Primeros pasos: Extracción, separación, identificación…

Prof. Ricardo Riguera Vega

Departamento  de  Química  Orgánica  y  CIQUS,    Universidad    de  San<ago  de  Compostela.  ESPAÑA  

 ricardo.riguera@usc.es http://www.usc.es/gi1608/

PROMETEO    ECUADOR,  Noviembre    

2013  

-­‐Drogas  de  abuso  mas  frecuentes  en  análisis  forense  

-­‐Tóxicos  más  frecuentemente  encontrados:  

Monóxido  de  carbono,  metanol,  glicol,    escopolamina,  estricnina,  plaguicidas,    insec<cidas,  ra<cidas…  METALES:  Pb,  Hg,  As,  Sb,  Cr,  Cu…  

-­‐Matrices  de  importancia  Forense  

Lindon  et  al.  

Etapas  en    el  análisis  forense  

1.-­‐  

2.-­‐    3.-­‐    

4.-­‐  

5.-­‐  

6.-­‐    7.-­‐  

Metodología  

1º:  Análisis  inicial  por  CCF,  reacciones  coloreadas,  inmunoensayos,  UV,  IR…  

 para  detectar/presumir  la  presencia  de    familias  de  drogas  /  sustancias  (p.  Eje.  

Alcaloides).  Son  procedimientos  baratos  y  rápidos  que  en  el  caso  de  dar  

”posiQvo”  deben  confirmarse  por  técnicas  de  mayor  precisión.  

Tambien    CG  y  HPLC    

2º  Análisis  Confirmatorio:  CG-­‐MS,  HPLC-­‐MS  y  MS/MS  

1.-­‐Toma  de  muestra,  extracción,  conservación,  y  preparación  para  análisis    

2.-­‐  Dos  aproximaciones:  Buscar  determinada  sustancia  o  análisis  mulQanalito  

La  validez  del  análisis  forense  depende  de  la  garan\a  ofrecida  por  el  laboratorio  

 y  requiere  controles  periódicos  y  documentados  de  sensibilidad,  precisión      etc  .  

Deben  seguirse  los  protocolos  aceptados  por  la  comunidad  cien\fica   y/o   forense   para   los   análisis   de   drogas   de   abuso,  fármacos,  tóxicos  etc  

Protocolos   específicos   según   la   matriz:   suero,   plasma,   sangre,    humor  vítreo,    orina,  pelo  etc    Valores   del   analito   caracterísQcos   para   cada   matriz:   DisQntos  fluídos   dan   disQnto   valor   para   una   misma   exposición   del  organismo.    DisQntas   matrices   representan   disQnta   exposición   temporal   al  analito.   P.   Eje.   en   pelo   puede   relacionarse   con   exposición   a  fármacos/drogas  en  meses  anteriores    Deben  conocerse  los  límites  de  detección  de  la  técnica  uQlizada  y  los  valores  significaQvos  en  cada  matriz.  

-  Extracción selectiva del analito/s o extracción general seguida de fraccionamientos posteriores.

-  con disolventes en frio, percolando, con soxhlet, a reflujo… - con gases supercríticos. -  en fase sólida (adsorción)

- Basado en la afinidad de los componentes por los disolventes según su polaridad, coeficiente de reparto, propiedades ácido / base. -Conservación del extracto: congelación, liofilización, atmósfera inerte.

En matrices muy complejas (órganos de animales) la gran abundancia de algunos componentes (grasas…) hace difícil aislar directamente los componentes muy minoritarios. Además, los mayoritarios pueden “arrastrar” a los minoritarios.

Primeros  Pasos:    Extracción  y  fraccionamiento  

General  isolaQon  strategy  of  natural  products:    

n   Extract  the  dried  and  ground  plant  material  with  a  suitable  solvent.      n   Concentrate  the  extract.      n   Separate  and  purify  each  component.      n   structural  determina<on    

Soxhlet

SEPARACIÓN POR TAMAÑO MOLECULAR

Moléculas pequeñas: fármacos, drogas, terpenos, lípidos, metabolitos secundarios… Macromoléculas: Proteinas, Ácidos nucleicos, Polisacáridos Un extracto general puede contener moléculas pequeñas y

macromoléculas.

- El estudio de las pequeñas requiere en general eliminar las

macromoléculas por precipitación, ultrafiltración, diálisis,

cromatografia de exclusión, C. de gel etc..

SEPARACIÓN POR SOLUBILIDAD: Mezcla conteniendo Hidrosolubles y Liposolubles

-Fraccionar la mezcla entre agua y disolvente orgánico inmiscible. Los

liposolubles quedarán en la fase orgánica y los hidrosolubles -sales,

azúcares, aminoácidos, saponinas…- en el agua.

- Evaporación “cuidadosa” del disolvente proporciona los compuestos.

PERO:

- Concentración la fase acuosa puede dar problemas (sales, calor, pH…).

-  Con disolventes orgánicos evitar material de plástico.

Otras soluciones para la fase acuosa:

Liofilización, diálisis, cromatografia de afinidad y/o reparto…

Ejemplo 1: un extracto animal/vegetal se puede fraccionar entre agua y

un disolvente orgánico. Al agua van los azúcares, aminoácidos, sales y

otros componentes muy polares, (hidrofílicos) mientras que los

terpenos, lípidos, ceras, esteroides… (poco polares) se van al hexano,

cloroformo, etc.

RECUPERACIÓN: por concentración/ evaporación del disolvente

Extracción. -Algunos disolventes (Etanol, THF, Dioxano…) son muy generales y extraen prácticamente todo tipo de componentes. Proporcionan extractos muy complejos que requieren fraccionamientos posteriores. - Mezclas cloroformo-metanol se utilizan para extraer conjuntamente todos los compuestos de baja y media polaridad (p. eje. Lípidos). - Agua, Metanol, Acetona, THF, n-butanol y sus mezclas se utilizan para hidrosolubles muy polares

SEPARACIÓN POR ÁCIDO-BASE: Mezclas conteniendo: compuestos neutros además de

aminas, alcaloides, ácidos, fenoles... -Fraccionar la mezcla entre un disolvente orgánico y agua a cierto pH.

-Los componentes neutros quedarán en la fase orgánica y evaporación

del disolvente proporciona los compuestos neutros.

- Los componentes básicos y/o ácidos serán hidrosolubles al pH

adecuado y quedarán en la fase acuosa en forma de sales.

- Aminas y alcaloides básicos pasan a la fase acusa a pH ácido (p. Eje.

ClH 5-10%) donde los alcaloides estan como hidrocloruros.

-  Ácidos y Fenoles pasan a la fase acusa a pH básico ( eje. NaOH o NH3

5-10%), donde estan en forma de sales sódicas o amónicas.

Ejemplo 2. Extracción selectiva ácido-base.

Al fraccionar una muestra biológica con un disolvente orgánico

(Cl4C, Cl3CH…) en presencia de ClH aq., los componentes neutros y

acidos se irán a la capa orgánica mientras que los alcaloides/aminas

se protonan y forman sales que se van al agua.

-Recuperación: Los alcaloides/aminas se pueden aislar a

continuación basificando la capa acuosa y extrayéndolos con

disolvente orgánico.

Ejemplo 3: Al fraccionar una muestra biológica con un disolvente

orgánico (Cl4C, Cl3CH…) en presencia de NaOH aq., los componentes

neutros y básicos se irán a la capa orgánica mientras que los ácidos

carboxílicos y fenoles se transforman en sales sódicas que pasan a la

capa acuosa.

Recuperación: Los ácidos carboxílicos y fenoles se pueden

recuperar acidulando la capa acuosa básica y extrayéndolos con

disolvente orgánico.

Debido a su carácter acido/base, la extracción de Aminoácidos es

muy sensible al pH (forman sales tanto en medio acido como básico)

Separation of a crude extract into fractions of low, medium and high polarity

ACTIVE CRUDE EXTRACT

1. MeOH/H2O 9:12. Hexane

Hexane

1. MeOH/H2O 8:22. CCl4

1. MeOH/H2O 6:42. CH2Cl2

1. H2O 100%2. n-BuOH

Increasing polarity

LOW / MEDIUM POLARITY HIGH POLARITY

ACTIVITY MONITORING: % inhibition at mg / mL, etc

ISOLATION PROCEDURE (I)

Solvent partition:

CCl4

CH2Cl2

n-BuOHH2O

ISOLATION PROCEDURE (II)

LOW / MEDIUM POLARITY FRACTIONS HIGH POLARITY FRACTIONS

1) CC: normal or reversed phase (adsortion, partition, affinity ...)2) MPLC: if necesary3) HPLC: normal or reversed phase

Pure active compound

ACTIVITYMONITORING

1. H2O 2. MeOH

1) CC: Amberlite XAD

Mineral salts

ACTIVITYMONITORING

1) CC: Sephadex LH-202) DCCC3) HPLC: C18, amino, cyano, ...

Organic materiali.e., terpenes, acetogenins, steroids, polypropionates, peptides, etc

Pure active compound

i.e., saponins, alkaloid salts, aminoacids, polyhydroxysteroids, etc

MeOHH2O

3º) Droplet Countercurrent Chromatography (DCCC): coeficiente de reparto entre dos fases

2º) Cromatografía de filtración en gel (shephadex LH-20) de dextrano que separa por reparto entre agua-MeOH

1º) Separación a través de una columna de Amberlite XAD-2 (copolímero de estireno) que adsorbe los compuestos orgánicos y eluye las sales inorgánicas y azúcares pequeños.

4º) Cromatografía líquida de alta eficacia o High performance liquid chromatography (HPLC) en fase reversa ( MeOH/agua o MeCN/agua)

Técnicas útiles para la separación y purificación de compuestos hidrosolubles

Main methods for structural determination

STRUCTURALDETERMINATION

Spectroscopicmethods

Chemicalmethods

MS

NMR 1H , 13C, DEPT COSY, TOCSY, ROESY

Absolutestereochemistry

FAB: (+), (-)CI, EILC-MS: ES, TSMS/MS

ReactivityDegradation studiesSynthesis

X-RayCDNMR

HMQC, HMBC

Main methods for analytical identification CG,    HPLC  y  su  acoplamiento  con  E.  de  masas  y  MS/MS  Espectroscopia  UV,  IR,  Raman;  Absorción  atómica,  ICP  Comparación  con  Bases  de  Datos  

Organización  de  Laboratorio  Forense