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ENSAYOS MICROBIOLOGICOS EN CONTROL DE CALIDAD: ASPECTOS RELEVANTES

MSc. María Salas Arruz Gerente General de Hypa6a S.A. Profesora Principal de la UPCH

ENSAYOS MICROBIOLOGICOS EN CONTROL DE CALIDAD: ASPECTOS RELEVANTES

Temas:

•  Ensayos frecuentes: Control Microbiológico (Limite Microbiano), Esterilidad, Potencia AnIbióIca, Endotoxinas Bacterianas – NormaIva Fundamento e Interpretación de cada ensayo.

•  Manejo de Cepas ATCC •  Cambios recientes en USP ó BP ó en las BPL de la OMS para

ensayos microbiológicos. •  Infraestructura requerida para reallizar los ensayos

microbiológicos Areas, Equipos, personal-‐ Requerimientos mínimos para implementar los ensayos

•  Controles ambientales requeridos en las áreas microbiológicas

FUNDAMENTO E INTERPRETACIÓN : •  Control Microbiológico (Limite Microbiano), •  Esterilidad, •  Potencia AnIbióIca, •  Endotoxinas Bacterianas –

Cepas Control

Preparación de medios y diluyentes

Promoción de Crecimiento Validación

O Aptitud del método de

prueba

Fase Analítica:

Fase Pre – analítica

Control Microbiológico o Limite Microbiano Objetivo:

Permite determinar el número de bacterias mesófilas

(aerobias) y hongos que pueden desarrollarse en una

muestra así como determinar si en la misma se

encuentran microorganismos de riesgo para la Salud

(patógenos) como:

Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomona

aeruginosa , Salmonella yBacterias gram negativas

tolerantes a la bilis

Control Microbiológico -‐ FUNDAMENTO:

Mediante medios de cultivos óptimos se evalúa si la muestra tiene gérmenes dentro de los límites establecidos y que éstos no sean patógenos. Medio de cultivo óptimo: se encuentra libre de gérmenes y aptos para que sean capaces de generar el crecimiento de microorganismos si estos estuvieran presenten en la muestra.(Control de medios - Pruebas de Promoción de crecimiento) Se prevee y evalúa si la ausencia de crecimiento en la muestra corresponde a inactivantes que se encuentren en la formulación.(Pruebas de aptitud)

Control Microbiológico o Limite Microbiano Medios de Cultivos: Se debe evaluar que esten libres de gémenes, para lo cual se les incuba por lo menos 48 horas y no debe presentar crecimiento alguno. Se debe evaluar que esten óptimos es decir que se compruebe que puedan crecer microorganismos si la muestra las tuviera, para lo cual se realiza la prueba de promoción de crecimiento

APTITUD DE LA PRUEBA - Validación

•  Se debe establecer la apItud del método es decir la capacidad de la prueba para detectar los microorganismos previamente inoculados (en canIdad conocida) en presencia del producto a examinar.

•  Permite comprobar que el método sirve para el fin previsto en la formulación a evaluar.

•  Para estas pruebas de apItud se deben uIlizar suspensiones

estandarizadas de cepas (ATCC: American Type Culture CollecIon)

Control Microbiológico -‐Partes El ensayo consta de 3 partes:

A.  Recuento Total de microorganismos aerobios. (microorganismos aerobios que requieren oxigeno para su desarrollo) TSA ( Tripticasa soya agar)

B. Recuento total combinado de Hongos Filamentosos y

Levaduras. Sabouraud agar C. Determinación de patógenos. Se siembra la muestra

en caldo TSB tripticas soya borth y luego pasa a medios diferenciales o selectivos.

Control Microbiológico -‐ Partes C. Determinación de patógenos. Se siembra la muestra en caldo TSB tripticas soya borth y luego pasa a medios diferenciales o selectivos. 1 g muestra en TSB 10 g muestra en TSB 10 g muestra en TSB

Manitol salado –Staphylococcus aureus Agar Cetrimide –Pseudomona aeruginosa Mac Conkey -‐ E. Coli

Caldo Mosel/ VRD Bacterias gram negaIvas resistentes a la bilis

Caldo Rappaport / XLD –Salmonella sp

InacIvantes

•  En alguno productos con posibles inacIvantes es necesario adicionar un neutralizante. Se requiere evaluar cual es el apropiado previo al ensayo

•  LeciIna ó Tween 80 •  Hacer inoculo de menos de 100 ufc y la recuperación de ser de la mitad al doble (factor 2)

PRUEBA DE MICROORGANISMOS ESPECÍFICOS

Pseudomona aeruginosa

Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Salmonella sp.

Especificaciones – USP/BP

Expresión de resultados Ensayo Especificación Resultado

CONTROL MICROBIOLOGICO

•  Recuento microbiano de aerobios totales

102 UFC/g (Máximo aceptable 200 UFC/g) Menor de 10 UFC/g

•  Recuento combinado de de hongos y levaduras

10 1 UFC/g (Máximo aceptable 20 UFC/g) Menor de 10 UFC/g

•  Determinación de patógenos: Salmonella sp Ausente en 1g Ausente en 1g

Pseudomona aeruginosa Ausente en 1g Ausente en 1g

Staphylococcus aureus Ausente en 1g Ausente en 1g

Escherichia coli Ausente en 1g Ausente en 1g

Salmonella sp Ausente en 10g Ausente en 10g

Dec 516-‐ Res 1482 Comunidad Andina(Julio 2011) -‐ CosméIcos

ÁREA DE APLICACIÓN Y FASE ETARIA LÍMITES DE ACEPTABILIDAD

  Productos para uso en infantes (hasta 3 años)

  Productos para uso en área de ojos.

  Productos que entran en c o n t a c t o c o n l a s membranas mucosas.

a.  Recuento de microorganismos mesófilos aerobios totales. Límite máximo 5 x 102 UFC/g ó ml.

b.  Ausencia de Pseudomonas aeruginosa en 1 g ó ml.

c.  Ausencia de Staphylococcus aureus en 1 g ó ml.

d.  Ausencia de Escherichia coli en 1 g ó ml.   D e m á s p r o d u c t o s

cosméticos susceptibles d e c o n t a m i n a c i ó n microbiológica.

a.  Recuento de microorganismos mesófilos aerobios totales. Límite máximo 5 x 103 UFC/g ó ml.

b.  Ausencia de Pseudomonas aeruginosa en 1 g ó ml.

c.  Ausencia de Staphylococcus aureus en 1 g ó ml.

d.  Ausencia de Escherichia coli en 1 g ó ml.   P r o d u c t o s a s e r

utilizados en los órganos genitales externos

a.  Ausencia de Candida albicans.

TÉCNICAS Y ESPECIFICACIONES (NormaIva) ENSAYO MEDICAMENTO DISPÓSITIVOS

MÉDICOS COSMÉTICOS PRODUCTOS SANITARIOS

CONTROL MICROBIOLÓGICO (ANTES LÍMITE MICROBIANO)

USP, BP EUROPEA OTRAS

-‐-‐-‐ Técnicas Propias

DECISIÓN 516 RESOLUCION 1482 (JULIO 2011

ESTERILIDAD USP, BP EUROPEA, OTRAS


-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐

ENDOTOXINAS BACTERIANAS


USP BP OTRAS

-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐

POTENCIA ANTIBIÓTICA


-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐ -‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐

Esterilidad

Consiste en evaluar si la muestra esta libre gérmenes viables. Esta prueba se realiza en medios de cultivo controlados y óptimos (TSB y THIO) También se evalúa la Aptitud de la prueba, es decir si la muestra no es capaz de inhibir el crecimiento (6 gérmenes)

Ensayo de Esterilidad/Inhibidores

Para Antibióticos: Beta-lactamasa ó Penicinilasa PENASA es el nombre comercial, enzima que degrada la estructura de los anIbióIcos conocidos como b-‐lactámicos. Los anIbióIcos de este Ipo son hidrolizados por las b-‐lactamasas, pierden su acIvidad anImicrobiana

Especificación y forma de expresión de resultados

doEnsayo Especificación Resulta Esterilidad Estéril Estéril -‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐ Ausencia de crecimiento microbiano El ensayo no se debe repeIr si se verifica que no se ha comeIdo error ó

contaminación

Valoración microbiológica (Potencia anIbióIca)

•  Se compara la acIvidad anImicrobiana de la muestra frente a un estándar de concentración conocida.

Potencia AnIbióIca . USP Método Cilindro placa Se emplean 15 placas, de manera que se obIene: S1= 9 lecturas S2= 9 lecturas S3= 45 lecturas S4= 9 lecturas S5= 9 lecturas M3= 9 lecturas

Valoración microbiológica (Potencia AnIbióIca)

USP BP

Emplea curva de 5 concentraciones de estándar y 1 de muestra

Emplea 2 curvas, una del del estándar y otra de la muestra, cada una de 3 concentraciones.

La curva debe tener como máximo factor de dilución 1.25

………..

Se debe realizar 3 repeIciones independientes

Se debe realizar 2 repeIciones independientes

En ambos casos los promedios de las repeIciones se obIene de los logaritmos

Diferencia entre USP y BP Halo

S1

S2

S3

S4

S5

M3

USP

S1

S2

S3

M1

M2

M3

BP

Log de Dosis Log de Dosis

Halo

Endotoxinas Bacterianas

•  Son los pirógenos mas toxigénicos. •  Es facIble cuanIficar la endotoxina mediante una técnica in vitro denominada LAL

Valoración microbiológica -‐especificación y expresión de resultados

Ensayo Especificación Resultados Valoración Microbiológica

90.0% -‐110.0% de lo declarado

95.2 de lo declarado

Los promedios de las repeticiones se obtiene de los logaritmos Ejm

Forma errada Forma adecuada

Primer Ensayo 97.00 % Segundo Ensayo 99.00 % Promedio 98,00%

Primer Ensayo 1.986771734 (97) Segundo Ensayo 1.995635195 (99) Promedio 1,991203465 97.995%

¿QUE SON LAS ENDOTOXINAS BACTERIANAS?

  Son lipopolisacáridos que se encuentran en la

membrana externa de la pared celular de las

bacterias gram negativas, compuestos por un

polisacárido y el lípido A.

  Inicialmente se les llamó endotoxinas ya que las

bacterias no la excretan al medio sino son

liberadas durante la lisis de la bacteria

¿QUE ES LAL?

 LAL (Limulus Amebocyte Lysate) o Lisado de amebocitos del género Limulus, es un extracto acuoso de amebocitos de la sangre de una especie de cangrejo l lamado “Limulus polyphemus” (“Horseshoe Crab”), animal prehistórico cuyo origen data del periodo Cámbrico, de hace más de 500 millones de años, por lo que se ha considerado como “fósil viviente” encontrados en áreas costeras del este de EE.UU y el Golfo de México.

Curso de Validación de Procesos y Técnicas AnalíIcas, dictado por HypaIa para IPEN-‐

2014

ETAPAS DE LA PRUEBA DE LAL METODO GEL-CLOT

 Confirmación de la Sensibilidad del reactivo de

LAL

 Prueba de Factores de Interferencia (Inhibición

y magnificación)

 Prueba del Límite de endotoxina

LA PRUEBA DE LIMULUS (GEL CLOT)

 Fundamento: •  Las proteínas

coagulables del lisado de amebocitos de Límulus gelifican en presencia de las endotoxinas baterianas

FOTO: ASSOCIATES OF CAPE COD.

PRUEBA DE LIMITE Y CUANTIFICACIÓN

Ejemplo: Sensibilidad Etiquetada (lambda) 0.25 EU/mL MVD = 64

DILUCIONES DE LA MUESTRATubos D.I. 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 Control

Negativo

1 + + + - - - - -2 + + + - - - - -C.P.1 + + + + + + + +C.P.2 + + + + + + + +

Concentración de endotoxinas= λ x IE

Concentración de endotoxinas = 0.25 x 4 = 1EU/mL

D.I.= Dilución inicial C.P.= Control positivo

λ = Sensibilidad del reactivo IE= Inversa de la última dilución positiva

PRUEBA DE INHIBICIÓN Y MAGNIFICACIÓN

Tubos

Concentración CSE en Agua LAL (UE/mL) Agua

LAL

Concentración CSE en la Solución de Muestra (UE/mL) Solució

n de Muestr

a (MDV)

2 λ λ 0,5 λ 0,25 λ 2 λ λ 0,5 λ 0,25 λ

1 + + -‐ -‐ -‐ + + -‐ -‐ -‐ 2 + + -‐ -‐ -‐ + + -‐ -‐ -‐ 3 + + -‐ -‐ -‐ + + -‐ -‐ -‐ 4 + + -‐ -‐ -‐ + + -‐ -‐ -‐

Especificación y forma de expresión

Ensayo

Especificación Resultado

Endotoxinas Bacterianas

No mayor de 10 UE/mg

Menor a 10UE/mg

MANEJO DE CEPAS ATCC

Cepas ATCC

•  Staphylococcus aureus ATCC 6538

•  Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

•  Escherichia coli ATCC 8739

•  Salmonella typhimurium ATCC 14028

•  Bacillus subtilis ATCC6633

•  Candida albicans ATCC 10231

•  Aspergillus brasiliensis ATCC 16404

TIPOS DE CEPAS

-  Cepas de colección: Microorganismos definidos por lo menos a nivel de género y especie, depositados y mantenidos en una Colección de Cultivos (CC) o Centro de Recursos Biológicos (BRC) y catalogados con el acrónimo de la colección/BRC seguido de un número identificativo.

-  En dicho catálogo se reseña el origen de la cepa, sus condiciones de cultivo y, en muchas ocasiones, algunas de sus características, así como la equivalencia, si la hay, con otras colecciones. Es equivalente a cepas de referencia, el proveedor más conocido es ATCC.

CEPAS

-  Cepas de reserva: cepas idénticas obtenidas mediante un único subcultivo de una cepa de referencia suministrada por el proveedor, o que proceden directamente del proveedor como tales.

-  Cepas de trabajo: subcultivos primarios obtenidos

de una cepa de reserva. La USP indica que la cepa sólo debe ser utilizada hasta la quinta generación.

-  Cepas comerciales: cepas suministradas por casas comerciales diferentes de las colecciones de cultivo o Centros de Recursos Biológicos, y que pueden o no proceder de una colección de cultivos.

- Cepas salvajes: No proceden de CC ni de BRC.

Solo es válido hasta el quinto pasaje

LIOFILO DE LA ATCC

Primer Pasaje

Primer Pasaje

Primer Pasaje

Primer Pasaje

Primer Pasaje

Primer Pasaje

Primer Pasaje

Primer Pasaje

Primer Pasaje

CEPAS DE RESERVA

Segundo Pasaje

CEPAS DE TRABAJO

Segundo Pasaje

Segundo Pasaje

Las cepas se uIlizan en A Promoción de crecimiento de los

medios

B

C

Prueba de las propiedades inhibitorias de los medios

D

Prueba de las Propiedades indicadoras de los medios

Ensayos de Aptitud del método de prueba

Medio de cultivo

Microorganismo de prueba

Características

C (-) C(+)

Agar VRB S.aureus ATCC 6538

E.coli ATCC 8739 P.aeruginosa ATCC 9027

Colonias rojas con precipitado rojo al rededor

Agar Mac Cokey S.aureus ATCC 6538

E.coli ATCC 8739

Colonias rojas o rosadas, que puede tener precipitado al rededor

Agar Manitol Salado E.coli ATCC 8739

S.aureus ATCC 6538

Colonias amarillas con zona amarilla al rededor

Agar Cetrimide S.aureus ATCC 6538

P.aeruginosa ATCC 9027

Colonias verdosas por formación de piocianina

Agar XLD S.aureus ATCC 6538

Salmonella ATCC 14028

Colonias negras

C a l d o R a p p a p o r t Vasiliadis

S.aureus ATCC 6538

Salmonella ATCC 14028

Turbidez del medio. Se pone ligeramente amarillo

Caldo Mossel S.aureus ATCC 6538

E.coli ATCC 8739 P.aeruginosa ATCC 9027

El medio se enturbia

Infraestructura requerida para realizar los ensayos microbiológicos Areas, Equipos, personal-‐ Requerimientos mínimos para implementar los ensayos

Instrumentos necesarios

PERSONAL Los ensayos microbiológicos deben ser realizados y supervisados por una persona experimentada, calificada en microbiología o su equivalente. El personal debe tener entrenamiento básico en microbiología y experiencia prácIca relevante antes de ser autorizado a realizar el trabajo que implican los ensayos microbiológicos.

INSTALACIONES -‐ Microbiología

Laboratorio de microbiología;  Separado de áreas como las de producción  Diseñada para sus acIvidades y evitar la contaminación y la contaminación cruzada  Materiales de construcción para limpieza, desinfección y minimizar los riesgos de contaminación  De acceso a personal autorizado

INSTALACIONES

Personal del laboratorio debe conocer;  Procedimientos de entrada y salida  El uso de las áreas  Las restricciones de trabajo en cada área  Razón de las restricciones  Niveles de contención

INSTALACIONES

Sistemas de aire acondicionado;  Separado de áreas como las de producción  Incluir temperatura y humedad controlada  El aire no debe ser fuente de contaminación

INSTALACIONES

Clasificación de áreas ;  De acuerdo a los productos y acIvidades a desarrollar  El ensayo de esterilidad debe ser ejecutada en condiciones de operaciones de manufactura estéril/ asépIca

Equipamiento;  NO DEBE SER COMPARTIDO

AREAS –IMPLEMENTACION:

Definir hacer, solo para lo que ha espacio suficiente

Control Microbiológico

Esterilidad Potencia AnYbióYca

LAL

Preparación de medios

X X X …….

Área de lavado de sucio

X X X X

Área de lavado de limpio

X X X x

Áreas clasificadas

-‐-‐-‐-‐-‐-‐ x ……. -‐-‐-‐-‐-‐-‐

Área no clasificada

x x x

Espacio para Incubadoras

2 2 1 a 3 ….,

Validación de métodos de ensayo

Los métodos de ensayo estándares (farmacopeicos) se consideran validados. Sin embargo, se necesita demostrar que el método de ensayo es adecuado para su uso en la recuperación de microorganismos en presencia del producto específico. Los métodos de ensayo que no se basan en las farmacopeas u otras referencias reconocidas deben ser validados antes de su uso. La validación debe incluir, cuando sea apropiado, determinación de la exactitud, precisión, especificidad, límite de de- tección, límite de cuantificación, linealidad y robustez. Los potenciales efectos inhibitorios de la muestra deben tomarse en cuenta al analizar diferentes tipos de muestra. Los resultados deben evaluarse con métodos estadísticos apropiados,

Equipamiento

Cada equipo, instrumento u otro dispositivo utilizado para el análisis, verificación y calibración debe identificarse individualmente. La validación inicial debe incluir estudios de desempeño (distribución espacial de la temperatura) para cada ciclo operativo y cada configuración de carga usada en la práctica. Se debe repetir este proce- so después de cualquier reparación o modificación significativa

ENSAYOS MICROBIOLOGICOS

CABINA DE FLUJO LAMINAR HORIZONTAL

ENSAYOS MICROBIOLOGICOS

Cabina de bioseguridad que permite el manejo de cepas y sustancias peligrosas como por ejemplo : citostáIcos

PRINCIPALES EQUIPOS–IMPLEMENTACION: Control

Microbiológico Esterilidad Potencia

AnYbióYca LAL

Incubadoras dedicadas 2 3 1-‐3 …….

Incubadora común para medios

1 1 1

pH metro X X X x

Cabina de flujo laminar ó de bioseguridad

X x

Cabina de bioseguridad

x …… x -‐-‐-‐-‐-‐-‐

balanza x x x

Autoclave de limpio x x x x

Autoclave de sucio x x x

CAMBIOS RELEVANTES USP, BP, BPL

ENSAYO USP BP

CONTROL MICROBIOLÓGICO

………armonizada -‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐armonizada

ESTERILIDAD -‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐armonizada -‐-‐-‐-‐-‐-‐armonizada VALORACIÓN MICROBIOLÓGICA

Mayor énfasis estadísIco

-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐

LAL -‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐armonizada -‐-‐-‐-‐-‐-‐armonizada

EN EL 2011 SE PÚBLICA BPL DE LA OMS ESPCÍFICA PARA MICROBIOLOGÍA

Buenas pracIcas de la OMS para laboratorios de microbiología farmacéuIca

WHO TRS 961. 2011

7. Instalaciones

Los ensayos microbiológicos, si fueran realizados, deben ser conducidos en una unidad del laboratorio diseñada y construida apropiadamente. Para mayor orientación ver el proyecto del documento de trabajo Guía de la OMS sobre buenas prác4cas para laboratorios farmacéu4cos de microbiología (referencia QAS/09.297)

INSTALACIONES

•  CONTROLES AMBIENTALES

CONTROLES AMBIENTALES

•  Los controles ambientales permiten evaluar la eficacia de las prácIcas de limpieza y desinfección realizadas y que podrían afectar la biocarga del ambiente.

•  Dichos controles deben darse cuando los materiales estén en la zona, se estén desarrollando las acIvidades de procesamiento y este presente el personal operaIvo.

MONITOREO AMBIENTAL

 Programa  Monitoreo de aire  Plaqueo  Placas de contacto  Temperatura  Diferenciales de presión  Limites de acción y de alerta  Análisis de tendencias

LIMPIEZA, DESINFECCION E HIGIENE

 Programa  Resultados del monitoreo ambiental  Procedimientos en caso de derrame  Lavado y desinfección de manos

INSTALACIONES PARA ENSAYO DE ESTERILIDAD

 Area clasificada  Control y registro de presión posiIva  VesIdor

Especificaciones recomendadas por la USP para controles del aire

Clases de Area UFC/m3 de aire

100 Menos de 3

10 000 Menos de 20

100 000 Menos de 100

Especificaciones recomendadas por USP para superficies de equipos o instalaciones

Clase de Area UFC/placa de contacto o en 30 cm2

100 3 (incluido el piso)

10 000 10 (piso)

Especificaciones recomendadas por USP para indumentaria del personal operativo

Clase de Área

Guantes (UFC/placa de contacto )

VesYmenta (UFC/placa de contacto)

100 3 5

10 000 10 20

!Gracias por su atención!

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