Tema 5. Recuento de microorganismos

Tema 5: Recuento de microorganismos

Microbiologia Microbiologia MICC, Grau en Nanocincia i Nanotecnologia

Medidas de masa celular: mtodos directos e indirectos

Recuento del nmero de microorganismos: recuento de

totales y recuento de viables.

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Mesures de la massa cellular

- Mtodes directes

- Pes humit (poc precs)

- Pes sec (15-20% de lhumit, ms precs, 1 mg 109 cllules)

- Quantificaci dun constituent concret - DNA, RNA, protenes, clorofilla, peptidglic, etc.

- til si la substncia s constant a cada cllula

- Mtodes indirectes

- Consum / producci dun metabolit (O2, CO2 / producci dcids)

- Mtodes ptics (mesura de la terbolesa dun cultiu). Mtodes rpids, fcils i sensibles

-Espectofotmetre / colormetre. Mesures de densitat ptica (DO = Absorbncia)

Quantificaci del creixement

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Massa cellular. Mtodes indirectes: Espectofotmetre

- Mesures de densitat ptica (DO = Absorbncia)

- Dispersi de la llum proporcional a la massa del cultiu

Ms cllules

Ms llum dispersada

Menys llum detectada

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Recompte del nombre de cllules

- Recomptes directes

- Cambres de recompte Petroff-Hausser/ recompte de Breed

- Comptadors electrnics: Coulter counter

- Recomptes cllules viables

- Mtodes sembra

- Mtodes membranes filtraci

Quantificaci del creixement

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Cambres de Petroff- Hausser

- Fcil, barat i rpid

- til per a procariotes i eucariotes

- No es diferencien cllules vives de mortes

Recompte de Breed:

Nombre de cllules. Recomptes directes

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Muestras diluidas (con muy bajo n de cfu/ml)

Procedimiento de filtracin por membrana:

- pasar muestra a travs del sistema (filtro)

- depositar filtro sobre la superficie de una placa de Petri con medio slido.

- al cabo del tiempo se formarn sobre el filtro tantas colonias como

individuos quedaron retenidos a partir del filtrado de la muestra original.

Nombre de cllules. Recompte de viables

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Nombre de cllules. Recompte de viables

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A partir del cultivo original se hacen

diluciones seriadas.

De algunas de ellas se siembra un cierto

volumen (normalmente 0,1 ml) en placas de

Petri.

Se cuentan las placas que tengan entre 20 y

300 colonias.

Se estima el n de unidades formadoras de colonias/ml (CFU/ml).

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Mtode

Mtode sembra per extensi

Sample is pipetted onto surface of agar plate (0.1 ml or less)

Sample is spread evenly over

surface of agar using sterile

glass spreader

Mtode sembra en profunditat

Typical spread-plate results

Surface

colonies

Incubation

Surface

colonies

Solidification

and incubation Subsurface

colonies

Typical pour-plate results Sterile medium is added and

mixed well with inoculum Sample is pipetted into

sterile plate

- simple

- usat per recompte de viables

- resultats imprecisos si les cllules sagrupen

- resultats com a unitats formadores colnies (CFU)

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Desventajas de esta metodologa

No podemos garantizar que cada colonia no proceda de ms de

un individuo (especialmente en bacterias que forman

agrupaciones de 2 o ms clulas).

El recuento se refiere no a clulas viables reales sino a unidades formadoras de colonia (UFC).

Por lo tanto, una UFC corresponde, como mnimo, a una

bacteria,

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DILUCIONES SERIADAS

0.1 ml + 0.9 ml buffer =

0.1 ml en 1 ml final

(dilucin 1/10) = 10-1

0.1 ml + 9.9 ml buffer =

0.1 ml en 10 ml final

(dilucin 1/100) = 10-2

10-4 10-6 10-8 10-10 10-12

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Mostra(ml) 0.5 0.05 0.05 0.5

Ringer (ml) 4.5 5 5 4.5

FD 10 -1 10 -2 10 -2 10 -1

FDA 10 -1 10 -3 10 -5 10 -6

Mostra BANCO DE

DILUCIONES

0.1 ml 0.1 ml

FD: factor de dilucin

FDA: factor de dilucin acumulado

cfu/ml = (n colonias x Factor dilucin acumulado) / volumen sembrado

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1/10-fold serial dilution

23 2

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23 2

Conveniente sembrar duplicados de cada dilucin

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Precauciones a la hora de sembrar y

de leer las placas sembradas:

- slo leer placas con n adecuado de colonias (20-300)

- comprobar que los factores de dilucin coinciden con los valores

de nmeros de colonias obtenidas

- tener en cuenta el volumen de las respectivas diluciones

sembrado en las placas

- conveniente sembrar varias placas rplica de cada dilucin para

hacer medias y tener valores representativos