LOPEZ MA. DE LOS ANGELES

RAMIREZ GONZALEZ MA. ' ISABEL

TELEFONO

7-58-68-48

8-55-13-01

MATRICULAS: 8 2 2 3 6 4 0 4

8 2 2 3 5 1 4 9

CLAVE: 23 .3 .130 .81

CARRERA: INGENIERIA BIOQUIblICA INDUSTRIAL

TRIMESTRE : 88 -0

HORAS- SEMANA: 2 O

LUGAR DONDE SE LLEVO A CABO: UNIVERSIDAD AUTONCMA METROFDLITANA- IZTAPALAPA

DEPTO . B IOTECNOLOGIA

AREA DE RODUCTOS NATURALES

LAB. ANALISIS DE MEDICAMENTE S-150

FEiCHA DE INICIO: 25 DE NOVIEMBRE DE 1987

FECHA DE

TITULO DEL PROYECTO: ISIS DEL AC IDO 6-AMINOPEN IC ILANICO

NaMBRE DEL "IDR: Q.F. I. YOLANDA VARGAS ALVARADO

PROFESOR ASOCIADO A LA UNIVERSIDAD AUTONCMA blEI'ROpOLITANA

HERAS L O E S MA. DE LOS RAMIREZ GCNZALEZ MA. ANGELES. ISABEL.

--- ".____ l__"_

México XI .F. a 7 de septiembre de 1988

M. en C. Avturo Preciado López Secretario Académico División de Ciencias y de la Salud Universidad Autónoma Unidad Iztapalapa

Biológicas

bletropolitana

Av. Purísima y blichoacán 09340 México D. F.

P R E S E N T E :

La que suscribe las C. Heras López Ela. de los Angeles y Ramírez

González Ma. Isabel con número de matrículas 82236404 y 82235149 respectiva-

mente, de la carrera de Ingeniería Bioquímica Industrial, tienen a bien co- -

municar a usted que concluimos nuestro servicio social en la Universidad - -

Autónoma Metropolitana, en el laboratorio de Análisis de Medicamentos S-150,

el cual inició 'el 25 de noviembre de 1987 y terminó el 25 de junio de 1988,

en el Análisis del Acido 6-aminopenicilánico, título que presenta el proyec-

to que llevamos a cabo, bajo la tutoría de la Q.F.I. Yolanda Vargas Alvarado,

profesora asociada de la Universidad citada.

Sin más por el momento y agradeciendo de antemano su fina atención

le reiteramos un cordial saludo. I,

Heras L6pez bla. de los Angeles. Ramírez González bla. Isabel.

DEPB4DENCIA: Depto. Biotecnología Area de Productos Naturales Lab. Análisis de Medicamentos.

hl6xico D.F. a 7 de sepiembre de 1988 M. en C. Arturo Preciado López Secretario Académico División de Ciancias Biológicas y de la Salud Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Av. Purísima y Michoach 09340 México D.F.

Por medio de la presente le comunicamos que las C. Heras López

Ma. de los Angeles y Ramírez González Ma. Isabel con nhero de matrículas - 82236404 y 82235149 respectivamente, de la carrera de Ingeniería Bioquímica

Industrial, concluyeron satisfactoriamente su servicio social, el cual ini-

ció el 25 de noviembre de 1987 hasta el 25 de junio de 1988, bajo la tutoría

de la Q.F.I. Yolanda Vargas Alvarado, profesora asociada a dicha Universidad.

Sin más por el momento y aprovechando la oportunidad de enviar-

le un cordial saludo.

Alvarado. Profesora Asociada a la UAM-I

TITULO DEL PROYECTO FINAL:

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . * * * ANALISIS DEL ACID0 6-AMINOPENICILANICO * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

I N D I C E .

paga

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58

1

O B J E T I V O .

Analizar cuatro lotes de ácido 6-aminopenicilánico (6-APA), obtenido por -

síntesis química en la planta piloto de Tecnología Farmaceútica de la Universi-

dad Autonoma metropolitana - Iztapalapa, utilizando simultaneamente un standard

de referencia.

. ".-

2

Las penicilina

1 N . T R O D U C C I O N

.S semisintéticas -una de las variaciones estructurales &S

fructíferas de entre las muchas estudiadas en este sector de los antibióticos-

representan un interesante ejemplo ilustrativo del importante papel que puede

desempeñar la modificación química de un producto natural.

El fascinante descubrimiento de FLBVIING, en 1929, y el posterior recono--

cimiento, en 1940, por FLOREY, CHAIN y ABRAHAM, de la utilidad potencial de

la penicilina en el control de las infecciones en animales y en humanos, marcó

el conienzo de una nueva era de la Quimioterapia. Sin embargo, a pesar del ca-

lificativo de "fármaco maravilloso" que recibieron estos productos de fennen-

tación, existían cinco propiedades que convenía incorporar a su espectro de -

acción:

l. Estabilidad en medios ácidos.

2. Espectro microbiológico más amplio.

3. Actividad frente a organismos resistentes.

4. Menor alergenicidad, y

5. Mayor eficacia metabólica (mejor absorción por vía oral, excreción más

lenta, etc.).

La variación estructural ha permitido, en mayor o menor grado, alcanzar -

estos objetivos, con la posible excepción de menor alergenicidad. En una de es

tas propiedades -actividad frente a organismos resistentes a penicilina (pro--

ductores de penici1inasa)- los resultados obtenidos han sido francamente con--

cluyentes.

-

El objetivo fundamental, al menos en los primeros intentos de síntesis to - tal, fue la comprobación de la estructura correcta.

ilna vez establecida la estructura correcta, los posteriores intentos de -

sintesis siguieron un curso más racional, aunque sin rendimientos mayores hasta

1957, con los trabajos de SHEEHAN y col.

3

Es interesante, sin embargo, señalar que este esquema de síntesis permiti6

preparar también el ácido 6-aminopenicilánico.

Aunque todas las penicilinas inicialmente descubiertas tienen una activi--

dad antibacteriana in vitro muy similar, la hica que conserva todavía un pues-

to importante en la práctica clínica es la bencilpenicilina (penicilina G) , de- bido a su mayor actividad in vivo y a su más fácil fabricación en gran escala.

Presenta, sin embargo, algunas limitaciones en su empleo. Su enumeración

equivale al enunciado de los principales objetivos perseguidos con las variacio -

nes estructurales, pues todas ellas se encaminaron hacia la corrección de aque-

llas limitaciones. He aquí las más importantes:

1. Excesiva solubilidad en agua. Ello, unido a otros factores tales como inac--

tivación bioquímica y unión a proteínas, hace que los niveles terapéuticos -

de bencilpenicilina en sangre desciendad muy rápidamente. Así, a partir de -

su inyección intramuscular, los niveles terapéuticamente eficaces sólo se m- - tienen durante tres a cinco horas.

2. Escasa resistencia a la degradación hidrolítica. La geometría del sistema -

anular impide la resonancia normal del grupo amídico del anillo de lactama; es-

te impedimento se traduce en un comportamiento químico bastante singular, en el

sentido de que la reactividad del enlace “ C = O resulta más próxima a la de

m anhídrido de ácido que a la de una amida. Por ello, en medio alcalino, se

hidroliza dando un ácido peniciloico y, en presencia de ácidos, sufre una trans -

posición rápida a un ácidd penilico (a) y a un ácido penicilénico (b) , con par- ticipación de la cadena carbonílica lateral. En consecuencia, la bencilpenicili -

na se degrada inactivándose al ponerse en contacto con el jugo gástrico. De -

hecho, la dosis por vía oral es unas cinco veces superior a la recomendada por

vía parenteral.

”

4

HOOC

3. Alergenicidad. El empleo de penicilinas registra la aparicih, en ocaciones,

de efectos secundarios de tipo alérgico (urticarias, dermatitis y , aunque menos

frecuentemente, reacciones anafiláticas) . 4. Inactivación enzimática. Al poco tiempo de establecerse la utilidad terapéu--

tica de las penicilinas, se describió dos tipos de enzimas que destruyen estos

antibióticos con pérdida de actividad: a) penicilinacilasas, que existen espe--

cialmente en las bacterias gram negativas, y que actfían separando la cadena la-

teral; b) penicilinasas o beta-lactamasas, que abren el anillo conduciendo a -

ácidos peniciloicos biológicamente inactivos.

ácido peniciloico -

I i o o c

COOH . . " .... "

5

No todas las variaciones estructurales estudiadas tuvieron como objeto ini-

inicial la intención de llegar a compuestos más activos, más selectivos, de es--

pectro antimicrobiano más amplio o con menores limitaciones de utilización, sino

que fueron el resultado de intentos de síntesis o de estudio de reactividad.

Los primeros intentos de modificación son simultheos al aislamiento y estu -

dio de las penicilinas naturales. La formación biosintética de penicilinas por -

el sistema de añadir sustancias al medio de cultivo ha permitido la síntesis de

un gran ntímero de análogos ; sin embargo, el m6todo no es de aplicación general y

tiene limitaciones en cuanto a la estructura del sustrato añadido, impuestas por

las especificaciones de la enzima o enzimas que intervienen en las reacciones de

activación y copulación.

El descubrimiento de la fenoximetilpenicilina (penicilina V), superior a la

bencilpenicilina en cuanto a estabilidad frente a ácidos, sirvió de poderoso es-

tímulo a las investigaciones dirigidas hacia la modificación de la porción -

6-acilámica.

ROC0.X

\

6

Durante algún tiempo, sin embargo, debido a las limitaciones del método - -

biosintético, los estudios se encaminaron hacia la conversión de penicilinas -

poseedoras de una funcionalidad reactiva en la cadena. Un ejemplo representati-

vo de este modo de hacer lo constituyen los derivados acilados, obtenidos por -

vía química, tomando como producto de partida la p-aminobencilpenicilina (penici -

lina T), obtenida por vía biosintética.

Durante este mismo período, SHEEHAN y sus col. que trabajaban en la sinte--

sis total de las penicilinas, anunciaron en 1958 la síntesis total del ácido -

6-aminopenicilánico y su posible utilidad como producto de partida para la prepa -

ración de nuevas penicilinas por acilación. El método, sin embargo, aunque abría

posibilidades hasta entonces inalcanzables, no era competitivo industrialmente.

ACID0 6-A1\ITNOPENICILANICO

Fueron BATCHELOR, DOYLE, NAYLER y ROLINSON, un año miis tarde, quienes resol -

vieron el problema al conseguir producir al ácido 6-aminopenicilánico por fermen -

tación, utilizando medios de cultivo a los que no se añadía precursores de la -

cadena lateral. Procediendo así, observaron la fonnación de una sustancia pareci -

da químicamente a la penicilina, pero prácticamente desprovista de actividad -

biológica. Su fenilacetilación por medios químicos condujo a un nuevo producto

-bencilpenicilina- con un dramático incremento en la actividad.

El aislamiento, purificación y estudio químico demostró terminantemente que

el producto resultante de la fermentación era el ácido 6-aminopenicilánico, que

7

fue llamado "ntícleo de la penicilina".

Actualmente son varios los caminos -que penniten llegar competitivamente al

ácido 6-aminopenicilhico:

1. Fermentación en condiciones similares a las de BATCHELOR y col.

2. Producción de una penicilina por fermentación y eliminación enzirrdtica poste-

rior de la cadena utilizando una penicilinasa adecuada. Este m6todo es actual -

mente el más conveniente. Para la separación de la cadena, se han empleado -

dos tipos de penicilinasas: uno de ellos, procedente de actinomycetes y de -

hongos, resulta especialmente adecuado cuando se emplean penicilinas con cade -

na alifática (pentil-, heptil- , fenoximetil-penicilinas, etc.) ; el otro, de -

origen bacteriana, acttía más eficazmente sobre bencilpenicilina.

3. Separación de la cadena por métodos químicos. El procedimiento más desarro--

llado -aunque su inter& es puramente académico- supone la protección del -

grupo carboxilo de la posición 3 en forma éster trimetilsilílico, la forma--

ción posterior de un iminokter en la cadena por tratamiento con pentacloruro

de fósforo y un alcohol, y la ruptura hidrolítica, en condiciones suficiente-

mente suaves para que no se afecte el anillo betalacthico, del compuesto re-

su1 tante :

X P

X = C1, OR, etc.

En estas condiciones tiene lugar simultáneamente la eliminación del grupo -

trimetilsililo.

8

La obtención del ácido 6-aminopenicilánico facilitó la síntesis de numero-

sas penicilinas, sin ninguna restricci6n en lo que respecta a naturaleza de la -

cadena, y sirvi6 de base a un amplio grupo de compuestos conocidos con el nombre

de "penicilinas semisintéticas". Todas ellas fueron el resultado de la acilación

del grupo amino, con el empleo de una gran diversidad de técnicas -basadas, fun -

damentalmente, en la química de péptidos- y de agentes de acilación (anhídridos

cloruros de ácido, cetonas, ácidos y carbodiimidas, etc.) . Además de derivados acilados, aprovechando la obtención del ácido 6-aminope -

nicilánico, se han preparado otros derivados de su grupo 6-amino, tales como -

ureas, tioureas, carbamatos, acilureas, imidas, sulfonamidas, fosfonil y tiono--

fosfonilamidas, etc,

A continuacih se presenta una serie de penicilinas que se sintetizan a -

partir del ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) .

1. Bencilpenicilina

2. Trifenilmetilpenicilina

3. Meticilina .. 4. Oxaciclina

5. Nafcilina

6. Difenicilina

7. Quinacilina

G E N E R A L I D A D E S

9

Nombre Quhico :

Acido 6-amino-! 3,3-D&til-7 Oxo-4 tia-1-Azabiciclo (3.2.0.) heptano-2 car-

boxilico.

F6rmula desarrollada:

C8,Hl2N2O3S Peso molecular 216.3

Su estructura presenta los anillos tiazol y betalactama.

Descripción:

El ácido 6-aminopenicilánico, se presenta como un polvo microcristalino, de -

color blanco o blanco rosado de olor característico.

Se descompone a 209-210OC.

Tiene una rotación específica [d ]il + 273O, en ácido clorhídrico O. 1N y a -

una concentración de 1.2%.

No debe contener más de 0.1% de agua (K. F.)

Su pérdida al secado 6OoC y al vacío no debe ser mayor del O. 2%.

El Acido 6-aminopenicilánico, no presenta actividad antimicrobiana.

10

METODOS UTILIZADOS PARA LA VALORACION DEL

ACID0 6-AMINOPENICILANICO.

METODO YODOMETRIC0 , I) . Existen dos formas en que la química del yodo puede utilizarse en titulacio -

nes de oxidorreducción. Una de estas implica el empleo de yodo en forma directa

como oxidante: en la otra forma, el yodo se emplea como reductor, el yodo libe-.

rad0 en la reacción generalmente se titula en medio ligeramente ácido o neutro

con solución valorada de un reductor como el tiosulfato de sodio. Estas técni--

cas se clasifican como métodos yodométricos.

Los métodos yodométricos dependen de la oxidación de yoduro a yodo y la -

titulación del yodo liberado con una solución valorada de un agente reductor. -

El tiosulfato de sodio es el reductor más conunmente utilizado.

Dado que el oxidante siempre reacciona con un razonable exceso de yoduro,

generalmente yoduro de potasio, la posterior titulación del yodo liberado ocu-

rre en presencia de ión yoduro.

La hidrólisis de yodo .en la reacción

I 2 + OH- - HOI + I-

se torna significativa a un pH de aproximadamente 8. Esto generalmente es de -

poca importancia cuando las titulaciones yodométricas se efecttían a este pH, -

ya que el yodo agregado comd titulante reacciona de inmediato con el reductor -

en solución. Sin embargo, en las operaciones yodométricas, la liberación de yo-

do a este pH provoca una apreciable hidrólisis: la reacción entre tiosulfato e

hipoyodito es

4HOI + S20t' + 7H20 < 2SOi- + 41- + 6H20+

la cual ocasiona un alejamiento de la estequiometría esperada para la reacción

yodo-tiosulfato. A fin de evitar esta dificultad, las titulaciones de yodo y -

tiosulfato de sodio suelen efectuarse en soluciones con un valor de pH inferior

a 6.

11

Este método se basa en l a apertura , por h idról is is (a lcal ina o enzimática)

del anillo betalactama, y l a posterior reacción del ácid0 penici loico l iberado

con iodo.

Es necesario correr un blanco paralelamente , porque en e l t r a b a j o o r i g i - -

n a l , se observó un ba jo consumo de iodo, durante e l periodo de reacción de l a -

muestra, debido a una gradual degradación de l a molécula.

La degradación de l a molécula se controla hasta c ierto punto, gracias a l -

uso de solución buffer. I

12

S / \ ,(CH3)*

A HN-CH-CH C

C- N CH -C0,2H Np OH """"_ -

A C I D 0 6 A M I N O P E N l C l L A N l C O

S /. \ /

HN -CH- CH C (CH 3) 2 I I N+ SOc NH - CH - C02H A

P E N I C I L O A T O S O D I C 0

KIS I2 ----------L K13

13 """"" Kt+ I 3-

IS \ """"- 2L I-+ I 2

S / \ / (CH

2 HN - CH2-7H C I NH - CH - C02H

A C I D 0 P E N O L O I C O -

13

METODOS COLORIMETRICOS PARA LA

VALORAC ION DE AC . 6 -MIINOPEN IC ILAN ICO.

La espectrometría visible consiste en la determinación de la capacidad de

absorción por un sistema químico de las radiaciones del espectro electromag

nético correspondientes al intervalo visible, esto es, de 380 a 750 m.

Los sistemas químicos que absorben este tipo de radiación son coloreados

y ahí que a esta técnica analítica se le haya dado también el nombre de colo-

rimetría o análisis colorimétrico.

En el procedimiento analítico cabe distinguir tres pasos:

1. Preparación de la solución coloreada adecuada.

2. Yedición de la capacidad de absorción de la luz de la solución.

3. Cálculo de la concentración de la especia coloreada presente.

En el análisis colorimétrico generalmente hay que proceder a un paso pre-

vio de formación de alguna especie compleja intensamente coloreada.

Este estadio de formación de color, en el que se añade a la solución pro-

blema un reactivo adecuado, implica una reacción química y, como tal, está su-

jeta a la influencia de todos los equilibrios concurrentes.

La absorbancia de la solución coloreada anteriormente preparada se mide -

con un forómetro de filtros o un espectrofotómetro.

Los métodos colorimétricos se aplican a la determinación de metales, no -

metales o compuestos orgánicos en una variedad de muestras casi ilimitada. Se

utilizan extensamente en los campos de la medicina clínica, del análisis de -

grasas, abonos, alimentos, jabones y detergentes, del análisis de aguas , de -

metales y de minerales.

Sus mayores ventajas son: una relativa sencillez y una precisión acepta--

ble cuando se trata de los componentes de las nuestras. Con instrumentación mo -

derna y un calibrado adecuado, los errores globales en la mayoría de las apli-

caciones se mantienen dentro del intervalo de + - 1-2 %.

14

METODO DE FORMACION DE ACID0 I-IIDlXl~lICO~ (bETOlXl 11).

Los derivados de. ácidos carboxílicos, cloruros, anhídridos, &teres y ami-

das foman con hidroxilamina en solución, ácidos hidroxámicos, que pueden exis-

tir en dos formas tautómeras: hidroxi-oximas y N-hidroxi-amidas:

G C - NOH R-C- NHOH I - L I1 OH O

Los ácidos hidroxámicos forman complejos coloridos con sales férricas en -

solución: esta reacción colorida se debe al grupo CO.NHOH, el cual está presen-

te en todos los ácidos hidroxámicos y reacciona con el iÓn férrico formando sa-

les conplej as, de fórmula estructural

Fe [R.CO(NH0)I3

Los ácidos carboxílicos no pueden convertirse directamente en ácidos hidro -

xámicos. Debe formarse primero el cloruro de ácido y luego el ácido hidroxámico

por tratamiento con hidroxilamina y álcali.

RCOCl + NH20H + NaOH - - - - - - - - -% RCO (NHOH) + NaCl + H20

3 RCO (NHOH)'+ FeC13 - - - - - - - - - - x Fe [R.CO(NH0)I3

Los anhídridos, lactonas y &teres, se comportan de igual manera.

Las aminas reaccionan más lentamente con la hidroxilamina, que los otros

derivados carboxílicos.

Una aplicación de gran importancia, las tenemos en las penicilinas, las -

cuales reaccionan por su función lactama.

A continuación se ilhtran los mecanismos de reacción:

15

S I \

HN-CH-CH C " (CH& 2 I

A C I D 0 6 A M I N O P E N l C l L A N l C O

C /

2 + I HN-CH-CH C- (CH&

I I HN-C- N- CH- C02H HO :O *

2 I c" ,L.* . .

/ \ HN- CH-CH C ' (CH31 2 1 I

C :N - CH- C02H // ..

O' NH,OH

/ \ S -R -

2 ' HN-CH-CH C - (CH& ' I '. I I

NH-C- C02H '\

R-C - NH

O 0

:: \ \ J

H I D R O X A M A T O F E R R I C 0

17

EETODO DE DETERMINAC ION DEL GRUPO MINO (hmOD0 111) . Una gran cantidad de sustancias, con el grupo NHz son capaces de condensar -

se con compuestos carbonílicos, obteniéndose productos del tipo C=N- y agua.

Estas reacciones usualmente requieren de catálisis ácidas :

C=o + RNH2 C=N-R + H 2 0

El grado máximo de la reacción está intimamente ligado con el pH.

Es posible entender esta reacción considerando el posible equilibrio en -

el que se encuentran RNH y el compuesto carbonílico.

R R NH2R

R A k m C=OH+ + :NH-R " C

El método expuesto se basa en la determinación del grupo amino, por reac-

ción con el p-Dimetilaminobenzaldehido, obteniendose un producto de condensa--

ción cuyo color puede determinarse espectrofotométricamente.

R-NH2 + R-CH=O lW=CHR

donde: R = alkil o aril.

18

+CH- ! I I I

CH -R -

CH COgH c - N- L

63 I

CH3 CH3 /N\

H2 I H2 H I I R-N-CH-O R-N- C-O

I

@ I - I

N / \

H3 CH3 J J

19

OH

R-NH-CH

I

/ N\ CH3 CH3

R-N -CH I

I

/ \

(9 N

CH3 CH3

I

I

I

!

20

VALORACION DE ACID0 6-AMINOPENICILANICO

POR EL " T O D O YODOMETRICO . (METODO I)

I

21

MATERIAL:

Balanza analítica

Matraces aforados de 100 m1

Matraces yodométricos de 150 ml

Pipetas volumétricas de 2 m1 y 10 m1

Bureta de 150 m1

Pinzas para bureta

Soporte

Espátula

REACT NOS :

Fosfato de potasio monoblísico

Fosfato de potasio dibásico trihidratado

Hidróxido de sodio

Acido clorhídrico

Tiosulfato de sodio 0.01 N

Iodo 0.01 N

Almidón

22

Balanza analítica digital que se utilizó para pesar

las muestra y el standard de referencia.

Potenciometro utilizado para preparar soluciones.

23

soLucIoNEs :

1.- Solución buffer de fosfatos pH = 6. Disolver 8g dr fosfato de potasio mono-

básico y zg de fosfato de potasio dibásico trihidratado, en un POCO de agua

I I dest i lada y aforar a 1000 ml. 2. - Solución lN de hidróxido de sodio.

3. - Solución 1N de ácido clorhídrico.

4 . - Solución 0.OlN de t i o s u l f a t o de sodio.

5. - Solución O . 01N de Iodo.

6. - Solución de almidón (indicador) ; un gramo de almidón soluble, en 10 m1 . de 1

agua c a l i e n t e , d i l u i r después a 100 m l . I

PROCEDIMIENTO:

Pesar 100 mg de muestra y disolver con solución buffer de fosfatos pH = 6

en un matraz aforado de 100 nit y l levar a volumen.

De ésta solución se toman 2 ml y se llevan a un matraz de 150 m1 con ta-

pón esmerilado, se agregan 2 m1 de solución 1N de NaOH, se tapa e l matraz se r

agita bién y se deja reposar 15 m i n .

Después de este tiempo, se agregan 2 .4 ml de soluci6n 1N de HC1, e inme--

diatamente 10 m1 de soluci6n O . 01N de Iodo, se agita bién y se deja reposar en

l a oscuridad 15 m i n después de los cuales se t i t u l a con l a solución de t i o s u l - -

fa to de sodio O . O l N , en presencia de almidón.

Blanco de muestra: a otros 2 ml de l a solución de l a muestra, se agregan -

10 m1 de solución 0.01N de Iodo y s e t i t u l a de inmediato con l a solución de -

t iosulfato .

En l a misma forma se analiza ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) standard

de referencia.

24

CALCULOS.

Para los cá lculos se u t i l i 2 6 la siguiente f6nnula:

(v - vt ) x 100 x c % =

( S - S ' ) x m

donde :

% = porciento de l a muestra analizada

v = m1 gastados de t i o s u l f a t o de sodio 0.01N anpleados para

t i t u l a r e l blanco de l a muestra.

v t = m1 gastados de t i o s u l f a t o de sodio O.OlN, empleados para

t i t u l a r l a muestra.

S = m1 gastados de t i o s u l f a t o de sodio O.OlN, empleados para

t i t u l a r e l blanco del standard de referencia.

S ' = m1 gastados de t i o s u l f a t o de sodio O.OlN, enpleados para

t i t u l a r e l standard de referancia.

C = % de l a sustancia de referencia.

m = mg de muestra empleados (en 2 m1 de solución).

25

FIG. 1-1

En la fig. 1-1 se aprecian las muestras inactivadas listas para titulación

26

I

FIG. 1-2

La fig. I - ? nos muestra el inicio de la titulación en presencia de

almidón (indicador) .

27

FIG. 1-3

En esta figura se observa el vire de color al tkrmino de la titulación.

28

RESULTADOS:

La tabla I (A) nos muestra los ml de tiosulfato de sodio 0.OlN empleados

para titular las muestras (V') y el standard de referencia, analizados simultá -

neamente (S').

Además, de 'los riil empleados en la titulaci6n de blanco de muestra (V) y

standard de referencia (S).

Así mismo, contiene el % (Y) de la muestra analizada.

Las muestras se analizaron 10 veces cada una y el standard de referencia

40 veces. I

TACIA I (A)

Lote No.

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

v 10.5

10.7

11. o

10.8

10.7

10.8

10.8

10.8

10.7

10.8

10.8

10.8

10.8

10.8

10.8

10.7

10.6

10.7

10.7

V'

10.7

10.6

10.7

10.7

10.7

10.7

10.8

10.7

10.7

10.7

10.8

10.7

10.7

10.8

10.7

10.7

10.8

10.8

11. o

10.8

S

9.6

9.8

9.8

9.8

9.8

9.8

9.7

9.8

9.8

9.8

9.7

9.8

9.8

9.8

9.7

9.8

9.7

9.7

9.8

S'

3.6

3.4

3.3

3.3

3. O

3.1

3.1

3.1

3. o

3.1

3.1

3.1

3.0

3.1

3.1

3.1

3.2

3.0

3.1

3.1

% de la muestra

-1.616

O. 8079

2.424

O. 8079

o. o

O. 7440

0.0

O. 7440

o. o

O. 7440

0.0

O. 7440

O. 7298

0.0

O. 7298

o. o

-1.5037

-0.752

-2.2556

o. o

4

30

d O O W I I

o o o c I I

o o o c o o o c

M N N N

M M M P r :

M M M N

M M M F ' :

M N M F ' :

M M M F ' :

N N 4 T -

M M M V

cob0303

m m a m c o 0 3 b c c

m m m o :

4 N M b 4 N M b 4 N M b 4 N M b

.... ". , I .-.- *... " ^ . ...

VALORACION DE ACID0 6-AMINOPENICILANICO

POR EL METODO DE FORMACION DE ACID0 HIDROXAMICO

(METODO 11)

31

32

MATERIAL :

Balanza anal it ica

Espátula

Matraces aforados de 100 ml

Pipetas volumetricas de 3 , 1 y 0.5 ml

Espectrofot6metro

Celdas de cuarzo

Tubos de ensaye

Gradilla

REACTIVOS :

Clorhidrato de hidroxilamina

Hidróxido de sodio

Acetato de sodio

Alcohol e t í l i c o a l 95%

Sul fa to f é r r i co amónico

Acido sulfúrico concentrado

Fosfato de potasio monobásico

Fosfato de potasio dibásico

. .. . . ". .

, 33

soLucIoNEs : 1.- Solución al 35% de clorhidrato de hidroxilamina.

2.- Solución buffer alcalino: disolver 173g de NaOH y 20g de acetato de sodio -

en agua destilada y llevar a un litro.

3. - Solución neutralizada de hidroxilamina: mezclar 10 ml de la solución de . - -

clorhidrato de hidroxilamina al 35% y 10 ml de la soluci6n buffer alcalino,

checar el pH y si es necesario ajustar a 7, por adición de pequeñas cantida -

des de los componentes. A 10 ml de la solución anterior añadir una mezcla --

preparada con 80 m1 de agua y 20 m1 de alcohol etílico al 95%, llevar a -

100 m1 con esta mezcla. ESTA SOLUCION SE DEBE PREPARAR DIARIAMENTE.

4. - Solución de sulfato férrico amónico: disolver 272g de sulfato férrico amó--

nico (dodecahidratado) , en una mezcla de 26 m1 de &ido sulfúrico concentra -

do y agua destilada, después aforar a 100 ml, mezclar bikn y dejar reposar,

filtrar si es necesario. Este reactivo se puede usar durante una semana si

se mantiene en un frasco oscuro, a temperatura ambiente.

5.- Solución buffer de fosfatos pH=6: disolver 8g de fosfato de potasio monobá-

sic0 y 2g de fosfato dibásico, en agua destilada y aforar a 1000 ml.

PFUICEDIMIENTO:

Pesar 60 mg de muestra, disolver en solución buffer de fosfatos pH=6, en -

un matraz aforado de 100 ml y llevar a volumen.

De ésta solución, tomar 3 ml, agregar 3 ml de agua destilada, 1.5 m1 de la

solución neutralizada de hidroxilamina, agitar bien y dejar reposar durante 5 -

minutos.

' Después añadir 1.5 m1 de la solución de sulfato férrico amónico, agitar -

bien y después de 3 minutos determinar la absorbancia a 480 nm usando como blan -

co agua destilada tratada en la misma forma que la muestra. Al mismo tiempo se

hace una determinación, con una sustancia de referencia. . . . x_ ". . . . . - - - """m".# . " . ~ ._. ." . .. .

34

CALCULOS :

Para los cálculos se utilizó la siguiente f ó m l a :

- . A C = Y A'

donde :

A = Absorbancia de la solución problema a 480 m.

A'= Absorbancia de la solución de referencia a 480 nm

C = % de la muestra de referencia

Y = % de la muestra problema.

35

RESULTADOS.

La tabla 1 1 - ( A ) nos muestra la absorbancia en m de los lotes.

La tabla 11-(B) indica las lecturas de absorbancia en nm del standard

de referencia.

En la tabla 11-(C) podemos apreciar el valor que toma cada una de las -

variables en la fórmula de cálculo, A = absorbancia da cada muestra, A' = ab-

sorbancia del standard de referencia (se tomo como valor para el cálculo la -

inedia c:le todas las lecturas) ; Y = porcentaje de las muestras ; J- C = porciento

ie 13 muestra de referencia.

En 13 tabla 1 1 - ( D ) se observa el porcentaje de cada lote.

!<OTA: las muestras Jc standard desarrollan color canela, mientras que las -

muestras problema desarrollan un ligerísimo color muy cercano al

blanco. A esto se deben las lecturas de absorbancia que muestran

36

rd

c, Q)

rll O

rl 7 l O

N O O

O

O O O O O

O O O O

m d O

m O O

b O

O O O O

O O O O

I

TABLA 11- (13)

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

Absorbancia

O. 342

O. 333

O. 320

O. 344

O. 341

O. 344

O. 333

O. 314

O. 346

O. 341

O. 344

O ..331

O. 312

O. 346

O. 341

O. 337

O. 335

O. 333

O. 331

0.357

O. 359

O. 357

O. 357

37

media standard = 0.339

38

d m d 00 m N N Ln O

Q)

O O O O I

m M M O

m M

m m M

M M M M

O O O

4 rl O O

N O O

O O

O O O

O O O O

t Ln O

d m O O

O O O S I O

,\o

d m N

O

rl

,\O

m d N

O

N

O O

O

,\o

03 Ln O

N

39

I

40

41

VALORACION DE ACID0 6-N*lINOPENICILANI~

POR EL ME"UD0 DE DETERMINACION DEL GRUPO AMINO.

(METODO 111)

42

MATERIAL:

Balanza analítica

Espátula

Matraces aforados de 50 m1

Pipetas volumetricas de 5 ml y 10 ml

Espectrofot6metro

Celdas de cuarzo

Tubos de ensaye

Gradilla

REACTIVOS :

Acido cítrico

Fosfato de sodio

Citrato de sodio

dibásico dihidratado

monohidratado

p-Dimetilaminobenzaldehído

Hidroquinona

Alcohol al 95%

43

soLucIoNEs : 1. - Solución buffer de pH = 2.5 : disolver 55.3g de ácido cítrico y 8.7g de fos-

fato de sodio dibásico dihidratado, en agua destilada y aforar a 1000 ml.

2. - Solución buffer de pH = 3: disolver 34.8g de ácido cítrico y 15.8g de fos-

fato de sodio dibásico dihidratado, en agua destilada y aforar a 1000 ml.

3. - Solución acuosa al O. 4% de citrato de sodio monohidratado.

4. - Solución de p-Dimetilaminobenzaldehído: disolver 0.584g de p-dimetilamino--

benzaldehído y 1 mg de hidroquinona (estabilizador) en 35 m1 de alcohol al

95%.

Después de disolver aforar con la solución (1) a 100 ml.

CONSERVAR ESTE REACTIVO EA FRASCO OSCURO. Esta solución es estable sólo por

dos días.

PROCEDIMIENTO:

Disolver 60 mg de muestra con la solución al O. 4% de citrato de sodio, afo -

rar a 100 ml. De la solución anterior tomar 5 ml y llevar a 50 m1 con la solución buffer

pH=3..

Tomar 5 ml de esta solución y llevar a, 10 m1 con la solución reactivo de - p-dimetilaminobenzaldehído. Agitar bien y dejar reaccionar durante 5 minutos.

Leer la absorbancia de la muestra a 415 nm usaildo como blanco una solución

preparada mezclando 5 m1 de la solución (2) y 5 m1 del reactivo p-dimetilamino-

benzaldehído . Proceder al mismo tiempo y en igual forma con una muestra de re-

ferencia.

44

A

. C = Y A'

donde :

A = Absorbancia de la solucih problema a 415 m.

A'= Absorbancia de la solución de referencia a 415 m.

C = % de la muestra de referencia.

Y = % de la muestra problema.

RESULTADOS.

La tabla 111-(A) nos muestra las lecturas de absorbancia de cada lote.

La tabla 111-(B) las lecturas de absorbancia del standard de referencia.

La tabla I11 - (C) nos da la relación de porcentajes de la muestra en cada

lote.

En este caso las muestras problema se analizaron tres veces cada una, -

mientras que el standard se anai-izó 36 veces, aquí también se tomó la -

media del standard para tomarlo como valor de A'.

En este método el color que desarrolla el standard es amarillo, las mues-

tras problema solo desarrollan un color ligeramente amarillo m y cercano

al blanco.

46 "-.

Y

U rl

d O O

O

VI O O

O

or) O O

O

m O O

O

d O O

O

In O O

O

\o O O

O

M O O

O

9 O

Ln b O

N O

O O

O O O

O O O O

J

y d

9

1 I

TAl3LA 111- (B)

Standard No.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

Absorbancia

O. 428

O. 438

O. 445

O. 446

O. 450

O. 449

O. 453

O. 442

O. 435

O. 414

O. 422

O. 431

O. 423

O. 424

O. 430

O. 439

O. 421

O. 430

O. 431

O. 421

O. 450

0.427

O. 418

O. 415

TABLA 111-(B) cont.

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

O. 441

O. 441

O. 442

O. 443

O. 433

O. 443

O. 445

O. 443

O. 435

O. 445

O. 432

O. 436

media del standard = 0.435

i

7

d

1

7

49

cd M

-

O

o\-

b Ln

M rl O

U

O. 8

O. 6

0.2,

O.

"

E E 0 -

(DETERWNACION DEL GRUPO AMINO 1

IDO 6-AMINOPENICILANICO (STANDAR)

.

\

."

n m.

J I 1

51

RESULTADOS DE PUNTO DE FUSION .

La primera prueba física que se realizó a las cuatro nuestras proporcionadas

fué punto de fusión, en un aparato Fischer como el que se nuestra en la fotogra-

fía.

FUNTO DE FUSION DE LOS LOTES DE 6-APA.

Lote 1

Lote 2

Lote 3

Lote 4

221 - 232OC

218 - 223OC

230 - 231OC

230 - 24OOC

St . de referencia 208 - 21OOC

Para llevar

ANAL IS IS ESTADIST IC0 DE RESULTADOS.

a cabo e l presente trabajo, se tomaron muestras de un lote de -

de ácido 6-aminopenicil$~nico con una preza del 99.7%, a partir de las cuales fue

ron hechas todas las determinaciones de los tres métodos expestos anteriormente.

-

h r a poder comparar los resultados obtenidos sa tomaron los primeros veinte

resultados de l a muestra de referencia de cada método, de las cuales se saco un

promedio por cada tknica aplicada.

Por otro lado, para observar l a dispersión de los valores obtenidos se calcu - 16 la variancia y la desviación standard.

También se calculó el coeficiente de variación y el ermr standard, todo es-

t o para cada método.

Los resultados se tabularon en l a Tabla R-(1).

E l objeto del análisis de resultados es comprobar por cual método se obtiene

10s resultados más exactos y en cual de ellos se obtiene la m i n i m a variación.

A continuación se presentan las fórmulas utilizadas para e l presente an&li--

s is es tadís tic0 . n

Varimcia : S = 2 i=l

n - 1

Desviación St . S = J 7

Co&. de Variación: cv = "(100) S

X

S

fi Error S t . E = -

TABLA R- (1) J

mTom I

% de muestra

90.36

96.38

97.89

97.89

102.4

100.9

99.4

100.9

102.4

100.9

99.4

100.9

102.4

100.9

99.4

100.9

97.89

100.9

100.9

100.9

x = 99.6955

S2= 7.5360997

S = 2.7451958

CV = 2.7535805

E = 0.6138444

~~

bETODO I1

% de muestra

101.4

98.7

94.88

102.00

101.1

102. o

98.7

93.1

102.8

101.1

102. o

98.14

92.51

102.8

101.1

99.92

99.33

98.7

98.14

105.85

- X = 99.7135

S2= 10.95894

S = 3.3104289

CV = 3.3199405

E = 0.7402344

t METODO I11

% de muestra

98.4

100.71

102.32

102.55

103.5

103.24

104.2

101.63 .

100.02

95.19

97.03

99.1

97.3

97.5

98.87

100.94

96.8

98.87

99.1

96.8

,

- X = 99.70365

S = 6.69758

S = 2.5879683

CY = 2.5956606

E = O. 5786873

2

--.I

3

1 t

-i

d

i 1 J

7 !

- 1 I d

54

-7 .A

DISCUSION DE RESULTADOS.

Las técnicas uti l izadas para l a valoración de ácido 6-aminopenicilánico, méto-

do ydométrico, Formación de ácido hidroxámico y Determinación de grupo amino, no -

I , son específicas para esta sustancia, s ino que se pueden aplicar a todas las penici- r "i

.J

/ - . ,

4 % I I. * ' ( f !,' . 1 ', i , I

' i

ferencia (&ido 6-aminopenicilánico con una preza del 99.7%), esto con e l o b j e t o - J

de cmparar l a exactitud entre las t k n i c a s aplicadas en l a valoración y comprobar -7 i u 4

cual de ellas es l a mejor para e l a n á l i s i s del k. 6-ApA, e l c u a l es una s u s t a x i a -7

de gran interes , ya que es e l p t o de partida para l a s í n t e s i s de las penici l inas I

semisintéticas. '4

d

Como pede observarse en l a Tabla R-(1) de a n á l i s i s e s t a d í s t i c o , e l método que

menor variación presenta es e l de Determinación de grupo amino (método 111) , ya que

su variancia presenta un valor menor que los otros dos métodos, es to nos indica que

los resultados obtenidos están muy proximos a su media, es d e c i r , que l a dispersión

de los datos es menor. Lo mismo se aprecia con e l coef i c iente de variación y e l -

ermr standard, por l o t a n t o , existe mayor homogeneidad en resultados obtenidos por

es ta t écn ica , lo que se traduce en mayor exactitud del método.

Con l o que respecta a l punto de fusión, se observa que los resultados obteni--

dos en los lo tes se a le jan mucho del valor reportado de p. f. para &ido 6-aminope-

n ic i lán ico , así como del standard de referencia, además de que los intervalos son -

muy grandes, en algunos de más de ocho grados.

d

7

J I

Y

d'

i 4

CONCLUS ICNES .

Debido a la importancia que actualmente tienen las penicilinas semisintéticas,

el presente trabajo tiene como objetivo, comprobar cual de los tres métodos utiliza

dos es el más exacto para la valoración del ácido 6-aminopenicilánico.

d

- -

-4

-9

De los resultados obtenidos con el standard de referencia se llegó a las - 4

siguientes conclusiones: - 1. - De los métodos químicos utilizados para la determinación del ácido 6-aminopeni- .d

-cilánico (6-APA), el Yodométrico aunque no es especifico para la valoración de

este ácido, ya que reacciona con las demás penicilinas existentes por medio de -_ la función lac tama, es el que más commnente se emplea, además de que se obtie-

nen buenos resultados, ya que el an6lisis estadístico nos muestra que el error L7

'1

4

c1

J

que hay en dicho método es pequeño, así como la dispersión con respecto a la - d

media.

En el método Yodométrico para lograr resultados precisos es importante proteger

las soluciones de yodo de la luz y asegurar tiempos de reacción idénticos para

el blanco y la muestra. - 'T 2. - El método de formación de ácido hidro$ámico, la reacción no es específica para ...A

análisis de ácido 6-aminopenicilánico, ya que la dan muchos ésteres, anhídridos -T

y midas que también pueden reaccionar con aldehídos Ó cetonas dando oximas, -

los cuales forman complejos coloridos estables con el ión férrico.

Con respecto al análisis estadístico se observa que éste método presenta un -

1

111

-1

4

4

7

4

" I

error mayor que el método yodométrico, lo mismo sucede en l a dispersión con res -.1 - pecto a la media. c-.

+

3. - El método de Determinación de grupo amino, que también es un método colorimétri- '"1

co, tampoco es un método específico para la valoración de 6-APA, ya que cual-,-

quier compuesto con un grupo -NH2 es capaz de formar productos de condensación

coloridos con el p-dimetilaminobenzaldehido.

4

-1

Este método colorimétrico presenta un valor de error más pequefio, así como la - *1

' d

56 d

4

dispersión con respecto a la media que los métodos anteriores. Y

Por lo tanto, se concluye que de los métodos expuestos anteriormente el más d

exacto es el 111, Determinación de grupo amino, para el control analftico de ácido

6-aminopenicilánico, como lo demuestra el análisis estadístico. \-.

.-.1

1

1 !

.d

REsmm.

Primeramente se procedio a recopilar _. la bib lliografia necesaria para reali-

zar el presente trabajo, una vez investigadas las técnicas de dlisis para -

6-APA y teniendo los reactivos necesarios (además del standard de referencia),

se paso a la parte práctica, la cual consistió en la valoración de los cuatro -

lotes proporcionados por la planta piloto de Tecnología,Farmacéutica, por medio

de las tres técnicas descritas anteriormente.

METODO I , YODaMETRICO que se basa en la apertura, por hidrólisis alcalina del anillo beta-lactama y la posterior reacción del ácido peniciloico. Despues de -

la hidrólisis el producto obtenido se hace reaccionar con una solución de yodo,

y más tarde se efectúa en medio ácido una titulación residual con una solución

de tiosulfato de sodio para determinar la cantidad de yodo consumido.

METODO 11, FOl?hlACION DE ACID0 HIIROXAMICO. Fbr medio de l a reacción entre el -

6-APA y la hidroxilamina para dar el ác. hidroxámico, el cual reacciona con el

cloruro férrico formando un complejo coloreado. Una aplicación de gran importan

cia, la tenemos en las penicilinas las cuales reaccionan por la función lactama

METODO 111, DETERMINACION DE GRUPO AMINO. Se determina por reacción con el p-di

metilaminobenzaldehído, obteniendose un producto de condensación cuyo color pue

de determinarse espectrofotométricamente.

-

-

-

1.

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"

4

-9 I

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. . . ." ".- . " . . ~ - I " - " .

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