Tecnicas Analiticas Para Vinos

JuanGarcaBarcel

TECNICASANALITICASPARA VINOS

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GAB Sistemtica Analtica S.L.Sant Jordi, 30. Moja-Olrdola 08734, BCN

tel. +34 938 171 842 fax. +34 938 171 436www.gabsystem.com [email protected]

TECNICAS ANALITICASPARA VINOS

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TECNICAS ANALITICASPARA VINOS

JuanGarcaBarcel

Publicadopor:GABC/SantJordi,30- Tel.(+34)938171842-Fax.(+34)93817143608734MOJA-OLRDOLA (Barcelona}

1Edicin-Octubre1990ISBN84-404-7827-5DepsitoLegalB-36.850/90

Diseo:NEXOSI.&S.

Fotocomposicinymontaje:PenedsEdicions,S.A.-VilafrancadelPeneds

Impresopor:Romany/Valls,S.A.-Capellades

Presentacin

Todas las obras deben ser fruto de una experiencia, de un conoci-miento y de una reflexin. En esta ocasin el lector tiene en sus manosun libro que rene los tres requisitos apuntados. Adems tiene comomrito que ha sido elaborado para servir a un profesional que hace desu quehacer diario un arte: el enlogo.

Con el inters, por consiguiente, que fuera til en la bodega, este libroposee la ventaja de haber sido escrito por un enlogo que ha prestadoservicio a un buen nmero de bodegas, que ha vivido vendimias yvinificaciones, y conocido la utilidad del control analtico sobre unproducto en periodo de evolucin.

Una obra como esta, no se escribe sin un buen bagaje de conoci-mientos. El autor que ha desarrollado sus conocimientos como tcnicoanalista durante muchos aos, en una Estacin de Viticultura yEnologa, concretamente en la de Vilafranca del Peneds, es claroejemplo del servicio que estas instituciones, repartidas por todo elterritorio espaol, ofrecen al sector vitivincola.

En las Estaciones Enolgicas la funcin de los tcnicos, como elautor, no se circunscribe tan solo en realizar su trabajo de analista,debe tambin ejercer otras funciones: estar debidamente informado delas novedades analticas, de los problemas que vive el sector y de susposibles soluciones, transmitir la informacin a la institucin, colaboraren los proyectos de investigacin o experimentacin y tambin, en lamedida de lo posible, crear escuela.

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La personalidad del autor de este libro, le ha permitido cumplir concreces muchos de estos encargos tcitos, siendo adems evidente suinquietud por ampliar conocimientos y transmitirlos, hecho que todoslos que con l nos relacionamos podemos constatar.

Este minucioso trabajo es tambin consecuencia de la reflexin queconlleva el conocer, profundamente, a quin va dirigido. Es fcillocalizar en la memoria del lector, tres obras de este autor que hanformado parte de la biblioteca de numerosos laboratorios enolgicos.Debe hacerse mencin tambin que esta obra adquiere un nivelptimo, en cuanto a metodologas actuales en anlisis de controlrutinario y de investigacin. Es decir sirve al enlogo en su labor diaria ypermite, a l y a otros estudiosos, penetrar en trabajos de controlmucho ms sofisticados y con tcnicas ms fiables.

Se recogen en esta obra, los mtodos analticos de la mayora decompuestos que pueden formar parte de una caracterizacin enol-gica, tanto aquellos que se encuentran tras un proceso normal devinificacin como aquellos que son contaminantes, bien sean acci-dentales (estireno, residuos antocriptogmicos, etc.) o voluntarios (ci-do saliclico, edulcorantes sintticos, etc.).

No estn contemplados todos los componentes del vino porque ellosupondra entrar dentro del mbito de la investigacin, utilizando elanlisis como finalidad ms que como herramienta para el apoyo a laproduccin. Aunque la componente prctica de la obra resalta encualquiera de sus pginas, hace despertar en las personas msreceptivas, la inquietud hacia el mundo de la enologa y les introduce enla complejidad de los productos vitivincolas, cuyo mximo exponentees el vino, y siempre en constante evolucin bioqumica.

Con relacin a sus trabajos anteriores el autor en esta obra da en-trada a mtodos instrumentales: cromatografa de gases, espectro-fotometra de absorcin atmica, espectrofotometra visible y ultra-violeta, etc. Es decir, aquellas metodologas que ya comienzan a estarpresentes en laboratorios de grandes empresas y de todos los centrosoficiales. Otras tcnicas, incluida la cromatografa lquida de altaresolucin, espectrofotometra de infrarrojo, etc. han sido soslayadaspor el autor y lmites de esta obra.

La situacin poltica en la que est inmersa nuestra comunidad vi-tivincola, hace que las referencias a los mtodos oficiales, deban surgirde su misma organizacin. Por ello, todo tratado como ste, que

se precie de actual, debe recoger la metodologa analtica de la Co-munidad Econmica Europea, cuyos mtodos son en su mayor partepropuestos o aprobados por la Oficina Internacional de la Via y el Vino(O.I.V.).

Como toda obra de ste carcter es difcil decir que un trabajo hasalido a la luz totalmente a gusto del autor y actualizado al mximo. Sinembargo, este libro aporta una de las recopilaciones ms exhaustivasque sobre anlisis de productos vincolas se han realizado en losltimos tiempos. Es a mi modo de entender un buen trabajo, un buenservicio a la enologa y a la analtica y un magnfico nexo de unin entreambas.

SantiagoMnguezSanzEstacindeViticulturayEnologa

InstitutCataldelaVinyaielVi

VilafrancadelPeneds,mayode1990.

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Introduccin

Este libro pretende ser una ayuda al analista de vinos, enlogo ybodeguero, al presentar una serie de metdicas que han sido esco-gidas, de las mltiples que existen, pensando en la exactitud y sencillezde trabajo. Se ha procurado evitar las tcnicas instrumentales mscomplejas, como: Resonancia Magntica Nuclear, Espectrofotometraen Infrarrojo, Radioqumica y en ella se incluiran las tcnicas con elcarbono radioactivo (C ), etc.Apesar de ello, es de esperar que cumplacon la idea en la que fue concebido este libro: ser til.

La disposicin de los captulos se ha efectuado por orden alfabticode temas globales de anlisis. En cada uno de ellos se describen variastcnicas analticas que pueden ser aplicadas segn las dispo-nibilidades de equipo y personal.

En cuanto se refiere a la distribucin de cada anlisis, se ha procu-rado separar perfectamente el principio del mtodo, los reactivos ne-cesarios, la tcnica operativa y los clculos. En algunas tcnicas, se haintroducido un apartado de comentarios, para ampliar el tema tratado.Tambin se resumen algunas notas aclaratorias del autor, en elapartado de observaciones.

En lo referente a reactivos, los productos que se indican debern serde la calidad: reactivo para anlisis. Cuando se hace referencia al agua,para diluciones u otras aplicaciones, siempre se refiere a: aguadestilada.

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Todoslosvolmenesquedebenmedirseconexactitud,enellibroseexpresancondosdecimales,porejemplo:10.00mL.

Alfinaldeltexto,serecogenunaseriedetablasquepuedenserdegranayudaparaellector.

Hedeagradecer,sobremanera,aD.SantiagoMinguezSanz,Doc-torIngeniero Agrnomo,DirectordelaEstacindeViticulturayEno-logadeVilafrancadelPeneds,elaceptarpresentarestahumildeaportacin,alaardualabordelanalista.

El Autor

INDICEGENERAL

ACIDEZACIDOSADITIVOSQUIMICOSALCOHOLESAZUCARESCARACTERISTICASCROMATICASCOMPUESTOSCARBONILICOSCOMPUESTOSFENOLICOSCOMPUESTOSNITROGENADOS

CAPITULO1CAPITULO2CAPITULO3CAPITULO4CAPITULO5CAPITULO6CAPITULO7CAPITULO8CAPITULO9

ESTERES CAPITULO10GASES CAPITULO11METALES CAPITULO12OTROSCOMPUESTOS CAPITULO13REGLASENOQUIMICAS CAPITULO14SOLIDOSSOLUBLES CAPITULO15UNIDADESINTERNACIONALES CAPITULO16PESTICIDAS Y FUNGICIDAS CAPITULO17TABLAS

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1. ACIDEZ

ACIDEZ TOTAL 1.5METODOCEE,referencia 1.6METODOCEE,usual 1.7METODODELA A.O.A.C 1.9METODOINSTRUMENTAL 1.11METODORAPIDO APROXIMADO 1.11TABLA DEEQUIVALENCIASDE ACIDOS 1.13

ACIDEZVOLATIL 1.14METODOUNICODELA C.E.E 1.15METODOGAB 1.19METODOGARCIA-TENA 1.20METODO A.O.A.C 1.21METODOGASCROMATOGRAFICO 1.24METODOENZIMATICO 1.27METODOCON AUTOANALIZADOR 1.28

MEDICIONDEL pH1.30METODOUNICODELA CEE 1.31

ACIDEZFIJA 1.34

1.3

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Acideztotal

COMENTARIOS

La acidez total es la suma de todas las acideces valorables quecontiene el mosto o el vino. Debe excluirse de ella las acideces deadicin, como son: el dixido de carbono (carbnico) y el dixido deazufre (sulfuroso).

En el vino se hallan los cidos procedentes del mosto, adems demuchos ms, formados durante el proceso de fermentacin, como son:actico, propinico, lctico, succnico, pirvico, gliclico, galacturnico,fumrico y otros. El contenido en cido mlico es considerablementemayor en los mostos de uva no madura.

Los cidos que se valoran son los siguientes: tartrico, mlico, lc-tico, succnico, actico, etc. Todos estos cidos orgnicos citados sonrelativamente dbiles, por ello la neutralizacin con una base fuerte,como lo es el hidrxido sdico, debe hacerse a valores de pH supe-riores al 7.00. La ha fijado el valor en pH = 8.2 como punto finalen la determinacin de la acidez total y ste corresponde al viraje decolor de la fenolftalena.

SinembargolaO.I.V.,definelaacideztotal,comosumadelosci-dosvalorables,hastapH7.0,poradicindesolucindehidrxidos-

AOAC'

1. ASSOCIATIONOFOFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS.

1.5

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dico.Elcidocarbnicoyeldixidodeazufrenosedebenincluirenlaexpresindelaacideztotal.

Valoracinpotenciomtrica.

1.Seeliminar,previamente,elgascarbnicoyeldixidodeazufrequesehalleenelvinoomosto.

2.Colocar100mL delamuestraenunmatrazde500mL,pro-vistodeunrefrigerantedereflujo.

3.Sehacepasarunacorrientedegasnitrgenoporelinterior,paralaeliminacindelaire.

4.Elmatrazsecalientahastaebullicin,quesemantendrduranteunahora,conunacirculacinlentadenitrgeno.

5.Djeseenfriarhastalatemperaturaambiente,sininterrum-pirelpasodelgasnitrgeno.

6.Enunvasodeprecipitadosde100250mL,secolocan20.00

7. Se procede a la valoracin, con hidrxido sdico 0.1 M, con-tenido en una bureta, midiendo simultneamente el pH de lasolucin con un electrodo sumergido en la misma, y co-nectado a su correspondiente medidor.

8. Cuando se alcance el valor de pH 7.0 a la temperatura de20C, se detendr la adicin del reactivo. Sean el volumen dereactivo gastado.

METODOCEE,referencia

Principiodelmtodo

Tcnicaoperativa

mL delamuestradesgasificada.3

2. Journal officiel des Communauts europennes, Todaslas metdicas CEE que se citan en este libro, han sido tomadas de la Revisin indicada.

3.Enestemanual,losvolmenesdelquidoquedebensermedidosexactamentesernpresentadoscondosdecimales(ejemplo20.00).

Revisin 1 de 17 de diciembre de 1987.

1.6

Clculos

Observaciones

Principiodelmtodo

Lafrmulaparaelclculo,enmiliequivalentesporlitroes:Acidez=10

Paraexpresarlaacidezengramosdecidotartricoporlitro,lafrmulaaaplicares:

Acidez=0.75xn

xn

La adicin del lquido de valoracin (hidrxido sdico 0.1 M), deberhacerse lentamente y mantener la solucin en constante agitacin. Eltiempo de valoracin debe durar, por lo menos, unos 5 minutosaproximadamente.

Se elimina el gas carbnico del vino, por agitacin de 50 mL en unmatraz de un litro, al propio tiempo que se procede a un vaco con unatrompa de agua. La agitacin debe durar de 1 a 2 minutos, hasta que eldesprendimiento de gas disuelto, haya cesado. De este vino setomarn 10.00 mL para la determinacin de la acidez total y 20.00 mLpara la acidez voltil .

La acidez total del vino, medida a pH 7.00, se efecta con el empleode azul de bromotimol como indicador. Un ensayo previo, permiteestablecer un patrn de color ajustado a pH 7.00. La acidez del dixidode azufre libre y combinado, viene corregida por la frmula establecida,utilizando los volmenes de de iodo 0.005 M gastados para laoxidacin del dixido de azufre libre y combinado, obtenidos al valorarel destilado de la acidez voltil, a partir de 20.00 mLde vino.

METODOCEE,usual

4

y n" ,n'

4.VaselatcnicaenelanlisiscorrespondienteaestemtododeCEE.

1.7

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Reactivos

Tcnicaoperativa

HIDROXIDOSODICO0.05M,

INDICADOR DE AZUL DE BROMOTIMOL. Se

SOLUCION TAMPON de pH 7.00.mL

Preparacindelpatrndecoloracin

Anlisispropiamentedicho

exentodeCO .

prepara disol-viendo 4 gramos de indicador, colocndolos en un matraz deun litro, con 200 mL de alcohol etlico neutro, aadindolehidrxido sdico 1 M hasta coloracin azul-verde (sta ser ladel pH 7.00) y enrasando a volumen con agua destilada exentade C0 .

Preparada con 107.3 gra-mos de fosfato monopotsico, 500 de hidrxido sdico 1 My agua destilada hasta un litro. Puede utilizarse un tampncomercial.

1. En un cristalizador de 12 cm de dimetro, se colocan 25 mL deagua destilada hervida, 1 mL de la solucin de azul debromotimol y 10.00 mLde la muestra desgasificada.

2. Neutralizar, mediante el empleo de la solucin de hidrxidosdico 0.1 M, en cantidad suficiente, para que adquiera unacoloracin verde azulada.

3. Aadiracontinuacin5mL delasolucintampndepH7.0.

4.Enuncristalizadorde12cmdedimetro,colocar30mL deaguadestiladahervida.

5.Seaade1mL deazuldebromotimoly10.00mL delamuestradesgasificada.

6. A continuacin se procede a la valoracin, con la solucin dehidrxido sdico 0.1 M contenida en la bureta, hasta que sealcance una coloracin idntica a la obtenida en el ensayoprecedente y en las mismas condiciones de observacin.

7.Elvolumendereactivogastadodelabureta,seasignacomo:n.

2

2

1.8 1.9

Clculos

Observaciones

Principiodelmtodo

Reactivos

Tcnicaoperativa

Laacideztotal,seexpresaenmiliequivalentesporlitro,segnlasiguientefrmula:

Acidez=10xn

obienengramosdecidotartricoporlitrodemuestra,segn:

Acidez=0.75xn

Si se analizan varios vinos del mismo origen, es suficiente un solopatrn de color. Si existen dudas sobre el viraje de la valoracin, puedecomprobarse que no se producir cambio de color, al aadir algunosmililitros de la solucin tampn de pH 7.0.

La valoracin se efecta con el indicador de fenolftalena. La pre-sencia de gran cantidad de agua caliente minimiza el error debido alcontenido de dixido de carbono. Se procede sin desgasificar lamuestra, si sta corresponde a un vino tranquilo.

1%,preparadaconal-coholdel70%.

SielvinocontieneapreciablecantidaddeC0 ,convieneeli-minarloporcualquieradelosdosmtodossiguientes:

METODODELA A.O.A.C.5

SOLUCIONDEFENOLFTALEINA al

HIDROXIDOSODICO0.0667M.

Desgasificacindelamuestra

2

5. Assoc.Off. AnalyticChemists, nmero962.12,pgina744,(1990).

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1.10 1.11

(1) Colocar 25 mL de la muestra en un pequeo erlenmeyer yconectarlo a una trompa de succin por agua. Agitar 1 minutobajo vaco. (2) En un erlenmeyer de 100 mL, colocar 25 mL demuestra. Calentar a incipiente ebullicin y dejarlo as durante30 segundos, agitar y esperar a que alcance la temperaturaambiente.

1.Enunerlenmeyerde500mL,sehierven200mL deaguadestilada.

2.Sedetienelaebulliciny,todavacaliente,seaade1mLdelasolucinindicadoradefenolftalena.

3.Conlasolucindehidrxidosdico,seneutralizahastaal-canzaruncolorrosado.

4. A continuacinseaaden5.00mL delamuestradevinoomosto.

5. Desde una bureta, se adiciona la solucin de hidrxido sdico,que se ha utilizado anteriormente, hasta lograr mismo colorinicial.

El clculo de la acidez total, expresada en gramos de cido tartricopor litro de vino, es igual al nmero de mililitros de reactivo de hidrxidosdico, gastados en la valoracin.

Siseutilizaunasolucindehidrxidosdico0.1M,laacidezsehallaporlasiguientefrmula:

Acidez=mL lcalix0.1x0.075x1000/5gtartrico/L

abreviadamente,acideztotal,eng/L=mL lcalix1.5.

a)Seprocurarefectuarlavaloracinenlugarbieniluminadoysobrefondoblanco.

b) Los cidos orgnicos presentes en el vino (tartrico, mlico, lc-tico, actico, etc.) son, relativamente, cidos dbiles frente al reactivode valoracin (hidrxido sdico), por ello el empleo de fenolftalenacomo indicador.

c) Cuando estos cidos son neutralizados con lcali, como el em-pleado en este anlisis, el verdadero punto final de la neutralizacin esmayor que pH 7.00, generalmente se halla entre el 7.80 y el 8.30.

. el

Clculos

Observaciones

La AmericanSocietyofEnologists,hanaceptadocomopuntofinaldevaloracindelosvinosymostos,elvalordepH=8.20.

d)Porlotanto,siseefectaunavaloracinpotenciomtrica,elpuntofinaldebersituarseenelvalor8.20depH.

a la calibracin y contraste de los electrodos delmedidor.

2. Efectese la adicin del lcali de la bureta, con agitacin de lamuestra, hasta alcanzar la lectura de pH 8.2 en el medidor.Este ser el punto final de la reaccin.

3. Caso de emplear un valorador automtico, el procedimientoes muy similar, debindose fijar en el aparato, el valor de puntofinal de la reaccin.

Esunmtodomuyrpido,aunquederesultadoaproximado.Es,talvez,lametdicaqueseempleaentodabodegaporsufacilidad.

METODOINSTRUMENTAL

METODORAPIDO APROXIMADO

COMENTARIOS

Principiodelmtodo

Reactivos

Tcnicaoperativa

ValoracinpotencimetricaapH=8.20.

1. Se seguirn las instrucciones del instrumento empleado, en loque se refiere


6

6.J.GarcaBarcel, Metodologadeanlisisdevinosyderivados(1976).

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1.12 1.13

Principiodelmtodo

Reactivos

Tcnicaoperativa

Clculos

De hecho es una alcalimetra realizada directamente sobre el vino y,en muchos casos, si el vino es tranquilo, sin eliminacin del carbnicopresente ni del sulfuroso. La solucin alcalina est preparada de forma,que operando sobre 10.00 mL de la muestra, cada mililitro de reactivogastado equivale a un gramo de acidez, expresada en cido sulfrico.

1. Colquese en un vaso de 100 mL, 10.00 mL de la muestra devino o mosto, medidos con una pipeta limpia y seca, o lavadacon el propio vino.

2.Sielvinoesblancoseaadendosotresgotasdefenolftalena.Sielvinoestinto,noesnecesarioaadirelindicador.

3. Se vierte, gota a gota, la solucin de hidrxido sdico 0,204 Mcontenida en una bureta, procurando imprimir al vaso unmovimiento giratorio, hasta alcanzar una coloracin rosa. Enlos vinos tintos el color es verdoso.

4. Se apreciar el viraje definitivo, por toque con un papel detornasol azul, dejando de aadir reactivo cuando dicho papeldeja de enrojecer.

La cantidad de mililitros y dcimas de reactivo gastados, nos indicarel nmero de gramos y dcimas, de acidez total expresada en cidosulfrico.

S se desea expresar la acidez hallada en tartrico, se multiplicar elvolumen gastado por 1.53. Si el valor quiere expresarse en milie-quivalentes/litro, se multiplica la acidez sulfrica por 20.4.

a)Enalgunosvinosblancos,nosedestacanetamenteelcolorrosacuandoseemplealafenolftalena;espreferiblecontrolarelpunto

SOLUCIONDEHIDROXIDOSODICO0.2041M.

SOLUCIONDEFENOLFTALEINA al2%.

Observaciones

finaldelaneutralizacinconlaayudadepapeldetornasol.

b) La inmersin de estos papeles reactivos en el vino, no debe serinstantnea, prximo al final de la operacin, requieren permanecer enel vino 10 20 segundos.

TABLA DEEQUIVALENCIASDE ACIDOS

Expresadocomo: TartricoMlicoCtricoLcticoSulfrico Actico

7.Losvaloresdeestecidocorrespondenalctricomonohidrato,noalanhidro.

Tartrico1.000 0.893 0.943 1.200 0.650 0.800

Mlico 1.119 1.000 1.055 1.343 0.731 0.896Ctrico7 1.071 0.957 1.000 1.286 0.766 0.938Lctico 0.833 0.744 0.777 1.000 0.544 0.667Sulfrico 1.530 1.367 1.428 1.837 1.000 1.224Actico 1.250 1.117 1.166 1.500 0.817 1.000

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1.14 1.15

Acidezvoltil

COMENTARIOS

En los vinos, se define como acidez voltil al contenido de cidosgrasos, cmo: actico, frmico, propinico, butrico, etc. No debenconsignarse en este dato los cidos que son arrastrables por el vapor,cmo: lctico, succnico, srbico, ni tampoco el dixido de carbono ydixido de azufre. La determinacin precisa de la acidez voltil en losvinos es de gran importancia en la industria enolgica.

Si los valores de la acidez voltil son elevados, indica que el vino hasufrido la accin de los microorganismos, principalmente por el

Cantidades de 0.3 a 0.8 g/L, expresado en cido actico, puedenconsiderarse normales. La legislacin actual no permite valores su-periores a 1 g/L. La bacteria que provoca la fermentacin malolctica,puede tambin producir pequeas cantidades de cido actico. Losvinos procedentes de mostos con elevado contenido de azcar tienen,en general, mayor acidez voltil.

El constituyente principal de la acidez voltil es el cido actico,aunque algunas veces estn presentes pequeas cantidades de loscidos propinico, butrico y valrico. Estos cidos son tambin arras-trables con el vapor. Las metdicas analticas eluden las interferenciasde los cidos lctico y srbico, principalmente, as como los dixidos decarbono y azufre.

Acetobacter.

METODOUNICODELA C.E.E.

Principiodelmtodo

Laseparacindeloscidosvoltilesseefectaporelarrastreconelvapordeaguaylarectificacindelosvapores.Lamuestradevinoseacidificaconcidotartrico(aproximadamente0.5gramospara20mL devino,antesdelarrastre).Sedebentomartodaslasprecau-cionesnecesarias,paraevitarlapresenciadelgascarbnicoeneldestilado.Elindicadorempleadoeslafenolftalena.Laacidezdeldi-xidodeazufrelibreycombinado,destilado,nodebefigurarenelvalordelaacidezvoltilyserestardelamisma,ascomotambinlaacidezdebidaalcidosrbico,eventualmentepresente.

Se compone de un generador de vapor de agua,de un borboteador en donde se coloca el vino, de una columnarectificadora y de un refrigerante. Dada la gran variedad de aparatospropuestos para tal finalidad, y ante la dificultad que presenta laadopcin obligatoria de un mismo aparato para los usuarios de todoslos pases, es preferible y racional fijar de la forma siguiente lascondiciones mnimas que debe reunir un aparato, que permita efectuarla tcnica de la acidez voltil con exactitud. Estas condiciones son:

1. El vapor de agua producido por el generador debe estar lo sufi-cientemente exento de CO , como para que 250 mL del vapor con-densado, adicionado de 0.1 mL de hidrxido sdico 0.1 M y dos gotasde fenolftalena al 1 %, presente una coloracin rosada estable, por lomenos durante 10 segundos.

2. En las condiciones normales de empleo, como mnimo el 99.5%del cido actico en solucin acuosa, colocado en el borboteador enlugar del vino, debe encontrarse en el destilado.

3. Si se coloca una solucin normal de cido lctico en lugar del vino,solamente el 5 por mil, como mximo, se debe encontrar en el destiladoobtenido en las mismas condiciones que en el caso anterior.

Todo aparato o toda tcnica que cumpla los tres requisitos citados,constituye un aparato o tcnica oficial internacional. Los dos aparatosque a continuacin se describen, cumplen con las condicionesdescritas.

Aparato y su control.

2

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1.16 1.17

Aparato pequeo. El vapor se produce en un baln de 1500 mL. Elborboteador est constituido por un tubo cilndrico de 3 cm de dimetroy 27 cm de largo. Este tubo se calienta elctricamente o con una llamade gas, que incida sobre un disco de hierro de 15 cm de dimetro, conun orificio central de 29 mm de dimetro, que es donde se apoya eltubo. Este dispositivo evita la pirogenacin de materias extractivasdel vino. Este calentamiento debe ser regulado de forma tal que, elvolumen de vino en su interior, ni aumente ni disminuya en unos mLdurante el curso del arrastre de vapor. El tubo interior de entrada delvapor debe hallarse a un cm del fondo del tubo exterior.

El vapor, con los cidos voltiles, pasa a la columna rectificadora,formada por un tubo cilndrico de 20 mm de dimetro y 50 cm delongitud, en cuyo interior hay una hlice de acero inoxidable con unpaso de 15 mm. Un refrigerante de West de 40 cm de longitud, com-pleta el aparato.

las

Reactvos

ACIDOTARTARICO.

ACIDOCLORHIDRICOconcentrado.


INDICADORFENOLFTALEINA al1%.INDICADORDE ALMIDON.IODO0.005M.SOLUCIONDEBORAXsaturada.

Tcnicaoperativa

1.Colocarenelgeneradordevapor,aguadecalodebarita,filtrada.

2. En el borboteador se colocan 20.00 mL de vino, previamentedesprovisto de gas carbnico, por agitacin al vaco a latemperatura ambiente.

3.Seadiciona0.5gramosaproximadamentedecidotartri-coalamuestradevino.

4. Se inicia la destilacin y se recogen 250 mL del destilado, enun tiempo que debe oscilar alrededor de 12 a 15 minutos comomximo.

5. Se valora la acidez del destilado, con solucin de hidrxidosdico 0.1 M, en presencia de 2-3 gotas de fenolftalena al 1 %.

6.Elvolumengastadoenestaprimeravaloracinsedesignacomon.

7. Terminada la anterior valoracin, se aade al lquido una gotade cido clorhdrico concentrado, para pasar del medio neutroal cido.

8. Seguidamente se aaden 2 mL de indicador de almidn, unpequeo cristal de ioduro potsico y se valora el dixido deazufre libre, con una solucin de iodo 0.005 M.

9.Sean'elvolumenempleadoenestasegundavaloracin.

10. Se aaden a continuacin 20 de solucin saturada debrax (el color de la solucin se vuelve rosa) y se valora denuevo con iodo 0.005 M, hasta el viraje del almidn.

11. El volumen del lquido gastado en esta ltima valoracin se leasigna como n'', que corresponde al S0 combinado.

mL

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1.18 1.19

Clculos

Observaciones

Laacidezvoltilseexpresaenmiliequivalentesporlitro,deacuerdoalasiguientefrmula:

5(n-0.1n'-0.05n")

Laacidezvoltilexpresadaengramosdecidoacticoporlitrodevino,secalculaporlafrmula:

0.300(n-0.1n'-0.05n")

a) En el caso de que las muestras de vino estn estabilizadas concido saliclico, este cido, que tambin es arrastrado, se deber de-terminar por colorimetra a pH 3 y con precisin de 0.5. Debe restarsede la cifra hallada anteriormente.

b) En los vinos adicionados de cido srbico, es conveniente de-terminar este cido en una parte alcuota del destilado obtenido, antesde efectuar toda la valoracin, ya que prcticamente destila si-multneamente con el cido actico.

c) Se describe la determinacin del cido srbico: Se toma 0.5 mLdel destilado, se coloca en una cubeta de cuarzo de 10 mm de paso deluz y se sita en el espectrofotmetro; se aaden 1.5 mL de la siguientesolucin cuya composicin es: bicarbonato sdico 0.5 g, sulfato decobre pentahidrato 0.001 g y agua destilada hasta un litro. Se deja lacubeta al aire durante unos minutos y luego se mide la absorbancia a256 nm, en comparacin con el agua destilada. El espectrofotmetroha sido previamente calibrado con una solucin de cido srbico de 20mg por litro.

d) Este mtodo es vlido para concentraciones de cido srbicoentre 10 y 300 miligramos por litro. El error en esta determinacin es del1 % aproximadamente. Un gramo de cido srbico corresponde a 8.92mL de solucin molar de hidrxido sdico y a 0.438 g de cido sulfrico.Un vino adicionado con 200 mg de cido srbico por litro, deberrestarse del valor de la acidez voltil hallada la cantidad de 1.7miliequivalentes por litro.

METODOGAB

Principiodelmtodo

Reactivos

Tcnicaoperativa

Se fundamenta en la metdica nmero 11.047 de la A.O.A.C. con lamodificacin de sustituir el destilador de arrastre de vapor por una placacalefactora elctrica y destilacin directa. El calefactor est previstopara la destilacin de pequeos volmenes y el conjunto destilador yrefrigerante, proyectado igualmente para la misma finalidad. La adicinde sulfato mercrico, bloquea totalmente el dixido de azufre presente.

SOLUCIONSULFATOMERCURICOal1%.SOLUCIONDEFENOLFTALEINA al1%.HIDROXIDOSODICO0.0167M.

1. Se deber conectar el aparato a la red y accionar el interruptor,para que se ponga en marcha, 15 minutos antes del primeranlisis, con objeto de que el calefactor alcance la tem-peratura adecuada.

system



METODOGARCIA-TENA

Principiodelmtodo

Reactivos

Se basa en una destilacin fraccionada del vino, y valoracin se-parada de las fracciones recogidas. El primer volumen se recoge enuna probeta de 5.1 mL y el segundo en probeta de 3.2 mL. Se emplea elmismo aparato destilador del mtodo GAB, con placa calefactoraelctrica.

SOLUCIONDEHIDROXIDOSODICO0.0204M.

SOLUCIONDEFENOLFTALEINA al1%.

1.20 1.21

2.Semiden10.00mL devinoysecolocanenelmatrazdedestilacin.

3. Con una pipeta Pasteur de plstico, se toman 2 mL de la so-lucin mercrica y se vierten en el matraz, adems de uno odos trozos de piedra pmez.

4.Secolocaelmatrazeneldestiladorylaprobetade10mL alasalidadelrefrigerante.

5.Secolocalaplacacalefactorabajoelmatraz,procurandoqueelfondodelmismo,asienteperfectamente.

6.Cuandosehayanrecogidolos10mL dedestilado,seretiralaplaca,sindesconectarla,sidebenrealizarseotrosanlisis.

7. El lquido de la probeta se coloca en un vaso y se valora consolucin de hidrxido sdico, en presencia de unas gotas defenolftalena.

Cada mililitro de solucin de hidrxido sdico, equivale a 0.10 gra-mos de cido actico, por litro de vino. Este valor equivale a la acidezvoltil real

Clculos

Tcnicaoperativa

Clculos

Principiodelmtodo

1.Enelmatrazdedestilacinsecolocan11.00mL delamuestradevinoyuntrozodepiedrapmez.

2.Secolocaralasalidadelrefrigerante,laprobetade5.1

mL.3.Supuestocalienteelcalefactor,secolocabajoelmatraz,

procurandoqueasienteperfectamente.4. Cuando el lquido alcance el trazo superior de la probeta, se

retira, e inmediatamente se sustituye por la probeta ms pe-quea (3.2 mL).

5.Unavezellquidolleguealtrazosuperiordelaprobeta,seretiralaplacacalefactoraysedaporterminadaladestilacin.

6. El lquido de la probeta se vierte en un vaso y se valora con lasolucin alcalina, en presencia de unas gotas de fenolftalena,hasta obtener un color ligeramente rosado. Se toma nota delvolumen gastado y se asigna como N.

7. A continuacinsevaloraellquidodelaprobetapequea,comosehaindicadoanteriormente,yseasignacomoN'.

El nmero de mililitros gastados para valorar el lquido de la probetapequea nos dar el valor de la acidez voltil real segn la frmula:

Actico=N'x0.366eng/L

Parahallarlaacidezvoltilaparente,sesumaalarealelvalorha-lladomultiplicandoNx0.122.

PuedetambinutilizarselatablaI.

Elmismoqueelanterior,empleandoelvapordeaguaparaelarrastredeloscidos.

METODO A.O.A.C.8

8. Ass.Off. Analyt.Chemists, nmero964.08.pgina744,(1990).

system



1.22 1.23

2.Elaparatodestiladorsecargaconaguadestilada,hastaquecubralaresistenciacalefactora.

3.Porelgrifoseadicionan25.00mL delvinopreviamentedesgasificado.

4. El aparato se conecta y se inicia la ebullicin, con el grifo dedoble paso comunicado con el exterior. Se mantiene stadurante 3 minutos. De esta forma se eliminar el carbnico quese halla disuelto en el agua.

5.Secierraelgrifoyelvapordearrastreborbotearatravsdelamuestra.

6.Duranteladestilacinserecogenunos300mL enelerlen-meyersituadoalasalidadelrefrigerante.

7. Se desconecta el aparato, se vaca el destilador, y se lava lacmara interior con agua destilada, y automticamente tendrlugar el vaciado del aparato.

8. Aldestilado,contenidoenelerlenmeyer,seaade1mL desolucinalcohlicadefenolftalenaal1%.

9.Sevaloraseguidamenteconsolucindehidrxidosdico0.1M,hastacoloracinrosada,persistente.

Para expresar los resultados en gramos de cido actico por litro devino, se multiplicarn los mililitros gastados de solucin de hidrxidosdico 0.1 M, por 0.006 y por 40 (factor global igual a 0.24).

Este anlisis representa la acidez voltil aparente, ya que no se hahecho ninguna correccin del dixido de azufre presente en la muestrade vino.

Clculos

Aparatodestilador

Reactivos

Tcnicaoperativa

Consiste en un matraz de aproximadamente 1.500 mL, con unacmara interior en donde se sita la muestra, una trampa de vapores,un grifo de dos pasos, una resistencia elctrica en el interior del matrazy un grifo de descarga. Todo ello construido en una sola pieza en vidrioPyrex. El residuo de vino que queda en la cmara interior, es eliminadoautomticamente por accin del vaco, cuando se desconecta elaparato. Al aadir agua por un grifo que comunica con el borboteador,sirve para lavarlo y dejarlo de nuevo dispuesto para una nueva muestraa analizar. El grifo de dos pasos, sirve para la entrada de la muestra ypara la salida del aire y CO , cuando se inicia la ebullicin, segn laposicin de la misma.

Es necesario eliminar el CO de la muestra, mediante agitacincon aspiracin, o bien, por incipiente ebullicin, con columnacondensadora y enfriado inmediato.

2

2


INDICADORFENOLFTALEINA,al1%

1.

system



METODOGASCROMATOGRAFICO

COMENTARIOS

9

Los mtodos comunmente usados en el anlisis de la acidez voltilde los vinos, incluyen la destilacin con arratre de vapor de agua yposterior valoracin alcalimtrica. Influyen en estas metdicas, lapresencia de otros cidos voltiles, cmo: srbico, fctico, sulfuroso ycarbnico, que luego hay que deducir del valor hallado.

Dado que el componente mayoritario de la acidez voltil, es el cidoactico, es a este compuesto donde la mayora de las tcnicas debendirigirse, procurando prescindir de todas las sustancias interferentes.Ya que la cromatografa es una tcnica de separacin por excelencia,es perfectamente posible su aplicacin a ste anlisis del cido actico.Lo ms destacable de este mtodo descrito a continuacin, es que elvino objeto de anlisis, no se somete a ningn tratamiento, por el cualpodran existir contaminaciones o transformaciones. Slo es necesariouna dilucin del mismo, con el propio patrn interno empleado en ladeterminacin.

El vino, por su compleja constitucin, presenta problemas en elanlisis cromatogrfico cuando se utiliza la inyeccin directa de lamuestra. Estos problemas se refieren solamente a deterioro de la co-lumna, pero nunca en el resultado del anlisis. La fase estacionaria dela columna, se hidroliza a causa de las inyecciones acuosas, san-grados del cido fosfrico y por la temperatura elevada de la misma.Tambin los componentes no voltiles del vino, como son: azcares,materias colorantes, protenas, etc., tienen un efecto perjudicial sobreel relleno de la columna. En esta tcnica se soslayan estas dificultades,por la dilucin de la muestra, por el escaso volumen de inyeccin (0.5microlitros) y por la mezcla adecuada de las fases estacionarias.

La resolucin del pico de cido actico es perfecta y, por ello, laexactitud de esta determinacin. Comparativamente con los mtodosde arrastre por vapor de agua, cabe destacar que el cido acti-

9. B. Trombella Ribeiro,yA. Amer. J. Enol, Vitic., 31, 3, pginas 294-297, (1980).

1.24 1.25

co no es arrastrado en su totalidad en los mtodos por destilacin,adems de las interferencias de otros compuestos voltiles, problemasque no presenta el mtodo gas cromatogrfico que se describe acontinuacin.

Se analiza el cido actico contenido en el vino, por cromatografagas-lquido. La separacin tiene lugar en una columna rellena deCarbowax 20 M y cido fosfrico, como fases estacionarias combi-nadas. Se emplea cido propinico como patrn interno. El mtodo esmuy fcil de realizar y se presta a la automatizacin. El tubo de vidrio delbloque de inyeccin del cromatgrafo, es conveniente cambiarlo cada70 inyecciones aproximadamente. Con esta precaucin, la columnapermite hasta 16 000 determinaciones, sin prdida apreciable de lafase estacionaria. El tiempo de anlisis es de unos 6 minutos.

Es necesario un cromatgrafo de gases, equipado con detectorF.I.D. y con tubo de vidrio de reducido volumen en el bloque de in-yeccin. La columna para el anlisis, ser un tubo de vidrio de 2 m delongitud y 2 mm de dimetro, rellena de Carbopack C de 60/80 mallas,con 0.3% de Carbowax 20 M y 0.1 % de cido fosfrico (H P0 ), Seemplea helio como gas portador.

pesa 1 gde cido propinico puro, para anlisis, y se coloca en unmatraz de 100 mL, se disuelve con agua destilada y se com-pleta a volumen.

preparado por mezcla de 5.00 mL de lasolucin de stock de propinico, 2 mL de cido fosfrico al70% y agua destilada hasta un volumen de dos litros.

Procdasealajustedelosparmetrosdelcromatgrafo,deacuerdoalossiguientesdatos:

Temperaturadelinyector,175C.Temperaturadelacolumna,90C.

Principio del mtodo

Aparatoymateriales

Reactivos

Tcnicaoperativa

3 4

SOLUCION DE ACIDO PROPIONICO de stock. Se

PATRON INTERNO,

1.

system



1.26 1.27

Temperaturadeldetector,200C.Flujodegasportador,32mL/min.Flujodehidrgenoyaire,losnecesariosparaunallamacorrecta.Volumendelamuestraainyectar,0.5microlitros.

2. Se toman 0,15 mL del vino a analizar y se diluyen con solucinde patrn interno hasta 2 mL. Esta dilucin se realiza consuma facilidad con un aparato diluidor Fisher o similar. Esta estoda la preparacin que requiere la muestra.

3. De la dilucin anterior, se toma con la microjeringa 0.5 mi-crolitros y se inyecta en el cromatgrafo o se colocan mues-tras en el dispensador automtico del cromatgrafo.

Con el empleo del integrador, es muy fcil la cuantificacin del an-lisis, efectuando comparacin con un patrn de cido actico puro,para anlisis, en cantidad adecuada para la determinacin. Es acon-sejable una solucin patrn, cuya concentracin sea de 0.5 gramos deactico por litro. El diluyente utilizado para este patrn, ser alcoholetlico al 10% en volumen.

a) Es muy interesante, para mejorar la metdica, que la columna devidrio, antes de efectuar el relleno con el soporte indicado, se mantengadurante una noche totalmente llena de una solucin de cido fosfricoal 1 % y secarla antes del uso, sin enjuague posterior.

b)Sielgasportador,helio,sesaturadecidofrmico,mejorasen-siblementeelanlisis

c) Seguidamente a una determinacin, puede inyectarse de nuevootra muestra, tan pronto haya salido el pico del patrn interno depropinico, con ello se proporciona un gran ahorro de tiempo.

Clculos

Observaciones

10

10. S.A. Kupina, J.L. Kutschinski y otros, Am. J. Enol. Vitic., 33, 2, pginas 67-74 (1982).

METODOENZIMATICO

COMENTARIOS

11

Todo lo explicado en los comentarios del anlisis anterior, son per-

fectamente aplicables a sta tcnica enzimtica, con ventajas muy

superiores al mtodo gas cromatogrfico.

Dado que el anlisis enzimtico es muy especfico, se presta, con granexactitud, a la determinacin del cido actico en el vino, eliminandototalmente las interferencias y por ello el resultado exclusivo delcomponente indicado. Presenta la ventaja sobre el mtodo gascromatogrfico, en la mayor economa de instrumentacin, ya que elespectrofotmetro necesario para las determinaciones enzimticas, esmucho ms barato que el cromatgrafo, aparte la facilidad de sumantenimiento.

El cido actico (acetato) se transforma, en presencia de la enzimaacetil-CoA-sintetasa (ACS) con adenosina-5-trifosfato (ATP) ycoenzima A (CoA), en acetil-CoA. Esta reacciona con el oxalacetato acitrato, en presencia de citrato sintetasa (CS).

La determinacin se basa en la formacin de NADH, medida por elaumento de la absorbancia a 340 mm. La cantidad de NADH formada,es la que sirve para medir la concentracin de cido actico. Lapresencia del alcohol retarda la reaccin del acetato, por ello, la lecturade la absorbancia se efecta despus de 20 minutos.

para 30 anlisis. Contiene 4 frascos conreactivos, alguno de los cuales se deben reconstituir con aguadestilada. La conservacin de estos reactivos, as como sureconstitucin, se indican en el folleto que acompaa a cadatest analtico.

-

Principiodelmtodo

Reactivos

Test-combinacin de la firma Boehringer Mannheim, nmerode catlogo 148261,

11. Boehringer Mannheim, Anlisis enzimticos de los alimentos, 1989

system



1.28 1.29

Tcnicaoperativa

Clculos

Principiodelmtodo

1. Se preparan las cubetas de 10 mm de paso de luz, que serecomiendan sean de plstico para un slo uso, con objeto deevitar contaminaciones. El espectrofotmetro con lmpara detungsteno, se sita a 340 mm de longitud de onda.

2. Se efectuar una dilucin del vino, colocando 10.00 mL en unmatraz aforado de 100 mL y completando el volumen conagua destilada. Si el vino tiene una acidez actica superior a1.5 g/L, se efectuar una dilucin mayor, empleando 1.00 mLde muestra de vino, en lugar de los 10 mL indicadosanteriormente.

3.Seguirpasoapasolasindicacionesdelfolletoadjuntoaltestdeanlisis.

El clculo de la concentracin de cido actico se determina por ladiferencia de las absorbancias ledas, siguiendo las instruccionesdetalladas en el folleto.

Ladiferenciadeabsorbancias,seindicapor Acylaconcentracinengramosdecidoacticoporlitro,sededuceporlafrmula:

c=0.308el resultado deber multiplicarse por el factor de dilucin, o sea por

primer caso de la muestra que no supere los 1.5 g/L en actico, ypor 100 en el segundo caso.

Los cidos grasos de la serie actica, se separan del vino por des-tilacin, bajo corriente de nitrgeno. La acidez del destilado, se midepor la coloracin del indicador de pH, azul de bromofenol. Lasdeterminaciones colorimtricas, se efectan a la longitud de onda de460 mm.

x Acg/L10

en el

METODO CONAUTOANALIZADOR

Reactivos

Tcnica operativa

Observaciones

SOLUCIONDE ACIDOTARTARICOa/2.5%,

SOLUCION DE BORATO SODICO 0.1 M.

SOLUCION DE FOSFATO POTASICO 0.1 M,

SOLUCION DE INDICADOR.

AGUAOXIGENADA,

preparadapordisolucinde25gramosdecidotartrico,reactivoparaanlisisyaguadestiladahastaunlitro.

Disolver con aguadestilada, en un matraz aforado 100 mL, 3.814 gramos detetraborato sdico.

disolviendo enun matraz de un litro, 123.6 gramos de fosfato monopotsico,reactivo anlisis y completar con agua.

En un matraz de 1 litro, se in-troducen 330 miligramos de azul de bromofenol, 100 mL desolucin de fosfato potsico 0.1 M y se completa con aguadestilada.

de 0.1 volmenes.

Se detallan en el manual de instrucciones del aparato.

a) Permite el anlisis de un buen nmero de muestras por hora, deforma automatizada. El lmite de concentracin permitida por elanlisis va desde 0 a 1 g/L, expresado en cido sulfrico, o sea unmximo de 1.23 gramos de cido actico por litro.

b) Con esta metdica, las interferencias son muy pequeas. El di-xido de azufre, se oxida fcilmente con el agua oxigenada. Las can-tidades de S0 empleadas en enologa no influyen en el anlisis.Tampoco interfiere el gas carbnico. El cido lctico se elimina porrectificacin, durante la destilacin de la muestra.

de

2

system



1.30 1.31

MedicindelpH

COMENTARIOS

La medicin del pH en el vino o mosto, tiene un marcado inters,pues este dato es importante por su efecto sobre: microorganismos,matiz del color, sabor, potencial redox, relacin entre el dixido deazufre libre y combinado, quiebras debidas al fosfato de hierro y, otrosms.

El valor de pH de los mostos destinados a los vinos de mesa, oscilaentre 2.7 y 3.8 dependiente principalmente, del grado de madurez de lauva de que proceden. No existe una relacin directa entre el pH y laacidez total valorable. Sin embargo, s existe una dependenciaemprica, entre el pH y la relacin bitartrato potsico/cido tartrico. Nohay correlacin entre el pH y el cido mlico.

La impresin organolptica de la astringencia y acidez, es ms de-pendiente del pH, que de la acidez total. La tonalidad y vivacidad delcolor de los vinos tintos, depende de su pH. Los ataques bacterianosson posibles cuanto ms elevado es el pH. Por ejemplo, la des-composicin del cido tartrico tiene lugar a valores superiores a pH3.6. Las precipitaciones o quiebras metlicas, son ms difciles desuceder, cuanto ms bajo es el pH. El poder antisptico del sulfurosoaumenta, cuando el pH es bajo, debido a que el SO libre es mayor. ElpH ptimo para la precipitacin de bitartrato potsico, genera unadisminucin de la acidez total y un aumento de la concentracin deiones hidrgeno, o sea una disminucin del pH.

,

2

Delasbebidasnaturales,elvinoeslaquetieneelvalordepHmsprximoaljugogstrico.

Es la medicin de la diferencia de potencial entre dos electrodos,sumergidos en el vino. Uno de los electrodos adquiere un potencial,que es una funcin definida del pH del lquido a medir, ste es elelectrodo de vidrio. El otro electrodo, tiene un potencial fijo y de ah sunombre de electrodo de referencia. La precisin en la medida del pHdebe ser de 0.05 unidades.

Medidor de pH de lectura digital, con precisin de 0.01 unidades.Electrodo de vidrio, en general se utiliza el electrodo combinado, porcontener en una sola pieza el electrodo de vidrio y el de referencia. Sedeber conservar sumergido en una solucin 3 M o bien una saturadade cloruro potsico.

parada por disolucin de 20.42 gramos por litro, en aguadestilada.

1) Solucin saturada de bitartrato potsico, preparada conuna cantidad mnima de 5.7 g/L a 20 C. Se conserva estasolucin unos dos meses, con el empleo de 0.1 g de timolpara 200 mL.

METODOUNICODELA CEE

Principiodelmtodo

Aparatos

Reactivos

SOLUCION 0.1 M DE FTALATO ACIDO DE POTASIO pre-

SOLUCIONDE ACIDOCLORHIDRICO0.1M.

SOLUCIONESPATRON:

system



1.32 1.33

Losvaloresdeestepatrnson:

3.57 a 20 C.

3.56 a 25 C.

3.55 a 30 C.2) Solucin 0.05 M de ftalato cido de potasio, pesandoexactamente 10.211 gramos del producto puro y seco, en un litrode agua destilada. Se conserva unos dos meses.

LosvaloresdepHson:3.998 a 10 C3.999 a 15 C4.003 a 20 C4.008 a 25 C4.015 a 30 C

3) Solucin preparada de la siguiente forma: 3.402 gramos defosfato monopotsico, 4.354 gramos de fosfato dipotsico yagua destilada hasta completar un litro.

EstepatrntienelossiguientesvaloresdepH.6.90 a 15 C6.88 a 20 C6.86 a 25 C6.85 a 30 C

A pesardeloindicadoanteriormente,serecomiendaadquirirdelmercado,lassolucionespatrnyapreparadas,puesseconservanenmuybuenascondicionesysondevaloresmuyfiables.

1.Puestaacerodelaparato,deacuerdoalasinstruccionesqueloacompaan.

2. Contrastado del medidor. Se sumergen los electrodos en lasolucin patrn de pH 7.00 a 20 C. Con el mando corres-pondiente de calibracin, se sita el valor de pH del patrn enla pantalla del aparato.

3.Seretiralasolucinpatrnyselavanloselectrodosconaguadestilada.

Tcnicaoperativa

4. Se cambia el patrn por otro de 3.00 4.00, a la misma tem-peratura y se comprueba si el medidor indica correctamente stevalor, en caso contrario con el mando corrector de la pendiente delelectrodo, se lleva al valor terico del patrn.

5.Elelectrodoselavaconaguadestilada.

6. Se sumergen los electrodos en el vino o mosto a la temperaturacomprendida entre 20 y 25 C. Es importante que la temperatura sealo ms prxima posible a la que se tena en el calibrado con lospatrones.

7. El display del aparato indicar el valor de pH de la muestra.

8. Los medidores de pH que incorporan en su circuito micro-procesadores, efectan el calibrado y control de los electrodos,automticamente. Se recomienda el empleo de ste tipo deaparatos.

9.Elresultadoseexpresacondosdecimales.

system



Acidezfija

COMENTARIOS

El dato analtico de la acidez fija, puede tener inters en la legislacinde algunos pases europeos, con objeto de detectar la adicin de aguaal vino. Aunque durante la fermentacin y posterior a ella, sucedentransformaciones profundas, el valor de la acidez fija se aproxima al dela acidez total del mosto original.

En algunas regiones, existen limitaciones legales a los valores de laacidez fija. Por ejemplo, en California, para los vinos de postre existe unnivel mnimo de 2.5 g/L.; 3.0 g/L para los vinos blancos y 4.0 g/L para lostintos. Estas cantidades son expresadas como cido tartrico.

Se halla el valor de la acidez fija, por diferencia entre la acidez total yla acidez voltil, expresadas las dos en cido tartrico. Esto quieredecir, que la acidez voltil, que generalmente est expresada en cidoactico, deber calcularse en cido tartrico, multiplicando su valoractico por el factor 1.25.

Clculo

1.34

system



2. ACIDOS

TARTARICO2.5METODOC.E.E.,referencia 2.6TEST VOLUMETRICODECOMPARACIN 2.7METODOREBELEIN 2.9METODOREBELEINmodificado 2.10METODORAPIDOO.I.V 2.12METODOCOLORIMETRICO 2.14

CITRICO2.16METODOUNICODELA C.E.E 2.16METODOSCHNEYDER 2.21METODOENZIMATICO 2.22

MALICO2.24METODO AMERICANSOCIETY OFENOLOGISTS2.25METODOO.1V(Af33) 2.26METODOENZIMATICO 2.28

LACTICO2.31METODO AMERICANSOCIETY OFENOLOGISTS2.31METODOENZIMATICO 2.33

ASCORBICO2.35METODOC.E.E.ascrbicototal 2.35METODOC.E.E.,rpido 2.39METODOENZIMATICO 2.40

SUCCINICO2.43METODOPEYNAUD-LAFON 2.43METODO CASTINO 2.45METODOENZIMATICO 2.48

ACIDOGLUCONICO2.50METODOPEYNAUD Y CHARPENTIE 2.50METODOENZIMATICO 2.54

VARIOS ACIDOS A LA VEZ2.56METODOKUNKEE 2.56METODODECAPA FINA 2.58

M.

2.3

system

GABSistemtica AnalticaS.L.

SantJordi,30.Moja-Olrdola08734,BCNtel.+34938171842fax.+34938171436

[email protected]

Tartrico

COMENTARIOS

La mayor parte de la cantidad de los cidos contenidos en la uva y enel vino, corresponde al cido tartrico. Ms de la mitad de la acideztotal, es debida a este cido y a sus sales. Concretamente, a un pH de2.98, de la totalidad del in tartrato presente, el 50% se halla en formade cido libre.

Es el ms fuerte de los cidos existentes en las uvas, y por ello,tampona el valor de pH del mosto o vino. Esta propiedad, es de granimportancia para la resistencia a las enfermedades, en el color y, en elsabor cido del vino.

El contenido de tartratos en la uva o en el mosto, es muy variable ydepende de la variedad, estado de madurez y regin geogrfica oclimatolgica de su cultivo. Los lmites extremos, pueden oscilar entre 2y 9 gramos por litro, expresados como cido tartrico.

-

2.5

system



[email protected]

METODOCEE,referencia

Principiodelmtodo

Reactivos

El cido tartrico, es valorado por pesada del racemato clcico pre-cipitado. Esta determinacin, puede completarse por otra volumtricade comparacin. Deben existir ciertas condiciones para la pre-cipitacin, como son: pH, volumen total empleado, y concentracin deiones precipitantes, de tal manera, que la precipitacin del racematosea total y, el levotartrato de calcio, permanezca en solucin. Si el vinoha sido adicionado de cido metatartrico, ser necesaria una hidrlisisprevia.

que contenga 10 gramosde calcio por litro. Se prepara con 25 gramos de carbonatoclcico, 40 mL de cido actico, reactivo anlisis y suficienteagua destilada hasta el volumen de un litro.

Se colocan en unvaso de 400 mL, 20 mL de una solucin de cido tartricodextro de 5 g/L, 20 mLde una solucin de tartrato amnico levoa 6.126 g/L y 6 mL de solucin de acetato clcico de 10 g decalcio por litro. Dejar en reposo, para que precipite, durantedos horas. Recoger el precipitado en un embudo filtrante devidrio poroso nmero 4, lavar por tres veces consecutivas con30 mL de agua destilada. Secar a la estufa a 70 C, hasta pesoconstante. Con las cantidades de reactivo indicadas, seobtienen aproximadamente 340 mg de racemato clcicocristalizado. Conservar en frasco tapado.

prepara con150 miligramos de tartrato amnico levo, que se disuelven en900 mL de agua, se aaden 8.8 mL de solucin de acetato decalcio de 10 g de Ca por litro y completar a un litro con agua.Dado que el racemato es ligeramente soluble en esta solucin,se procede a saturarlo de la siguiente forma: aadir 5miligramos de racemato de calcio al volumen anterior, agitar ydejar reposar 12 horas y filtrar.

SOLUCION DE ACETATO CALCICO

RACEMATO DE CALCIO CRISTALIZADO.

SOLUCION DE PRECIPITACION (pH.= 4.75). Se

2.6

Tcnicaoperativa

Clculos

Reactivos

1.Secolocanenunvasodevidriodeunos600mL,500mLdesolucindeprecipitaciny10.00mL delamuestradelvinoaanalizar.

2.Conelextremodeunavarilladevidrio,frtenselasparedesdelvaso.Sedejaenreposodurante12horas.

3. Filtrar sobre filtro de vidrio poroso nmero 4, previamentetarado y situado en un erlenmeyer Kitasato, para poder filtrar alvaco, por succin con una trompa de agua. Lavar el vaso con elmismo lquido filtrado, repetidamente, hasta que todo elprecipitado se haya pasado al filtro.

4.Secarenestufaa70C,hastapesoconstante.

5.PesarelprecipitadoyseaP elpesodelracematodecalcio(CaC O H ),cristalizadocon4molculasdeagua.

Unamolculaderacematoclcico,correspondeamediamolculadecidotartricodextro,enelvino.

Lacantidaddecidotartricopresenteenelvino,vienedeterminadaporlassiguientesfrmulas:

384.50xP seexpresaenmiliequivalentesdelcidotartricoporlitrodevino.

28.84xP serefiereengramosdecidotartricoporlitrodevino.36.15xP expresadoengramosdebitartratopotsicoporlitrode

vino.

equivalenteaproximadamentea82g/L.

4 6 4

TESTVOLUMETRICODECOMPARACION

ACIDOCLORHIDRICODILUIDO1:5(v/v),

2.7

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SOLUCION DE EDTA 0.05M.

SOLUCIONDEHIDROXIDOSODICOa/40%(p/v).

INDICADOR ACIDO CALCONCARBONICO,

n

Se emplea la sal disdica delcido etilendiamino tetractico o complexon III. Se pesan18.61 gramos y se disuelven en agua destilada hasta un litro.

preparado con 1gramo de 2-hidroxi-4sulfo-1-naftilazo-3-naftoico y 100 gramosde sulfato sdico anhidro. Mzclese ntimamente en elmortero.

1. El embudo filtrante del anlisis anterior, despus de habertomado nota de su peso, se coloca sobre un erlenmeyer y seaaden 10 mL de cido clorhdrico diluido, para disolver elprecipitado.

2. Se lava el filtro con 50 mL de agua destilada. Se aaden 5 mLde solucin de hidrxido sdico al 40% y 30 miligramos delindicador.

3.ValorarconlasolucindeEDTA 0.05M,hastavirajedelin-dicador.Seanelnmerodemililitrosgastados.

La cantidad de cido tartrico por litro de vino, se hallapor las siguientes frmulas:

5x siseexpresaenmiliequivalentesporlitro.

0.375xnexpresadoengramosdecidotartrico/L.

0.470xnexpresadoengramosdebitartratopotsicoporlitrodevino.

Tcnicaoperativa

Clculos

2.8 2.9

METODOREBELEIN1

Principiodelmtodo

Reactivos

Tcnicaoperativa

Puede utilizarse tanto para mostos, como para vinos. Al vino se aadedirectamente: nitrato de plata, vanadato amnico, carbn decolorante ysubsiguiente filtracin. Se eliminan as las sustancias colorantes y elexceso de vanadato. No se perjudica en absoluto la coloracin rosa,debida a la reaccin entre el cido tartrico y el vanadato. La reaccincoloreada se mantiene estable durante algunas horas. La gran ventajade este mtodo, aparte la rapidez, es que los azcares, alcohol, cidosorgnicos e inorgnicos presentes en el vino, no interfieren en ladeterminacin. Es muy especfico del cido tartrico. Esta tcnica serecomienda como mtodo de control, dada su rapidez, exactitud yfacilidad de realizacin.

encidoacti-coal30%.

preparada con10 gramos de vanadato amnico, disueltos en 150 mL dehidrxido sdico 1 M, 200 mL de acetato sdico al 27% ycompletar el volumen a un litro, con agua destilada.

1. En un erlenmeyer de 200 mL se vierten 10.00 mL del vino aensayar o 3.00 mL si es mosto. A continuacin 15.00 mL desolucin de nitrato de plata 0.1 M y 0.5 g de carbndecolorante.

2. Agteseunos15segundos. A continuacin,sindejardeagi-tar,seaaden15mL desolucindevanadatoamnico.

3. Filtrar a travs de un filtro de papel, despreciando los 5 mLprimeros, luego se recogen 10 mL y se dejan reposar 30minutos.

SOLUCIONDENITRATODEPLATA 0.1M,

SOLUCION DE VANADATO AMONICO al 1 %,

1.H.Rebeiein, Chem.Mikrobiol.Technol.Lebensm.,2,pginas33-38,(1973).

system



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2.10 2.11

4. Se prepara el espectrofotmetro, para determinar la densidadptica en una cubeta de 10 mm de paso de luz, a la longitud deonda de 530 nm.

5.Serealizaunensayoenblanco,conelempleodeaguades-tiladaenvezdevino.

6. Deber confeccionarse una curva patrn, con soluciones decido tartrico, reactivo anlisis, de concentracionesconocidas.

7. Se coloca el lquido a analizar en una cubeta y se mide ladensidad ptica. El valor se compara con la grfica obtenidacon las soluciones patrn.

Slo es necesario comparar las lecturas de la densidad ptica ypasarlas a la grfica patrn, leyendo la concentracin del cidotartrico.

Clculos

METODOREBELEINmodificado2

Principiodelmtodo

Reactivos

Es un perfeccionamiento del mtodo anterior, para eliminar las in-terferencias debidas a la presencia de antocianinas en los vinos tintos.Esencialmente es una correccin del color del vino, con lo que se evitael empleo del carbn, para eliminar el color.

Se pesan 270 gra-mos de acetato sdico para anlisis y se disuelve con aguahasta completar un litro.

Acidoacticoal30porciento.

SOLUCION ACETATO SODlCO al 27%.

SOLUCION1.

2.M.VidalyJ.Blouin,Ref. Fr.Oenol.,70,pginas39-46,(1978).

SOLUCION 2.

SOLUCION 3.

Solucin de metavanadato. Disolver 10 gramosde metavanadato amnico en 150 mL de hidrxido sdico 1 M.aadir 200 mL de solucin de acetato sdico al 27% ycompletar con agua destilada hasta un litro.

Disolver 4.5 gramos de cloruro amnico en 150mL de hidrxido sdico M y 200 mL de solucin de acetatosdico al 27% y agua destilada hasta un litro. Mzclensevolmenes iguales de esta solucin y la de cido actico al30%. Se corrige el pH al mismo valor que el que tenga unamezcla de volmenes iguales de cido actico al 30% ysolucin 2, mediante el empleo de una solucin de hidrxidosdico 1 M.

1. Se preparan cuatro tubos de ensayo, asignados como A, B, Cy D.

2. A cada uno de los tubos se aaden los volmenes que seindican en el siguiente cuadro:

3. Mzclese bien cada tubo y djese reposar durante 15 minutos.Se procede a la determinacin de la densidad ptica en elespectrofotmetro, en la longitud de onda de 530 nm y concubetas de 10 mm de paso de luz.

4. Preparacin de las soluciones patrn para el trazado de lagrfica. Se prepara una solucin standard con 10 gramos decido tartrico, reactivo anlisis, disueltos en un litro de aguadestilada. En 10 matraces aforados de 100 mL, se vierten encada uno de ellos 5.00, 10.00, 20.00, 30.00....90.00 mL de lasolucin standard, completando con agua hasta el enrase. Lasolucin de cada matraz tendr una concentracin

Tcnica operativa

Cantidad en mL

A B C D

Vino o mosto 1 0 1 0Agua 0 1 0 1

Solucin 1 10 10 0 0

Solucin 2 10 10 0 0

Solucin 3 0 0 20 20

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2.12 2.13

de cido tartrico de: 0.5, 1.0, 2,....9 gramos por litro. La so-lucin standard sin diluir, corresponde a una concentracin detartrico de 10 gramos por litro.

5. Se prepara una curva con patrones desde 0 a 5 gramos decido tartrico por litro. Las soluciones de los tubos B y D noson necesarias, si el vino es blanco o, cuando se emplean lospatrones.

Para el clculo de la absorbancia, hay que anotar la diferencia entrelas absorbancias A y C (o sea A - C), en el caso de vinos blancos. Envinos tintos, la absorbancia o densidad ptica a considerar ser:

(A-B)-(C-D).

Se puede determinar el cido tartrico, por precipitacin en forma detartrato cido de potasio, en condiciones tales, que se reduzca almnimo su solubilidad.

obtenida colocando en unmatraz aforado de un litro, 300 g de cloruro potsico puro, 5.75g de sal de Seignette (tartrato de sodio y potasio) 1.25 g deoxalato potsico, disolver con agua destilada y completar avolumen. Si la temperatura es baja, pueden aparecer cristalesen el fondo del envase, que debern redisolverse calentandoligeramente, antes del uso.

Clculos

Principiodelmtodo

Reactivos

METODORAPIDOO.I.V.3

ACIDO ACETICOCONCENTRADO.

SOLUCION DE PRECIPITACION,

ALCOHOL ETILICO 96%.

3.P.G.Garoglio,Enc.Vitic.Mond.,vol.5,pgina63,(1973).

SOLUCIONDELAVADO,

AZUL DEBROMOTIMOL,


preparadaenunmatrazaforadodeunlitro,disolviendo150gdecloruropotsico,200midealcoholetlicoycompletaravolumenconaguadestilada.

disolviendo1gdelindicadoren100mL dealcoholetlico.

1. En un tubo de centrfuga, se colocan 10.00 mL de vino, 0.4 mLde cido actico, 7.5 mL de solucin de precipitacin y 2 mL deetanol.

2. Con un agitador de vidrio, se agita hasta que aparezca unenturbiamiento cristalino. Esto requiere aproximadamenteunos 10 minutos.

3.Dejareltuboenreposoduranteunahora,alatemperaturade8C,aproximadamente.

4. Despus de transcurrido el tiempo, se agita con un agitador devidrio, teniendo cuidado de mezclar el precipitado con ellquido. Esta agitacin es indispensable para obtener unaprecipitacin completa.

5.Dejarlounahoraenelfrigorfico.

6. A lasalidadelrefrigerador,secentrifugaysedecantaellquidoquesobrenada,quedebeestarperfectamentelmpido.

7.Lavarelprecipitado,dosveces,conaproximadamente2mLdelasolucindelavado.

8.Centrifugarotravezydespreciarellquido.

9.Pasarelprecipitado,conayudadeunchorrodeaguadesti-lada,aunvaso.

10. El bitartrato potsico se analiza por alcalimetra, con la so-lucin 0.1 M de hidrxido sdico, en presencia de unas gotasde indicador de azul de bromotimol (cambio de color deamarillo a azul).

Tcnicaoperativa

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2.14 2.15

Clculos

Principiodelmtodo

Reactivos

Tcnicaoperativa

Sielvolumengastadodehidrxidosdico0.1Mesn,lacantidaddecidotartricosehallaporlasfrmulas:

1.5xn-2engramostartricoporlitro.

13.33(1.5xn-2)enmiliequivalentesporlitro.

1.254(1.5xn- enbitartratopotsico.

Es esencialmente un mtodo colorimtrico, fundamentado en elmtodo de Matchett y otros por reaccin del cido tartrico y elmetavanadato. Esta modificacin presenta un mtodo que mejora

suprecisin.

1.PrepararunacolumnadevidrioPyrexde500mmdelongi-tudy12mmdedimetro.

2.Cargarlacolumnautilizando mL delaresina,mezcladacon20vecessuvolumendecidoacticoal30%.

2)

RESINA ANIONICA DUOLITE A101D.

ACIDO ACETICOCONCENTRADO.

SOLUCION ACIDO ACETICOa/30%.

SOLUCIONSULFATOSODICO0.5M.

SOLUCIONMETAVANADATOSODICOal3%.

20

METODOCOLORIMETRICO4

5

4.G.Hilly A.CaputiJr., Am.J.Enol.Vitic.,21,pginas153-161,(1970).

3. Preparar el grifo de salida de la columna, de modo que el flujode salida del lquido sea de 2.5 a 5 mL por minuto. Lavar laresina con 30 mL de cido actico al 0.5% y finalmente con 50mLde agua destilada.

4. Colocar en la cabeza de la columna, 10.00 mL de vino y arras-trar la muestra con mLde cido actico al 0.5%.

5. Lavar con 50 mLde agua destilada.

6. Eluir los cidos adsorbidos con solucin de sulfato sdico 0.5M.

7. El cido lctico eluye en los primeros 30 mL y el cido tartricoen la fraccin comprendida entre los mL.

8. Recoger las muestras en probetas graduadas.

9. Colocar en un matraz aforado de 50 mL, 25.00 mL de la frac-cin recogida entre mL bien mezclada, que contiene elcido tartrico.

10. Aadir 0.5 mL de cido actico concentrado y 2 mL de lasolucin de metavanadato sdico y completar a volumen conagua destilada.

11. Se mezcla bien y se deja en reposo durante unos 80 minutos ala temperatura ambiente.

12. Se mide la absorbancia a travs de una cubeta de 10 mm depaso de luz y en el espectrofotmetro a la longitud de onda de480 nm.

13. Realcese un ensayo en blanco, con 25.00 mL de solucin desulfato sdico 0.5 M, 0.5 mL de cido actico concentrado y 2mL de solucin de metavanadato, diluido con agua hastamL.

14. Se prepara una grfica con soluciones patrn de cido tar-trico y la absorbancia de la muestra se compara con losvalores de la grfica.

25

46 y 75

46 y 75

50

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2.16 2.17

Ctrico

COMENTARIOS

METODOUNICODELA CEE

La presencia de este cido en las uvas es muy escasa, de un ordenmximo de 0.08%. En los vinos normales, es muy extrao hallar valoressuperiores a 0.5 g/L. En general oscilan entre 0.1 a 0.3 gramos por litro.

En algunos pases, est limitada la cantidad de cido ctrico presenteen los vinos. La legislacin espaola y la de la CEE, no permitencantidades superiores a un gramo de cido ctrico por litro de vino. Elcido ctrico, es un producto que se aade a los vinos para aumentar laacidez y para complejar el hierro presente, evitando con ello posiblesenturbiamientos.

El cido ctrico, es precipitado por el in bario, en mediohidroalcohlico y alcalino. Despus de la decoloracin de la solucinacuosa del precipitado brico, por el carbn activo, se oxida con elacetato de

Principio del mtodo

plomo IV, formndose en presencia del cido diazosulfanlico, uncompuesto amarillo, que se cuantifica colorimtricamente a 420 nm.

(densidad = 0.910).

preparada pordisolucin de 20 gramos de cloruro de bario, reactivo anlisis, enagua destilada, enrasando a volumen de 100 mL.

Mezclar140mL deaguadestiladacon300mL dealcoholde96%.

por disolucin de71 gramos de sulfato sdico anhidro, reactivo anlisis, en aguadestilada hasta un litro.

obtenida por di-solucin de 270 gramos de acetato sdico anhidro, reactivoanlisis, en agua destilada hasta el volumen de un litro.

por disolucin de 2gramos de nitrito sdico cristalizado, reactivo anlisis, en aguahasta 100 mL (sta solucin se conserva por algn tiempo enfrascos de color topacio).

Disolver 1.5 gramos decido sulfanlico, en 50 mL de cido actico concentrado y llevara volumen de 250 mL con agua destilada. Agitar frecuentementedespus de la preparacin, y dejar en reposo durante una noche.Mantngase en frascos oscuros y en estas condiciones suconservacin es ilimitada.

locan en un erlenmeyer de 500 mL unos 50 gramos, apro-ximadamente, de acetato de plomo IV (plomo tetracetatohumectado en cido actico cristalizable) y se aaden 250 mLdecido actico tambin cristalizable. Se deja en reposo hasta queaparezca un lquido claro sobrenadante. Esta solucinmantenida en frasco oscuro, se conserva indefini-

Reactivos

AMONIACO CONCENTRADO

SOLUCION DE CLORURO BARICO al 20%,

SOLUCIONDELAVADO.

SOLUCION DE SULFATO SODICO al 7.1 %,

CARBON ACTIVO.

SOLUCION DE ACETATO SODICO al 27%,

SOLUCION DE NITRITO SODICO al 2%,

SOLUCION DE ACIDO SULFANILICO.

SOLUCION SATURADA DE ACETATO DE PLOMO IV. Se co-

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2.18 2.19

damente. En el anlisis slo se emplea el lquido claro, por ellose deber aadir, cuando sea necesario, una cantidad decido actico, con objeto de mantener la solucin saturada,disponible para el anlisis.

preparadacon 5 mL de la solucin anterior, que se colocan en un er-lenmeyer de 250 mL, al que se aadirn, con rapidez, 50 mLde una solucin de ioduro potsico al 10%. Valorar inme-diatamente, con una solucin 0.05 M de tiosulfato sdico, enpresencia de engrudo de almidn, como indicador. Sea elnmero de mililitros gastados.

TomarunvolumendelasolucinsaturadadeacetatodeplomoIV,igualalacifraresultantedelasiguientefrmula:

y colocarlo en un matraz aforado de 1 litro, completando elvolumen con cido actico puro. Guardada en frascos os-curos, esta solucin se conserva indefinidamente.

1. Introducir en un tubo de centrfuga, de una capacidad de 40 a50 mL. 5.00 mL del vino o mosto a analizar, 1 mL de amonacoconcentrado y 1 mL de solucin de cloruro brico al 20%.Mezclar bien, mediante el empleo de una varilla de vidrio.Despus de aproximadamente dos minutos de agitacin, seaaden 15 mLde alcohol de 96%, mezclar bien de nuevo con lavarilla y dejar reposar 5 minutos.

2. Centrifugar durante 3 a 4 minutos. Despreciar el lquido so-brenadante y lavar el precipitado de la forma siguiente: tomar 2mL de solucin de lavado con una pipeta de 2 mL, apoyar lapunta de la misma en la parte superior interior de la pared deltubo y verter el lquido soplando por la pipeta, imprimiendo almismo tiempo un movimiento de rotacin del tubo alrededor desu eje. Poner en suspensin el precipitado, empleando unavarilla de vidrio con goma en la punta. Lavar la varilla por dosveces con 2 mL de solucin de lavado cada vez, de forma, queno quede ninguna partcula del precipitado adherido a la gomade la varilla. Centrifugar de nuevo.

SOLUCION DE ACETAT DE PLOMO IV al 1 %,

n

2.25x1000/n enmL

Tcnicaoperativa

3. Tirarellquidoyefectuarunsegundolavadodelprecipitadodeigualforma.

4. El precipitado, todava hmedo, del lquido de lavado, se re-cubre con unos 10 mLde la solucin de sulfato sdico al 7.1 %.Se coloca el tubo en un bao de agua hirviente, durante 10minutos, agitando con una varilla, de manera que no seformen grumos en el precipitado.

5. Todava caliente, el contenido del tubo se pasa cuantitati-vamente a un matraz de 50 mL, con la ayuda de la solucin desulfato sdico al 7.1 %. Se deja enfriar y se lleva a volumencon la misma solucin. Se mezcla bien.

6. Se pasa el lquido a un erlenmeyer de 100 mL, que contiene0.2 gramos de carbn activo. Agitar. Se deja en reposo du-rante 5 minutos y se filtra sobre papel tupido.

7. Esta es la solucin que se emplea para el anlisis, que re-presentar el cido ctrico del vino o del mosto, diluida diezveces.

8. Se emplean dos erlenmeyers de 50 mL, asignados como Aque contienen cada uno, 10 mL de solucin de acetato

sdico al 27%. Aadir a cada uno de ellos, 2.00 mL de lasolucin a analizar.

9. Preparar en un tubo, la solucin de diazoacin, aadiendo,con agitacin, 5 mLde la solucin de cido sulfanlico y 1 mLdela solucin de nitrito sdico. Con agitacin, verter en elerlenmeyer A, 2 mL de esta solucin recin preparada y 5 mLde cido actico cristalizable. En el erlenmeyer B, se vierten 2mL de la solucin de diazoacin y 5 mL de solucin de acetatode plomo IV al 1 % y poner en marcha, inmediatamente, unreloj avisador para 13 minutos.

10. Aproximadamente a los 5 minutos, filtrar el contenido de loserlenmeyers, sobre filtro de papel plegado. Poco tiempo antesde los 13 minutos, verter los lquidos filtrados en las cubetasespectrofotomtricas de 30 mm de paso de luz y colocarlas enel espectrofotmetro a la longitud de onda de 420 nm. Cuandose cumpla el tiempo de 13 minutos, se toma la lectura de ladensidad ptica de la cubeta B, actuando la cubeta A cmoensayo en blanco.

yB,

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11. Si la solucin a analizar es muy concentrada en cido ctrico yla absorbancia es elevada, diluirla con solucin de sulfatosdico al 7.1 %. Las lecturas se contrastan con la curva decalibrado, que indicar la cantidad de cido ctrico en gramospor litro de vino.

12. En un matraz de 100 mL, se disuelven 273.4 miligramos decido ctrico monohidrato (equivalente a 250 mg de cidoctrico anhidro) con solucin de sulfato sdico al 7.1 %, llevar avolumen con la misma solucin. Tomar 10.00 mL de estasolucin obtenida, pasarla a un matraz de 100 mL y enrasar avolumen con solucin de sulfato sdico. Con esta solucinpreparar las siguientes diluciones, empleando el sulfatosdico al 7.1 % cmo disolvente:

5.00mL secompletanavolumende200mL

Estas diferentes diluciones, corresponden a las soluciones aanalizar, equivalentes a vinos que contengan 0.065, 0.125,0.250, 0.500 y 1 gramos por litro.

13.Tmense 2.00 mL de cada una de estas diluciones, que secolocan en los erlenmeyers marcados A y B, procediendo alanlisis tal como se ha indicado anteriormente. El punto cerode la curva de tarado, se obtiene colocando en los citadoserlenmeyers, solamente solucin de sulfato sdico. Larepresentacin grfica de las absorbancias, en funcin de laconcentracin de cido ctrico, no es lneal y presenta unaligera curvatura.

2.20 2.21

METODOSCHNEYDER6

Principiodelmtodo

Reactivos

Tcnicaoperativa

El vino tratado con una solucin acuosa de bromuro potsico y otracida de bromato, forma un precipitado que se elimina por cen-trifugacin. Al lquido claro, se vuelven a aadir de nuevo, las solu-ciones anteriores ms una de anhdrido vandico. En caliente, se formauna opalescencia, que se mide con el espectrofotmetro a 590 nm.Mediante una grfica de tarado, se halla la concentracin de cidoctrico.

Disolver10gdebromuropotsicoenaguadestilada,contenidaenunmatrazaforadode100mL yenrasar.

Enunmatrazde100mL,sedisuelven2.5gra-mosdebromatopotsico,conunos50mL deaguadestilada,seaaden2.5mL decidosulfricoconcentradoysecompleta,cuandoestfro,conaguadestilada.

Disolver 1 gramo de anhdrido vandico, en 25 mLde cido sulfrico concentrado. Verter esta solucin, poco a pocoy con agitacin, sobre 75 mLde agua destilada.

1.Enuntubodecentrfuga,sevierten10.00mL devino,2.5mL desolucin A y2.5mL desolucinB.

2.Setapaeltuboyseagitadurante minutos.Duranteestetiempotienelugarlareaccin.

3.Secentrifugaa2000r.p.m.,durante10minutos.4. Se toman mL del lquido claro y se introducen en un tubo de

ensayo, con adicin de 1 mL de la solucin A, 1 mL de lamL de la solucin C, agitando despus de cada adicin. Setapa y se sumerge en un bao de agua a 25 C.

SOLUCION A.

SOLUCIONB.

SOLUCION C.

20

2

B y 2.5

6.J.Schneyder, Mitt.RobeWeinObstau,Fruechteverwert.(Klosterneuburg),19,pginas122-123,(1955).

5.00 mL id id 100 mL5.00 mL id id 50 mL

10.00 mL id id 50 mL20.00 mL id id 50 mL

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2.22 2.23

de evitar contaminaciones. El espectrofotmetro con lmparade tungsteno, se sita a 340 nm de longitud de onda.

3. Efectuar una dilucin del vino de diez veces, si la concen-tracin de cido ctrico sobrepasa 0.4 g/L.

4. Seguir paso a paso las indicaciones del folleto adjunto al testde anlisis.

El clculo de la concentracin de cido ctrico, se determina por ladiferencia de las absorbancias ledas, siguiendo las instruccionesdadas en el folleto.

Puedeexpresarseelcidoctricohalladocomo,anhidroomonohidrato,paraellolasfrmulasaaplicarsern:

c=0.460xAcg/L anhidro

c=0.503 g/Lmonohidrato

siendo ladiferenciadeabsorbanciasledas.

a) Para determinar el cido ctrico total, en el que se incluye el cidosalificado, se procede como sigue: En un matraz provisto de re-frigerante de reflujo, se colocan 20.00 mL de vino y 6 mL de solucinalcohlica de hidrxido potsico, aproximadamente 2 M, y se hiervedurante 10 minutos. Se deja enfriar a temperatura ambiente y seneutraliza con cido sulfrico 2 M. Cuantitativamente se pasa a unmatraz de 50 mL y se enrasa con agua. De este lquido se toman 10.00mL y se llevan a volumen de 100 mL con agua destilada. Esta dilucines la que se emplea en el anlisis. En caso de que sea muyconcentrada, se diluyen 5.00 mL a 100 mL. Los clculos son losmismos, que en la determinacin del cido ctrico libre.

b) Esta metdica, como todas la enzimticas, son muy especficas ypor ello el gran inters de su aplicacin en la determinacin del cidoctrico en el vino. La laboriosidad del mtodo qumico, haceproblemtico el resultado, dada la gran cantidad de manipulacin ne-cesaria para llevarlo a cabo.

Clculos

Observaciones

xAc

Ac

5. La opalescencia formada, se mide en el espectrofotmetro ala longitud de onda de 590 nm, en comparacin con aguadestilada.

6. Se prepara una grfica de tarado, empleando soluciones pa-trn entre 0.1 a 0.5 gramos de cido ctrico por litro. La den-sidad ptica medida en el anlisis del vino, se compara con losvalores de la curva patrn.

7.Elvinoaanalizar,nodebecontenerunacantidadmayorde0.5gramosdecidoctricoporlitro.

El cido ctrico, o sus sales, se convierten en oxalacetato, reaccinque es catalizada por la enzima citrato liasa (CL). La cantidad de NADHoxidada, se corresponde cuantitativamente, con la cantidad de citrato.Se mide a la longitud de onda de 340 nm.

para 30 determinaciones, que contiene losiguiente: 2 frascos con reactivos, que debern reconstituirsecon agua destilada. La conservacin de estos reactivos, ascomo su reconstitucin, se indica en el folleto que acompaa acada test.

1. La determinacin del cido ctrico libre, que es la forma normalen que se encuentra el cido en el vino, puede realizarse envinos blancos o tintos sin dilucin ni decoloracin alguna.

2.Sepreparanlascubetasde10mmdepasodeluz,queserecomiendanseandeplsticoparaunsolousoconobjeto

METODOENZIMATICO

Principiodelmtodo

Reactivos

Tcnicaoperativa

Test-combinacin de la firma Boehringer Mannheim, nmerode catlogo 139076,

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Mlico

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Por su concentracin, es el segundo cido de importancia en la uva.En el fruto verde, su presencia es elevada y disminuye a medida queavanza la maduracin, principalmente durante los meses de julio yagosto. En la madurez, la cantidad presente puede ser de un 10 al 35%,mientras que cuando est verde, alcanza hasta un 65% de la acidez.

Peynaud considera que la desaparicin del cido mlico durante lafermentacin es debida a la separacin de los dos tomos de hidrgenoy, posterior decarboxilacin del cido oxalactico a etanal, que actacomo acceptor de hidrgeno y se transforma en alcohol.

El cido mlico es de importancia en el vino, ya que es el ms f-cilmente atacable por microrganismos, en comparacin con el tartricoo succnico. En los vinos que han sufrido la fermentacin malolctica,puede darse el caso de total ausencia de este cido. Puede sucedertambin que, en vinos obtenidos de cosechas verdes, la concentracinde cido mlico alcance los 6 gramos por litro.

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7. E. Peynaud Mauri,yA. Ann. Inst. natl. recherche agran., serE4, pginas 111-139,

(1956).

2.24 2.25

METODO AMERICANSOCIETY

OFENOLOGISTS8

Principiodelmtodo

Reactivos

Tcnicaoperativa

Se utiliza la enzima L-mlico dehidrogenasa, para catalizar la reac-cin entre el cido mlico y la NAD (nicotinamida adenina dinucletido),formando cido oxalactico y la forma reducida del dinucletido(NADH). El cido oxalactico se fija por la hidracina, en solucinalcalina. La reaccin se mide por el cambio en el coeficiente de ex-tincin a 340 nm, debido a la reduccin del NAD a NADH.

En un matraz aforado de 100 mL, secolocan 7.5 gramos de glicina, 5.2 gramos de sulfato de hi-dracina y 0.2 gramos de EDTA, un poco de agua para quequeden en suspensin y luego se aaden 51 mL de hidrxidosdico 2 M, enrasando al volumen con agua destilada. Estasolucin es estable durante una semana, si se mantiene a unatemperatura inferior a 4 C.

disolver 420 miligramos de NAD en 12 mLde agua destilada. Esta solucin se conserva cuatro semanasa 5 C.

por disolucin de10 miligramos en 2 mL de agua. Esta suspensin es establedurante un ao a 5 C.

1. En un tubo de ensayo pequeo, se colocan 0.9 mL del tampnde pH 9.5. Se aade 1 mLde agua destilada y 1.00 mLdel vino omosto a analizar, con un contenido de cido mlico entre 10 y40 microgramos. Para ello hay que diluir la muestra de 100 a200 veces.

2.Seaadenacontinuacin,0.1mL deNAD(35miligramos/mL)ysemezclabien.

TAMPON DE pH 9.5.

SOLUCION NAD,

SOLUCION DEHIDROGENASA MALICA,

8.B.Gump,S.Saguandeekuiyotros, Am.J.Enol.Vitic.,36,3,pginas248-251,(1985).

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2.26 2.27

3. En el espectrofotmetro se colocar una cubeta con paso deluz de 10 mm con la muestra anterior y se leer la absorbanciaa 340 nm. Este valor de absorbancia se asigna con la letra .

4. Se aaden seguidamente 4 microlitros de la solucin dedehidrogenasa mlica y se mezcla. Se coloca en la estufa a 37C, durante 30 minutos.

5. Transcurrido el tiempo indicado, se enfra a 25 C durante 6minutos y se lee la absorbancia de nuevo. Sea el valorledo.

6. Se prepara una grfica con soluciones patrn de cido mlico,a partir de una solucin standard que contenga 40 gramos porlitro.

La absorbancia causada por el cido mlico, se calcula segn lafrmula siguiente: Este valor se lleva a la grfica y de ella sededuce la concentracin de cido mlico, que deber ser multiplicadapor el factor de dilucin que haya tenido lugar.

El cido mlico, separado mediante el empleo de una columna cam-biadora de aniones, se determina colorimtricamente en el eludo quetambin contiene cidos tartrico y lctico. Por la accin del cidosulfrico concentrado y el cido cromotrpico, se forma una coloracinamarilla. La intensidad de este color depende en gran manera de laconcentracin del cido sulfrico, por ello es necesario regularla conmucha precisin. El cido lctico y el cido mlico provocan, junto conel cido tartrico, una reaccin interferente que colorea de azul-violetael cido cromotrpico debido al metanal formado. El resultado de lamedida deber corregirse, previa determinacin de lasconcentraciones del cido tartrico y lctico.

A1

A2

A2-A1.

Clculos

Principiodelmtodo

METODOO.I.V.(Af33)

Reactivos

Tcnicaoperativa

SOLUCION ACIDO CROMOTROPICO al 5%.

ACIDO SULFURICO al 96%.

SOLUCIONDESULFATOSODICOal7.1%

SULFATOSODICO0.5M.

ACIDO ACETICOal30%. ACIDO ACETICOal0.5%.

RESINA ANIONICA FUERTE,11/MERCK.

Es necesarioprepararla en el momento del uso, disolviendo 500 miligra-mos de cromotropato sdico, en 10 mLde agua destilada.

Se parte del cido del 98%, pre-via valoracin y de ste se prepara exactamente, la solucindel 96% de cido sulfrico.

preparadacon71gramosdesulfatosdicoanhdroyaguadestiladahastaelvolumendeunlitro.

1.Colocarlaresinaenunacolumnadevidrio.Laresinadebeestarensuspensinencidoacticoal30%.

2.Selavaconcidoacticoal0.5%variasveces.

3. Despus del lavado, se vierten en la columna 10.00 mL devino, se abre el grifo de la columna y se deja fluir el lquido auna velocidad de 1-1.5 gotas por segundo.

4.Selavalaresinaconagua.

5.Conlasolucindesulfatosdico,seeluyenloscidosfija-dosenlaresina.

6. En un tubo con tapn esmerilado, de una cabida aproximadade 50 a 60 mL, se coloca 1.00 mL del lquido eludo de laresina.

7.Enuntuboigual,sepreparaunensayoenblanco,colocan-doenl,1mL desolucindesulfatosdico.

8. A cada uno de los tubos se aade 1 mL de cido cromotrpicoy 10 mL de cido sulfrico. Tapar y agitar, de forma que seobtenga una homogeneidad perfecta, pero sin que el lquidollegue a mojar el tapn.

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9. Sumergir los tubos en un bao de agua, en enrgica ebulli-cin, manteniendolos as durante 20 minutos exactos.

10. Enfriar los tubos a 20 C. Despus de 90 minutos exactos,desde el enfriamiento, medir la densidad ptica con respectoal ensayo en blanco. La longitud de onda de trabajo delespectrofotmetro, en 429 nm.

Leer en la grfica de tarado, el valor del cido mlico en bruto yasignado como M. El valor real de cido mlico, se deduce por lasiguiente frmula:

enlaque T igualalaconcentracindecidotartricoenlamuestrayL igualalcidolcticodelamisma.

Para preparar la grfica patrn, se disolvern 250 miligramos decido mlico puro, racmico o levgiro, (los dos dan la misma reac-cin), en solucin de sulfato sdico 7.1 %, llevando el volumen a 500mL. Tomar 5.00, 10.00, 15.00,... 35.00 mL de esta solucin, verterla enmatraces de 50 mL y completar a volumen con la solucin de sulfatosdico. Las soluciones obtenidas, corresponden a un eluado de vinoque contiene 0.5, 1.0, 1.5,... 3.5 gramos de cido mlico por litro.

En presencia de I-malato dehidrogenasa, el cido l-mlico o sussales, es oxidado por el NAD a oxalacetato. La reaccin, catalizada porla enzima glutamato-oxalacetato-transminasa (GOT), el oxalacetato seconvierte en I-aspartato, en presencia de I-glutamato.

Clculos

Principiodelmtodo

METODOENZIMATICO

La cantidad de NADH formada, es esteoquimtrica con la concen-tracin de I-malato. La NADH es la que provoca la absorbancia en lalongitud de onda de 340 nm.

para25determinaciones.Contiene4frascosconreactivos,algunodeloscualessedeberecons-tituirconaguadestilada.Laconservacindeestosreacti-vos,ascomosureconstitucin,seindicaenelfolletoqueacompaaacadatestanaltico.

1. Se preparan las cubetas de 10 mm de paso de luz, recomen-dndose que

Tecnicas Analiticas Para Vinos

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