Producción de Ácido Cítrico

El ácido cítrico es un constituyente natural de los frutos cítricos. Hasta 1920, la mayor exigencia del mismo era satisfecha primeramente por la extracción a partir de limones, y el país que tenía la mayor producción era Italia.

Luego, comenzó a investigarse su obtención a través de la fermentación de medios azucarados por hongos, especialmente Aspergillus. En épocas más cercanas, el desarrollo de esta fermentación oxidativa creció enormemente y hoy satisface la producción de todo el consumo mundial de bebidas gasificadas.

Microorganismos empleados

Los organismos que se utilizan actualmente en la industria son los hongos del género Aspergillus (A. Niger y A. Wentii). Las cepas empleadas se reproducen sólo por vía agámica.

En la superficie de los medios de cultivo líquidos en reposo forman un micelio espeso. En medio agitado, con aireación adecuada, crece en forma sumergida en forma de esferitas (peletas) constituidas por hifas enrolladas sobre sí mismas. Para una buena fermentación, la peleta no debe tener un diámetro superior a 1-1.5mm, y su concentración, variar entre 120.000 y 240.000/litro.

Estos tipos de hongos se aíslan normalmente a partir del suelo, aunque están muy difundidos en otros hábitats naturales.

Quimismo

El ácido cítrico es un compuesto intermediario del Ciclo de Krebs. Según este ciclo, cada mol de ácido cítrico se forma por condensación de los ácidos acético y oxalacético, y este último proviene de la oxidación del ácido cítrico. En otras palabras, puede decirse que la formación de cada mol de ácido cítrico implica la destricción de otro mol del mismo ácido.

Sin embargo, las cepas de Aspergillus utilizaas en la industria permiten acumular ácido cítrico brindando rendimientos superiores al 80% del azúcar consumido. Esto significa, obviamente, que en estas cepas el proceso de demolición es menos

CH2-COOH

CHOH-COOH

Ch2-COOH

intenso que el de formación. En efecto, se ha demostrado la existencia de poca aconitasa, la enzima que transporma el ácido cítrico en ácido cis-aconítico y que, por otro lado, estas cepas puede fijar CO2 al ácido pirúvico, formando ácido osal-acético, y no depender del ácido oxal-acético proveniente de la utilización del ácido cítrico.

De acuerdo a esto, el esquema de formación es el siguiente: un mol de hexosa es transformado en dos moles de ácido purúvico (glicolisis), una de las cuales es oxidada a ácido acético y CO2. Este CO2 se fija a la otra molécula de ácido pirúvico formando ácido oxal-acético. Luego, como en el ciclo de Krebs normal, los ácidos acético y oxalacético se condensan. En el Cuadro 1 se compara el Ciclo de Krebs de A. Niger productor de ácido cítrico , con un ciclo normal.

Cuadro 1: Esquematización del Ciclo de Krebs normal (izquierda) y del Ciclo de Krebs en cepas de A. Niger productoras de ácido cítrico

Normal

glucosa

Ac. Pirúvico (2 moles)

Ac. Acético

Ac. Oxalacético

Ac. Cítrico

Ac. Cis-aconítico

glicolisis

aconitasa

A. Niger

Ac. Oxalacético

glucosa

Ac. Pirúvico (2 moles)

CO2 + Ac. Acético

Ac. Cítrico

Ac. Cis-aconítico

glicolisis

Debe evitarse en lo posible la formación de ácido oxálico, producto del quimismo que aparece especialmente cuando el pH del medio se halla por encima de 2, aunque no para todas las cepas. Este ácido se forma a partir de los ácidos isocítrico y málico, ambos intermediarios del Ciclo de Krebs.

Ac. Isocítrico _____ ac. Succínico + ac. Glioxálico

Ac. Oxálico

Ac. Málico ______ ac. Acético + ac. glioxálico

Ac. Oxálico

Materias primas

Fuentes de C: muchas sustancias orgánicas pueden ser fermentadas con producción de ácido cítrico. Sin embargo, los mayores rendimientos se obtienen usando sacarosa y fructosa. La glucosa puede dar buenos rendimientos, próximos a los de sacarosa, pero en condiciones de trabajo más difíciles.

Industrialmente se fermentan soluciones de sacarosa de una concentración comprendida entre 12 y 20%, obtenidas por disolución directa o por adecuada dilución de melazas de caña de azúcar o remolacha.

Fuente de N: en los medios sintéticos se agregan sales nitrogenadas, generalmente NO3NH4 (0.15-0.25%). Usando melaza normalmente no es necesario agregar sustancias nitrogenadas, aunque a veces puede ser conveniente intefrarla con pequeñas cantidades. Es importante que la fuente de N sea escasa respecto a la de C, para limitar el desarrollo del hongo. Si la concentración de N es elevada se forma mucho micelio y poco ácido cítrico; en cambio, si está en cantidad limitada, el hongo se desarrolla mientras lo dispone, y luego, el azúcar que queda (10-15%) es solamente respirado, es decir, oxidado hasta ácido cítrico.

Sales nutritivas: en medios sintéticos se agregan pequeñas concentraciones de PO4H2K (0.03-0.3%) y SO4Mg (0.05-0.1%), para proporcionar al hongo elementos indispensables para su desarrollo. Emplenado cantidades mayores aumenta la formación de ácido oxálico y disminuye el rendimiento en ácido cítrico.

Indudablemente, la cepa del hongo utilizada tiene una gran influencia sobre las sales requeridas, y la composición del medio de cultivo debe optimizarse en relación a aquella.

Acondicionamiento de melazas: para preparar el mosto es necesario ante todo diluir la melaza hasta el 10-15% de azúcar y efectuar una purificación, especialmente con el objeto de eliminar los cationes metálicos pesados (Fe, Cu, Zn). Esto último se logra con el agregado de ferrocianuro de K (0.2g por cada 100g de melaza original), calentando a 80°C (15min.) dejando en reposo toda una noche y filtrando. El agregado de ferrocianuro también tiene un efecto limitante sobre el crecimiento del hongo, evitando un excesivo desarrollo del micelio.

Condiciones ambientales de la fermentación

PH: el empleo de pH bajo favorece la producción de ácido cítrico, suprime la de oxálico, reduce al mínimo el peligro de contaminaciones y facilita la esterilización. El intervalo de pH más satisfactorio es de 1 a 2%.

Temperatura: la temperatura óptima para las cepas productoras de ácido cítrico se encuentra entre 25°C y 35°C.

Aireación: la formación de ácido cítrico es un fenómeno de oxidación y por lo tanto, el oxígeno no debe faltar nunca. Para cultivos de superficie, la circulación de ire saturado de humedad debe ser de 200ml de aire por hora y por gramo de micelio. Para procesos a micelio sumergido, la cuba se airea con oxígeno o aire a presión (presión en la cuba, 2 a 3 atm), regulando la velocidad del agitador de manera de disolver más de 100mg de O2 por litro y por minuto.

SISTEMAS DE FERMENTACIÓN

Fermentación en superficie

En este sistema se utilizan bandejas de acero inoxidable, o aluminio de alta pureza, de 1-2m2 de superficie y 5-10cm de altura, que se cargan con el medio de cultivo y se siembran con conidios de Aspergillus. Al cabo de 2-5 días la superficie está cubierta con una capa de micelio. Con esto, se verifica una adecuada velocidad de producción de ácido cítrico, y la fermentación se completa en 7 a 8 días.

En las cámaras de fermentación, las bandejas se distribuyen en estantes o se aplican intercalando travesaños de madera (pilas de hasta 20 bandejas). Cada cámara puede tener hasta 300 bandejas y una fábrica importante posee unas 20 cámaras de fermentación (6000 bandejas).

En las paredes de la cámara hay una serpentina por la cual circula agua, para ajustar la temperatura al valor requerido por el proceso.

Para este tipo de fermentación se pueden utilizar medios sintéticos o melazas, acondicionadas como ya se ha visto. El medio de cultivo se distribuye en las bandejas y se esteriliza en conjunto con todo el ambiente de la cámara, inyectando vapor hasta que la temperatura del medio alcance el valor de 65-70°C, manteniéndola algunas horas (esterilización práctica).

Luego de la esterilización se siebra con conidios. A partir de un cultivo esporulado, se hace pasar una corriente de aire estéril que arrastra una nube de esporos al interior.

Durante la fermentación, el aire debe distribuirse efectuando un barrido a velocidad adecuada sobre la superficie de las bandejas. Previamente se lo esteriliza por filtración y luego se lo satura de humedad, para evitar la evaporación del medio, lo cual provocaría un aumento de la presión osmótica, perjudicial para el hongo. La provisión de aire se efectúa en varios puntos de la cámara, a partir de una línea central ubicada sobre el techo de la misma.

En cuanto a la evolución de la fermentación, puede decirse que cuando se ha transformado un 90% de la sacarosa que había en el medio, disminuye la velocidad de incremento de la acidez total (Figura 4).

En una fermentación normal la acidez total aumenta hasta el noveno o décimo día, habiéndose acumulado un 7-8% de ácido cítrico y menos del 1% de ácido oxálico. Normalmenmte en este punto se detiene la fermentación, ya que luego existe la posibilidad de que el hongo comience a utilizar el ácido cítrico como fuente de C, ante la escasez de azúcar disponible.

2.5

2.0

1.5

1.0

pH

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

120

90

60

30

0

Peso del micelio(gr)

Normalidad %

Días

Fermentación sumergida

Algunas de las ventajas que ofrecen los sistemas de fermentación sumertida son: Medio agitado, respecto a los sistemas en superficie Menor espacio necesario Menor riesgo de infecciones Mejor control de las variables del proceso (temperatura, pH O2) Menor duración del proceso Posibilidad de utilizar las mismas cubas para otras fermentaciones

(producción de gluconato, antibióticos, etc.)

Sin embargo, este sistema de producción resulta delicado de instrumentar, ya que es importante la influencia de un gran número de variables, que deben optimizarse:

la cepa de A. Niger utilizada la edad del cultivo la composición del medio de esporulación la temperatura de incubación (el rango de 26-30°C es el óptimo) la presencia de metales pesados en el medio de fermentación (según su

concentración pueden actuar como inhibidores) el diámetro y concentración de las peletas

Se utilizan tanques de acero inxidable, cuyo diseño responde al diseño general para una cuba utilizada en fermentaciones aeróbicas.

La aireación debe ser muy enérgica y de tal modo de lograr en la cuba una presión de 2-3atm para facilitar la disolución del oxígeno (como valor orientativo debe conseguirse una velocidad de disolución de unos 100mg de O2 por litro de medio y por minuto). La continuidad de aireación es fundamental; en efecto, si se interrumpiera por media hora la inyección de aire, aún reanudando luego la circulación, el hongo no produce más ácido cítrico por la profunda alteración que sufre su sistema enzimático.

La cuba dispone además de un agitador, con velocidad variable entre 300 y 600RPM, y de cuatro rompeolas diametralmente opuestos para aumentar la turbulencia del líquido.

La formación de espuma causada por la aireación puede controlarse con la ayuda de antiespumantes, generalmente octodecanol al 1% o productos de base de siliconas.

La duración de la fermentación se sitúa entre 5 y 9 días.