsall et. al., 2002

DISEÑO RACIONAL: EJEMPLO 2Termoestabilidad: Estabilización de la hélice α

Desnaturalización termal (DC)

Proteína Tm (ºC)Natural 49M1 53M2 72M3 50M4 53M5 68M6 88

Temperatura

Frac

ción

des

natu

raliz

ada

Termoestabilidad: Estabilización de la hélice α

Marshall, S. A., Morgan, Ch. S. y Mayo, S. 2002. Electrostatics significantly affect the stability of designed homeodomainvariants. J. Mol. Biol. 316 (1), 189-199.


- His, Lys y Arg, (N-terminal) Ser, Thr, Asn y Asp.

- Exclusión de Asp y Glu (C-terminal)

- Fuerzas electrostáticas de atracción o repulsión entre residuos con grupos cargados que estén adyacentes (varios residuos de Glu o Lys)

- Volumen estérico de los grupos adyacentes de los residuos de Asn, Thr, Ser y Leu

- Presencia de residuos de Pro

RestriccionesDiseño Racional: Estabilización de la hélice α

DISEÑO RACIONAL

Rediseño de Proteínas

I. Diseño Racional por Mutagénesis dirigida

II. Evolución Molecular dirigida

ESTRATEGIAS PARA LLEVAR A CABO UNA MODIFICACIÓN ENZIMÁTICA POR INGENIERÍA PROTEICA

INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR EVOLUCIÓN MOLECULAR DIRIGIDA

SELECCIÓN2

DNA RECOMBINANTE

1


EVOLUCIÓN MOLECULAR DIRIGIDA

1a Generación

2ª Generación 3ª Generación

4ª Generación

Evolución Natural Millones de años

Evolución Dirigida Semanas o mesesESCALA TEMPORAL

Generación : MUTACIÓN - SELECCIÓN

SELECCIÓN


SELECCIÓN2

DNA RECOMBINANTE

1



A. ERROR POR PCR o PCR MUTAGÉNICA (Lio and Wise, 1990)

Generación de librerías de mutantes al azar

DNA RECOMBINANTE

denaturation

denaturation

extension


A. ERROR POR PCR o PCR MUTAGÉNICA (Lio and Wise, 1990)

DNA RECOMBINANTE

Tasa

de

mut

ació

n (%

)


DNA RECOMBINANTE

B. “DNA BARAJADO” (Stemmer, 1994)

PCRSin cebadores

DesnaturalizaciónHibridación

Producto del“barajado”

Elongación

DNasa

Recombinación aleatoria in vitro

DNA RECOMBINANTE

Error por PCR DNA barajado

Genes

Librería de genes mutados

Librería de proteínas mutadas

Nuevos genes con modificaciones

deseadas

Transformación

Selección

Repetición(opcional)

EVOLUCIÓN DIRIGIDA

Proteínas quiméricas


SELECCIÓN2

DNARECOMBINANTE

1


SELECCIÓN DE LOS MEJORES VARIANTES

Métodos de Selección ~ “Éxito de la evolución”● EficacesiSensiblesiPrecisosiRápidos: Alta capacidad de procesamientoiRevelar la propiedad buscada

Métodos colorimétricos Robotización

Selección de las enzimas termoestables

6 generaciones de mutagénesis al azar

Recombinación

66.56sF9

656H7

5H3

5H1

5E12

5D464.5

5H8

644G4

623H5

58.22A12

57.31A5D1

52.5Nativa

Tm(ºC)ENZIMAS

Esterasa

ii

i i

i

i

ii

i

ii

i

i

i

Sustrato

Giver, L., Gershenson, A., Freskgard, P.O. y Arnold, F. 1998. Directed evolution of thermostableesterase. Biochem. 95, 12809-12813.

ProductoA405

30º y 50ºC

Selección de las enzimas termoestables

Librería de genesMutantes

Thermus thermofilus Leu-

Librería de mutantes Leu+ ENZIMAS

MUTANTES

↑Tª

Tamakoshi M., Nakano, Y., Kakizawa S., Yamagishi, A. y Oshima, T. 2004. Extremophiles, 5(1), 17-22.

Sistema de Selección

5 generaciones de mutagénesis

aleatoria

Selección:


SELECCIÓN2

DNARECOMBINANTE

1


CARACTERIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS MUTADAS


Mutante de lipasa de Rhizopus arrhizus

NATIVA MUTANTE

Glu190 Val190

Niu. W-N, Li Z-P, Zhang D-W, Ming-Rui Yu M-R y Tan T-W. 2006. Improved thermostability and the optimum temperature of Rhizopus arrhizus lipase by directed evolution. J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 43 (1), 33-39.

INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR DISEÑO SEMI-RACIONAL

DNARECOMBINANTE

PURIFICACIÓNFUNCIÓNCONFORMACIÓN


Mutaciones al azar

INVESTIGACIÓN BÁSICA

APLICACIONES DE LA INGENIERÍA DE PROTEÍNAS Y PERSPECTIVAS FUTURAS

BIOCATÁLISIS

► Estructura - función de las proteínas► Proceso de Plegamiento Proteico► Flexibilidad conformacional Nuevos fármacos► Diseño de enzimas nuevas y/o quiméricas.

INVESTIGACIÓN BÁSICA:

BIOINFORMÁTICA

BIOLOGÍA DE SISTEMAS



BIOCATÁLISIS

Proteínas Naturales

Proteínas Recombinantes

► BiomedicinaNuevos Fármacos

► Industria Química-Farmacéutica.TermoestablesEspecificidad, Regioespecificidad

Proteínas Recombinantes

Modificadas

Propiedades únicas

EJEMPLOS DE ENZIMAS MODIFICADAS POR INGENIERÍA DE PROTEÍNAS

OBJETIVO ENZIMA RESULTADO MÉTODO Referencia

Enantio-selectividad

Hidrolasa de epóxido

↑ 13 Error por PCR + DNA

barajado

Van Loo et al., 2004

Actividad Anhidrasacarbónica

↑ 40 Mutagénesis+Recombina

ción

Gould andTawfik, 2005

Eficacia catalítica

N-acetiltransferasa

↑10.000 DNA barajado

Castle et al.,2004

Temoestabilidad Xilanasa Tm ↑ 35ºC Mutagénesisdirigida

Palackal et al., 2004

Estabilidad en medio orgánico

Subtilisina E ↑ 170

(60% DMF)

Error por PCR

Chen andArnold,

1993

Regio-especificidad

Galactoxidasa Oxida Glucosa en posición 6

Mutagénesisaleatoria

Sun et.al.,2002

Dependencia cofactor

Lactato deshidrogenasa

NAD→NADP Mutagénesis(PCR)

Flores andEllinngton,

2005

Nombrecomercial Tipo de enzima Principal

aplicaciónAquazym® Ultra Alpha-amilasa Industria textilCarezyme® Celulasa Industria detergentesCellusoft® Celulasa Industria textilClear-Lens® LIPO Lipase Limpieza personalDuramyl® Alpha-amilasa Industria detergentesEndolase® Celulasa Industria detergentesEverlase® Proteasa Industria detergentesLipolase® Lipasa Industria detergentesNovozym® 735 Lipasa Industria textilOvozyme® Subtilisina (proteasa) Industria detergentesSavinase® Proteasa Industria detergentesTermamyl® Alpha-amilasa Industria detergentesThermozyme® Alpha-amilasa Industria textil

ENZIMAS COMERCIALES MODIFICADAS POR INGENIERÍA DE PROTEÍNAS

Gracias por su atención.

PRÁCTICAS

1.Modificación de la Lisozima de pollo

2. Rediseño del núcleo del represor ARC

3. Comparación de la isopropil-malatodeshidrogenasa mesófila y termófila

DISEÑO RACIONAL DE PROTEINAS

TERMOESTABLES

Por elemento

Aminoácidos

Por cadena, por estructura secundaria

RASMOLCOLOR

MOVIMIENTO : Rotar, transladar ampliar reducir, cortar, etcFORMA: varillas, bolas, cintas, etc

PRÁCTICAS

Yamada et al., 1993. J.Biol. Chem., 268, 10588-10592

MÁS ESTABLE(4,O kcal/molL)

1. Modificación de la Lisozima de polloPRÁCTICAS

Met Lys

Waldburger et al., 1995. Nature Struct. Biol., 2, 122-128.

2. Rediseño del núcleo del represor ARC

PRÁCTICAS

Kirino et al., 1994. Eu. J. Biochem., 220, 275-281Numata et al., 1995. Protein Eng., 8, 39-43

3. Comparación de la isopropil-malato deshidrogenasa mesófila (Escherichia coli) y termófila (Thermus termophillus)

PRÁCTICAS

Teresa de Diego Puente 2007 - UM · Reemplazamiento de pares iónicos internos Reemplazamiento...

Documents

Transcript of Teresa de Diego Puente 2007 - UM · Reemplazamiento de pares iónicos internos Reemplazamiento...