Tecnica s Experimental Es
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Estudio de respuestas celulares Estudio de respuestas celulares in in vitrovitro eein vivoin vivo
Funcionalidad de las células
Activación
• Proliferación
• Función efectora
• Síntesis de sustancias inmunoreguladoras(citoquinas)
• Expresión de Receptores
Apoptosis
Detección de tipos celulares
• Caracterización fenotípica
• Evaluación número total de linfocitos
• Relaciones LT/LB, LT CD4+/ CD8+
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In vivo
• Proliferación
• Apoptosis
• Citotoxicidad
In vitro
• Activación de Linfocitos por Mitógenos o Ag
• Cultivo Mixto Linfocitario (CML)
• Citotoxicidad Mediada por Células (CMC)
• Producción de citoquinas, Acs (para LB)
• Muerte celular - Apoptosis
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Activación celular:Medición de citoquinas:
• ELISA, RIA
• ELISPOT
• Inmunofluorescencia
• PCR
• Western Blot
• Métodos biológicos
ڡ Marcación
intracitoplasmàtica
ڡ Beads
ڪ RT – PCR (cualitativa-semicuantitativa)
ڪ RT - Real-time PCR (RT-qPCR) Cuantitativa
Citometría de flujo(Células en suspensión)
Microscopía(cortes de tejidos, células adheridas a un soporte)
![Page 4: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/4.jpg)
Proliferación celular:
• In vitro
• In vivo • Incorporación de Bromo-deoxiuridina
• CFDA-SE
Apoptosis:• Anexina-V / PI
• Tunel
• Hipodiploidía
• Fragmentación de ADN
• Tinción con Bromuro de etidio y Naranja de acridina
• dosaje biológico de TNF-α
• Vías de activación de caspasas
• Incorporación de 3H-Timidina
• Incorporación de Bromo-deoxiuridina
• CFDA-SE
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Estudio de la función efectora:
• Citotoxicidad mediada por células
• Reacción mixta linfocitaria
• Ensayos de presentación y procesamiento
• In vitro
•In vivo
• 51Cr
• colorantes
• enzimas
CFDA-SE
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Separación de las células
células mononucleares
Sangre periférica
LT (80%)LB (10%)NK (10%)
Ganglios
LT (70%)LB (30%)
Bazo
LT (50%)LB (40%)NK (10%)
Métodos
• Gradiente de Ficoll-Hypaque• Gradiente de Percoll• Pasaje a través de columnas de lana de nylon• Adherencia
• Citotoxicidad mediada por Ac• Técnicas inmunomagnéticas• Citometría de Flujo – Separación de células
enriquecimiento
purificación
Separación de células
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Gradiente de Gradiente de FicollFicoll--HypaqueHypaque
Separación de células
Sedimentación con Dextran:
Para enriquecer en PMN
Desplaquetizar
Separar células por adherencia (y diferenciar los monocitos a macrófagos)
Separar células por gradiente de Percoll
A partir de éstas fracciones se puede:
Plasma
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Gradiente de Gradiente de PercollPercoll
Centrifugación
eritrocitos
plasma
granulocitos
linfocitos
blastos, monocitos, NK
Separación de células
Permite separar los linfocitos de los monocitos del halo del Ficoll (doble purificación)
• pellet: linfocitos
• Halo de monocitos
Accesibles en costo
Simples
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Ventaja: No se necesitan Ac o complemento
Desventaja: Enriquecimiento, no quedan las poblaciones puras
Pasaje a travPasaje a travéés de columnas de lana de nylons de columnas de lana de nylon
Adhesión de LB y macrófagos
LT eluyen
Enriquecimiento de células T por no adherencia al nylon
Separación de células
LBMO
LT
LB
LT
MOLB
LT
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TIPO CELULAR MARCADORLT CD3
LT helper CD3 CD4
LT citotóxico CD3 CD8
LBIgM de superficie
CD19CD21
NK CD16
monocitos CD14
SeparaciSeparacióón de las poblaciones n de las poblaciones linfocitariaslinfocitarias
• citometria de Flujo (sorting)
• Perlas inmunomagnéticas
• Citotoxicidad mediada por anticuerpos
Utilizando anticuerpos específicos
Selección Positiva
Selección Negativa
Separación de células
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CitotoxicidadCitotoxicidad mediada por mediada por AcAc
Complemento
Y
YY
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Depleción de la población
Separación de células
![Page 12: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/12.jpg)
TTéécnicas cnicas inmunomagninmunomagnééticasticas
Ac con microesferasmagnéticas
SELECCIÓN NEGATIVA
SELECCIÓN POSITIVA
Separación de células
![Page 13: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/13.jpg)
Activación de Linfocitos (LT y/o LB)
• Estimulación con Mitógenos
• Estimulación Antigénica
• Cultivo Mixto Linfocitario (CML)
Pruebas Funcionales Pruebas Funcionales in in vitrovitro
Evaluación de la Proliferación Celular
• Incorporación de 3H-Timidina
• Incorporación de Bromo-deoxiuridina
• CFDA-SE
• IL-2 (método indirecto)
Proliferación celular
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Proliferación celular
Proliferación in vitro de celulas mononuclearesActivación Policlonal Células respondedorasFitohemaglutinina (PHA) LT
Concanavalina A (Con A) LT
Mitógeno de Fitolaca (PWM) LT y LB
Ésteres de forbol (PMA) LT y LB
Proteína A S. aureus LB
ionomicina LT + LB
antiCD3 + antiCD28 LT
Activación antígeno específica: se utilizan antígenos o mezclas de antígenos respecto a los cuales se quiere ver la proliferación.
• Previa sensibilización con el Ag (presencia de célulasespecíficas)• Cultivos más prolongados(5 a 6 días)• Necesitan las CPA
![Page 15: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/15.jpg)
Ensayo y controles Estimulación con mitógeno para evaluar proliferación de LT y LB.
Células sin estimularCélulas estimuladas con mitógeno
Proliferación linfocitaria antígeno específica.
Células sin estimularCélulas estimuladas con antígeno.Células estimuladas con mitógeno.
¿Hubo proliferación?
Proliferación celular
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Proliferación celular
Cultivo en presencia de antígeno o mitógeno
Los linfocitos proliferan
3H-timidina
la timidina se incorpora al ADN celular
El ADN se transfiere a una membrana
Se miden las cuentas por minuto (3H) en cada muestra en un contador de centelleo
Incorporación de 3H-Timidina
![Page 17: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/17.jpg)
Proliferación celular
010203040506070
0 2 4 6 8
Dias después del Inicio del Cultivo
cpm
x 1
0-3
Cinética de proliferación
Curvas dosis respuesta
Incorporación de 3H-Timidina
Células estimuladas
Células sin estimular: basal
Curva dosis respuesta
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 11000
25
50
75células de dadorinmunizadocélulas de dador control(no inmunizado)
Dosis de antígeno (μg/ml)
CPM
(x10
-3)
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BrdU es incorporado en el ADN de aquellas células que se encuentran en la fase S del ciclo celular.
(clélulas proximas a dividirse)
5-bromo-2-deoxyuridina Brdu es un homologo sintético de la timidina
Proliferación celular
Incorporación de 5-Bromodesoxiuridina (BrdU)
La incorporación de BrdU a las células se puede detectar utilizando un anticuerpo monoclonal anti-BrdU marcado con:
- Una enzima (ej peroxidasa) ELISA
- Un Fluorocromo (FITC) Citometría de Flujo
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Cultivo en presencia de
antígeno Los linfocitos específicos proliferan
La BrdU se incorpora al ADN celular
Lisis y desnaturalización
Fijación del DNA a la placa
Anti-BrdU-HRP Revelado
Proliferación celular
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Proliferación celular
![Page 21: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/21.jpg)
Marcación de células con CFSE: El 5,6 ester succinimidil diacetato carboxifluoresceina
Atraviesa fácilmente las membranas celulares. No Fluorescente
Atraviesa las membranas
celulares con más dificultad. Fluorescente
Reacciona con las proteínas formando uniones covalentes
estables
Proliferación celular
![Page 22: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/22.jpg)
Células marcadas con CFSE
Inyección a un animal:
- Proliferación in vivo
- Citotoxicidad in vivo
- Homing
- Proliferación in vitro
- Estudio de variaciones en la población según el número de divisiones experimentadas: • Expresión de citoquinas
• Diferenciación celular (ej: marcadores de células de memoria)
Proliferación celular
![Page 23: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/23.jpg)
Proliferación celular
Linfocitos Linfocitos
CFDA-SE
inyección endovenosa a un
animal
o
Estimulación in vitro
Proliferación
A medida que proliferan el CFSE se va diluyendo, generación a
generación.
Disminuye la intensidad de Fluoresencia detectada
![Page 24: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/24.jpg)
Células marcadas antes de estimular
Aumenta el número de divisiones celulares
Disminuye la intensidad de fluorescencia
Proliferación celular
![Page 25: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/25.jpg)
autofluorescencia Células marcadas antes de estimular
Células proliferando
Proliferación celular
Aumenta el número de divisiones celulares
Disminuye la intensidad de fluorescencia
![Page 26: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/26.jpg)
Cultivo Mixto Cultivo Mixto LinfocitarioLinfocitario (CML)(CML)
Ag: CMH alogeneicode CPA y LB
Célula respondedora
Células estimuladoras
Proliferación por reconocimientoprincipalmente del CMH II
5 a 7 días
UNIDIRECCIONAL: células estimuladoras tratadas con mitomicina C o irradiadas
BIDIRECCIONAL
Proliferación celular
![Page 27: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/27.jpg)
Medición de citoquinas: • ELISA
• ELISPOT
• Inmunofluorescencia
• PCR
• Western Blot
• Métodos biológicos
ڡ Marcación intracitoplasmàtica
ڡ Beads
ڪ RT – PCR (cualitativa-semicuantitativa)
ڪ RT - Real-time PCR (RT-qPCR) Cuantitativa
Citometría de flujo(Células en suspensión)
Microscopía(cortes de tejidos, células adheridas a un soporte)
Activación celular: producción de citoquinas
![Page 28: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/28.jpg)
Medición de citoquinas por ELISA
ELISA de captura
• En sobrenadantes de cultivo
• Suero
• Diferentes fluídos biológicos
Curva de calibración (citoquina estándar)
muestras
![Page 29: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/29.jpg)
Medición de citoquinas por ELISPOT
• Se detecta la producción de citoquinas a nivel de uan célula individual
• Se requiere al igual que en el ELISA de captura dos anticuerposdiferentes que reconozcan epitopes diferentes en la citoquina.
• Los “spots” formados son permanentes y pueden ser contados visualmente, microscópicamente o electrónicamente
• Es 20-200 veces más sensible que un ELISA de captura: la concentración de citoquina secretada en el microentorno de la célula es mucho mayor que en un sobrenadante de cultivo.
• Si se usa en paralelo con un ELISA se puede determinar la cantidad promedio de citoquina producida por célula.
• Acoplado a métodos de pruificación de poblaciones celulares, se puede determinar la frecuencia de células productoras de citoquinas en las diferentes subpoblaciones
![Page 30: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/30.jpg)
Se sensibilizan placas de microtitulación con fondo de nitrocelulosa horneada con el anticuerpo anti-citoquina de interés
Se cultivan las células productoras de citoquinas en presencia de estímulos. Las citoquinas secretadas se unen a los anticuerpos unidos a la placa.
Se lisan las células.
Se incuba con otro anticuerpo anti-citoquina de interés biotinilado.
Se incuba con la enzima unida a avidina
Se revela con el sustrato de la enzima que genera un precipitado (spot), cada spot indicaría el sitio que ubicaba una célula productora de citoquinas (Unidad productora de citoquinas)
Medición de citoquinas por ELISPOT
![Page 31: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/31.jpg)
ELISPOT
![Page 32: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/32.jpg)
Determinación de la producción de citoquinas por PCRSe determina la presencia o cantidad del mRNA de la citoquina estudiada
Técnica experimental:
- Aislamiento de RNA celular
- Obtención de cDNA
- PCR: clásica o cuantitativa
- Análisis de resultados
- electroforesis en gel de agarosa
- análisis cuantitativo
Tipo de muestras:
• células en cultivo
• tejido (biopsias, etc.)
• células mononucleares de SP (PBMCs)
![Page 33: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/33.jpg)
Aislamiento de RNA celular
Extracción de RNA por el método de trizol(isotiocianato de guanidinio y fenol)
1- Homogeinización en trizol
2- Agregado de cloroformo, centrifugación
3- separación de fase acuosa
4- agregado de isopropanol, centrifugación
5- lavado con etanol, secado
6- suspensión en agua lobre de RNAsas (55-60ºC, 15 min)
cloroformo
Disociación total de complejos nucleoproteína
Método rápido
Mantiene integridad del RNA
Prevenir contaminación con RNAsas
![Page 34: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/34.jpg)
Determinación de citoquinas por RT-PCR semicuantitativa
cDNA
Transcripciónreversa
Transcriptasa reversa
Primers (oligo-dT, primersdiseñados al azar, primersespecíficos para un gen)
dNTPs
dNTPs, TAQpol, primers, MgCl2
citoquina
citoquina
Expresión relativa(densitometría)
A B A B
![Page 35: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/35.jpg)
Determinación de citoquinas por RT-PCR cuantitativa (real time PCR)
SYBR Green es un fluorocromo que se intercala en el DNA doble cadena
Permite monitoreo contínuo de la fluorescencia durante la PCR
Estimamos el número de copias iniciales del cDNA
Al final de la PCR se hace un ciclo de aumento contínuo de la temperatura y determinación constante de fluorescenciaInformación cualitativa del producto de PCR
curva de melting
![Page 36: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/36.jpg)
Análisis de resultados RT-qPCR
Comparación entre detección contínua de DNA y PCR convencional
![Page 37: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/37.jpg)
Análisis de resultados: puesta a punto y problemas
Cuantificación
Fluorescencia
![Page 38: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/38.jpg)
Real time PCR usando sondas TaqMan
Sondas de hidrólisis
Emiten fluorescencia cuando la actividad exonucleasa 5´-3´ de la TaqPol hidroliza la sonda
El reporter se separa del quencher
La sonda está fosforilada en 3´, no puede ser extendida por TaqPol
Se mide fluorescencia al final de la extensión
Las sondas se van consumiendo, y la fluorescencia aumentando
No hay curva de meltingNo se distingue entre cDNA y DNA genómico hay que correr un gel de agarosa
![Page 39: Tecnica s Experimental Es](https://reader036.fdocuments.ec/reader036/viewer/2022062419/55721048497959fc0b8cee5c/html5/thumbnails/39.jpg)
El número de ciclos necesarios para alcanzar un nivel de fluorescencia es proporcional a la cantidad de cDNA de inicial
Se grafica, número de ciclos versis logde la cantidad de DNA inicial y se obtiene una linea recta.
Puede obtenerse una curva de calibración utilizando cantidades conocidas de cDNA.
Análisis de resultados: Cuantificación