Técnicas de Separación Métodos de Extracción

• La Extracción es el proceso de separación de una sustancia, basado en la libre distribución de esta en dos fases.

• Mediante esta técnica se pueden separar componentes que se hallan presentes en mezclas sólidas, (utilizando un Soxhlet) o mezclas líquidas, (utilizando un embudo de decantación).

• La mayoría de las veces lo que se persigue al realizar una extracción es aumentar la concentración del analito y reducir o eliminar la presencia de posibles agentes interferentes en el proceso de análisis.

• La fase más utilizada para realizar los procedimientos de análisis es la fase líquida, por esto la mayoría de los procesos de extracción buscan llevar el analito a una solución líquida en la cual el nivel de concentración del analito sea adecuado.

• La separación de un compuesto por extracción se basa en la transferencia selectiva del compuesto desde una mezcla sólida o líquida con otros compuestos hacia una fase líquida (normalmente un disolvente orgánico).

• El éxito de la técnica depende básicamente de la diferencia de solubilidad en el disolvente de extracción entre el compuesto deseado y los otros compuestos presentes en la mezcla inicial.

Coeficiente de Reparto o DistribuciónEl reparto del soluto entre las dos fases inmiscibles es un fenómeno de

equilibrio. Si las especies A de soluto se pueden distribuir entre el agua y la fase

orgánica, el equilibrio resultante se expresa como:

A (ac) = A (org)

Extracción líquido-líquido• La sustancia a extraer se encuentra disuelta en un líquido que la

solubiliza menos que el líquido de extracción. Esta se consigue por partición entre la fase acuosa y la fase orgánica

Factores que influyen en la distribución entre las dos fases:• pH de la fase acuosa• Disolvente empleado• Proporción fase acuosa/orgánica

La elección del disolvente esta determinada por la lipofilia o hidrofilia del toxico a extraer.

Características del disolvente de extracción ideal• Que no sea miscible con el otro disolvente • Que el componente deseado sea más soluble en el disolvente de

extracción que en el disolvente original. • Que el resto de componentes no sean solubles en el disolvente de

extracción.• Que sea suficientemente volátil con bajo punto de ebullición menor

que el del analito, de manera que se pueda eliminar fácilmente del producto extraído mediante evaporación o destilación.

• La viscosidad debe ser baja para favorecer la mezcla con la matriz biológica

• Baja polaridad para mayor selectividad• Que no sea tóxico ni inflamable. • Bajo porcentaje de solubilidad en agua para que extraiga menor

cantidad de impurezas

• Los disolventes empleados en la extracción liquido-liquido se pueden clasificar según su capacidad de extracción en series eleutropicas( de acuerdo a su polaridad)

Disolvente P.E (Celsius)

Polaridad Solubilidad en agua %

n-Hexano 69 0 0.001

Tetracloruro de Carbono

Ciclohexano

77

81

1.7

0

0.08

0.01

Diclorometano 40 3.4 1.30

Cloroformo 61 4.4 0.82

1,1-dicloroetano 57 - 5.02

Eter Etílico 35 - 6.04

Acetato de etilico 77 4.3 8.08

Esquema General de Extracción

Muestra↓

Pretratamiento↓

Acidificación↓

Extracción con éter etílico↓

Fase orgánica ↔ Fase acuosa↓ Tóxicos ácidos alcalinizar y extraer con diclorometano

Extracto orgánico (básicos) ↔ Fase acuosasust. Insolubles en

Solventes orgánicos

Consideraciones •En cada caso hay que buscarlas condiciones que favorezcan al paso del analito a la fase orgánica•En las matrices biológicas el toxico debe encontrarse en forma no ionizada para pasar de fase acuosa a orgánica •El pH debe ajustarse para controlar la ionización y permitir la extracción •A pH por debajo de 3 los compuestos ácidos se encuentran en forma no ionizada y podrán ser extraídos con solventes orgánicos•A pH por encima de 5 permanecerán en la fase acuosa•Tras las extracción inicial el pH se puede invertir y reextraer el analito en forma cargada a la fase acuosa para conseguir una mayor purificación

Extracción en columnas• Se caracteriza por usar columnas rellenas con resinas de

divinilbenceno-poliestireno (Amberlita XAD-2) o tierras de sílice• Las resinas o tierras de sílice actúan como soporte para la muestra

biológica no intervienen activamente en la extracción • La extracción se efectúa eluyendo la columna con disolventes

orgánicos a pH adecuado

• Ventajas sobre la extracción liq-liq- No forma emulsiones- Los extractos finales son mas limpios, reduciéndose el tiempo de

extracción

Extracción por arrastre de vapor

•La destilación por arrastre de vapor es un procedimiento clásico de extracción para tóxicos volátiles, puede realizarse con agua o con un gas inerte. Se aplica a trozos de tejido macerados obtenidos por enzimas proteolíticas o de un homogenizado. • Arrastre de vapor con agua se añaden ácidos o bases hasta conseguir pH ácido o básico.

el análisis del toxico se realiza por espectrofotometría uv-vis, volumetría, gravimetría, cromatografía.

Microdifusión• Se aplica a tóxicos volátiles.• Fundamento: una muestra que contiene un toxico volátil se hace

coincidir con un disolvente o disolución con un reactivo apropiado que actúa como liquido extractor, en compartimentos concéntricos separados pero mantenidos próximos en el seno de una misma atmosfera contenidos en un recipiente cerrado, el compuesto volátil de acuerdo a la ley de la difusión de los gases tiende a pasar al ambiente como en principio y después al liquido extractor hasta alcanzar el equilibrio de concentraciones entre ambas fases liquidas y la fase del recipiente cerrado. Estas se conocen como celdas de difusion de conway.

Extracción en fase sólida • La Extracción en Fase Sólida (SPE) es una potente y simple técnica

de limpieza de muestras que es, al mismo tiempo, rápida y económica. Una columna SPE consiste en un lecho de adsorbente de partículas gruesas mantenido entre dos discos porosos en un tubo desechable. SPE permite la preconcentración de la muestra con un riesgo mínimo de pérdida o contaminación de la misma. El componente de interés resulta retenido en una fase sólida mientras que los contaminantes de la matriz se eluyen. Se puede realizar en fase normal, reversa y intercambio iónico. Los modos pueden ser de retención del analito y retención del interferente.

• Pasos de modo de retención del analito. Etapas de SPE• 1. Activación. El primer paso es la activación (A) en la que se utiliza

un solvente orgánico para "humidificar" la fase.• 2. Acondicionamiento. La fase estacionaria SPE se acondiciona con

el mismo solvente de la matriz, por ejemplo, con matrices acuosas el solvente es agua. El acondicionamiento permite "alinear" la fase estacionaria lejos de la superficie de la sílice, permitiendo la interacción entre el analito y la fase estacionaria. Cualquier solvente orgánico residual se elimina en esta etapa, asegurando que los componentes de interés sean retenidos en la parte superior de la columna.

• 3. Retención. Las interacciones entre las moléculas de la muestra y la fase estacionaria controlan la retención en el adsorbente de SPE. Para maximizar las interacciones la muestra (A=analitos + M=matriz) deben cargarse en el adsorbente de SPE a aproximadamente 3 ml/min. Este caudal puede controlarse mediante una válvula en la estación de vacío

• 4. Eliminar interferencias. Usando un solvente o una serie de solventes de fuerza creciente los contaminantes pueden eliminarse del adsorbente de SPE hasta que solo los analitos de interés queden atrapados. Por ejemplo, al retener compuestos hidrofóbicos en C18 la contaminación puede eliminarse con un lavado de agua : metanol 50:50 puesto que los compuestos de interés no se eluyen del adsorbente de SPE hasta que no se use un mayor porcentaje de solvente orgánico.

• 5. Elución. La elución de los analitos (A) se efectúa mediante un eluyente adecuado (E) y a un caudal de 1ml/min. El adsorbente de SPE y las interacciones analito-adsorbente determinan el eluyente final de elución, tanto los analitos como solventes de elución se recuperan en un recipiente o recolector.

A = analito, M = matriz (A + interferentes), W = solvente de lavado, E = solvente de elución

• ¿ Como seleccionar la fase estacionaria?

Aplicación

Fase Reversa

Aislamiento de componentes apolares en una matriz polar

Fase normal

Aislamiento de componentes polares en una matriz apolar

Intercambio iónico Aislamiento de compuestos ionizables

C18 Silica SAX

C8 NH2 SCX

Fases Fenil Florisil Verify

Retain Diol

Hipercab Ciano

VerIfy hipercab

Principios de extracción y mecanismos de interacción. (Documento)

Usos de las fases•Octadecil Silano (C18) : el material de base es sílice que es estable en la mayoría de los solventes orgánicos. Se usa para aislamiento compuestos no polares, pesticidas, aflatoxinas, cafeína, drogas, conservantes, ácidos grasos, nicotina, policlorobencenos( PCB’s), metales pesados, vitaminas y drogas. Pueden retener compuestos polares.•Octil (C8) : pesticidas y PCB’s•Octil (C8) sobre Sílice + Intercambiador Catiónico Fuerte (C8 + SCX): La fase es una mezcla de 80% C8 y 20% SCX, un intercambiador catiónico fuerte basado en sílice modificada con ácido bencensulfónico. Se recomienda para análisis de anfetaminas, enriquecimiento de drogas ácidas, neutras y básicas de orina o plasma, opiáceos.•Dimetil (C2) sobre sílice: se utiliza mucho para análisis de antiepilépticos o anticonvulsivantes, permite interacciones con los grupos polares de los analitos, es mas polar que C18 y C8.

• SiO2 sílice sin modificar: es recomendada para análisis de vitaminas, aflatoxinas, cloramfenicol. pesticidas.esteroides.

• Retain PEP (polímero polar mejorado): material polimérico muy versátil para la retención de compuestos polares y no-polares, es un material poliestireno DVB de alta pureza y porosidad modificado con grupos funcionales tipo urea para obtener una retención equilibrada de analitos polares y no polares. Este material también resulta ideal para la retención de compuestos neutros, o mezclas de compuestos de diferentes grupos funcionales. Aplicaciones análisis de drogas y metabolitos en fluidos biológicos, péptidos en suero, plasma o fluidos biológicos.

• Retain-Ax: es un material poliestireno DVB de alta pureza y porosidad modificado con grupos funcionales tipo amonio cuaternario para obtener una retención de analitos ácidos, usado en el análisis de THC y sus metabolitos.

• Retain Cx: es un material poliestireno DVB de alta pureza y porosidad modificado con grupos funcionales sulfónicos ácidos para obtener una retención de analitos básicos. Aplicable en el análisis de un amplio rango de drogas de abuso incluyendo drogas básicas y neutras

• HyperCarb: cien porciento de carbón grafitizado, utilizado en la retención de compuestos muy polares, separa productos farmacéuticos, microcontaminantes solubles en agua, compuestos ionizables, iónicos y polares, incluyendo pesticidas y metabolitos de drogas.

• Verify-AX: es un material C8 de alta pureza y porosidad modificado con grupos funcionales amonio cuaternario con interacciones mixtas no polares y de intercambio iónico que resulta en una elección ideal para la extracción de drogas ácidas y metabolitos de matrices biológicas y ha sido optimizado para THC y sus metabolitos.

• Verify-CX: es un material C8 de alta pureza y porosidad modificado con grupos funcionales sulfónicos ácidos con interacciones mixtas no polares y de intercambio iónico que resulta en una elección ideal para la extracción de drogas básicas de matrices biológicas.

• Columna estratificadas: es una combinación de C2 y C18 empaquetados en una misma columna, donde C2 retendrá los compuestos apolares y C18 retendrá ambos, pero la elución de los apolares será difícil.

• Columnas inmunoafinidad: se preparan para cada analito desarrollando el anticuerpo selectivo. En la columna se almacenan los anticuerpos inmovilizados y el analito queda retenido por inmunoafinidad eluyendo el analito con una mezcla de disolventes agua o tampón. La extracción por inmunoafinidad puede aplicarse off-line evaporando el extracto antes de pasar al análisis instrumental u on-line conectada directamente con la columna cromatografica. Se aplica a micotoxinas, tetrahidrocannabinol y benzodiacepinas en muestras biológicas.

• Polímeros marcados molecularmente: son muy estables y tienen lugares de reconocimiento que están incluidos en su matriz y que se adaptan a la forma y funcionalidad del analito de interés. Con la desventaja que es difícil eliminar la plantilla.

Características de los P.M.M•Pueden reaccionar con un analito o con un grupo químico dependiendo de la plantilla seleccionada para su síntesis.•Son muy estables y resistentes a temperaturas de hasta 120 Celsius y el tratamiento con ácidos o bases provoca bajas perdidas en su selectividad.•El proceso de elaboración es muy reproducible, consiguiéndose gran homogeneidad entre los distintos lotes.•La eliminación de la plantilla es imprescindible, no solo para dejar libre el lugar de la unión del analito, sino para reducir al mínimo las interferencias analíticas.•Se empaquetan en columnas al igual que las otras fases y se pueden usar fuera de línea o en línea.•La forma de operar es la tradicional a la de las columnas tradicionales en extracciones en fase solida. Si se emplean los mismos disolventes que EPS el polímero actuara e fase reversa o de intercambio iónico.•Su uso contribuye a una mayor selectividad y sensibilidad del método analítico, reduciendo el tiempo de análisis.

complejación

Polimerización

+P

Etapas implicadas en la síntesis de polímeros de impresión molecular (P = analito plantilla)

• Extracción por absorción con barra agitadora:Las barras de agitación consta de tres partes esenciales, la parte

interna es un agitador magnético, una cubierta de cristal que rodea el agitador y la parte externa que es un absorbente de polidimetil siloxano la cual impide la descomposición.

El proceso de extracción se lleva acabo colocando una cantidad apropiada de muestra en un vial de extracción en espacio de cabeza o en otro recipiente. Se introduce la barra de agitación y se mantiene la agitación durante 30 -240 min. El tiempo de agitación se controla cinéticamente, teniendo en cuenta el volumen de la muestra, la velocidad de agitación y las dimensiones de la barra agitadora. Después de la extracción se recoge la barra agitadora, se elimina el exceso de agua con papel absorbente y se introduce en un tubo de desorción térmica, en algunos casos se recomienda lavar la barra con agua destilada para eliminar las proteínas y otros componentes volátiles que pueden interferir en la desorción térmica. La temperatura de aplicación depende de la volatilidad del analito, esta temperatura puede oscilar entre 150 a 300 oC con un tiempo de 5- 15 minutos.

Aplicaciones •Se ha aplicado a muestras ambientales, la principal ventaja es que puede aplicarse a compuestos orgánicos volátiles y semi volátiles, y si se emplea la combinación con la desorción liquida y HPLC también es aplicable a compuestos no volátiles.•Determinación de compuestos orgánicos en fluidos biológicos.•Extracción de fenoles, esteroides, ácidos grasos, drogas de abuso, barbitúricos, y benzodiacepinas, hidrocarburos aromáticos poli cíclicos en orina.•Determinación de contaminantes en alimentos.

ImánRecubrimiento de vidrio

PDMS

Unidad de desorción térmica para SBSE

Desorción térmica

• Extracción con fluido supercrítico (EFSC): se considera un fluido que esta en estado supercrítico cuando su temperatura o presión igualan o superan su punto critico.

Características• Viscosidad similar a la de un gas• Densidad y poder de solvatación similar a los solventes líquidos• Se difunden rápidamenteLa EFSC permite lograr altos porcentajes de recuperación del analito,

mejoran la precisión o exactitud del método y acortan el tiempo de análisis. El fluido supercrítico mas usado es el CO2 por su baja temperatura critica ( 31.1 o C ), presión 72.8 atm, químicamente inerte, toxicidad, costo.

Los fluidos supercríticos como CO2 pasan al ambiente y se disipan fácilmente, esta es una gran ventaja porque se evita la etapa de la eliminación del solvente. El CO2 es un solvente de baja polaridad comparable al hexano pero si se modifica su polaridad pueden extraer compuestos polares.

Aplicaciones •Análisis de drogas de abuso o medicamentos •Análisis de alimentos o detección de acelerantes de la combustión y explosión.•Determinación de anfetaminas, cocaina, cannabinoides, benzodiacepinas y opiáceos.

Dr. Nahun Lanza