TecnicBasicas Colif Tot Fecales Ecoli NMP 6529

Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.

Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD). Facultad de Química, UNAM

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Método para la determinación de bacterias coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli por la técnica de diluciones en tubo

múltiple (Número más Probable o NMP)

OBJETIVOS • Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos

coliformes fecales. • Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante la

búsqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli.

• Organizar e interpretar los resultados. GENERALIDADES Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral utilizando como vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que funcione como indicador de contaminación fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de los patógenos intestinales y debe de ser capaces de desarrollarse extraintestinalmente. El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, sin embargo, las características de sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse fuera del intestino también se observan en aguas potables, por lo que el grupo coliforme se utiliza como indicador de contaminación fecal en agua; conforme mayor sea el número de coliformes en agua, mayor será la probabilidad de estar frente a una contaminación reciente. Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el agua. En productos alimenticios que han recibido un tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción, etc.), se utilizan como indicadores de malas prácticas sanitarias. Los microorganismos coliformes constituyen un grupo heterogéneo con hábitat primordialmente intestinal para la mayoría de las especies que involucra. El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gram-negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. Este



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grupo esta conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella. El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h. de incubación a 44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la más prominente es Escherichia coli. La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivo líquidos y sólidos con características selectivas y diferenciales. Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia Enterobacteriaceae (bacterias entéricas), existe como comensal en el intestino delgado de humanos y animales. Sin embargo, hay algunas cepas de E. coli patógenas que provocan enfermedades diarreicas. Estas E. coli se clasifican con base en las características que presentan sus factores de virulencia únicos, cada grupo provoca la enfermedad por un mecanismo diferente. Las propiedades de adherencia a las células epiteliales de los intestinos grueso y delgado son codificadas por genes situados en plásmidos. De manera similar las toxinas son mediadas por plásmidos o fagos. Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) E. coli enteroadherente difusa (DAEC). Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras están implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos contaminados. Escherichia coli enterotoxigénica ETEC es reconocida como el agente causal de la diarrea del viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin fiebre. Este tipo de infecciones es muy frecuente en países subdesarrollados y afecta principalmente a los niños. Patogénesis: El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina. Una toxina termolábil de aproximadamente 89 kDa cuya secuencia, antigenicidad y función es similar a la toxina del cólera, la otra toxina que produce es termoestable y es de bajo peso molecular (4 kDa) y es capaz de resistir temperaturas de ebullición hasta por 30 minutos. La infección puede ser adquirida por el consumo de alimentos como vegetales frescos (lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido calculada en aproximadamente 108 bacterias, por otra parte en jóvenes y ancianos la dosis infectiva puede ser más baja.



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Escherichia coli enteropatógena ECEP. Es causa importante de diarrea en los lactantes particularmente en los países en vías de desarrollo. La ECEP se adhiere a las células de la mucosa del intestino delgado. Sus factores de virulencia favorecen la adhesión y en ocasiones penetra a las células mucosas. La infección por ECEP provoca diarrea acuosa generalmente autolimitada aunque en ocasiones puede ser crónica. Patogénesis. El microorganismo produce dos proteínas: la intimina que es codificada por el gen eae y un factor de adherencia que es codificado por un plásmido, ambas proteínas permite su unión a los enterocitos y la destrucción de las microvellosidades intestinales. Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua contaminada y productos cárnicos. En estudios con voluntarios se encontró que la dosis infectiva es de 106 microorganismos. La diarrea por ECEP se ha vinculado con múltiples serotipos específicos de E. coli los cuales pueden ser identificados mediante la tipificación del antígeno O (somático) y en ocasiones del antígeno H (flagelar). Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra estrechamente relacionado con el género Shigella, produce una enfermedad similar a la shigelosis. La enfermedad se presenta comúnmente en niños de países subdesarrollados y en personas que viajan a dichos lugares. La EIEC provoca la enfermedad (diarrea disentérica invasiva) al invadir las células epiteliales de la mucosa intestinal. A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a 100 microorganismos, en el caso de EIEC la dosis infectiva es de aproximadamente 106 bacterias. Algunas características importantes de este microorganismo que permiten diferenciarlo de la cepa típica de E. coli son: No utiliza la lactosa como fuente de carbono, no descarboxilan la lisina, es inmóvil y anaerogenicos. La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y destruir el epitelio del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en los fagolisosomas. Escherichia coli enterohemorrágica EHEC produce verotoxina, denominada así por su efecto citotóxico sobre las células Vero, una línea de células renales de monoverde africano. Existen al menos dos variantes antigénicas de la toxina. La ECEH se ha asociado con colitis hemorrágica, una variedad grave de diarrea; y con el síndrome urémico hemolítico, enfermedad capaz de producir insuficiencia renal aguda, anemia hemolítica microangiopática y trombocitopenia. La verotoxina tiene muchas propiedades similares a la toxina shiga producida por algunas cepas de Shigella dysenteriae tippo 1; De los serotipos de E. coli que producen la verotoxina el más común y el único que puede identificarse en muestras clínicas es el O157:H7. La E. coli O157:H7 no emplea sorbitol y es negativa a la prueba de MUG.



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La causa más común de esta infección es el consumo de carne sin cocinar o poco cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los casos de colitis hemorrágica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse mediante la cocción completa de la carne En la siguiente tabla se resumen algunas propiedades y síntomas causados por las cepas de Escherichia coli antes descritas.

Propiedades y síntomas causados por algunas cepas de Escherichia coli patógenas

ETEC EPEC EHEC EIEC Toxina

Lábil/estable - Shiga o vero -

Invasiva

- - - +

Intiminas

- + + -

Enterohemolisina

- - + -

Aspecto de las heces

Aguadas Aguadas sanguinolentas

Aguadas muy sanguinolentas

Mucoides y sanguinolentas

Presencia de leucocitos en heces

- - - +

Fiebre

baja + - +

Intestino involucrado

Delgado

Delgado

Colon

Colon y parte baja del delgado

Dosis infectiva Alta Alta baja Alta Serotipos varios O26, O111 y

otros O157:H7, O26, O111 y otros

Varios

FUNDAMENTO La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del Número más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a 35°C ± 1°C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa. En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se



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encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. La determinación del número más probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 ± 0.1°C por un periodo de 24 a 48 h. La búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioquímicas básicas (IMViC) a las colonias típicas. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 1. Para análisis de agua Para la preparación del medio de cultivo utilizado en la prueba presuntiva de muestras de agua o hielo, consultar el cuadro 1. • 5 ó 10 tubos de 22 x 175 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio o

caldo lactosado concentración doble o triple con campana de Durhama. • 5 ó 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con

campana de Durhamb. • 5 ó 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC y campana de Durham

o caldo EC MUG con campana de Durham b. • 2 cajas Petri con agar para métodos estándar d • 2 cajas Petri con agar Eosina azul de metileno c • 6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe • 3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIM (opcional)e • 3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de caldo citrato de Koser o citrato de

Simmons (opcional)e 2. Para análisis de alimentos • 1 matraz de 250 mL con 90.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solución

amortiguadora de fosfatosa • 2 tubos de 16 x 150 mm con 9.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solución

amortiguadora de fosfatosa



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• 15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio concentración sencilla o caldo lactosado concentración sencilla con campana de Durhama

• 15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con campana de Durhamb.

• 15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC o EC-MUG con campana de Durhamb.

• 2 cajas Petri con agar para métodos estándard • 2 cajas Petri con agar Mac Conkeyc • 6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe • 3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIMe • 3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de citrato de Simmons, o caldo citrato de

Kosere SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES • Frascos gotero con reactivo de Erlich o Kovace • Frascos gotero con indicador rojo de metiloe • Frascos gotero con reactivo alfa naftol VP1e • Frascos gotero con solución de hidróxido de potasio al 40 % VP2e • COLORANTES PARA TINCIÓN DE GRAMd MATERIAL Y EQUIPO • Mechero, a,b,c,d,e. • Propipetaa. • Gradillaa,b,c,e. • Balanza granatariaa. • Stomachera • Bolsas para stomacher . • Lámpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366 nm)c • Lentes de seguridadc • Pipetas de 10.0 mL estériles con tapón de algodóna. • Pipetas de 1.0 mL estériles con tapón de algodóna. • Pipetas Pasteur estériles a, b, c, d • Asa bacteriológicab,c,d,e • Portaobjetosd • Microscopio ópticod • Termómetro calibradob • Baño de agua a 44.5° ± 0,1°C.b • Incubadora a 35° ± 2,0ºCa. • Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180°Ca • Autoclavea



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NOTAS a Material necesario al inicio de la práctica. b Material necesario a las 48 h. de iniciada la práctica. c Material necesario a las 96 h. de iniciada la práctica. d Material necesario a las 120 h. de iniciada la práctica. e Material necesario a las 144 h. de iniciada la práctica.



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2 a 3 asadas/tubo 2 a 3 asadas/tubo

37°C

24 - 48 h

37°C

24 – 48 h

44.5°C

24 – 48 h

Tubos con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio (CLSS) triple concentración (3X) CLSS + 20.0 mL de muestra

Siembra con asa bacteriológica de los tubos positivos (producción de gas) en caldo lactosa verde brillante bilis 2% y caldo EC

Tubos con 10.0 mL de Caldo Lactosa verde brillante bilis 2%

Lectura de tubos positivos en tablas. NMP de coliformes totales /100 ml de muestra

Tubos con 10.0 mL de Caldo EC o EC-MUG

Lectura de tubos positivos en tablas. NMP de coliformes fecales /100 ml de muestra.

Siembra de tubos positivos en placas de Agar EMB para la búsqueda de Escherichia coli

DETERMINACIÓN DEL NMP DE COLIFORMES EN AGUA Y HIELO POTABLES



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Pesar 10.0 g de muestra Homogenizar la muestra Realizar 2 diluciones decimales más en en condiciones de asepsia con 90.0 mL de solución diluyente tubos con 9.0 mL de solución diluyente

10-1 10-2 10-3

10-1 10-2 10-3 10-1 10-2 10-3

10-1 10-2 10-1 10-2 10-1 10-2 10-1 10-2

1.0 mL 1.0 mL

35°C

24 - 48 h

35°C

24 - 48 h

44.5°C

24 - 48 h

Sembrar por triplicado cada dilución en tubos de caldo lauril sulfato de sodio (1X)

Lectura de tubos positivos en tablas. NMP de coliformes totales /g de muestra

Lectura de tubos positivos en tablas. NMP de coliformes fecales /g de muestra. Siembra de tubos positivos en agar Mac Conkey para búsqueda de Escherichia coli

Tubos con 10.0 mL de CLSS concentración sencilla (1X) + 1.0 mL de muestra

Siembra con asa bacteriológica de los tubos positivos (producción de gas) en caldo lactosa verde brillante bilis 2% y caldo EC

Tubos con 10.0 mL de Caldo Lactosa verde brillante bilis 2%

Tubos con 10.0 mL de Caldo EC o EC-MUG

DETERMINACIÓN DEL NMP DE COLIFORMES EN MUESTRAS SÓLIDAS O ALIMENTOS



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PROCEDIMIENTO 1. Agua y hielo 1.1 Prueba presuntiva • Agitar la muestra y transferir volúmenes de acuerdo con el cuadro 1, a cada uno de

los tubos con caldo lauril sulfato de sodio que se hayan seleccionado. Agitar los tubos para homogeneizar la muestra.

CUADRO 1. Preparación de inóculo con caldo lauril sulfato de sodio

INOCULO (mL)

CANTIDAD DE MEDIO POR TUBO (mL)

VOLUMEN DE MEDIO MAS INOCULO (mL)

CALDO LAURIL TRIPTOSA REQUERIDO g/L

CONCENTRACIÓN

1 10 o más 11 o más 35,6 1 X

10 10 20 71,2 2 X

10 20 30 53,4 1.5 X

20 10 30 106,8 3 X

100 50 150 106,8 3 X

100 35 135 137,1 3.5 X

100 20 120 213,6 4 X

• Incubar los tubos a 35 ± 0,5°C. Examinar los tubos a las 24 h. y observar si hay

formación de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se observa producción de gas, incubar 24 h. más.

1.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales • Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba

presuntiva, a otro tubo de 16 x150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana de Durham.

• Agitar los tubos para su homogeneización.

• Incubar a 35 ± 2°C durante 24 a 48 h..



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• Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento) y producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h..

• Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más probable de organismos coliformes totales/100 mL.

1.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales. • Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba

presuntiva (caldo lauril sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC conteniendo campana de Durham.

• Agitar los tubos para su homogeneización. • Incubar a 44.5 ± 0.1°C en incubadora o un baño de agua durante 24 a 48 h. • Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y

producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h. • Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más probable de

organismos coliformes fecales/ 100 mL. Control de calidad 1. Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras. 1.4 Prueba confirmativa para Escherichia coli • Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos en caldo EC y sembrar por

estría cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento. • Incubar las placas invertidas a 35°C por 18-24 h. • Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfología colonial:

Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metálico. Si no hay colonias con morfología típica, probar una o más colonias lo más parecido E. coli de cada placa y sembrarlas en agar cuenta estándar para realizar las pruebas de morfología microscópica y pruebas bioquímicas.

• Incubar las placas a 35°C por 18-24 h. • Hacer un frotis y teñirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos

cortos o cocobacilos Gram-negativos.



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1.4.1 Identificación bioquímica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC). a. Producción de indol (I) • Inocular un tubo en caldo triptona e incubarlo a 35°C por 24 ± 2 h. • Adicionar entre 0.2 y 0.3 mL de reactivo de Kovacs. • La presencia de una coloración roja en la superficie del tubo se considera una

prueba positiva. b. Producción de ácidos mixtos (Rojo de metilo, RM) • Inocular un tubo adicional con caldo RM-VP e incubar a 35°C por 48 ± 2 h. • Adicionar 5 gotas de solución de rojo de metilo. • Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color

amarillo es una prueba negativa. c. Producción de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP) • Inocular un tubo con caldo RM-VP e incubar a 35°C por 48 ± 2 h. • Adicionar 0.6 mL de solución VP1 y 0.2 mL de solución VP2 y agitar. • Dejar reposar durante 10 minutos sin agitar el tubo; se considera una prueba

positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie. d. Utilización del citrato (C) • Inocular un tubo con caldo citrato de Koser o Simmons un inóculo ligero para evitar

turbiedad en el tubo (opcional: puede utilizarse citrato de Simmons) • Incubar a 35°C por 96 h. • El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad del medio, se considera una

prueba positiva. NOTAS Para determinar la producción de indol, en lugar del caldo triptona puede utilizarse al agar SIM. Este medio se inocula por picadura con el asa bacterioogíca de forma recta.



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Se incuba a 35°C por 24± 2 h. Finalizado el periodo de incubación se adiciona el reactivo de Kovac o Erlich cuyo fundamento es el mismo. Para determinar la utilización del citrato de sodio como única fuente de carbono, también se puede utilizar el agar citrato de Simmons en forma inclinada, el cual se inocula en la superficie (pico de flauta). Se incuba a 35°C de 24 a 48 h. La presencia de una coloración azul debida al vire del indicador que contiene el medio, indica prueba positiva

1.4.2 Prueba confirmativa opcional para Escherichia coli utilizando caldo EC-MUG (4 metil-umbeliferil-ββββ-D-glucuronido)

FUNDAMENTO Alrededor del 94% de las cepas de Escherichia coli incluso las cepas no productoras de gas producen la enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato específico 4-metilumbeliferil-beta-D-glucurónido (MUG) en 4-metilumbeliferona (MU); el cual al ser expuesto a una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una fluorescencia azul fácil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se puede identificar Escherichia coli. a. Prueba confirmativa • A partir de la fase presuntiva (inciso 1.1.) y de cada tubo que muestre formación de

gas , tomar una asada y sembrar en un número igual de tubos con medio de confirmación EC-MUG.

• Incubar a 44,5 ± 0,2°C en baño de agua durante 24 h., observar si hay formación de

gas; si no se observa la formación de gas continuar la incubación 24 h. más. • Irradiar los tubos con una fuente de luz UV, observar fluorescencia y hacer la

lectura. • Utilizar estos resultados para calcular el número más probable (NMP) de E. coli.

Control de calidad Inocular en dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli como control positivo y K. pneumoniae como control negativo.



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2. Alimentos 2.1 Preparación de la muestra. • Moler 10.0 gramos de la muestra en un picador 2 veces o con cubiertos estériles y

mezclar. • Adicionar el alimento a 90.0 mL de agua peptonada al 0.1 %, licuar y dejar en

reposo de 2-3 minutos. • Realizar diluciones hasta 10- 3 g/mL con agua peptonada al 0.1 %. En caso de

trabajar con muestras congeladas, descongelarlas previamente entre 2° y 5 ° C. 2.1.1 Prueba presuntiva. • Añadir 1.0 mL de la dilución 10- 1 g/mL a cada uno de 3 tubos con 10.0 mL de caldo

lauril sulfato de sodio. • Añadir 1.0 mL de las diluciones 10- 2 g/mL y 10- 3 g/mL a dos series de 3 tubos cada

una con caldo lauril sulfato de sodio. • Incubar a 35-37°C durante 24-48 h. • Los tubos después de la incubación, se registrarán como positivos si presentan

crecimiento y producción de gas. 2.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales • Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba

presuntiva a otro tubo de 16 x 150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana de Durham.

• Agitar los tubos para su homogeneización. • Incubar a 35 ± 2°C durante 24 a 48 h. • Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe crecimiento y

producción de gas, después de un período de incubación de 24 a 48 h. • Consultar las tablas de NMP que se encuentran en el anexo para conocer el

número más probable de organismos coliformes totales por mL. 2.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.



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• Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva (caldo lauril sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC conteniendo campana de Durham.

• Agitar los tubos para su homogeneización. • Incubar a 44.5 ± 0.1°C en incubadora o un baño de agua durante 24 a 48 h. • Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe turbidez y producción

de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h. • Consultar la tabla de NMP (ANEXO) para conocer el número más probable de

organismos coliformes fecales por mL. Control de calidad • Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y

una de Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras.

2.4 Prueba confirmatoria de Escherichia coli. • Confirmar la presencia de Escherichia coli en por lo menos el 10% de las pruebas

con resultados positivos de coliformes fecales; sembrar en placas de agar McConkey a partir de los tubos que demostraron la presencia de gas en la prueba confirmativa.

• Incubar las placas a 35 ± 0.5°C durante 24 ± 2 h., observar las colonias típicas

fermentadoras de color rojo rodeadas de un halo opaco de precipitación de sales biliares.

• Hacer tinción de Gram para observación de la morfología de las bacterias. • Seleccionar 1 o más colonias aisladas para realizar pruebas IMViC. Todos los cultivos que:

• Fermenten la lactosa con producción de gas dentro de las 48 h. a 35°C. • Sean bacilos o cocobacilos Gram-negativos no esporulados • Se obtenga las siguientes combinaciones para el IMVIC: Biotipo 1(++--) o Biotipo 2 (-

+--) son consideradas como Escherichia coli.

• Calcular el NMP de E. coli basándose en la proporción de los tubos positivos de caldo EC.



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CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Calcular la densidad microbiana con base en el número más probable conforme al procedimiento señalado en la tabla 1, (que se muestra a continuación y es utilizado para el análisis de agua), para estimar la población de bacterias coliformes totales, bacterias coliformes fecales y Escherichia coli de acuerdo con las diluciones empleadas. Expresar en NMP/g o mL para alimentos y NMP/100 mL para agua. En el caso de usar volúmenes de 20 mL de muestras de agua en 5 tubos o 10 mL de muestras de agua en 10 tubos, utilizar las siguientes tablas: TABLA 1. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con 20 mL de muestra de agua o hielo.

95% de Límite de Confianza (aproximado) No. de Tubos positivos

NMP/100 mL Inferior Superior

0 <1,1 0 3,0 1 1,1 0,05 6,3 2 2,6 0,3 9,6 3 4,6 0,8 14,7 4 8,0 1,7 26,4 5 >8,0 4,0 Infinito

TABLA 2. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 10 mL de muestra de agua o hielo.

95% de Límite de Confianza (aproximado) No. de Tubos Positivos

NMP/100 mL Inferior Superior

0 <1,1 0,0 3,0 1 1,1 0,03 5,9 2 2,2 0,26 8,1 3 3,6 0,69 10,6 4 5,1 1,3 13,4 5 6,9 2,1 16,8 6 9,2 3,1 21,1 7 12,0 4,3 27,1 8 16,1 5,9 36,8 9 23,0 8,1 59,5

10 >23,0 13,5 Infinito



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BIBLIOGRAFÍA

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