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TECNICAS DE LABORATORIO

QBI

TÉCNICAS DE

LABORATORIO


SOLUCIONES: Concentración

Cantidades, unidades y dimensiones

El Sistema Internacional de Unidades (SI) fue creado en 1960 por la Conferencia

General de Pesos y Medidas para estandarizar las unidades de medida basadas en el

sistema métrico. De esta manera, SI permite la comunicación entre científicos de

diferentes disciplinas y diferentes países sin la necesidad de conversión de unidades de

medida. El conocimiento de las cantidades, unidades y dimensiones es esencial para

comprender cómo se llevan a cabo los cálculos biomoleculares.

Una cantidad es una propiedad medible de un sistema definido (masa, temperatura,

energía). Una unidad es una cantidad de un tamaño definido que se utiliza como

referencia para otras cantidades del mismo tipo (kilogramo, mol). Una dimensión es

una cantidad física descripta por el producto de símbolos con los exponentes

apropiados (m3, mol/dm

3).

Reglas básicas para el uso correcto de unidades y dimensiones

• Indicar todos los valores con sus correspondientes unidades; la relación de valores

que tienen las mismas unidades se deben indicar sin unidades ya que las mismas se

cancelan. • Sumar o restar sólo aquellos valores que tienen las mismas unidades. • No se deben hacer comparaciones de valores con diferentes dimensiones. • Se debe asignar a una determinada variable las mismas unidades a través de todos

los cálculos. • Multiplicar o dividir unidades cuando se dividen o multiplican valores; luego

incluir el producto o cociente de las unidades con el resultado calculado. • Multiplicar o dividir unidades en cada paso de un cálculo; no esperar hasta el final

del cálculo para deducir cuales serán las unidades finales. • La pendiente de una curva tendrá las dimensiones de y dividida por aquéllas de x. • Multiplicar valores tabulados o graficados por 10 o el múltiplo más adecuado para

evitar trabajar con números muy grandes o muy pequeños. • Las dimensiones del lado izquierdo de una ecuación deben ser iguales a aquéllas

del lado derecho. • El análisis de las unidades después de cada paso de un cálculo permite detectar

errores cometidos durante el cálculo.

Los resultados deben informarse sólo con los dígitos significativos

Los cálculos llevados a cabo en computadoras habitualmente rinden resultados con 10

o más dígitos. Sin embargo, la inclusión de tantos dígitos no implica que esos

resultados sean más precisos. Para evitar la confusión de los colegas, los informes

científicos deben incluir los resultados de cálculos sólo con los dígitos que son

significativos. Los dígitos significativos en una medición son aquellos que pueden

obtenerse con cierta precisión de un determinado aparato.


Unidades de concentración

En SI, el uso de mol l-1

y las unidades relacionadas se acepta para la expresión de

concentraciones sobre la base de cantidades de sustancia por unidad de volumen. Un mol se define como la cantidad de sustancia que contiene las entidades elementales equivalentes a los átomos presentes en 0.012 kg de carbono-12. Se ha demostrado

experimentalmente que 0.012 kg de carbono-12 contienen 6.02217 x 1023

átomos.

Este número es el número de Avogadro y se utiliza para definir el mol de cualquier unidad elemental tal como átomo, molécula, ión, protón o electrón. Un mol puede ser también definido como el equivalente del peso molecular (más correctamente a la masa molecular en g) de una sustancia. Por lo tanto, el peso de una sustancia (su masa) y moles pueden ser interconvertidos como se muestra en las siguientes ecuaciones:

número de moles = peso en g

peso molecular

peso molecular = peso en g

número de moles

Concentración molar, mol l-1

, el número de moles por litro (M) puede

expresarse como una función de las cantidades relativas de acuerdo a las siguientes relaciones:

Molaridad, M = moles de soluto

1 litro solución

Número de moles = volumen en l x moles l-1

Peso en gramos = número de moles x Peso molecular

Peso molecular = peso en g

número de moles

Equivalentes y normalidad no se recomiendan en SI, sin embargo son todavía

de uso común.

Normalidad, N = número de equivalentes

1 litro de solución

Número de equivalentes = normalidad x volumen en l

Las concentraciones frecuentemente se expresan como porcentaje

peso/volumen (% p/v) y se define como el peso del soluto en gramos por 100 ml de

solución. De manera similar el porcentaje peso/peso (% p/p) se define como el peso de

soluto en gramos por 100 g de solución y el porcentaje volumen/volumen (% v/v) se

define como el volumen de un líquido activo (soluto) disuelto en un segundo líquido

para dar 100 ml de solución.

ppm: partes por millón

meq: milequilaentes


Un principio muy simple para entender las diluciones

La cantidad total de soluto en la solución concentrada es igual a la cantidad

total de soluto en la solución diluida; sin embargo, la concentración (C) de soluto es

menor en la solución diluida que en la solución concentrada.

V1 . C1 = V2 . C2

AGUA, CONTROL ÁCIDO-BASE Y ELECTROLÍTICO

El control de las propiedades ácido-base es importante en bioquímica

El pH de lãs soluciones es importante en bioquímica por dos razones principales. Primero,

el correcto funcionamiento de las biomoléculas depende en un grado importante del

control de pH. Segundo, cambios de pH tan pequeños como de 0.1 ó 0.2 unidades pueden

causar disturbios metabólicos en ciertas células, tejidos u órganos. Debido a la sensibilidad al pH de muchas moléculas, el control del pH es también importante para el éxito de muchos procedimientos utilizados en los laboratorios. Esto incluye la separación, purificación y ensayo de actividades biológicas de muchas biomoléculas. Por ejemplo, diferentes cromatografías, electroforesis, la medición de actividades enzimáticas y ultracentrifugación, todos requieren el uso de soluciones buffer.

ESPECTROFOTOMETRIA

Los métodos ópticos para analizar muestras cuanti y cualitativamente se pueden

dividir en dos grupos: 1) métodos en que la muestra emite radiación por sí misma (Ej.:

reacción biológica de óxido reducción en luciérnagas) 2) métodos en los que se usa una

fuente externa de radiación que incide sobre la muestra. La radiación incidente puede ser

absorbida (análisis espectrofotométrico) o dispersada (fluorescencia). La luz emitida es

característica de cada sustancia con o sin cambio en la longitud de onda. La espectrofotometría es utilizada principalmente en bioquímica para determinar la

concentración de un soluto en una solución, identificar compuestos desconocidos por su

espectro de absorción. Además, se pueden seguir las reacciones catalizadas por una

enzima midiendo espectrofotométricamente la aparición de producto o la desaparición del

sustrato. La concentración de soluciones de compuestos conocidos se determina

cuantificando la absorción de la luz a una o más longitudes de onda conocidas. Cuando un rayo de luz atraviesa un medio homogéneo de espesor b, en el cual

hay especies absorbentes que están en una concentración c, parte de la luz es absorbida y parte transmitida.

Para una determinada longitud de onda (radiación monocromática) la relación

entre luz incidente (Io) y la luz transmitida (I) está dado por la ley de Lambert-Beer:

T (transmitancia) = I / I0 = 10-ε.c.b

Se define absorbancia (A) como:

A = log T-1

= log Io / I = ε.c.b


También se designa A como " densidad óptica", esta magnitud varía de cero

para I = Io (absorción nula) hasta para I = 0 (absorción total). La constante k es el coeficiente de extinción (o absortividad).Es una

característica intrínseca de cada sustancia y depende de la longitud de onda, sus unidades dependen de las utilizadas para c y b:

b: ancho de la cubeta (camino óptico de la solución) cm

c : concentración M (g/l)

ε .coeficiente de extinción molar M-1 cm-1

coeficiente de extinción molar específico 1 g-1

cm-1

Si la radiación incidente no es monocromática, la ley de Lambert-Beer no se

cumple estrictamente. Toda sustancia absorbe luz. Cuando se mide absorbancia en función de la

longitud de onda se observan picos relativamente agudos en longitudes de onda características de la sustancia en estudio. Así, compuestos desconocidos pueden ser identificados por su espectro de absorción en el UV, IR o Visible. El análisis químico fotométrico se basa en general en la medición de la cantidad de luz absorbida por una solución coloreada Si la sustancia es incolora se puede transformar en un compuesto coloreado mediante una reacción química conveniente.

La existencia de un color se debe a la absorción en la región visible del espectro. Por ej. Las hojas son verdes porque la clorofila absorbe el rojo y el violeta y refleja la mayor parte del amarillo, verde y azul. Este espectro incluye no solamente el campo visible sino también el campo de longitud de ondas largas del IR y cortas del UV. Casi todas las sustancias absorben en el UV, las pocas que no lo hacen se usan como solventes, agua, etanol, metanol, etc.

Regiones del espectro electromagnético:

Rayos X 0.01-15 nm

UV lejano 15-200 nm

UV cercano 200-400 nm

Visible 400-800 nm

Infrarrojo 800-2500 nm


ESPECTROFOTOMETRO

Instrucciones de manejo:

a) Colocar el filtro correspondiente a la longitud de onda deseada (7) b) Seleccionar la longitud de onda “WAVELENGTH” correspondiente con la

rueda 5. c) Encender en posición TRANS (1). d) Apretar “ZERO SET” y llevar a 0 con “ZERO” (2) manteniendo zero set

apretado. e) Poner un tubo con H2O (volumen mínimo de medición 3 ml) (6). f) Pasar 1 de “TRANS” a “ABS” y llevar a 0.000 de Abs con la rueda 100% T/0A”

(3). (Tiene rueda de macro y de micro).

g) Medir la muestra.

Muy importante:

Cuando se va a poner el tubo de medición se lo debe limpiar por fuera para

eliminar las gotas de solución que pudieran haberse derramado cuando se cargó

el tubo. Esto no solo dará lecturas equivocadas por incremento de los valores de extinción sino que provocará el deterioro del aparato. No solo las partes móviles y las

fotocélulas son dañadas por reactivos corrosivos, sino que entre los contactos de las

mismas se pueden producir corrientes de la misma magnitud que las producidas por la luz. Esto ocurre aún con muy poca humedad.

Si por algún accidente se rompiera un tubo dentro del aparato avise

inmediatamente. Como el instrumento es sensible a las vibraciones y los colores pueden ser

inestables, es conveniente controlar el 0% T y el 100 % T cada tres mediciones. No olvide restar el blanco a todas las lecturas, salvo que haya llevado a cero el

aparato con el blanco de reacción. Para que un dato de absorbancia pueda ser utilizado en el cálculo de concentración

debe estar dentro de la zona en la cual la curva es lineal, esto es, en el rango de concentraciones en el que se cumple la ley de Lambert-Beer.

Para conseguir esto puede ser necesario diluir la muestra problema.


AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Algunas consideraciones generales:

* Cualquier célula, tanto procariota como eucariota, contiene miles de proteínas diferentes con un amplio rango de actividades biológicas. La purificación de una proteína individual es una cuestión central para llevar a cabo el análisis biológico detallado de su estructura y función. No existe un único procedimiento para poder aislar en forma pura cada una de las proteínas, pero existen metodologías que permiten distinguir a las proteínas en base a características estructurales y funcionales específicas. Seleccionando procedimientos apropiados y aplicándolos en una determinada secuencia, usualmente es posible obtener un alto grado de purificación de la proteína en estudio y un aceptable rendimiento. No existe un orden estándar en la aplicación de los diferentes procedimientos para obtener óptimas purificaciones.

Debido a las diferencias estructurales y funcionales entre proteínas, una secuencia ideal para una proteína puede no tener éxito en la purificación de otra proteína. El conocimiento de las bases teóricas de cada procedimiento permite al investigador elegir una secuencia inicial de técnicas a aplicar para la purificación. De todas maneras, la puesta a punto de un protocolo involucra experimentos de ensayo y error.

Independientemente del esquema de purificación elegido, es esencial tener presente que la mayoría de las proteínas son moléculas excesivamente frágiles. La exposición aún a temperaturas moderadas (ejemplo, 37ºC) causa desnaturalización, por lo tanto, todos los pasos deben realizarse a bajas temperaturas (0-4ºC). Las proteínas son también sensibles a pHs extremos por lo que todos los pasos de purificación se realizan en soluciones buffer y se evitan los pH´s extremos.

Equipamiento requerido:

* Además del equipamiento usual en la mayoría de los laboratorios, tales como

pHmetros, balanzas y agitadores magnéticos, la purificación de proteínas requiere un

equipamiento más especializado. * A los efectos de minimizar la desnaturalización y proteólisis algunos de los

pasos de la purificación deben llevarse a cabo a 4ºC. Se necesita un cuarto frío para llevar a cabo la diálisis, precipitaciones y cromatografías. Para almacenar muestras por períodos cortos se requiere hielo granizado, por lo tanto es necesaria una granizadora de hielo. Para almacenar muestras y buffers son necesarias heladeras (4ºC), freezers (-15ºC a -20ºC). En algunos casos, para preservar la actividad de muestras almacenadas es necesario conservarlas en freezer a -70ºC.

* Espectrofotómetros que cubran un rango de 205 a 850 nm son esenciales para cubrir un amplio espectro de proteínas. En algunos casos, la medición de actividad de enzimas requiere contar con un registrador.

* Algunas proteínas específicas requieren equipamientos tales como contador de centelleo, lector de ELISA, HPLC, etc.

* La electroforesis se utiliza habitualmente para evaluar la purificación de una proteína. Se requieren fuentes de poder y los diferentes equipos de electroforesis,

según el tipo de separación a realizar.

* Para extraer las proteínas de su fuente son necesarios equipos de

homogenización (se discutirán mas adelante). Para clarificar los homogenatos se

necesitan centrífugas. Estas deben estar refrigeradas, y deben alcanzar fuerzas


centrífugas de 15000 g y deben cubrir un rango de 100 ml a pocos litros. Son muy

útiles además, las centrífugas para tubos de 1.5 ml (Eppendorf)

* Para las cromatografías se requieren, colectores de fracciones, monitores y

registradores, bombas peristálticas y columnas de diferentes tamaños. El rango de

tamaño de diferentes columnas debe cubrir aquellos necesarios para intercambio

iónico y cromatografías de afinidad (relativamente cortas y gordas) y las que se usan

para filtración en gel (relativamente largas y finas).

* Dentro del equipo más especializado necesario para estudios específicos, se

pueden mencionar los analizadores de aminoácidos y secuenciadores de proteínas,

FPLC, HPLC, etc.

Buffers:

* En todos los pasos de una purificación es necesario controlar el pH de la

solución para evitar la desnaturalización o inactivación de la proteína.

* Los factores que se deben tener en cuenta para la elección de un buffer son

los siguientes: + El pH deseado. + Si el buffer es aniónico o catiónico. Por ejemplo, para una cromatografía de intercambio aniónico se debe usar un buffer catiónico (por ejemplo, Tris y no fosfato) + Variación del pH con la fuerza iónica y la temperatura. + La reactividad química. Por ejemplo las aminas primarias como el Tris pueden interferir con el análisis de proteínas o pueden inhibir algunas enzimas.

+ Absorción a 280 nm. Costo. Especialmente si se utiliza en grandes escalas. + Solubilidad.

* Un "buen" buffer es biológica y químicamente no reactivo, no tóxico, no

absorbe en la región del UV y tiene una mínima dependencia con la temperatura y

fuerza iónica.

Métodos de extracción:

* Los primeros pasos en un procedimiento típico de extracción consisten en el

lavado del tejido y la aplicación de un método de lisis. Luego una centrifugación

permite separar la proteína soluble de las fracciones de membrana y de los restos

celulares. Finalmente, la muestra de proteína puede ser analizada, purificada o

almacenada.

* El tejido se lava con una solución salina para eliminar trazas de material

extracelular. * El extracto obtenido luego de la lisis se denomina homogenato. Habitualmente

se centrífuga de 10 min a 15000 g a 1 hora a 100000 g. El sobrenadante se denomina

extracto crudo y el pellet contiene la fracción de membrana.


* Las células animales están rodeadas exclusivamente por la membrana

plasmática y mantenidas por el citoesqueleto. Por lo tanto no tienen la rigidez de las

bacterias y levaduras. Esta fragilidad y su relativo gran tamaño simplifican la lisis.

* Las células vegetales tienen una pared compuesta por carbohidratos

complejos insolubles, ligninas o ceras que rodean la membrana plasmática. Microfibrillas de celulosa cubren la membrana y le dan cierta protección contra

la ruptura, aunque el tamaño las hace algo más vulnerables. En las vacuolas hay compuestos fenólicos que se liberan durante la extracción y que pueden inactivar proteínas. Por lo tanto es esencial una extracción muy rápida de la proteína en interés.

* Las bacterias tienen una pared celular constituída por un péptido glicano que

le otorga fuerza y rigidez. Se utiliza frecuentemente lizosima en un medio isotónico

para romper el péptidoglicano.

* Homogenización: es una de las formas más comunes de lisarlos tejidos

blandos. Se puede llevar a cabo con una licuadora o con un homogenizador Potter-

Elvenhjem. Es un método rápido y relativamente poco dañino para las proteínas. Las

principales precauciones que hay que tener se relacionan con la liberación de proteasas

de otros compartimientos celulares y con la liberación de calor.

* Sonicación: un sonicador lisa tejidos generando vibraciones que causan

ruptura mecánica de la pared celular. Se utiliza generalmente para bacterias.

* French Press: este método permite la lisis de las células sometiendo la

muestra a alta presión e inmediatamente liberarla a presión atmosférica. El rápido

cambio de presión causa la ruptura celular. Se utiliza fundamentalmente para bacterias

y levaduras.

* Moler con arena: La molienda de células con abrasivos se utiliza

frecuentemente para organismos unicelulares y tejidos vegetales. Los materiales son

económicos (mortero, arena u otro abrasivo).

* Tratamiento enzimático: la digestión de la pared celular con enzimas

(lisozima, por ejemplo) se utiliza generalmente para microorganismos ya que las

células en suspensión permiten un tratamiento relativamente uniforme.

* Otros métodos de lisis: + lisis de células animales en cultivo con detergentes. + Lisis por shock osmótico, sometiendo a las células a una solución hipotónica. Se utiliza comúnmente para glóbulos rojos y otras células sin pared celular. + Lisis por congelado y descongelado: se puede lograr la lisis mediante la aplicación de varios ciclos de congelado y descongelado. Este método se puede aplicar si la proteína es estable y resiste la desnaturalización. Se debe proteger contra la proteólisis.


Fraccionamiento subcelular:

El fraccionamiento subcelular implica dos procesos:

a- ruptura de la estructura celular b- separación de las distintas subestructuras con

centrifugación diferencial.

El esquema típico empleado para un fraccionamiento

subcelular es el que se representa a continuación:

Precipitado a 1000 g: Es la fracción nuclear cruda. Contiene núcleos y células sin romper.

Precipitado a 10000 g: es la fracción mitocondrial cruda. Contiene mitocondrias, cloroplastos, lisosomas, etc.

Precipitado a 100000 g: Es la fracción microsomal.

Contiene ribosomas, polisomas y microsomas (artificios

formados a partir de la ruptura de estructuras membranosas

como aparato de Golgi, membranas celulares, etc.)

Sobrenadante de 100000 g: es el citosol. Está

constituido principalmente por proteínas solubles, RNA y

otras moléculas como aas, proteínas, hidratos de carbono,

sales, etc. No contiene estructuras membranosas.

Figura: Centrifugaciones repetidas a velocidades progresivamente mayores

fraccionarán los extractos celulares en sus componentes. En general cuanto menor

es el tamaño del componente subcelular tanto mayor será la fuerza centrífuga

necesaria para sendimentarlo. Los valores típicos de los diversos pasos de

centrifugación mostrados en la figura son los siguientes: Vel baja: 1.000 veces la

gravedad (g), 10 min. Vel media: 20.000 g, 20 min

Vel. alta: 80.000 g , 1 hora Vel muy alta: 150.000 g, 3 horas


Determinación de la concentración de proteínas:

* Muchas veces es útil, aunque no esencial, determinar la concentración total de

* Es importante recordar que todos los métodos empleados para la

determinación de la concentración de proteínas son semicuantitativos. La respuesta de las proteínas, por ejemplo en el desarrollo del color en un ensayo espectrofotométrico,

varía con la composición de aas y puede ser influenciado por la presencia de grupos

prostéticos no proteicos, tales como carbohidratos. De tal forma que, si bien la seroalbúmina bovina (BSA) se utiliza universalmente como proteína standard para las

cuantificaciones, es preferible, cuando esto es posible, calibrar el ensayo usando una

muestra de la proteína purificada o una proteína que rinda una coloración similar.

* Absorbancia a 280nm: La mayoría de las proteínas exhiben un máximo de

absorción a 280nm que se atribuye al grupo fenólico de la tirosina o al grupo indólico del

triptofano. El coeficiente de extinción a 280 nm varía de proteína en proteína en el rango

de 0.4 a 1.5 dependiendo de la composición de aas. Existen casos extremos en el que el

coeficiente de extinción es 0 (proteínas que ligan calcio) y 2.5 (lisozima). Se trata, por lo

tanto, de un método poco preciso. Esta técnica es relativamente poco sensible y requiere

entre 0.05 y 2 mg de proteína. Es particularmente sensible a las interferencias de otros

compuestos que absorben a 280 nm, especialmente ácidos nucleicos. La ventaja de éste

método es que es muy rápido y no destructivo, por lo tanto la muestra puede ser usada

para otras determinaciones. Se requieren cubetas de cuarzo.

* Método de Biuret y µBiuret: bajo condiciones alcalinas el ión cobre (II) se

une al nitrógeno del enlace peptídico de proteínas y péptidos desarrollando una

coloración violeta con un máximo de absorción a 540-560 nm. No da interferencia con

aas libres y tiene poca dependencia de la composición de aas. Ya que el reactivo de

cobre reacciona con el enlace peptídico y no con las cadenas laterales de los aas la

mayor desventaja del método es su baja sensibilidad (1-10 mg/ml de proteínas).

Algunos buffers (Tris, por ejemplo) pueden interferir con la reacción.

* Se logra más sensibilidad leyendo a 330 nm (rango 0,1-1 mg)

* Método de Lowry: es el método más utilizado. El fundamento del método se

basa en la reducción del reactivo de Folin por la oxidación de aas aromáticos en una

reacción catalizada por cobre. La reacción da una fuerte coloración azul y es más sensible

que el método de Biuret (0.1 a 1 mg/ml). La eacción depende del pH (10-10.5). La

reacción tiene una moderada dependencia con la composición de aas pero tiene muchos

compuestos que interfieren (aas, buffers, lípidos, azúcares, ácidos nucleicos).

* Método de Bradford: Bajo apropiadas condiciones, los grupos acídicos y básicos de las proteínas interaccionan con grupos disociados de colorantes orgánicos para formar precipitados coloreados. En éste método se utiliza el colorante Coomasie Blue G-250. La unión del colorante a la proteína causa un cambio en el máximo de

absorción del colorante de 465 nm (rojo) a 595 nm (azul). Es un método rápido y simple. Es muy sensible (5-100 µg/ml). Tiene una significativa dependencia con la

composición de aas debido a la unión primaria a grupos básicos (especialmente

argininas) y a residuos aromáticos.


Elección de los métodos de purificación:

* Hay numerosos métodos de purificación disponibles, aunque algunos se

utilizan mucho más frecuentemente que otros. A continuación se mencionan algunos

criterios para la aplicación de una determinada secuencia de los métodos. a) Los primeros pasos en un esquema de purificación son frecuentemente

aquellos que tienen menor poder de resolución tales como la precipitación con sulfato de amonio o para algunas proteínas, la desnaturalización por calor. Estos métodos tienen la ventaja de reducir notablemente la cantidad de proteína total en la muestra. Los métodos de alta resolución pero baja capacidad (ejemplo isoelectroenfoque) se aplican en la parte final del esquema de purificación, cuando la cantidad de proteína total es baja y las proteínas contaminantes están en muy bajas concentraciones.

b) En general es más eficiente utilizar una serie de métodos que exploten propiedades físicas y funcionales de las diferentes proteínas, más que una serie de métodos que exploten las mismas propiedades. Así, cuando se utilizan técnicas cromatográficas, se debe incluir al menos un fraccionamiento por peso molecular (filtración en gel) y al menos un paso de fraccionamiento por carga (cromatografía de intercambio iónico).

c) Durante la cromatografía es común sacrificar algo de rendimiento para

aumentar la pureza. En otras palabras, no hay que tratar de recuperar toda la proteína

en estudio si esto significa incluir cantidades relativamente grandes de proteínas

contaminantes.

d) Algunas técnicas, en particular SDS-PAGE (electroforesis en geles de

poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes), isoelectroenfoque y geles

bidimensionales, no se emplean comúnmente como métodos preparativos para la

purificación de proteínas, sino que usualmente se emplean para analizar el progreso de

la purificación. Son técnicas analíticas de gran resolución.

Procedimientos experimentales:

Desnaturalización por calor: La purificación de proteínas se lleva a cabo

habitualmente a bajas temperaturas ya que la mayoría de las proteínas son estables

entre 0 y 4ºC. A medida que la temperatura se incrementa desde 0 a 37-40ºC su estabilidad decrece significativamente. Sobre los 40ºC la mayoría de las proteínas son

altamente inestables, se desnaturalizan y usualmente precipitan. Sin embargo, cada

proteína individual difiere en la sensibilidad al calor. La estabilidad a la temperatura

de una enzima se determina experimentalmente en extractos después de la incubación a diferentes temperaturas a varios tiempos. Si la proteína en estudio es resistente a

relativamente altas temperaturas, este tratamiento podrá ser utilizado como paso de

purificación.

Precipitación con sulfato de amonio: La solubilidad de las proteínas varía de acuerdo a

la fuerza iónica y por lo tanto de acuerdo a la concentración de sales de la solución. Se

pueden observar dos efectos diferentes. A bajas concentraciones de sales, la solubilidad

aumenta cuando se incrementa la concentración de sales. Este fenómeno se denomina

"salting-in". Sin embargo cuando la concentración de sales aumenta mucho la solubilidad

de las proteínas decrece y en un punto determinado toda la proteína precipita. Este

fenómeno se denomina "salting-out". Las bases teóricas del "Salting-out"


son complejas pero un factor es probablemente la competencia entre la proteína y los

iones por el agua disponible. A altas concentraciones de sales, no hay suficientes

moléculas de agua disponibles para una completa solvatación de las proteínas y por lo

tanto las interacciones proteína-proteína son predominantes sobre las interacciones agua-proteína y ocurre la precipitación. Ya que las proteínas difieren marcadamente en

su solubilidad a alta fuerza iónica, salting-out es un procedimiento muy útil para la

purificación de proteínas. La precipitación con sulfato de amonio se emplea

frecuentemente como uno de los primeros pasos en el esquema de purificación.

Filtración en gel: Un amplio rango de biomoléculas pueden separarse sobre la base de sus

diferencias de tamaño y forma. Este procedimiento se conoce con el nombre de

cromatografía de exclusión molecular o filtración en gel. Se pueden utilizar una amplia

gama de matrices formadas por bolitas porosas de material inerte y altamente hidratado.

Las matrices comerciales más comunes son Sephadex (bolitas de dextrano), Sepharosa y

Bio Gel A (agarosa) y Bio Gel P (poliacrilamida). Cada matriz tiene un rango de de

fraccionamiento que está determinado por el tamaño del poro de las bolitas. Así por

ejemplo, Sephadex G-50 tiene un límite de exclusión de 30.000, lo que significa que todas

las proteínas cuyo PM sea superior a 30.000 no podrán penetrar en el interior de las bolitas

y serán eluídas primero, en lo que se denomina volumen muerto de la columna. Las

proteínas de menor PM quedarán incluidas en la matriz. Cuanto menor sea su PM tendrán

mayor facilidad para penetrar en el interior de gel lo que determinará un mayor número de

intercambio y una menor velocidad de elusión. Se denomina volumen de elusión al

volumen en el que eluye una proteína en particular.


Vo Vo-Vt Vt

Kav = Ve-Vo / Vt-Vo

Kd = Ve-Vo / Vt-Vo-Vmatriz = Ve-Vo / Vi

R = coeficiente de retención = Vo-Ve


Cromatografía de intercambio iónico: una resina de intercambio iónico es una matriz

insoluble con grupos cargados unidos covalentemente. Se disponen comercialmente de

matrices cargadas positiva y negativamente. Las matrices cargadas negativamente ligan

iones cargados positivamente (cationes). Las resinas pueden ligar un tipo de catión pero,

ante la presencia de un segundo tipo de catión lo desplazan o intercambian con el primero.

De manera similar, las resinas de intercambio aniónico están cargadas positivamente y

ligan (e intercambian) iones cargados negativamente. El fraccionamiento de proteínas por

columnas de intercambio iónico depende de la diferencia en las cargas de las distintas

proteínas. La carga de una proteína depende del número y tipo de grupos ionizables. Para

cualquier proteína al pH correspondiente a su punto isoeléctrico no se unirá a ningún tipo

de intercambiador aniónico. Por encima de ese pH la proteína estará cargada

negativamente y se unirá a un intercambiador aniónico. Por debajo de ese pH, estará

cargada positivamente y se unirá a un intercambiador catiónico. Para eluir las proteínas

retenidas en la matriz se puede modificar el pH del medio o bien modificar la fuerza

iónica aumentando la concentración de sales. Esta última es la condición frecuentemente

utilizada.


Cromatografía de afinidad: este tipo de cromatografía es la más específica. La matriz

es usualmente agarosa, poliacrilamida o dextrano, a la cual se une covalentemente un

ligando específico. La naturaleza química del ligando está determinada por alguna

propiedad específica y conocida de la proteína en estudio. En el caso de una enzima, el

ligando elegido es generalmente el sustrato o un inhibidor o activador que se unen

reversiblemente a la enzima. En teoría, la cromatografía de afinidad permitiría la

purificación de una proteína en un único paso. Sin embargo en la práctica esto casi nunca se logra, aunque el grado de purificación que se alcanza es muy bueno.

Desafortunadamente en muchos casos no se conoce ninguna propiedad de la proteína

en estudio o no se dispone de algún ligando que permita la preparación de una

columna de afinidad.

ELECTROFORESIS PAGE: cualquier ión o grupo cargado si es sometido a un campo eléctrico migra a una velocidad determinada. Ya que las proteínas tienen una carga neta a cualquier pH

diferente a su punto isoeléctrico, ellas también migrarán y su velocidad de migración

dependerá de la densidad de carga (relación carga/masa). A mayor relación carga / masa

mayor velocidad de migración. El medio más frecuentemente utilizado las para

electroforesis es poliacrilamida. La poliacrilamida resulta de la polimerización de

monómeros de acrilamida en cadenas largas y entrecruzamiento de estas cadenas por

compuestos bifuncionales como la bis-acrilamida. Esta reacción crea una matriz porosa

con un tamaño de poro controlado. La forma de controlar el tamaño del poro es

modificando la concentración de acrilamida y bis-acrilamida. Así, durante la electroforesis

en geles de poliacrilamida, las proteínas están sometidas a un efecto de filtrado molecular,

por el cual las proteínas más grandes migran más lentamente en relación a las proteínas

menores . Por lo tanto la separación de proteínas nativas en buffers no disociantes

depende tanto de la carga como de la masa de proteína. Aunque la electroforesis, en condiciones nativas o desnaturalizantes, es útil en un número

de situaciones, especialmente cuando se desea detectar una proteína particular a través de

su actividad biológica, en la mayoría de los estudios se utilizan condiciones que disocian a

las proteínas en sus subunidades. El agente de disociación mas frecuentemente utilizado es

SDS (sodium dodecyl sulfate). La electroforesis en PAGE-SDS permite un rápido análisis

de la composición de una mezcla de proteínas y es extremadamente útil para monitorear la

pureza de la muestra durante su purificación.


Para el análisis en PAGE-SDS, la muestra se desnaturaliza por calor a 100 ºC durante

2 a 5 min, en presencia de un exceso de SDS y 2-β-mercaptoetanol (para clivar los

puentes disulfuro). Bajo estas condiciones, la mayoría de los polipéptidos se unen al

SDS en una relación 1.4 g de SDS por gramo de polipéptido. Como consecuencia de

esto el detergente le otorga a la proteína una carga neta negativa que hace

insignificante la carga intrínseca del polipéptido. Ya que la distancia de migración de

los polipéptidos es inversamente proporcional al log del peso molecular, la proteína de

interés puede ser identificada en el gel si se conoce el PM de las subunidades que la

constituyen, o inversamente, puede determinarse el PM de cada subunidad.

Parámetros de purificación: Tabla de Purificación.

Muestra Vol Proteínas Proteínas Actividad Actividad Actividad Purificación Rendimiento

ml mg/ml

Totales Total Específica

mg U/ml U U/mg %

Homog. A 1

Paso de

A

B C

Purificación

(PP)

A: Activdad total B: Actividad específica PP

Masa de Proteínas Actividad específica Homog

C: Actividad total PP

Actividad total Homog


ESPECTROMETRÍA DE MASAS

La espectrometría de masas (MS) permite analizar la composición de diferentes elementos químicos e

isótopos atómicos, separando los núcleos por su relación masa-carga. En el caso de la identificación de la

estructura primaria de las proteínas, la MS presenta numerosas ventajas frente al método de Edman: es

más sensible, permite analizar directamente las mezclas proteicas y ofrece un mayor rendimiento por

muestra. Por ello, es el método utilizado en las dos técnicas de identificación de proteínas más comunes:

la identificación por huella peptídica y el análisis MS/MS (solo veremos el primero).

Identificación por huella peptídica

Se puede partir de proteínas separadas en gel o proteínas en solución. En cualquiera de los casos, se añade

una proteasa con un patrón de corte conocido (típicamente, tripsina), generándose una colección o

conjunto de péptidos. Habitualmente, esta colección de péptidos será lo suficientemente específica como

para poder identificar la proteína con la que estamos trabajando.

Los péptidos trípticos son analizados por MS en un equipo denominado MALDI-TOF (MALDI por sus

siglas en inglés Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization y TOF por el nombre en inglés del

detector: time of flight). En este equipo cada péptido tiene un tiempo de permanencia o “tiempo de

vuelo” inversamente proporcional a su masa.

Por último se realiza la comparación del espectro de masas con la información almacenada en bases de

datos de secuencias conocidas, como Swiss-Prot o nr-GenBank. Para ello existen motores de búsqueda

como MASCOT (http://www.matrixscience.com/search_form_select.html) que ordenan las proteínas

identificadas asignándoles puntos en función del número de coincidencias entre las masas de los péptidos

de la proteína a identificar, con la masa de los péptidos trípticos teóricos de las proteínas de la base de

datos.

http://www.matrixscience.com/search_form_select.html


ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS Amino ácidos - Notas claves

Amino ácidos Todas las proteínas están formadas por el mismo juego estándar de 20 aas.

Un aa típico tiene un grupo amino primario, un grupo carboxilo, un átomo de hidrógeno y

una cadena lateral (grupo R) unidos a un átomo de carbono α central (Cα). La prolina es la

excepción a esta regla por poseer un grupo amino secundario.

Enantiómeros Los 20 aas, excepto la glicina, tienen cuatro grupos diferentes ordenados

tetraédricamente alrededor del átomo de Cα y por lo tanto pueden existir en configuración

D o L. Estos dos enantiómeros son imágenes especulares que sólo pueden distinguirse

sobre la base de su diferente rotación de la luz polarizada en el plano. Sólo los isómeros L

se encuentran en las proteínas.

Los 20 aa’s estándar tienen diferentes grupos R y muestran diferentes propiedades

físico-químicas (polaridad, acidez, basicidad, aromaticidad, tamaño, inflexibilidad

conformacional, habilidad de formar puentes hidrógeno, habilidad de

entrecruzamiento y reactividad química).

Glicina (Gly, G) tiene un átomo de hidrógeno como grupo R.

Alanina (Ala, A); valina (Val, V); leucina (Leu, L); isoleucina (Ile, I) y metionina (Met, M) tienen grupos R alifáticos de diferentes estructuras, hidrofóbicos y químicamente inertes. Fenilalanina (Phe, F); tirosina (Tyr, Y) y triptofano (Trp, W) tienen grupos R aromáticos de naturaleza hidrofóbica. Prolina (Pro, P) tiene un grupo R alifático unido al grupo amino (imino ácido). Es conformacionalmente rígida. Cisteína (Cys, C) tiene un grupo R que contiene azufre. Es un grupo R hidrofóbico, altamente reactivo, que puede formar un enlace disulfuro con otro residuo de cisteína.

Arginina (Arg, R) y lisina (Lys, K) son aas básicos con grupos R cargados positivamente,

mientras que el grupo R de la histidina (His, H) puede estar cargado positivamente o sin

carga a pH neutro. Acido aspártico (Asp, D); ácido glutámico (Glu, E) tienen grupos R ácidos, cargados negativamente a pH neutro. Asparagina (Asn, N) y glutamina (Gln, Q) tienen amidas como grupos R. Serina (Ser, S) y treonina (Thr, T) tienen hidroxilos en sus grupos R. Todos estos aas son polares y sin

carga y pueden formar puentes hidrógeno.

Datos útiles: * El β-mercaptoetanol reduce las cistinas rompiendo los puentes disulfuro y el SDS otorga carga homogénea a las proteínas determinando que corran exclusivamente por su tamaño. * PM promedio de un aminoácido = 120; de la glucosa libre = 180; de la glucosa formando parte de la cadena = 162. * tripsina corta dejando libre el carboxilo de Arg y de Lys. * Quimotripsina corta dejando libre el carboxilo de Phe, Tyr y Trp. * Bromuro de cianógeno rompe enlaces peptídicos con carbonilo aportado por met.

* Cistina = Cys (S-S)Cys


Disociación de grupos ionizables de aminoácidos

GRUPO aa libre RANGO de pK

En polipéptido

- carboxilo (Ct) 1.8-2.5 1.8-2.5

- amino (Nt) 8.9-9.7 7.5-8.5

- carboxilo (Glu,Asp) 3.8-4.3 3.0-4.7

- amino (Lys) 10.5 9.4-10.6

- OH fenólico (Tyr) 10.1 9.8-10.4

- Imidazol (His) 6 5.6-7.0

- Guanidinio (Arg) 12.5 11.6-12.6

- Sulfidrilo (Cys) 8.3 9.4-10.8

CATALISIS BIOLÓGICA: ENZIMAS

Notas claves Termodinámica

Energía de activación y estado de transición

Cambio en energía libre: La diferencia en el nivel de energía entre sustratos y productos se

denomina cambio en la energía libre de Gibbs (∆G). Un ∆G negativo indica que la reacción es

termodinámicamente favorable en la dirección indicada, mientras que un ∆G positivo indica que

la reacción no es termodinámicamente favorable y requiere la entrada de energía para que la

reacción proceda en la dirección indicada.. Si el cambio en energía libre (∆G) de una reacción es

negativo, dicha reacción puede ocurrir espontáneamente. Una reacción energéticamente

desfavorable es conducida frecuentemente por el acoplamiento a una reacción energéticamente

favorable, como por ejemplo la hidrólisis de ATP.

Equilibrio químico: Una reacción química frecuentemente existe en un estado de equilibrio

dinámico. La constante de equilibrio (K) define la relación de las concentraciones de

sustrato y productos en el equilibrio. Las enzimas no alteran el equilibrio sino que aceleran

el logro del equilibrio aumentando la velocidad de las reacciones en ambos sentidos. Introducción a las enzimas

• Catalizadores • Sitio activo • Especificidad por sustrato • Clasificación • Medición de actividad • Isoenzimas.

Cinética enzimática Velocidad de la reacción enzimática. La actividad enzimática se expresa comúnmente como la

velocidad inicial (V0) de la reacción catalizada. Las unidades de V0 son umol min-1, que puede

ser también representada por la unidad (U) o el katal (kat) (1 umol min-1 = 1U = 16.67 nanokat). El término actividad (actividad total) se refiere a las unidades totales de enzima en la muestra, mientras que la actividad específica es el número de unidades por miligramo de

proteína (U mg –1

).


Relaciones entre diferentes concentraciones de sustratos y las velocidades de

reacción Relaciones entre diferentes concentraciones de la enzima y las velocidades

de reacción Efecto de la Temperatura y el pH sobre la velocidad de reacción Modelo de Michaelis-Menten: Supuestos en los que se basa el modelo, significado de los parámetros de la ecuación de Michaelis y su relación con los parámetros que describen las

siguientes ecuaciones:

Vmax [S]

V0 =

Km + [S]

Lineweaver-Burk y la determinación experimental de Km y

Vmax Inhibición enzimática - Inhibición reversible e irreversible, competitiva y no competitiva. Características y análisis de los parámetros cinéticos Regulación de la actividad enzimática Regulación feedback y moléculas efectoras. En algunas vías metabólicas, los productos

finales son frecuentemente inhibidores “feedback” de las primeras etapas de la misma vía

para evitar la acumulación de intermediarios y el uso innecesario de metabolitos y energía. Enzimas alostéricas, propiedades: Modificaciones covalentes reversibles, Activación

proteolítica Síntesis y degradación.

ESTRUCTURA DE HIDRATOS DE CARBONO

Monosacáridos y disacáridos – Notas claves • Aldosas y cetosas • Estereoisómeros • Estructuras cíclicas • Disacáridos • Derivados • Nomenclatura

Polisacáridos y oligosacáridos – Notas claves • Polisacáridos • Glucógeno • Almidón • Dextrano • Celulosa • Oligosacáridos

Método de identificación y secuenciación


Determinación de azúcar reductor

Uno de los problemas más importantes en la investigación bioquímica es la necesidad de

contar con métodos analíticos adecuados.

Los materiales biológicos con los que se trabaja normalmente distan mucho de ser simples, lo que determina que los métodos empleados para la determinación de una sustancia en particular tengan en cuenta las probables interferencias. Uno de los métodos analíticos sumamente importante en la resolución de muestras de azúcares es la determinación de azúcares reductores. El tratamiento de glucosa con álcali diluido, rinde una mezcla en equilibrio de glucosa, fructosa y manosa. Esta reacción tiene lugar con intervención de formas enólicas intermediarias, llamadas enodioles (isomerización en el C1 y C2)

O

H

C H C OH

OH

H H C

H C OH C OH C O

H C OH H C OH

H C OH

Aldosa Enodiol Cetosa

Isomerización de azúcares por tratamiento con álcali.

Los azúcares con el grupo carbonilo libre son los capaces de formar el enodiol intermediario

en medio alcalino, y por ende son reductores ya que es ese intermediario la forma reactiva

de los azúcares en una reacción de óxido-reducción. Uno de los métodos más utilizado para la determinación de azúcar reductor es el de

Somogy-Nelson.En este método se produce la reducción del ion Cu2+

a Cu2O por acción de

los azúcares en medio alcalino y caliente. Luego por acción del Cu2O sobre el reactivo de Nelson (arsenomolíbdico) se forma un complejo coloreado, en el que el Mo se ha reducido. Este complejo se determina espectrofotométricamente a 540 nm.

SECUENCIACIÓN DE OLIGOSACÁRIDOS

Para analizar un oligosacárido se deben tener en cuenta los siguientes puntos: a) composición de azúcares. b) sitios de unión glicosídica.

c) configuración anomérica de los enlaces glicosídicos.

a) Composición El primer paso en la secuenciación es determinar la composición de monosacáridos. Para hidrolizar la cadena de oligosacáridos se utilizan principalmente dos métodos: 1) Se puede utilizar una solución acuosa ácida para liberar los monosacáridos (ClH 2-4 N durante 3-6 horas a 100 ° C).Luego de la hidrólisis ácida, los monosacáridos liberados se transforman en derivados (acetatos) y se los analiza por cromatografía gaseosa con espectrometría de masas. 2) Un método alternativo al método anterior es utilizar cloruro de metilo anhidro, que es

menos destructivo.


b) Uniones glicosídicas

Otro paso importante en la secuenciación de un oligosacárido es conocer el tipo de enlace

entre cada monómero. Cada monosacárido está unido a uno de sus vecinos a través del C1

anomérico y por otro átomo de C a otro monosacárido. En el caso de las cetosas la unión se

hace a través del C2. La posición de las uniones glicosídicas se determina por metilación

exhaustiva. En esta reacción se metilan los hidroxilos libres, es decir aquello que no están involucrados en

uniones.Luego el oligosacárido metilado se hidroliza para romper las uniones glicosídicas y los

nuevos hidroxilos libres son acetilados.

c) Configuración anomérica y secuenciación

Para la secuenciación se pueden utilizar métodos enzimáticos y químicos. Para las

determinaciones enzimáticas se utilizan exoglicosidasas específicas para tipos de uniones y

tipo de azúcares.

Para ello el oligosacárido se trata en forma secuencial con una serie de enzimas específicas

para uniones y azúcares. Cada enzima puede liberar los azúcares terminales, dependiendo de

la secuencia y del tipo de enlace ( y ).

La información que se obtiene con el tratamiento de las exoglicosidasas se confirma por los

análisis de metilación exhaustiva.

La ventaja del uso de las exoglicosidasas es que es una técnica muy sensible y debido a la

especificidad de las enzimas es posible conocer en gran detalle la estructura de

oligosacáridos complejos

Acción del ácido periódico

El ácido periódico produce oxidación de dioles vecinales, hidroxi vecinales y carbonilos

vecinales. De acuerdo a los productos obtenidos se puede determinar el tamaño del anillo (anillo

de 6 C o 5 C), o el lugar de las ramificaciones.

La acción del IO4H produce liberación de ácido fórmico o formaldehído, según la estructura del azúcar.

El ácido fórmico liberado es titulado con NaOH para cuantificarlo.

Los moles de ácido fórmico liberado dan una medida de los extremos no reductores que

presenta el oligosacárido.


1 mol oligosacárido oxidado

1 mol oligosacárido 3 moles ácido fórmico

1 mol fomaldehído

En el caso particular de analizar un oligosacárido con enlaces 1- 4 se obtendrían los siguientes

compuestos

Si las uniones fueran diferentes hay que analizar los sitios de acción del periodato y los

productos obtenidos

Determinación de la estructura de mono- di - y polisacáridos


METABOLISMO ENERGÉTICO:

Los problemas propuestos para contribuir al conocimiento y comprensión del

metabolismo energético de células animales y vegetales se han organizado en cuatro guías

que se detallan a continuación. Finalizada cada una de ellas se recomienda al estudiante

integrar los conceptos aplicados con los utilizados previamente dentro del bloque. Para

realizar esta integración se propone seguir el esquema de las figuras 1 y 2.

Conocimientos y conceptos a utilizar para la resolución de las guías de problemas:

a- Estructura de Hidratos de carbono: métodos para su análisis

b- Enlaces de alta energía: ATP, transporte de electrones: fosforilación oxidativa, fotosíntesis: Fase lumínica y fase oscura

c- Ciclo de Krebs: reacciones de oxidorreducción y coenzimas de nicotinamida, localización y función biológica. Termodinámica, sistemas acoplados

d- Glucólisis y Gluconeogénesis: regulación, balance energético.

Figuras 1, 2 y 3obtenidas de “Molecular Cell Biology” Albert y col.

Figura 1


Figura 2

Figura 3


WESTERN BLOT:

Es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas. Este método

permite la detección de una sola proteína dentro de una muestra biológica. La especificidad

de Western Blot se logra mediante la utilización de un anticuerpo que reconoce y se une a

un epítope único de la proteína de interés. Con esta técnica se puede estimar el tamaño de

una proteína, confirmar la presencia de modificaciones post-traduccionales y ser utilizado

para comparar cuantitativamente los niveles de proteína entre muestras.

Proceso:

Se parte de una mezcla de proteínas extraídas de tejido en estudio.

Las proteínas en el extracto se separan de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis en

un gel de acrilamida conteniendo dodecilsulfato de sodio (SDS). El SDS se une a las

proteínas y confiere, de forma proporcional a la masa de cada proteína, una carga negativa a

cada una de ellas.

Las proteínas son transferidas electroforéticamente a un soporte rígido o membrana, dónde

quedan inmovilizadas.

La membrana con las proteínas inmovilizadas debe tratarse para bloquear las zonas con

ausencia de proteínas y así evitar la unión no específica de los anticuerpos. A continuación

se incuba con un anticuerpo primario dirigido contra el epítope específico de la proteína

diana. Tras varios lavados de la membrana, se adiciona un anticuerpo secundario marcado

que se unirá de forma específica al anticuerpo primario, proporcionando una forma de

detección.

Después de un lavado de la membrana para eliminar el anticuerpo no unido, se procede a

detectar la localización de la banda en la membrana. Para la detección de

quimioluminiscencia, se utiliza un anticuerpo secundario conjugado con el enzima

peroxidasa (HRP); la adición de un sustrato de HRP provoca una reacción enzimática que

da como resultado final la emisión de luz la cual puede ser detectada por autrorradiografía.

La detección de fluorescencia se basa en la captación de luz emitid por sustancias

fluoróforas conjugadas con el anticuerpo secundario.


LÍPIDOS Estructura y función de los ácidos grasos

Notas claves

Estructura y propiedades

Nomenclatura

Funciones Prostaglandinas

Introducción Los lípidos son compuestos primarios en las células, donde funcionan como elementos estructurales de las membranas y de tejidos especializados como el nervioso, reserva energética, activadores específicos de enzima, transportadores de restos carbohidratos en la síntesis de glicoproteínas y como reguladores de funciones orgánicas (vitaminas liposolubles o el grupo de hormonas esteroides). Con el nombre de lípidos se agrupan compuestos biológicos químicamente heterogéneos caracterizados por la presencia, en su estructura, de compuestos parafínicos como son principalmente los ácidos grasos o cadenas similares, que por su carácter hidrofóbico les confieren la característica solubilidad en solventes neutros /orgánicos) y la insolubilidad en agua. También integran la estructura de distintos lípidos compuestos tan variables como el glicerol, aminoalcoholes (etanolamina), aminoácidos (serina), ácido fosfórico, monosacáriodos y oligosacáridos, que introducen en los lípidos grupos polares hidrofílicos que les imparten propiedades químicas y físicas características. Con estructuras tan diferentes la solubilidad de los lípidos es muy variada ofreciendo las bases para su fraccionamiento.

Preparación de extractos lipídicos 1) Extracción: Debido a las características estructurales de los lípidos su extracción de diferentes materiales biológicos se realiza con mezclas de solventes orgánicos adecuadas. Un método general para extraer lípidos de tejido húmedo consiste en el uso de la mezcla

cloroformo:metanol en proporción 2:1, seguido de una filtración y posterior lavado. 2) Partición: La fracción no lipídica se remueve particionando con un solvente polar. El filtrado obtenido se mezcla con 0,2 volúmenes de agua o una solución salina

(Cl2Ca 0,003 N). Se obtienen entonces dos fases que se separan por centrifugación . La fase superior con el material contaminante no lipídico se descarta y la fase inferior que contiene los lípidos se lava con una mezcla de solventes. Una vez obtenida la fracción lipídica se procede a su concentración por evaporación del solvente bajo una atmósfera de nitrógeno. 3) Separación: uno de los principales métodos utilizados para separar e identificar las

distintas clases de lípidos es la cromatografía en capa delgada (TLC). Con este método se pueden separar sustancias hidrófilas y sustancias hidrófobas (lípidos).


La TLC usa generalmente sílica gel como adsorbente, esta fase fija se suspende en

agua y deposita sobre placas de vidrio ( o metálicas o plásticas) que luego de secarse

queda adherida como una capa delgada de 0,1 a 2 mm de espesor. El disolvente o fase

móvil es en general una mezcla de solventes elegido de acuerdo a los lípidos que se

vaya a separar. Se deja correr el cromatograma y los compuestos presentes en el extracto estarán a distintas distancias desde el origen. Esto dependerá de su estructura química, de la naturaleza del adsorbente y la composición del solvente. Dado que los compuestos separados son incoloros, el cromatograma se revela con algún reactivo especial de manera de detectar las manchas. Se deben sembrar en el mismo cromatograma compuestos standard para comparar la posición (Rf) de estos compuestos con las distancias de las manchas correspondientes a los compuestos del extracto. Rf : Relación de frente: Movimiento relativo de un compuesto con respecto al frente alcanzado por el solvente. Es una propiedad característica y reproducible. d) Revelado: uno de los reactivos más utilizado para revelar los lípidos es el vapor de iodo, debido a su propiedad de unirse a los dobles enlaces de los ácidos grasos insaturados. (Aparecen manchas marrones sobre un fondo amarillo). FIG. 1 e) Densitograma: Una vez realizado el análisis cualitativo del cromatograma se realiza su cuantificación mediante un densitograma. Luego de identificar los compuestos se puede raspar la zona de la mancha del cromatograma y eluirla para su posterior cuantificación.

Cromatografía de ácido silícico Otra técnica ampliamente usada para la separación de los compuestos lipídicos de un extracto es la cromatografía en columna de ácido silícico. Según este método los lípidos están generalmente más fuertemente adsorbidos a medida que la polaridad aumenta, desde hidrocarburos hasta los fosfolípidos. Para eluírlos de la columna se va incrementando la polaridad del solvente. FIG 2

Cromatografía en fase gaseosa La cromatografía en fase gaseosa es particularmente apropiada para la separación de gases y líquidos volátiles o sólidos en estado gaseoso. se emplea para analizar cuali y cuantitativamente mezclas de ácidos grasos de esteroles, de hidrocarburos así como de otros compuestos que son volátiles o pueden convertirse químicamente en derivados volátiles. La cantidad de muestra necesaria para el análisis está en el orden de los microgramos. Las separaciones son función distribución diferencial de las moléculas del soluto entre el

flujo de gas inerte (nitrógeno, argón) que es la fase móvil y un sólido o un líquido

dispuesto sobre un sólido que constituye la fase estacionaria. Los compuestos que van

siendo separados abandonan la columna a determinados y diferentes tiempos (tiempo de

retención de cada componente) y son medidos a la salida de la columna por un detector. El

detector más empleado y de mayor sensibilidad es el detector de ionización de llama.


Fig.1 Fig.2

TIPOS DE CENTRIFUGACIÓN

a) Centrifugación diferencial: Se emplea comúnmente como metodología inicial para

el aislamiento de fracciones celulares (mitocondrias, núcleos, etc.) b) Centrifugación isopícnica diferencial de equilibrio: Separa las partículas por su

densidad. Generalmente para la preparación del gradiente se usan sales de metales

pesados, como por ejemplo cesio o rubidio, si bien también puede utilizarse sacarosa.

La muestra se mezcla homogéneamente con una disolución concentrada de CsCl. La

centrifugación de la misma produce un gradiente de concentración de sal y por lo tanto

un gradiente de densidad que se forma debido a la gran masa del ión cesio. Entonces

tiene lugar la redistribución de las moléculas en el gradiente y el campo centrífugo las

lleva hacia una región en la que la densidad de la disolución es igual a su propia

densidad de flotación.


c) Centrifugación zonal: El principio se separación es por el coeficiente de

sedimentación (S) de las partículas. Implica la formación de una capa de la muestra en

un gradiente de densidad líquido continuo. La muestra se somete a centrifugación

hasta que se haya efectuado la separación deseada, esto es, antes de su sedimentación

completa, pero después del tiempo suficiente para que las partículas se hayan

trasladado por el gradiente para formar zonas o bandas discretas.

Centrífugas preparativas

a) De uso general máxima: 6.000 rpm (6.000 g). Los rotores pueden ser de ángulo

fijo o de ángulo móvil. Difieren solamente en su capacidad de carga (tubos de 10, 50 y

100 ml). b) De alta velocidad: velocidad máxima 25.000 rpm (89.000 g). La cámara del rotor

está refrigerada para eliminar el calor producido por la fricción entre el aire y el rotor.

c) Ultracentrífuga preparativa: velocidad máxima 75.000 rpm (510.000 g). Las

cámaras del rotor están a la vez refrigeradas y evacuadas para así minimizar la

producción de calor por fricción.


MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN

Método de Maxam y Gilbert (Método Químico): Este método usa reactivos químicos

que reaccionan con bases especificas para romper el ADN preferencialmente en

determinados nucleótidos. Primeramente las cadenas de ADN se marcan radiactivamente

en el extremo 5´, y se separan (solamente una se va a secuenciar). Luego, la cadena a

secuenciar se trata con cuatro reactivos químicos diferentes que tienen la capacidad de

cortar la cadena en uno o dos nucleótidos específicos. El tratamiento no es exhaustivo, de

manera que reacciona un solo residuo de la/s base/s susceptibles. Por consiguiente, en

cada mezcla de reacción, se generan un conjunto de fragmentos radiactivos. Finalmente,

estos fragmentos son separados por tamaño utilizando una electroforesis en gel de

poliacrilamida. El revelado del gel por autorradiografía, permite visualizar las bandas

radiactivas correspondientes a los distintos fragmentos, y a través de ellos se va armando

la secuencia.


Método de Sanger (Método Enzimático): En este método se usa la enzima ADN

polimerasa I para producir fragmentos de ADN de diferentes tamaños, que luego al ser

separados mediante electroforesis, permite como en el método químico, leer el orden de

los nucleótidos. Se usa ADN de simple cadena como templado para la síntesis de cadenas de ADN complementarias usando como sustratos 2´3´ dideoxinucleótidos y los cuatro nucleótidos normales. Los dideoxinucleótidos se incorporan a la cadena de ADN, pero no permiten su elongación posterior, dado que no pueden formar uniones fosfodiéster con el siguiente precursor. Se producen entonces, una serie de cadenas de ADN incompletas que terminan específicamente en el dideoxinucleótido. Para determinar la secuencia se realizan por separado cuatro reacciones de síntesis de ADN, cada una con un nucleótido finalizador de cadena diferente, sus productos de separan por electroforesis en gel de poliacrilamida y se detectan posteriormente por

autorradiografía.


TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

La Tecnología del ADN recombinante constituye una mezcla de técnicas, entre las que

podemos citar:

1) Corte específico del ADN mediante nucleasas de restricción 2) Amplificación y clonado del ADN que posibilita integrar un fragmento específico de ADN en un elemento genético de replicación rápida (plásmido) para que pueda ser reproducido en bacterias o levaduras 3)Secuenciación del ADN 4) Hibridización de los ácidos nucleicos, que permite identificar secuencias específicas de ADN o ARN con gran exactitud, debido a la capacidad de los ácidos nucleicos de unirse a secuencias complementarias. 1)Nucleasas de Restricción Muchas bacterias producen estas enzimas, que son capaces de cortar al ADN en

sitios determinados, ya que reconocen secuencias específicas de cuatro o seis nucleótidos. Una nucleasa de restricción determinada cortará cualquier doble hélice de ADN en una serie de fragmentos conocidos como fragmentos de restricción. Muchas nucleasas de restricción producen cortes escalonados, que dejan fragmentos cortos de una sola hebra en ambos extremos. Estos extremos se denominan "extremos cohesivos", ya que son complementarios con cualquier otro extremo producido por la misma enzima. Cuando los dos extremos se han unido gracias al apareamiento de bases complementarias, pueden sellarse por la acción de una enzima conocida como ligasa, que forma enlaces fosfodiester covalentes entre los extremos opuestos de cada hebra de ADN. 2) Amplificación y clonado del ADN La obtención de fragmentos específicos de ADN para diversos fines (secuenciación, clonado, expresión) se ha simplificado enormemente a partir del desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (“PCR”). Este proceso permite obtener grandes cantidades de ADN sin necesidad de clonar. La PCR requiere un par de cebadores que, por lo general, son fragmentos cortos de ADN sintetizados químicamente (oligonucleótidos) que tienen secuencias de nucleótidos específicamente complementarias a aquellas en las hebras opuestas que flanquean la región blanco. Estos cebadores definirán los extremos del segmento de ADN que se duplicará. La fuente original del molde o templado de ADN no tiene que estar altamente purificada y aun una cantidad muy pequeña del templado puede servir como iniciador de la PCR. La muestra de ADN se calienta, permitiendo que las hebras complementarias se separen. Entonces se añaden los cebadores junto con una enzima polimerizante del ADN. Los cebadores se unen a las cadenas de una sola hebra durante la fase de enfriamiento, y la enzima polimerizante extiende al cebador a lo largo del resto del fragmento, creando moléculas de ADN doble hebra. Entonces el proceso se repite, es decir se calienta la mezcla nuevamente y durante las sucesivas fases de enfriamiento, los cebadores sobrantes se unen a las hebras molde y se alargan mediante la enzima polimerizante para producir mas moléculas de doble hebra. Teóricamente, después de 20 de estos ciclos una molécula sencilla de ADN puede amplificarse a un millón de copias. Con esta cantidad de ADN se pueden fabricar sondas, realizar secuencias, etc. Fragmentos de ADN procedentes de cualquier fuente también pueden ser amplificados

mas de un millón de veces insertándolos en un plásmido o en un virus bacteriano

(bacteriófago) y luego cultivándolo en células bacterianas o de levaduras. Este proceso se

denomina clonado del ADN. Los plásmidos son pequeñas moléculas circulares de


ADN duplex que se presentan en forma natural en bacteria y levaduras, donde se

replican como unidades independientes cuando prolifera la célula huésped. Estos vectores a menudo confieren resistencia a antibióticos. Estas propiedades y su reducido tamaño los hace muy útiles como herramientas de clonado y multiplicación del ADN. Pueden ser cortados con enzimas de restricción y luego se les puede ligar el fragmento de ADN que se desee clonar. Luego, las moléculas híbridas (Vector + ADN insertado) se introducen nuevamente en bacterias que transitoriamente se han hecho permeables a las macromoléculas. Solo algunas de las células tratadas incorporarán el plásmido. Estas células pueden seleccionarse mediante la resistencia a antibióticos que les habrá conferido el plásmido, ya que sólo estas células crecerán en presencia de antibióticos. Al dividirse estas bacterias, también se replicará el plásmido, produciéndose así un enorme número de copias del mismo. ADNc Una estrategia alternativa al proceso anteriormente descrito consiste en empezar el

proceso de clonado seleccionando sólo aquellas secuencias de ADN que fueron

transcriptas ( es decir, que produjeron ARN). Esto se lleva a cabo extrayendo el ARNm de

las células y haciendo una copia de ADN de cada molécula de ARNm presente (la cual se

denomina ADN copia o ADNc). Esto es posible gracias a la enzima transcriptasa reversa

que cataliza el proceso de síntesis de una cadena complementaria de ADN sobre un patrón

de ARN. Las moléculas de ADNc de una sola hebra sintetizadas mediante la transcriptasa

reversa pueden ser amplificadas por PCR (obteniéndose una molécula doble hebra) o ser

convertidas en moléculas de ADNc doble hebra por la ADN polimerasa. Estos fragmentos

pueden insertarse en los plásmidos y clonarse. Es posible construir plásmidos de tal manera que el ADNc clonado dirija la síntesis dentro de una célula de grandes cantidades de la proteína codificada por el ADNc (recordar que se originó a partir de un ARNm). Se puede inducir a bacterias a producir cantidades enormes de proteínas útiles como la insulina o el interferón.

3) Secuenciación Es de suma utilidad conocer la secuencia exacta de un determinado fragmento de ADN, ya que partir de este dato se pueden fabricar oligonucleótidos para amplificaciones por PCR o saber cuales enzimas de restricción pueden ser útiles para clonar ese ADN. El método más usado en la actualidad es una variante del método enzimático ideado por Sanger. Gracias a la automatización de este proceso, y combinando varias técnicas de Biología Molecular se ha llegado a determinar la secuencia completa del genoma de varias especies, (entre ellas la humana). Todas las secuencias de genes conocidos forman parte de bancos de datos de libre acceso en Internet. Esto permite identificar secuencias desconocidas por comparación con estos bancos, como así también obtener datos acerca de secuencias de interés.

4) Hibridización Las hebras complementarias del ADN, producto de su desnaturalización pueden formar de nuevo una doble hélice si se mantienen a 65ºC durante un período prolongado; proceso denominado hibridización del ADN. Se producen reacciones de hibridización similares entre dos cadenas cualquiera de ácido nucleico de una sola hebra (ADN/ADN; ARN/ARN, ADN/ARN) siempre que tengan una secuencia de nucleotidos complemenaria. Puesto que la velocidad de formación de la doble hélice está limitada por la velocidad a la que chocan dos cadenas complementarias de ácido nucleico, es posible medir la concentración de las moléculas de ADN que presentan una secuencia particular de


nucleótidos a partir de la velocidad con que la preparación del ADN en cuestión se

hibridiza con una sonda de ADN clonado marcada radiactivamente de secuencia

complementaria al ADN problema. Se trata de una prueba tan exacta que puede

detectar incluso secuencias complementarias cuya concentración sea una molécula por

célula. A partir de estas mediciones se puede determinar el número de copias de la

secuencia de ADN contenida en la sonda clonada que existen en el ADN de una

célula. También se pueden realizar estudios de hibridización con el ARN aislado de las células, para determinar si la secuencia de ADN que se ha clonado es una de las que se transcriben a ARN, y en caso afirmativo, cuantas copias del ARN se producen por célula y en que tipos de células y tejidos . Las sondas radiactivas de ADN clonado se utilizan ampliamente para localizar secuencias determinadas de ácido nucleico en mezclas de fragmentos de restricción de ADN separados por electroforesis sobre gel. Se realiza una copia del gel, transfiriendo todos los fragmentos de ADN a una membrana cargada (nitrocelulosa o nylon) mediante difusión, proceso denominado “transfer”. Luego, mediante autorradiografía, se identifican las localizaciones de los fragmentos que se hibridizan con la sonda de ADN radiactivo. Si el material contenido en la membrana es ADN, el estudio se denomina "Southern blot" Este proceso también puede realizarse sobre ARN. Si el material transferido a la membrana es ARN, el estudio se denomina "Northern blot" Estas denominaciones son independientes del tipo de sonda usada (ARN, ADN o ADNc).

RADIACTIVIDAD

Los átomos existentes en la naturaleza pueden dividirse en dos grupos: estables e

inestables. Estables son aquellos que no cambian su identidad espontaneamente en el

tiempo. Los átomos inestables pierden su identidad por transformación en otros. La

mayoría de los elementos conocidos existen como mezclas de isótopos, es decir

átomos que contienen el mismo número de protones, pero no de neutrones. Se llama nucleido a una especie atómica que está definida por su masa, su carga nuclear y el estado energético de su núcleo (combinación particular de neutrones y protones). Cuando la combinación es inestable con respecto a la desintegración nuclear se los denomina radionucleido. Tanto los isótopos estables como los radiactivos son utilizados en investigaciones biológicas.

Cómo se desintegran los nucleidos? El fenómeno mediante el cual el nucleido de un átomo se transforma espontáneamente en otro, recibe el nombre de desintegración radiactiva. En cada desintegración radiactiva el núcleo pierde aproximadamente una milésima parte de su masa en forma de radiación. Los nuevos elementos originados como productos finales del proceso de desintegración suelen no ser radiactivos. Se pueden identificar tres tipos de radiaciones: alfa (α), beta (β) y gama (γ). Rayos alfa: son núcleos de Helio, o sea átomos de Helio que han perdido sus dos

electrones, adquiriendo una doble carga positiva. Los átomos recorren en el aire entre

3 y 7 cm antes de chocar con otros átomos que encuentran a su paso. Estas partículas

son retenidas por una hoja de papel o una lámina de aluminio de 0,05 mm de espesor.


Rayos beta: son electrones. Un neutrón nuclear se convierte en un protón nuclear y un

electrón. la emisión de una partícula beta (electrón) resultará e un isótopo estable con

un N atómico mayor en una unidad y un peso atómico idéntico al radioisótopo

original.

Ej.: 146C 14

7N + e-

Las partículas son emitidas en una escala continua de energía desde cero hasta el valor

máximo (E max). Dicho valor es característico de cada radioisótopo. Los rayos beta recorren distancias mayores que los alfa, tienen mayor poder

penetrante que los anteriores ya que atraviesan fácilmente el papel y de acuerdo a sus

energías, hasta unos mm del aluminio. Cuando las partículas beta atraviesan la

materia, su energía se disipa principalmente por ionización y/o excitación de los

átomos con los que chocan. Estas interacciones se detectan con los contadores Geiger-

Muller (ionización) y de centelleo (excitación). Rayos gamma: son ondas electromagnéticas como la luz visible o los rayos X pero de

menor longitud de onda. Tienen valores discretos de energía y no es una escala

continua. No varía ni el número atómico ni el másico. El nucleido simplemente sufre

una transición desde un estado más alto de energía hasta uno más bajo. Un rayo

gamma no presenta carga y por lo tanto no ioniza directamente átomos en su

trayectoria.

Los rayos gamma son penetrantes y para detenerlos se precisa una pared gruesa de plomo o cemento. La mayoría de los radioisótopos usados en estudios bioquímicos son emisores beta y/o gamma. De los isótopos producidos artificialmente los que se emplean más frecuentemente son: 3H, 14C, 24Na, 32P, 35S, 40K, 59F, 131I. Todos ellos emiten radiaciones de partículas beta cargadas negativamente y los isótopos 24 Na, 59Fe y 131I emiten al mismo tiempo radiaciones gamma. La radiactividad es la transformación atómica en la que un elemento se convierte en

otro, con la emisión de radiaciones. La desintegración radiactiva obedece a las leyes

de la probabilidad y es independiente de influencias externas como presión, gravedad,

temperatura, campos eléctricos o magnéticos y tratamientos químicos. La intensidad de la radiactividad es proporcional a la masa del nucleido La actividad decrece con el tiempo y es característica de cada nucleido

λ= constante de desintegración radiactiva (tiempo–

1) N= número de átomos en el tiempo t

- dN = número de átomos que decaen (desintegran por unidad de

tiempo) dt

En cualquier momento dado, el número de átomos de un material radiactivo que se

desintegran por unidad de tiempo es proporcional al número de átomos presentes en

ese tiempo. A este valor se lo conoce generalmente como: actividad y es la velocidad de desintegración de una fuente activa al tiempo t. Aunque es una constante de proporcionalidad su significado físico puede verse

rearreglando la ecuación.

por lo tanto

Es decir que es la fracción de átomos radiactivos que decaen por un incremento de

tiempo. Integrando entre los límites de N0 (número original de átomos radiactivos y N

(número de átomos radiactivos a cualquier otro tiempo) y entre los límites de t0 y

cualquier otro tiempo t se obtiene:

Periodo de semidesintegración. Es el tiempo necesario para que el número inicial de átomos disminuya a la mitad. N = No / 2 t = ln No/N t1/2 = ln No/No/2 = ln2 = 0,693

λ λ λ λ Vida media: es el promedio de vida de sus átomos. τ = 1

λ La relación entre el período de semidesintegración y vida media es: t1/2 = 0,693 τ τ = 1,444 t1/2 Unidades de radiactividad. La unidad estándar de decaimiento radiactivo es el Curie (Ci). Se lo define como la cantidad de cualquier nucleido radiactivo en el cual el número de desintegraciones por segundo es 3,7x1010 Para la mayor parte de las aplicaciones biológicas se necesita normalmente cantidades mucho menores de un Ci y se emplea el miliCurie (mCi) y el microCurie ( Ci) que equivalen a 10-3 y 10-6 Ci respectivamente. La unidad estándar de tiempo es el minuto, por lo tanto: 1 Ci=2,2x106 dpm.

Normalmente la actividad se indica por cuentas detectadas por minuto (cpm) y no

como desintegraciones por minuto (dpm), dado que es difícil determinar el número

absoluto de dpm. Esto se debe a que la eficiencia de la mayoría de los contadores es

menor del 100%, es decir, solo detectan una fracción del total. Para experimentos cuantitativos muy precisos el valor de cpm se convierte en dpm

dividiendo por la eficiencia del contador. Actividad específica. Los isótopos radiactivos y los compuestos marcados radiactivamente con isótopos, son

por lo general isotópicamente puros. La abundancia relativa de un isótopo se describe

por su actividad específica, que es una manera de designar la fracción de moléculas

totales presentes que es radiactiva. Este valor se expresa generalmente como actividad

(mCi o Ci) por milimol o micromol (mmlo o mol) o como Ci/gr, dpm/mol, cpm/ mol,

etc. Dilución isotópica. Los trazadores radiactivos pueden usarse para determinar la cantidad de una sustancia

simple en una muestra, agregando a la misma una cantidad conocida del mismo


compuesto "marcado" (radiactivo). Así, el compuesto no marcado (frío) y el mismo

compuesto marcado se mezclan sin que sea posible distinguirlos entre si. La actividad

específica de la solución resultante se puede calcular mediante la siguiente fórmula:

Donde: a2: actividad específica en el diluyente + radiactivo agregado x1: masa radiactiva agregada

x2 : masa del diluyente (compuesto no marcado) z: actividad (cpm) del radiactivo agregado

La actividad específica del radiactivo agregado (a1) será:

Luego, se reaisla una pequeña cantidad del compuesto y se mide la radiactividad del

mismo. De la actividad específica del mismo y conociendo el número total de cuentas

originariamente agregado, se puede calcular la cantidad del compuesto no marcado

presente desde un principio en la mezcla.

Aplicaciones de radioisótopos en biología y bioquímica. Un gran número de los análisis bioquímicos requieren la detección de cantidades

mínimas (10-14

a 10-6 moles) de material. Ahora bien, las pruebas químicas rara vez son

sensibles a cantidades menores de 10-7 moles. Esta limitación se ha superado por el

desarrollo de una tecnología de marcadores radiactivos, cuya extraordinaria sensibilidad en la detección de material marcado con isótopos radiactivos ha permitido que los estudios

con muchas sustancias en cantidades del orden de 10-12

moles sean de rutina. Además el uso de radiactividad ha permitido el desarrollo de aproximaciones experimentales de gran alcance a diversos tipos de problemas.

Estas aproximaciones emplean la técnica de marcado doble, que permite el seguimiento de dos sustancias al mismo tiempo, la técnica de un seguimiento de un pulso radiactivo y el análisis de intercambio.

En una molécula marcada al menos un átomo esta presente como radioisótopo. Este radioisótopo no modifica las propiedades químicas de la molécula. Los radioisótopos se pueden utilizar para seguir las actividades de moléculas marcadas dado que estos átomos pueden detectarse cuando emiten partículas. Se encuentran

disponibles comercialmente aminoácidos y nucleótidos marcados con 14

C o 3H, así

como cientos de intermediarios metabólicos marcados. El 125

I puede estar unido en forma enzimática o química a una proteína si afectar la macromolécula. La metionina

marcada con 35

S se utiliza para marcar proteínas ya que posee una alta actividad especifica. La magnitud de la actividad específica depende de la relación de átomos inestables (potencialmente radiactivos) a átomos estables (no radiactivos), y de la probabilidad de decaimiento de los átomos inestables, indicado por su vida media. Existen principalmente dos métodos para detectar la radiactividad incorporada. I) En la autorradiografía se marca una célula o componente celular y lego se cubre con una emulsión fotográfica sensible a la radiación. El desarrollo de la emulsión revela la

distribución del material marcado. Por ejemplo la incorporación de 3H timidina

identifica el núcleo como el mayor sitio de síntesis de ADN. En oposición, la


incorporación de uridina marcada a ARN muestra este se sintetiza primero en el

núcleo pero la gran mayoría se localiza en el citoplasma.

II) En los ensayos cuantitativos, las células se pueden marcar tanto in vivo

como in vitro y sus componentes celulares se pueden aislar y purificar de diversas maneras. Se mide entonces la cantidad o tipo de radiactividad en estos componentes mediante un contador Geiger (para detectar iones producidos en un gas por las emisiones radiactivas) o por un contador de centelleo (que cuenta los flashes de luz generados por una sustancia fluorescente que absorbe la energía de la muestra radiactiva). A menudo se emplean una combinación de técnicas de marcado y bioquímicas, como por ejemplo el experimento de "pulso-caza" (pulse-chase) . En este caso el material radiactivo (el pulso) se añade únicamente durante un periodo muy corto de tiempo y luego se elimina por lavado, siendo substituido por moléculas no radiactivas (caza). Tras diversos períodos de tiempo se toman muestras y en cada momento se identifica la forma química o la localización de la radiactividad. Ejemplo: se pueden crecer células en un medio de cultivo que contenga aminoácidos marcados y se incorporan al pool general de aminoácidos, que constituyen la fuente para la síntesis de proteínas. La actividad específica de los aminoácidos en el pool alcanza un máximo en los primeros cinco minutos, sin embargo la acumulación de radiactividad en las proteínas comienza mas lentamente. Sin embargo si se agregan al medio aminoácidos no marcados (caza), se frena en pocos minutos la incorporación de radioactividad a la proteína, debido al rápido equilibrio entre los aminoácidos que están dentro de la célula y los del medio de cultivo.

TÉCNICAS DE LABORATORIO - iib.org.ar Cuando se va a poner el tubo de medición se lo debe limpiar...

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