Nmero ms probable (NMP) de coliformes totales y fecales Prueba presuntiva y confirmativangela Ruiz, Anglica Quiroz, Anglica cotacio, Carlos majeEstudiantes Del IV semestre de Ingeniera De AlimentosBacteriloga docente, Paola Andrea Garca RincnUniversidad De La Amazonia Avd. Circunvalar, Barrio Porvenir, FlorenciaCaquet ColombiaMicrobiologa de alimentosSeptiembre 2014

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Toma de MX llegada al laboratorio Fecha : 25/09/14 fecha : 26/09/14Hora : 5:00 pm hora: 11:00 am

Marca del producto

Sitio de tomaFama la calea,exterior galera central

RemitenteJose ramirez

Descripcin de la muestraCarne de res cruda 10gr, sin refrigeracin,no almacenamiento (expuesta al medio ambiente)y color rojo negrusco opaco.

Tipo de empaqueSin empaque OBS:colgada en ganchos

Tcnica de anlisisNMP de coliformes totales y fecales

Medio de cultivoAgar EMB y caldo brilla

Tiempo de incubacin24 a 48h

Temperatura C35C+/- 2

Resultado obtenidoPresencia de coliformes

INTRODUCCINExisten diversos mtodos para cuantificar el nmero de microorganismos presentes en muestras lquidas y slidas. Dentro de las tcnicas ms comunes se encuentra el recuento directo por microscopia de fluorescencia, as como los procedimientos basados en diluciones en serie, haciendo crecer microorganismos en medios de cultivo sintticos slidos o lquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) o la estimacin por el mtodo del Nmero Ms Probable (NMP). Segn El mtodo del nmero ms probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este mtodo fue empleado para estimar el nmero de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que tambin puede ser aplicado para la determinacin de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados, por tanto este mtodo es aplicable para estimar el nmero de microorganismos en muestras de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como anaerobias. (Guedea, 2011)Esta prctica se realiz con el objetivo Detectar bacterias coliformes en carne y saber si la muestra trada es apta para el consumo humano.

MARCO TEORICODebido a que un gran nmero de enfermedades son transmitidas por va fecal-oral utilizando como vehculo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que funcione como indicador de contaminacin fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de los patgenos intestinales y debe de ser capaces de desarrollarse extraintestinalmente.De acuerdo con Camacho y otros (2009) El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, sin embargo, las caractersticas de sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse fuera del intestino tambin se observan en aguas potables, por lo que el grupo coliforme se utiliza como indicador de contaminacin fecal en agua; conforme mayor sea el nmero de coliformes en agua, mayor ser la probabilidad de estar frente a una contaminacin reciente.Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no slo sobreviven, sino que se multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el agua. En productos alimenticios que han recibido un tratamiento trmico (pasteurizacin, horneado, coccin, etc.), se utilizan como indicadores de malas prcticas sanitarias. (Camacho, y otros, 2009)Segn Camacho (2009) Los microorganismos coliformes constituyen un grupo heterogneo con hbitat primordialmente intestinal para la mayora de las especies que involucra.El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gram-negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con produccin de gas en un lapso mximo de 48 h. a 35C 1 1C. Este grupo est conformado por 4 gneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella. (Camacho, y otros, 2009)El grupo de coliformes fecales, est constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con produccin de gas a las 48 h. de incubacin a 44.5 0.1C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la ms prominente es Escherichia coli. (Camacho, y otros, 2009)La demostracin y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivo lquidos y slidos con caractersticas Selectivas y diferenciales.Escherichia coli Es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia Enterobacteriaceae (bacterias entricas), existe como comensal en el intestino delgado de humanos y animales. Sin embargo, hay algunas cepas de E. coli patgenas que provocan enfermedades diarreicas. Estas E. coli se clasifican con base en las caractersticas que presentan sus factores de virulencia nicos, cada grupo provoca la enfermedad por un mecanismo diferente. Las propiedades de adherencia a las clulas epiteliales de los intestinos grueso y delgado son codificadas por genes situados en plsmidos. De manera similar las toxinas son mediadas por plsmidos o fagos.Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli enterotoxignica (ETEC), E. coli enteropatgena (EPEC), E. coli enterohemorrgica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) E. coli enteroadherente difusa (DAEC). Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras estn implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos contaminados. (Camacho, y otros, 2009)Escherichia coli enterotoxignica ETEC Es reconocida como el agente causal de la diarrea del viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin fiebre. Este tipo de infecciones es muy frecuente en pases subdesarrollados y afecta principalmente a los nios.Patognesis: El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina. Una toxina termolbil de aproximadamente 89 kDa cuya secuencia, antigenicidad y funcin es similar a la toxina del clera, la otra toxina que produce es termoestable y es de bajo peso molecular (4 kDa) y es capaz de resistir temperaturas de ebullicin hasta por 30 minutos.La infeccin puede ser adquirida por el consumo de alimentos como vegetales frescos (lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido calculada en aproximadamente bacterias, por otra parte en jvenes y ancianos la dosis infectiva puede ser ms baja. (Camacho, y otros, 2009)Escherichia coli enteropatgena ECEP. Es causa importante de diarrea en los lactantes particularmente en los pases en vas de desarrollo. La ECEP se adhiere a las clulas de la mucosa del intestino delgado. Sus factores de virulencia favorecen la adhesin y en ocasiones penetra a las clulas mucosas. La infeccin por ECEP provoca diarrea acuosa generalmente autolimitada aunque en ocasiones puede ser crnica.Patognesis. El microorganismo produce dos protenas: la intimina que es codificada por el gen eae y un factor de adherencia que es codificado por un plsmido, ambas protenas permite su unin a los enterocitos y la destruccin de las microvellosidades intestinales.Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua contaminada y productos crnicos. En estudios con voluntarios se encontr que la dosis infectiva es de microorganismos. La diarrea por ECEP se ha vinculado con mltiples serotipos especficos de E. coli los cuales pueden ser identificados mediante la tipificacin del antgeno O (somtico) y en ocasiones del antgeno H (flagelar). (Camacho, y otros, 2009)Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra estrechamente relacionado con el gnero Shigella, produce una enfermedad similar a la shigelosis. La enfermedad se presenta comnmente en nios de pases subdesarrollados y en personas que viajan a dichos lugares. La EIEC provoca la enfermedad (diarrea disentrica invasiva) al invadir las clulas epiteliales de la mucosa intestinal.A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a 100 microorganismos, en el caso de EIEC la dosis infectiva es de aproximadamente bacterias. Algunas caractersticas importantes de este microorganismo que permiten diferenciarlo de la cepa tpica de E. coli son: No utiliza la lactosa como fuente de carbono, no descarboxilan la lisina, es inmvil y anaerogenicos.La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y destruir el epitelio del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en los fagolisosomas. (Camacho, y otros, 2009)Escherichia coli enterohemorrgica EHEC produce verotoxina, denominada as por su efecto citotxico sobre las clulas Vero, una lnea de clulas renales de monoverde africano. Existen al menos dos variantes antignicas de la toxina. La ECEH se ha asociado con colitis hemorrgica, una variedad grave de diarrea; y con el sndrome urmico hemoltico, enfermedad capaz de producir insuficiencia renal aguda, anemia hemoltica microangioptica y trombocitopenia. La verotoxina tiene muchas propiedades similares a la toxina shiga producida por algunas cepas de Shigella dysenteriae tippo 1; De los serotipos de E. coli que producen la verotoxina el ms comn y el nico que puede identificarse en muestras clnicas es el O157:H7. La E. coli O157:H7 no emplea sorbitol y es negativa a la prueba de MUG.La causa ms comn de esta infeccin es el consumo de carne sin cocinar o poco cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los casos de colitis hemorrgica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse mediante la coccin completa de la carne (Camacho, y otros, 2009)En la siguiente tabla se resumen algunas propiedades y sntomas causados por las cepas de Escherichia coli antes descritas.

Fuente: (Camacho, y otros, 2009)

Nmero ms probable ( NMP) de bacterias; tres tubos por cada dilucin

Fuente: international comisin on microbiological specifications for foods 2000.microoganismos de los alimentos 1. Editorial acribial. Segunda edicin. Volumen1. Pg. 133-134. MATERIALES Y MTODOSLos materiales utilizados en la prctica fueron: 3 pipetas estriles, caja de Petri, Erlenmeyer, 9 tubos tapa rosca, mortero, asas recta y redonda, carne. Bolsas ziploc, Agua peptonada.Los medios de cultivo utilizados fueron (caldo brilla y agar, EMB ( Eosina Metil Blue) Se prepar el sitio de trabajo con una previa desinfeccin. Se procedi macerando la carne y luego se prepararon tres disoluciones con material macerado posteriormente se realizaron las respectivas siembras de cada dilucin en caldo Brilla y se incubo a 35C 2 por 24-48 horas.A los tubos que presentaron turbidez y/o formacin de gas se le realizo la prueba confirmativa, Con un asa redonda, se tom una asada de los tubos positivos se sembr por aislamiento en una caja de Petri con Agar VRB (Rojo Neutro, Bilis, Agar) y se encubo a 35C 2C por 24 horas.

RESULTADOSPRUEBA PRESUNTIVAFigura 1: tubos antes y despus de sembrados en el caldo Brilla.

Grupo 2

Grupo 3

Grupo 1

De los tubos sembrados en el caldo Brilla se obtuvo los siguientes resultados para coliformes totales:DILUCIONES

Grupos

1+++

2+++

3+++

Total 333

Para coliformes totales el triplete de valores obtenido es: 3, 3,3 y consultando la tabla del NMP nos da un valor mayor de 11.000NMP de coliformes totales = 11.000/100 mL

.PRUEBA CONFIRMATIVA MACROSCOPIAFigura 2: macroscopia de los tubos positivos sembrados en caldo brilla.

MICROSCOPIA (100 X)

DISCUSIN En la prueba presuntiva todos los tubos dieron positivos por que presentaron turbidez y presencia de gas, obteniendo un ndice delNMPparala muestrade carne de 11.000 bacterias/100 mL.Para realizar la prueba confirmativa se sembr en agar EMB ( Eosina Metil Blue) luego de la incubacin de por 24 horas se apreciaron colonias de color verde metalico en los bordes de las estra con puntos negros en la dilucin y en la dilucin y (vase figura 2) se apreciaron colonias de color marrn en forme de punticos en las estras. En las microscopia de la dilucin , y (vase figura 3, 4 y 5), se aprecia bacilos gran negativos.

Segn Ramrez (2011) Las colonias de E. Coli en agar E.M.B. (eosina y azul de metileno) tienen 2 a 4 mm de dimetro, un centro grande de color oscuro e incluso negro, y tienen brillo verde metlico cuando se observan con luz refleja. aunque hay otras bacterias que logran producir este color muy tenue y escaso. Con relacion a Ramrez (2011) y segn los resultados obtenidos podemos decir que obtuvimos colonias tpicas de E. Coli, pero para tener seguridad de su especie se debi hacer ms pruebas, porque hay otras bacterias que tienen la capacidad de producir el mismo color, por lo tanto podemos decir que son del genero Escherichia.

CONCLUSIONPodemos concluir con respectos a los objetivos que la determinacin coliformes fecales y totales pueden estar presentes en el agua como en los alimentos ya que estos microrganismo se pueden trasmitir por las haces fecales.

En la muestra de carne que se trabaj se encontr bacterias del genero Escherichia por tanto la carne est contaminada y no est apta para el consumo humano.

CUESTIONARIO: 1. Cul es el fundamento bioqumico de la prueba triptonasa?

Rta: El indol es un compuesto que se genera mediante la desaminacin reductiva deltriptfano y esta reaccin es llevada a cabo poralgunas bacterias que poseenlas enzimas denominadas en su conjunto triptofanasas. Para detectar la produccin deindol seutiliza el medio Caldo triptfano y la lectura de la prueba se realizacon el reactivo de Kovacs(alcohol isoamilo,p-dimetilaminobenzaldehdo ycido clorhdricoconcentrado)con el que el indolproducidoreacciona generando una coloracinrosa intensa.

2. cules son los componentes de los medios EMB y VRB y cual es le funcionamiento de cada uno de ellos ?Rta: Agar EMBFrmula (en gramos por litro)Instrucciones

Peptona10.0Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos; mezclar, calentando a ebullicin durante 1 o 2 minutos hasta su disolucin. Esterilizar en autoclave a no ms de 121C durante 15 minutos. Enfriar a 45C y distribuir agitando suavemente.

Lactosa5.0

Sacarosa5.0

Fosfato dipotsico2.0

Agar13.5

Eosina0.4

Azul de metileno0.065

pH final: 7.2 0.2

Agar VRBFrmula (en gramos por litro)Instrucciones

Extracto de levadura3.0Suspender 41,5 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar, calentando a ebullicin 1 o 2 minutos. Enfriar a 45C y verter en placas. Una vez preparado debe usarse de inmediato. NO AUTOCLAVAR.

Peptona7.0

Sales biliares1.5

Lactosa10.0

Cloruro de sodio5.0

Agar15.0

Rojo neutro0.03

Cristal violeta0.002

pH final: 7.4 0.2

3. Cul es la diferencia de entre coliformes totales y fecales? Rta: coliformes totalescoliformes fecales

Comprende todos los bacilos Gram-negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con produccin de gas en un lapso mximo de 48 h. a 35C 1 1C. Este grupo est conformado por 4 gneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.

Est constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con produccin de gas a las 48 h. de incubacin a 44.5 0.1C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la ms prominente es Escherichia coli

BIBLIOGRAFA Camacho, A., Giles, M., Ortegn, A., M, P., Serrano, B., & Velzquez, O. (2009). Mtodo para la determinacin de bacterias coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli por la tcnica de diluciones en tubo mltiple (Nmero ms Probable o NMP). Recuperado el 18 de 10 de 2014, de http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Colif-tot-fecales-Ecoli-NMP_6529.pdf.Guedea, R. M. (2011). DETERMINACION DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES. Recuperado el 18 de 10 de 2014, de http://jfklsdgvegh.blogspot.com/2011/10/determinacion-de-coliformes-totales-y.html.Ramrez., A. R. (2011). Escherichia coli. Recuperado el 18 de 10 de 2014, de http://www.uv.mx/personal/sbonilla/files/2011/06/escherichia-coli-i.pdf.