TEMA 5.7. Regulación de la expresión génica

1. CONCEPTO. 2. CONTROL DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN PROCARIOTAS 2.1. Operones. El operón de la lactosa 2.2. La represión catabólica. La proteína CAP (CRP) 3. CONTROL DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN EUCARIOTAS 3.1. Eucariotas versus Procariotas 3.2. Estructura de la cromatina 3.3. Eucromatina-Heterocromatina 3.4. Metilación del DNA 3.5. Acetilación de histonas 3.5 Los factores de transcripción 3.6. Dominios de unión al DNA de proteínas reguladoras 3.7. Regulada por señales inter e intracelulares 3.8. Represión traduccional 3.9. Silenciamiento postranscripcional de los genes por interferencia del RNA

La expresión génica es el proceso que abarca desde la transcripción de un gen a mRNA, el procesamiento de ese mRNA y su traducción a proteína

Las cels procariotas (reacc. al medio) y eucariotas pluricel (reacc. a hormonas, factores crecimiento,…) reaccionan a los estímulos* En org pluricel multitud de tipos celulares con el mismo DNA, pero notables diferencias morfo y fisiológicas Resultado de diferencias en la expresión génica

Inducción y represión

El primer y más importante control de la actividad de los genes tiene lugar a nivel del inicio de la transcripción Interacción entre proteínas y DNA (en secuencias, sitios de unión, específicos) Señales del entorno pueden modificar estas interacc y provocar cambios en la expresión génica

Expresión génica constitutiva: Los genes de los productos que se requieren en todo momento (genes constitutivos) son de expresión constante Los niveles celulares de otros genes aumentan y disminuyen en respuesta a señales moleculares: Expresión génica regulada (GENES INDUCIBLES)

RNApol se unen al DNA e inician transcripción en promotores. Promotores: su secuencia de nucleótidos varía e influye en afinidad unión RNApol (factor 1000)

En genes inducibles la tasa de inicio de la transcripción está regulada por la secuencia del promotor, pero además es modulada por proteínas reguladoras potencian o interfieren en la interacc entre RNApol y promotor Activadores, represores y factores de especificidad (subU σ RNApol) impiden el acceso Potencian interacción

Secuencia consenso de muchos promotores de E coli

El inicio de la transcripción está regulado por proteínas que se unen a los promotores o cerca de ellos

Sustitución de σ70 por σ32 cuando bacterias sometidas a estrés por calor RNApol se dirige entonces a promotores especializados con sec consenso ≠

Algunos incluyen fact transcripcionales como las prot de unión a TATA

En procariotas sitios de unión de represores al DNA: operadores Generalmente cercanos al promotor Unión RNApol o movimiento a lo largo del DNA bloqueado con represor presente Regulación negativa

La unión del represor al DNA se regula por un efector (molécula pequeña que une al represor y provoca cambio conformacional: ↑ o ↓ transcripción) En cels eucariota Regulación positiva: por activadores. Sitios de unión a menudo adyacentes a promotores a los que la RNApol no se une por si sola o débilmente También modulable por efector

En cels eucar. potenciadores también pueden estar distante del promotor Molécula señal o efector puede producir disociación del activador o ser necesario para su unión al DNA

EFECTOR

REPRESOR

ACTIVADOR

1. Control de la expresión génica en procariotas 2. Control de la expresión génica en eucariotas

TEMA 12. Regulación de la expresión génica

La mayoría de los genes procarióticos están agrupados y se regulan en operones

Mayoría de los mRNA procar son policistrónicos: promotor único Grupo de genes + promotor + secuencias adicionales (reguladoras) = operón Jacob y Monod (1960) introdujeron estos conceptos operón y operador en estudio del metabolismo de la lactosa (en ausencia glucosa puede ser única fuente de carbono) por E coli Gen regulador (i) codifica proteína represora que se une al centro operador (impidiendo transcripción genes estructurales)

Estructura general de un operón

Estructura del operón de la lactosa

Elementos del modelo: -gen regulador (i) -centro operador (secuencia reguladora del DNA) -genes estructurales

pi

El operón de la lactosa

E. coli depende de Glucosa como fuente de energía, pero en su ausencia puede procesar Lactosa

En condiciones normales sólo unas pocas moléculas (~10) de β-galactosidasa Tras activación miles

Transporte lactosa a través membrana

Detoxificación otros compuestos transportados por permeasa

Regulación del operón de la lactosa REGULACIÓN NEGATIVA

Secuencia nucleótidos operador lac repetición invertida casi perfecta (simetría rotacional binaria en DNA)

Lo que se corresponde con simetría en prot. represora

UNIDAD FUNCIONAL Dímero represor lac unido al DNA (puede formar tetrámeros)

En ausencia de lactosa el represor lac se une rápida e intensamente al operador impidiendo avance de la RNApol

2 lugares secuencia ~operador Unión cooperativa dímeros represor de interacción

con DNA

en formación dímeros y tetrámeros

Interacciones represor lac-DNA

El represor lac (DIMEROS N-terminal) unido al DNA mediante inserción de α-hélice (del motivo hélice-giro-hélice) en el surco mayor DNA y contactos con pares de bases y esqueleto fosfodiester (resíduo Arg forma puentes hidrógeno con resíduo G)

La unión de ligandos puede provocar cambios conformacionales en proteínas reguladoras

Cuando el represor lac se encuentra unido al inductor (alolactosa*) la afinidad del represor hacia el DNA del operador disminuye enormemente

El inductor (alolactosa o IPTG) se une al centro del dominio grande de cada monómero del represor

Otras muchas redes de regulación génica de E.coli y otras muchas bacterias funcionan de manera análoga a la del operón lac

* alolactosa:producto colateral de la reacción de la β-galactosidasa *IPTG: análogo sintético

Activación de la transcripción por la proteína CAP (o CRP) REGULACIÓN POSITIVA

En procariotas también hay proteínas que se unen al DNA y estimulan transcripción

CAP (catobolite activator protein) o CRP (prot de respuesta al cAMP) Estimula transcipción genes que catabolizan lactosa y arabinosa En operón lac CAP se une a repetición invertida (posic -61) SIMETRÍA BINARIA CAP actúa como un dímero Complejo CAP-cAMP estimula transcripción 50 veces Incorporación RNApol a promotores con CAP favorecida

El dímero de CAP unido al DNA

La superficie que se une al DNA está formada por un par de α-hélices separadas por un giro rígido motivo hélice-giro-hélice común a familia represor lac y otras muchas proteínas (no todas, ej. Represor metionina de E coli)

En condiciones normales uso glucosa: El efecto inhibidor de la glucosa, represión por catabolito, se debe a la capacidad de la glucosa para disminuir la concentración de cAMP en el interior de la cel

Operon lac con expresión génica máxima cuando no hay glucosa, 1) la alolactosa elimina la inhibición del represor lac 2) el complejo cAMP-CAP estimula la unión de la RNApol

1. Control de la expresión génica en procariotas 2. Control de la expresión génica en eucariotas

TEMA 12. Regulación de la expresión génica

Mayor complejidad de los genomas eucarióticos mecanismo de regulación génica más complejos

Eucariota vs Procariota

-Genoma más grande (varios cromosomas) -Diversidad de tipos celulares (diferencias drásticas en la expresión de genes) -Genes no agrupados en operones (genes que codifican prot para distintas etapas de una vía están desperdigados por el genoma) -Factores transcripcionales forman grandes complejos -Transcripción y traducción no acopladas -DNA asociado a histonas: cromatina

NUCLEOSOMAS: complejos de histonas unidos al DNA

Possible Points of Eukaryotic Gene Regulation

COMPARTIMENTALIZACIÓNseparación transcripción y traducción que hacen el proceso más complejo

Eucromatina-Heterocromatina

El acceso a los promotores eucar está restringido por la estruct de la cromatina Activación de la transcripción asociada con múltiples cambios estruct cromatina en la región transcrita El estado transcripcional basal es restrictivo por lo que predomina la regulación positiva: genes eucariotas requieren activación para ser transcritos Heterocromatina: transcripcionalmente inactiva (más condensada) Eucromatina: cromatina menos condensada, pero no toda en estado transcripcionalmente activo (sensibilidad DNAasa I)

Muchos sitios hipersensibles (a DNAasa I) corresponden a sitios de unión de proteínas reguladoras y la relativa ausencia de nucleosomas (o conformación alterada) en estas regiones puede permitir la unión de estas prot.

Metilación del DNA

Acetilación de histonas y desplazamiento nucleosomas

Para inhibición de genes inadecuados en determinados tipos cel Islas CPG: regiones de DNA que conforman ~ 40% promotores de los genes de mamíferos (regiones de gran concentración de pares de C y G enlazados por fosfatos) ~70% secuencias CPG están metiladas en posición C-5 de la citosina (metiltransferasas específicas). La distribución de estas citosinas metiladas varía según tipo cel En la mayoría de los casos, los sitios CPG están desmetilados si los genes están expresados

Dominios N-terminales de las histonas internas son ricos en Lys Allí donde la cromatina está siendo activada para la transcripción las histonas del nucleosoma se acetilan (por histonas acetiltransferasas nucleares).

MODIFICACIÓN DNA POR:

*Acetilación múltiples residuos de Lys de histonas H3 y H4 puede reducir afinidad nucleosoma por DNA *Acetilación también puede impedir o promover interacción con otras proteínas implicadas en la transcripción o en su regulación

También metilación, fosforilación y ubiquitinación

Formación del complejo de transcripción de la RNApol II

Regulación positiva por necesario empaquetamiento DNA (más eficiente) Aunque tb ej de regulación negativa Al aumentar el tamaño del genoma se debe mejorar la especificidad: necesidad complejos prot reguladoras

Mayoría promotores de la RNApol II incluyen la caja TATA y la sec Inr (iniciador), y sec. adicionales que varían en número y localización : potenciadores (Enhancers que pueden encontrarse a centenares o miles pb, incluso aguas abajo) *Enhancer en levaduras se llaman UAS generalmente aguas arriba y próximos

Se requiere participación de: factores de transcripción basales o generales, transactivadores (unión a los potenciadores) y coactivadores (no se unen al DNA, sino comunicación entre transactivadores y el complejo de la RNApol II y los factores de transcripción)

Primer componente complejo pre-inicio es la ‘prot de unión a TATA’ o TBP; compuesta por fact transcripción TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH, TFIIA (tal vez) y RNApol II. NO es suficiente para inicio transcripción

*

Regulación negativa menos frecuente, en la que algunas prot reguladoras que se unen a promotores RNApol II pueden actuar como represores inhibiendo la formación de complejos de pre-inicio activos

Pueden funcionar a distancia (HMG) Algunos transactivadores facilitan transcripción centenares promotores, otros de sólo unos pocos Contienen dominio estructural para la unión al DNA y otro/s para la activación de la transcripción o interacc con prot reguladoras

Coctivadores: TFIID, formado por TBP y TAF (factores asociados a TBP): TAF son parecidas a histonas y pueden desplazar el nucleosoma durante la transcripción como Mediador (complejo de 20 o más polipéptidos) se unen a C-terminal subU grande RNApol II Funcionan en la proximidad caja TATA

Formación “lazo” facilitada por proteínas HMG (proteínas no histonas de alta movilidad)

Genes del metabolismo de la galactosa en levaduras

Genes para enzimas metabolismo galactosa (GAL) en varios cromosomas, transcriben por separado pero promotores (~) regulados de forma coordinada

Secuencia del proceso: los complejos se ensamblan secuencialmente, primero transactivador (Gal4p), de afinidad alta promueve unión de otros complejos, después lo hacen los complejos proteicos adicionales (como SWI/SNF, GCN5-ADA2-ADA3 y mediador) necesarios para remodelar la cromatina y permitir que comience la transcripción

Promotores con TATA, Ins y UASG reconocida por activador Gal4p

Dominios de unión al DNA de proteínas reguladoras Incluyen pequeños motivos estructurales reconocibles y característicos, permiten la discriminación entre pares de bases (las distinguen) estableciendo enlace por puente de hidrógeno con los grupos funcionales expuestos en el surco mayor. Principales: motivos hélice-giro-hélice (procariota) y dedo de zinc (muchas prot eucariotas)

Visto en el represor lac. También localizado en algunas proteínas reguladoras eucariotas ~20 aa en 2 segmentos α-hélice cortos, separados por un giro β. Uno de los segmentos α-helicoidales, el llamado de reconocimiento, interacciona con el DNA con especificidad de secuencia (se sitúa casi dentro del surco mayor)

~ 30 aa formando un lazo alargado sujeto por su base por único ión Zn2+, coordinado con 4 enlaces (4 Cys o 2 Cys y 2 His). Zinc no interacciona con DNA, sino que estabiliza el motivo estructural La interacción de un único dedo de zinc es débil y muchas proteínas que se unen al DNA contienen múltiples dedos de zinc (muy pocos casos en procariotas)

Estructura de dedos de zinc

Ej. Receptores hormonas esteroideas: prot con un sitio de unión para la hormona, un dominio de unión al DNA y una región que activa la transcripción del gen regulado

El dominio de unión al DNA (altamente conservado) con dos dedos de zinc

Interacción prot-prot entre proteínas reguladoras

La interacc entre 2 proteínas reguladoras tiene lugar a menudo a través de dominios que contienen cremalleras de leucina o motivos hélice-lazo-hélice

Región de la cremallera

Hélice α con residuos de aa hidrofóbicos concentrados en un lado, y con la superficie hidrofóbica como área de contacto entre los 2 polipéptidos de un dímero. Residuos de Leu en cada séptima posición formando una línea recta e interaccionando entre sí. Las 2 hélices se enrollan una en torno a la otra formando una hélice suavemente superenrollada

La cremallera de leucina no interaccionan directamente con el DNA

Comparten una región de unos 50 aa importantes tanto en la unión al DNA como en la dimerización de la proteína. Esta región forma 2 hélices α anfipáticas cortas unidas por un lazo de longitud variable: hélice-lazo-hélice que interaccionan para formar dímeros. Las hélices no están implicada en la unión al DNA

No confundir con motivo hélice-giro-hélice implicado en unión al DNA

DNA

DNA

La expresión génica eucar. puede ser regulada por señales inter e intracelulares: receptores hormonales nucleares

Hormonas esteroideas (muy hidrofóbicas; estrógenos, progesterona, cortisol) tras atravesar membrana (difusión) se une a su prot receptora específica en el núcleo y es el complejo hormona-receptor el que se une a secuencias muy específicas de DNA, elementos de respuesta hormonal (HRE), alterando la expresión génica (puede potenciar o inhibir la expresión de genes adyacentes) Unión (interacc) hormona-receptor →cambios conformacionales en prot receptoras que influyen es su capacidad de interacción con factores transcripcionales adicionales

Capacidad de una hormona alterar expresión gen específico (a traves complejo Recep-Ho) depende sec HRE, posición y número

Receptores hormonales tienen dominio de unión al DNA altamente conservado con dos dedos de zinc. La región de unión al ligando (extremo C-terminal) bastante específica para cada receptor (grandes diferencias en tamaño para cada caso)

Sec DNA HRE son ~ en longitud y estructura, pero # en secuencia. Cada receptor tiene una HRE consenso Dos sec consenso de 6 nucleótidos contiguos separados por 3 nucleótidos en tandem o palíndromo

La fosforilación de factores de transcripción puede contribuir a su regulación

Vía β-adrenérgica produce un aumento en los niveles de cAMP celulares. El cAMP se une a la subU reguladora de la PKA (protein quinasa A), activándola. subU de PKA liberada penetra en el núcleo y fosforila a la proteína nuclear de unión al elemento de respuesta al cAMP (CREB). Una vez fosforilada CREB se une a ciertas secuencias de DNA denominadas de respuesta al cAMP (CRE) y actúa como factor de transcripción, activando la expresión de los genes cercanos

CREB

Muchos mRNA eucarióticos está sometidos a represión traduccional

Transcritos generados en núcleo son modificados y transportados al citoplasma →retraso aparición prot

En algunas circunstancias (ej. genes eucar muy largos) para tener un incremento rápido en la producc de una prot, un mRNA reprimido traduccionalmente ya presente en citoplasma puede ser activado para su traducción sin retraso. También en cels anucleadas (reticulocitos) donde el control transcripcional es inasequible (control traduccional mRNA almacenados) Mecanismos:

1. Fosforilación de los factores de inicio (formas fosforiladas menos activas)

2. Represores traduccionales que se une directamente al mRNA (3’UTR) e interaccionan con otros factores de inicio de la traducc unidos al mRNA o con la subU 40S para impedir inicio traducc

3. Prot de unión que impiden la interacc entre eIF4E y eIF4G, en mamíferos 4E-BP (unión al eIF4E) Con crecimiento cel lento estas prot limitan la traducc, cuando se reanuda crecimiento o en respuesta a factores de crecimiento u otros estímulos se inactivan por fosforilación

Regulación postranscripcional por interferencia del RNA (microRNAs)

En eucariotas superiores (nemátodos, moscas, plantas y mamíferos) se ha descubierto una clase de pequeños RNA (19-25 nucleótidos) (micro-RNA o miRNA) que participan en el regulación génica

Regulan expresión de mRNA post-transcripcionalmente: Interacción con el mRNA, a menudo en animales en 3’UTR (en plantas en reg. codificadora), provocando inhibición traducción y llevan a la degradación del mRNA, silencian el gen

-Un solo microRNA puede regular potencialmente cientos de mRNAs -Un mismo mRNA puede ser regulado por múltiples micro-RNAs Muchos presentes sólo de manera transitoria durante el desarrollo (stRNA). Se han identificado cientos distintos -Controlar desarrollo temporal algunos organismos -mecanismo protecc frente virus (plantas) -controlar actividad transposones -papel en formación heterocromatina

Silenciamiento por micro-RNA

Transcriben como RNA prepulsor ~70 nucleótidos con secuencias complementarias internas en horquilla Los precursores se cortan con endonucleasas (la más conocida Dicer o troceador) para formar duplex de 20-25 nucleótidos. Una de la hebras se asocia con un mRNA diana o RNA virus o transposón…

Aprovechado en el lab como estrategia de RNA de interferencia (iRNA) para silenciar expresión genes

El desarrollo está controlado por cascadas de proteínas reguladoras Los mecanismos de regulación más complejos se encuentran en el desarrollo de un organismo multicelular. El destino de las células de las células en el embrión temprano está determinado por el establecimiento de gradientes antero-posterior y dorso-ventral de las proteínas que actúan como transactivadores de la transcripción o como represores de la traducción (morfógenos: producto de los genes reguladores del patrón), regulando los genes necesarios para el desarrollo de las estructuras apropiadas para una parte determinada del organismo. Los genes reguladores operan coordinadamente en el tiempo y el espacio.

Actúan genes maternos (se expresan en huevo no fecundado y mRNA permanecen latentes hasta fecundación), de segmentación (transcriben después fecundación y dirige la formación del número correcto de segmentos corporales; genes gap, genes de la regla par, genes de la polaridad de los segmentos) y homeóticos (se expresan más tarde, especificando que órganos y apéndices se desarrollan en los distintos segmentos corporales )