TAXONOMIA MOLECULAR DE AISLAMIENTOS DE Fusarium

OBTENIDOS A PARTIR DE MUESTRAS CLÍNICAS

YESID FABIÁN ACEVEDO GRANADOS

Tesis de Grado presentada para optar al Título de

Magíster en Ciencias - Biotecnología

DIRECTORA

Adelaida María Gaviria Rivera, I.A, Ph. D.

Grupo de Investigación en Sistemática Molecular

Universidad Nacional de Colombia

CO-DIRECTORA

Luz Elena Cano Restrepo, Ph. D.

Grupo de Micología Médica y Experimental

Corporación para Investigaciones Biológicas

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

SEDE MEDELLÍN

FACULTAD DE CIENCIAS

2013

CONTENIDO

RESUMEN……………………………………………………………………………...1

1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………...3

2. MARCO TEÓRICO….……………………………………………………………...7

2.1 Patogenicidad e importancia Clinica…………………………………………….......8

2.2 Taxonomia de Fusarium……………………………………………………………12

2.3 Técnicas Moleculares de Valor Taxonómico………………………………………14

2.3.1. Genes Utilizados en Taxonomía Molecular de Fusarium…….…………………16

2.3.2. Importancia del Factor de Elongación de la Traducción 1α (EF-1α) en

Fusarium………………………………………………………………………………..19

2.3.3 Importancia de la segunda subunidad mayor de la ARN polimerasa II (RPB-2) en

Fusarium………………………………………………………………………………..21

3. OBJETIVOS………………………………………………………………………..26

3.1. Objetivo general………………………………………………………………...…26

3.2. Objetivos específicos…………………………………………………………........26

4. METODOLOGÍA…………………………………………………………………..27

4.1 Poblacion y muestra………………………………………………………………...27

4.2 Cepas…………………………………………………………………………….…27

4.3 Extracción y purificación de ADN…………………………………………………28

4.4 Amplificación por PCR de los genes EF-1α y RPB2………………………………..28

4.5 Electroforesis, procesamiento y análisis de imágenes…………………………...…30

i

4.6 Secuenciación de los fragmentos de los genes EF-1α y RPB2 de aislamientos de

Fusarium sp…………………………………………………………………………….30

4.7 Edición y análisis de las secuencias………………………………………………..31

4.8 Identificación molecular a nivel de complejos de especie de aislamientos del género

Fusarium procedentes de muestras clínicas…………………………………………….31

4.9 Variabilidad evolutiva y análisis de secuencias……………………………………31

4.10 Taxonomía molecular de aislamientos de Fusarium a partir de los genes EF-1α y

RPB2……………………………………………………………………………………32

4.11 Correlación de especies de Fusarium con variables epidemiológicas…………....32

5. RESULTADOS……………………………………………………………………..33

5.1 Amplificación por PCR de los genes EF-1α y RPB2………………………............33

5.2. Identificación molecular a nivel de complejos de especie de aislamientos clínicos de

Fusarium sp. por consulta en la base datos Fusarium-ID……………………………...34

5.3 Variabilidad evolutiva y análisis de secuencias……………………………………..42

5.3.1 Caracterización de las secuencias………………………………………………...42

5.3.2 Estimación de patrones de sustitución……………………………………………43

5.3.3 Distancias genéticas………………………………………………………………44

5.3.4 Análisis de entropía de secuencias……………………………………………….46

5.4 Taxonomía molecular de aislamientos de Fusarium……………………………….48

5.5 Correlación de especies de Fusarium con variables epidemiológicas……………..62

6. DISCUSIÓN………………………………………………………………………...64

6.1 Identificación molecular a nivel de género y especie de aislamientos clínicos de

Fusarium..........................................................................................................................64

6.2 Variabilidad evolutiva y análisis de secuencias…………………………………....68

ii

6.3 Taxonomía molecular de aislamientos de Fusarium…………………………….…71

6.4 Correlación de la especie identificada de Fusarium sp con las variables

epidemiológicas de los pacientes analizados…………………………………………...75

7. CONCLUSIONES………………………………………………………………….78

AGRADECIMIENTOS……………………………………………………………….79

BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………...81

ANEXOS…………………………………………………………………………….....99

Anexo 1. Arboles obtenidos mediante los métodos de Máxima Verosimilitud, Máxima

Parsimonia e Inferencia Bayesiana……………………………………………………..99

iii

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Descripción de los cebadores utilizados para la identificación y taxonomía.......29

Tabla 2. Composición de las mezclas de PCR para la identificación y taxonomía

molecular de género y especie de aislamientos de Fusarium sp .procedentes de muestras

clínicas.............................................................................................................................30

Tabla 3. Identificación molecular a nivel de complejos de especie de aislamientos del

género Fusarium, obtenidos de muestras clínicas………………………………………36

Tabla 4. Características de los alineamientos de las secuencias de EF-1α y RPB2……...43

Tabla 5. Máxima estimación de probabilidad compuesta de patrón de sustitución de

nucleótidos de EF-1α.......................................................................................................44

Tabla 6. Máxima estimación de Probabilidad compuesta de patrón de sustitución de

nucleótidos de RPB2.......................................................................................................44

Tabla 7. Matriz de Distancias Genéticas de EF-1α...........................................................45

Tabla 8. Matriz de Distancias Genéticas de RPB2............................................................45

Tabla 9. Localización de la lesión y número de especies de Fusarium aisladas entre la

población femenina y masculina incluida en este estudio……………………………….62

iv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Mapa de la región de EF-1α…………………………………………………...21

Figura 2. Mapa de la región de RPB2...............................................................................25

Figura 3. Electroforesis de fragmentos amplificados por PCR de los genes EF-1α, RPB2

5-7 y RPB2 7-11 de aislamientos clínicos del género Fusarium.......................................34

Figura 4. Análisis de Entropía y comparación con las zonas amplificadas por los

cebadores del gen EF-1α………………………………………………………………..46

Figura 5. Distribución de nucleótidos informativos a través de los intrones y exones del

gen EF-1α……………………………………………………………………………….47

Figura 6. Análisis de Entropía y comparación con las zonas amplificadas por los

cebadores del gen RPB2………………………………………………………………...47

Figura 7. Dendrograma del gen EF-1α. de 59 aislamientos clínicos de Fusarium

construido usando el método de Neighbor-Joining……………………………………..50

Figura 8. Dendrograma del gen RPB2 de 59 aislamientos clínicos de Fusarium construido

usando el método de Neighbor-Joining…………………………………………………53

Figura 9. Dendrograma de la concatenación de los genes EF-1α y RPB2 de aislamientos

clínicos del complejo de especies Fusarium oxysporum construido usando el método de

Neighbor-Joining……………………………………………………………………….55

Figura 10. Dendrograma de la concatenación de los genes EF-1α y RPB2 de aislamientos

clínicos del complejo de especies Fusarium solani construido usando el método de

Neighbor-Joining……………………………………………………………………….57

Figura 11.Comparación de los dendrogramas construidos bajo el método de Neighbor-

Joining………………………………………………………………………………….59

Figura 12. Dendrograma de la concatenación de los genes EF-1α y RPB2 de aislamientos

clínicos de Fusarium usando el método de Neighbor-Joining…………………………..61

v

RESUMEN

Fusarium es un género fúngico amplio y diverso de diferentes complejos de especies,

causante de una gran variedad de enfermedades en plantas, productor de diversas toxinas

y representa un importante patógeno oportunista en humanos. La taxonomía de las

especies de Fusarium ha sido por mucho tiempo una tarea compleja y controversial. Esto

es debido principalmente a la aplicación de diferentes sistemas taxonómicos y la inherente

variabilidad morfológica de algunas de estas especies. Estas características requieren de

la revisión por parte de un experto en taxonomía, con el fin de lograr un acertado y

confiable diagnóstico, el cual es crucial en el manejo de enfermedades o infecciones y

estudios de diversidad genética. En Colombia, el laboratorio de Micología Médica de la

Facultad de Medicina de la Universidad de Antioquia ha reportado un incremento anual

del 211 % de casos de infecciones causadas por Fusarium, entre 1990 y 2000 y la Unidad

de Micología Médica y Experimental de la Corporación para Investigaciones Biológicas

(CIB) del 317 % entre 1995 (29 aislamientos) y 2003 (92 aislamientos), sin embargo en

estos centros especializados a nivel nacional en micología médica, no se lleva a cabo un

diagnóstico a nivel de especie.

El principal objetivo de este estudio fue el de estudiar la diversidad y establecer la

taxonomía de aislamientos clínicos de Fusarium, mediante el uso de dos marcadores

moleculares. En primera instancia se llevó a cabo la identificación de los 59 aislamientos

mediante consulta en la base de datos Fusarium-ID con base en secuencias codificantes

del factor de elongación de la traducción EF-1α. Y en segunda se llevaron a cabo análisis

de secuencias y variabilidad evolutiva que permitieron evaluar los niveles de información

contenido en las secuencias de EF-1α y RPB2 usadas en el presente estudio. Variables

como la localización de la lesión y el género del paciente permitieron correlacionar los

aislamientos de Fusarium con la población afectada.

Los resultados obtenidos permitieron observar la agrupación de los 59 aislamientos en

tres complejos de especies: Fusarium oxysporum (FOSC), Fusarium solani (FSSC) y

Fusarium incarnanatum-equiseti (FIESC). Alineamientos de las secuencias permitieron

evidenciar la alta variabilidad de las secuencias mostrando zonas variables que contrastan

1

con zonas conservadas, además se identificó la variabilidad haplotípica, patrones de

sustitución de cada grupo de secuencias, al igual, se determinaron las distancias genéticas

entre los complejos de especies identificados, así como análisis de entropía; todo lo

anterior permitió observar niveles de informativos y de variabilidad más adecuados en las

secuencias de EF-1α, en comparación a lo observado en las secuencias de RPB2. La

taxonomía resultante basada en las secuencias de EF-1α permitió la agrupación de los

distintos aislamientos en los tres complejos de especies identificados mediante los

métodos de Neighbor-Joining, Máxima Verosimilitud, Máxima Parsimonia e Inferencia

Bayesiana; en el caso de la taxonomía basada en las secuencias de RBP2 se observó por

el contrario la agrupación de dichos aislamientos en mezclas de los diferentes complejos

de especies obtenidos. Basado en la mayoría de resultados, se observa que el uso de las

secuencias codificantes para el factor de elongación de traducción 1α, EF-1 α permiten

una confiable clasificación de los aislamientos de origen clínico y permite ratificar la

utilidad que posee este marcador molecular en los distintos complejos de Fusarium en

comparación a lo observado al usar la secuencias de la segunda subunidad mayor de la

ARN polimerasa II, RPB2.

2

1. INTRODUCCIÓN

Fusarium es uno de los géneros fúngicos más importantes a nivel mundial por su

patogenicidad a plantas, humanos y animales y la producción de toxinas. Las especies de

este género durante años recientes han aumentado su implicación en enfermedades en

humanos y hoy en día representan la segunda causa de infecciones fúngicas invasivas en

humanos con altas tasas de morbilidad y mortalidad (Alastruey-Izquierdo et al., 2008).

El espectro de infecciones pueden ser desde tipo superficial (onicomicosis y queratitis),

invasivas locales, hasta diseminadas; estas últimas se presentan exclusivamente en

pacientes severamente inmunocomprometidos (Guilhermetti et al., 2007). De igual

manera especies de Fusarium también pueden causar enfermedades alérgicas como es la

sinusitis en individuos inmunocompetentes (Nucci y Anaissie, 2007).

Estudios recientes han demostrado que el género Fusarium incluye diversos clados

filogenéticos, contenidos en complejos de especies (Summerbell y Schroers, 2002). La

taxonomía de Fusarium es muy compleja y ha sufrido varios cambios (Llorens et al.,

2006). En la década anterior se reportó la marcada y preocupante incidencia de

infecciones causadas por Fusarium en humanos y animales, en donde además de la

acostumbrada presencia de F. solani y F. oxysporum, se logró identificar otras 13 especies

de este género entre las cuales se encuentran F. verticilloides, F. chlamydosporum, F.

dimerum, F. napiforme, F. nygamai, F. proliferatum y F. sacchari (Alastruey-Izquierdo

et al., 2008).

Desde su definición en 1809 por Link, el género Fusarium ha recibido mucha atención

en la literatura científica. Una parte importante de estos estudios trata de aspectos

taxonómicos, en donde la gran mayoría se centran en el uso de caracteres morfológicos

para diferenciar secciones y especies. La caracterización convencional de especies de

Fusarium se ha basado principalmente en criterios morfológicos, aunque también se ha

tenido en cuenta características fisiológicas al igual que la fertilidad (Sampietro et al.,

2010). La identificación de especies de Fusarium siempre ha sido difícil, aun para

expertos micólogos por que la evaluación morfológica y sexual requiere tiempo, de gran

conocimiento y experiencia en la taxonomía y fisiología de Fusarium, y aun así, el

3

porcentaje de incertidumbre en la correcta identificación de la especie es del 30 %.

(Mishra et al., 2003; Alastruey-Izquierdo et al., 2008; Sampietro et al., 2010). La

experiencia requerida solo es disponible en laboratorios de referencia y aun en ellos, al

menos cinco días de trabajo son requeridos para identificar un aislamiento a nivel de

especie mediante observación de caracteres morfológicos (Alastruey-Izquierdo et al.,

2008).

En los años noventa, con el incremento del uso y aceptación de los métodos basados en

el ADN, comenzó a ser claro que las clasificaciones basadas exclusivamente en

morfología desestimaban la verdadera diversidad de este género (Gräfenhan et al., 2011).

Las secuencias de ADN de varios loci como el factor de elongación de la traducción 1α

(EF-1α), segunda subunidad mayor de la ARN polimerasa II (RPB2), β-tubulina,

calmodulina y regiones ribosomales, han permitido establecer varios complejos de

especies de interés clínico, como: F. solani complejo de especies (FSSC), F. oxysporum

complejo de especies (FOSC), F. incarnatum-equiseti complejo de especies (FIESC), F.

chlamydosporum complejo de especies (FCSC), F. tricinctum complejo de especies

(FTSC), F. dimerum complejo de especies (FDSC) y Gibberella fujikuroi complejo de

especies (GFSC) (O’Donnell et al., 2010; Park et al., 2011). Actualmente es aceptado que

los taxones que anteriormente se pensaba que representaban especies, actualmente son

complejos de especies. (Kvas et al., 2009).

El gen EF-1α ha mostrado una alta señal taxonómica, ya que permite la correcta

identificación y correspondencia gracias al adecuado nivel de resolución intraespecies y

el alto grado de concordancia en sus resultados al ser usados de forma individual y

conjunta, para todos los complejos de especies del género, seguido por el gen RPB2 que

no es aparentemente efectivo para el complejo de especies Fusarium oxysporum (FOSC),

pero si para los demás complejos de especies reportados en humanos (Jiménez-Gasco y

Jiménez-Díaz 2003; Balajee et al., 2009; O’Donnell et al., 2009). Estos genes son

marcadores moleculares adecuados para estudios de taxonomía y filogenia porque

cumplen con algunas de siguientes características: i, se presentan como una única copia

dentro del genoma o múltiples copias idénticas, ii son de fácil alineamiento y análisis

entre especies estrechamente relacionadas, con alto grado de sustitución en su secuencias,

4

lo suficiente para asegurar que las mutaciones se hayan acumulado de forma

proporcionada durante el breve tiempo durante el cual los taxa hayan ido evolucionando,

iii. tasas de sustitución suficientemente altas para generar un número suficiente de sitios

informativos, pero lo suficientemente bajas para evitar el número excesivo de

sustituciones múltiples (fenómeno de saturación); para los genes codificantes de proteínas

puede ser que la tasa de sustituciones sinónimas sea demasiado alta a pesar de que las

sustituciones no sinónimas sean muy pocas, iv. disponibilidad universal de cebadores

para PCR. Conllevando posteriormente al conocimiento de su ortología entre

especímenes y parologia definiendo relaciones entre organismos (Guarro et al., 1999;

Cruickshank R, 2002; Gomes et al., 2002).

La carencia de variación informativa en la subunidad 28S del ADN ribosomal, al igual

que del ARN de la subunidad menor de la mitocondria, poligalactouronasa y de las IGS,

como también la presencia de autapomorfias en las secuencias del gen Calmodulina, y

el descubrimiento de tipos no ortólogos del ITS2 en algunos complejos de especies de

Fusarium, ha generado grandes controversias sobre el uso de estos genes a nivel

individual, especialmente de los genes del ARN ribosomal nuclear, para la reconstrucción

filogenética y la inferencia de los límites de especies dentro del reino Fungi (Alastruey-

Izquierdo et al., 2008; O’Donnell et al., 2009; Kvas et al., 2009; Landlinger et al., 2009;

Harrow et al., 2010).

La identificación precisa y rápida de la especies de Fusarium es crítica para predecir el

potencial patógeno de dichos aislamientos y administrar el mejor tratamiento (Alastruey-

Izquierdo et al., 2008; Landlinger, et al., 2009; Sampietro et al., 2010). Los métodos

moleculares que se fundamentan en la comparación de secuencias de ADN son

actualmente los más utilizados para el estudio de genética de poblaciones, taxonomía,

filogenia y sistemática de Fusarium. Estos métodos incluyen entre otros: el polimorfismo

en el tamaño de los fragmentos de restricción (Restriction Fragment Length

Polimorphisms: RFLP), el polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados

(Amplified Fragment Length Polymorphisms: AFLP), la amplificación aleatoria de ADN

polimórfico (Random Amplified Polymorphic DNA: RAPD), patrones de diferenciación

de elementos repetitivos y secuenciación de genes codificantes o no de proteínas

5

(Jiménez-Gasco y Jiménez-Díaz, 2003). La secuenciación de múltiples loci, como el

factor de elongación de la traducción 1α (EF-1α, TEF), una región de la subunidad mayor

de la ARN polimerasa II (RPB2), la topoisomerasa II y las regiones ITS del ADN

ribosomal se han utilizado para sistemática molecular (Balajee et al., 2009).

La secuenciación de loci es esencial para determinar los límites de la especie y

correlacionarlos con sus hospederos y distribución biogeográfica de hongos de

importancia clínica, como Fusarium (Wang et al., 2011). Genes codificantes de proteínas,

con numerosas porciones intrónicas, se consideran potenciales marcadores en estudios

taxonómicos a nivel de especie en hongos, dado que estos tienden a variar a altas tasas en

comparación con los marcadores utilizados comúnmente como el ITS y las regiones del

ARN ribosomal nuclear (Harrow et al., 2010). Del relativo pequeño número de genes que

han sido evaluados a la fecha dentro los diversos complejos de especies del genero

Fusarium (FSSC, FOSC, FIESC, FCSC, FTSC, FDSC y GFSC), como regiones

espaciadoras intergénicas del ADN ribosomal (Intergenic Spacer Region: IGS), ADN

ribosomal, factor de elongación de la traducción (Elongation Factor 1α: EF-1α),

poligalacturonasa (PG), ARN de la subunidad menor del ribosoma mitocondrial, segunda

subunidad mayor de la ARN polimerasa II (RPB2), fosfato permeasa, β-tubulina (TUB),

nitrato reductasa, genes de apareamiento MAT 1 and MAT2 (Matying type 1 y 2) y RPB2.

Aunque la mayoría de estos genes son útiles para la detección e identificación del género,

normalmente no contienen suficiente polimorfismo para distinguir entre especies dentro

de complejos de especies de Fusarium; solo los genes EF-1α y RPB2, han demostrado un

alto grado de concordancia en sus resultados al ser usados de forma individual y conjunta

(Jiménez-Gasco y Jiménez-Díaz, 2003; Balajee et al., 2009). Partiendo de la poca utilidad

de estas secuencias, estas deberían ser excluidas de futuros análisis, principalmente de los

que implican el uso de tres locus (Sharma et al., 2004; O’Donnell et al., 2008). Por todo

lo anterior los genes EF-1α y RPB2 fueron utilizados para estudiar la taxonomía de

aislamientos clínicos de Fusarium provenientes de diferentes pacientes de la población

del Valle de Aburra (Antioquia).

6

2. MARCO TEORICO

Fusarium actualmente está constituido por aproximadamente 70 especies (Leslie y

Summerell, 2006), comúnmente aisladas de diversos climas y nichos ecológicos (Nelson

et al., 1994). Las especies del género pueden ser organismos saprofitos que suelen

colonizar sustratos vegetales y constituirse como verdaderos patógenos en cultivos como

plátano, avena, arroz, entre otros, y causar graves repercusiones económicas para el sector

agrícola, pues de 101 cultivos de importancia económica a nivel mundial, más de 80

pueden ser atacados por Fusarium (Leslie y Summerell, 2006).

El género Fusarium se encuentra dentro de la división Ascomycota, clase Euascomyctes,

orden Hypocreales y familia Hypocreaceae. La fase sexual o perfecta (también llamada

teleomórfo) se encuentra en los géneros Albonectria, Gibberella y Haematonectria

(Leslie y Summerell, 2006).

En los años 70 se determinó que ciertas cepas de Fusarium son capaces de producir cierto

tipo de micotoxinas, las cuales son metabolitos secundarios que pueden ocasionar serias

intoxicaciones en animales y humanos (Kim et al., 1995). Actualmente, algunas especies

de Fusarium son reconocidas como importantes patógenos oportunistas, que causan

diversos tipos de patologías tanto en el hombre como en otros animales (Guarro y Gené,

1995; Boutati y Anaissie, 1997; Ortoneda et al., 2004). Su ocurrencia como agentes

causales de infección en humanos se ha venido incrementado en los últimos años (Marr

et al., 2002; Husain et al., 2003), las especies aisladas con mayor frecuencia son F. solani,

F. oxysporum y F. verticillioides, pero más recientemente se ha observado un aumento

del número de casos clínicos producidos por especies nunca antes registradas en humanos

como F. chlamydosporum, F. dimerum, F. napiforme, F. nygamai, F. proliferatum, F.

sacchari, F. incarnatum, F. thapsinum y F. polyphialidicum, entre otras (Nucci y

Anaissie, 2007).

7

2.1 Patogenicidad e Importancia Clínica.

Múltiples estudios han demostrado que los mecanismos de infección de Fusarium entre

los hospederos vegetales y animales son diferentes. En el hombre y otros animales pueden

ocasionar diversas patologías a través de diferentes mecanismos de acción, como:

- Micetismo: intoxicación alimentaria por sustancias químicas constituyentes del hongo

ingerido.

- Micotoxicosis: intoxicación por ingestión de toxinas elaboradas por el metabolismo del

hongo al crecer en algunos alimentos.

- Alergias: reacciones de hipersensibilidad debidas a mecanismos inmunológicos.

- Micosis: infecciones por invasión de los tejidos superficiales o profundos.

Fusarium ha llegado a causar una amplia gama de enfermedades en el hombre que

incluyen, micotoxicosis y micosis que pueden ser de tipo superficial, localizada o

diseminada (Guarro y Gené, 1995). Las infecciones por Fusarium se incluyen dentro de

la categoría de las hialohifomicosis, las cuales se definen como micosis causadas por

hongos oportunistas que presentan hifas hialinas y septadas; también se utiliza el término

fusariosis para referirse específicamente a las infecciones causadas por este género.

La ingestión accidental de toxinas producidas por Fusarium (micotoxicosis) es rara en el

hombre, pero es más frecuente en animales a consecuencia del consumo de piensos y

forrajes contaminados por estos hongos durante el periodo de almacenaje. Sin embargo

durante la Segunda Guerra Mundial, la escasez de alimentos produjo varios brotes

importantes de micotoxicosis en la antigua Unión Soviética, que ocasionó la muerte de

cientos de personas que debieron alimentarse con cereales colonizados por Fusarium

(Nelson et al., 1994). En la actualidad desde el punto de vista clínico son mucho más

importantes las micosis.

8

El origen de la infección, puede generarse por la acción de enzimas como proteasas,

colagenasas y queratinasas propias de Fusarium o por consecuencia de traumatismos

físicos, los cuales se convierten en la puerta de entrada (Nelson et al., 1994);

posteriormente se puede desarrollar fácilmente diferentes tipos de infección. Entre las

infecciones superficiales y micosis superficiales, se han reportado casos de: onicomicosis,

queratitis, infecciones cutáneas, colonización de ulceras e infecciones de heridas y

quemaduras (Guarro y Gené, 1995). Las onicomicosis son, probablemente, el tipo más

común de infección superficial causado por Fusarium. El hongo invade las uñas, asociado

con el uso masivo de duchas, baños turcos, tratamientos de pedicura y el uso de calzado

cerrado en zonas tropicales, en los cuales se generan ambientes de humedad propicios

para la proliferación y desarrollo de Fusarium (Tosti et al., 2000). La queratitis por

Fusarium, a diferencia de otros géneros, cursa con un peor pronóstico y su tratamiento es

de difícil manejo (Tosti et al., 2000).

Los casos de infecciones localizadas en tejidos profundos, aunque presentan una menor

incidencia, son igual de importantes, diversas e incluyen: endoftalmitis exógena (debida

a traumatismos), que puede llevar a ceguera completa y ataque al sistema nervioso

central; infecciones profundas de piel y tejidos subcutáneos; osteomielitis; artritis séptica;

peritonitis relacionada con el uso de catéteres; abscesos cerebrales; endocarditis;

infección pulmonar y cistitis (Guarro y Gené, 1995).

En la actualidad, el incremento de terapias clínicas agresivas, aumenta considerablemente

el número de pacientes inmunodeprimidos, esto ha favorecido que las infecciones

ocasionadas por Fusarium sean cada vez más frecuentes. En estos pacientes las

infecciones presentan un tratamiento comprometido y con altos porcentajes de mortalidad

(aproximadamente 70 %) (Leslie y Summerell, 2006). Los síntomas clínicos típicos de

una fusariosis diseminada incluyen fiebre refractaria y la presentación de nódulos

cutáneos de color purpura con un área necrótica central (Nucci et al., 2003). En un gran

porcentaje, la biopsia de estos nódulos denota la presencia de hifas hialinas, septadas y

con ramificaciones que irrumpen vasos sanguíneos. Los cultivos del material de biopsia

y los hemocultivos resultan de gran beneficio en el diagnóstico, ya que posibilitan de

alguna manera discriminar la infección de aquellas provocadas por miembros del género

9

Aspergillus, que de forma contraria presentan hemocultivos negativos (Nucci y Anaissie,

2007). En el caso de las infecciones localizadas, estas pueden responder a una

combinación de tratamientos con antimicóticos sistémicos y escisión quirúrgica, pero las

infecciones sistémicas pueden llegar a ser crónicas o fatales, sobretodo en pacientes en

estado inmunocomprometido (Dignani y Anaissie, 2004; Nucci y Anaissie, 2007).

Las especies del genero Fusarium que se han reseñado como patógenos para el hombre,

teniendo en cuenta su orden de importancia, son: F. solani, F. oxysporum, F.

verticillioides, F. dimerum, F. proliferatum, F. chlamydosporum, F. sacchari, F.

nygamai, F. napiforme y más recientemente, F. incarnatum, F. polyphialidicum y F.

thapsinum (Nucci y Anaissie, 2007).

F. solani, la especie del género más aislada en todo el mundo se ha descrito en numerosas

ocasiones como agente de infecciones superficiales, localizadas y diseminadas en

pacientes inmunocomprometidos, especialmente en pacientes neutropénicos

(disminución aguda o crítica de granulocitos en la sangre). F. solani se ha relacionado

con pacientes que presentan queratitis (Godoy et al., 2004; Naiker y Odhav, 2004; Zhang

et al., 2006), incluso ha estado vinculada con el uso de lentes de contacto (Donnio et al.,

2007; O’Donnell et al., 2007; Jureen et al., 2008), considerado como el principal agente

causal de ceguera en áreas tropicales. También se ha reportado en casos de infecciones

cutáneas (Bodey et al., 2002; Pérez-Pérez et al., 2007), de micetoma (infección crónica

de la piel y tejidos subyacentes) (Tomimori-Yamashita et al., 2001; Yera et al., 2003),

infecciones diseminadas en trasplantes de órganos (Arney et al., 1997; Sampathkumar y

Paya, 2001), cáncer (Bushelman et al., 1995; Hennequin et al., 1997) o leucemia (Nucci

y Anaissie, 2007). En un estudio realizado con 84 pacientes con leucemia se encontró 30

de ellos con fusariosis invasiva, F. solani fue la especie más aislada, presente en 17

pacientes (Nucci et al., 2003).

En segunda instancia, con menor número de casos registrados, pero con igual nivel de

importancia clínica se encuentra la especie F. oxysporum; a la cual se le ha atribuido casos

de onicomicosis (Guilhermetti et al., 2007), queratitis (Chang et al., 2006), infecciones

diseminadas (Guarro y Gené, 1995; Rothe et al., 2004; Olivares et al., 2005) y localizadas

10

(Bodey et al., 2002; Gorman et al., 2006). Esta especie se ha aislado reiteradamente en

los sistemas de distribución de agua de un hospital de Houston (Texas), evidenciando que

se trataba del agente causal de múltiples infecciones en pacientes de dicho hospital

(Anaissie et al., 2001). Incluso se ha descrito como responsable de infecciones adquiridas

por uso de catéter (Ammari et al., 1993), e infecciones en pacientes con SIDA (Paugam

et al., 1999) o que han sido sometidos a trasplante de órganos (Banerji y Singh, 2011).

En tercer lugar se encuentra F. verticillioides, que a diferencia de las especies F. solani y

F. oxysporum, sobresale por su capacidad de producir varios tipos de micotoxinas como

moniliformina, fusarinas y fumonosinas, las cuales se relacionan con diversas

enfermedades en animales y humanos al ingerir cereales u otros alimentos contaminados

por este microorganismo (Nelson et al., 1994). Además de su relevancia como agente

causal de micotoxicosis, también se le ha acusado casos de queratitis (Pereiro et al., 1998;

Naiker y Odhav, 2004), micetoma (Ajello et al., 1985) e infecciones cutáneas (Bodey et

al., 2002). Asimismo, se ha vinculado con infecciones diseminadas en pacientes con

SIDA (Guarro et al., 2000) y con cáncer (Hennequin et al., 1997; Tezcan et al., 2009).

Otras especies, igualmente implicadas en patologías humanas, pero con menos frecuencia

son, F. proliferatum capaz de producir fumonisina, de forma similar que F. verticillioides

y se le ha señalado como agente causal de onicomicosis (Ninet et al., 2005), lesiones

cutáneas (Bodey et al., 2002), endoftalmitis (Ferrer et al., 2005), así como de infecciones

sistémicas (Summerbell et al., 1988). De igual manera F. sacchari se ha implicado en

casos de queratitis (Chander et al., 2011) y de al menos un caso de fungemia (Guarro et

al., 2000). F. dimerum se ha asociado a casos de queratitis (Schroers et al., 2009),

infecciones cutáneas (Bodey et al., 2002), endocarditis (Camin et al., 1999) y numerosos

casos de infección diseminada en pacientes inmunocomprometidos (Austen et al., 2001;

Letscher-Bru et al., 2002; Bigley et al., 2004). Por su parte F. incarnatum se ha aislado

de la epidermis de pacientes víctimas de quemaduras (Lortholary et al., 2010) y de

lesiones cutáneas (Bodey et al., 2002). F. chlamydosporum se ha identificado como

agente causal de dos casos de fusariosis profunda, uno de ellos asociado a infección por

catéter en un paciente con linfoma (Kiehn et al., 1985) y el otro de una persona con cuadro

clínico de neutropenia (Segal et al., 1998). A F. nygamai se le ha atribuido varios casos

11

de micotoxicosis en Malasia (Sapumohotti, 2004), aunque solo años más tarde sé

demostró que es productor de moniliformina (Leslie et al., 2005); también se ha

informado como agente responsable de infección sistémica en un paciente con leucemia

(Azor et al., 2009). F. thapsinum, una especie descrita recientemente (Klittich et al.,

1997), ha sido el agente causal de fusariosis sistémica en un paciente con leucemia (Nucci

y Anaissie, 2007), así como de diversos casos de queratitis (O’Donnell et al., 2007). Y

por último, se han encontrado dos especies de Fusarium de las que solo se ha descrito un

único caso como son: F. napiforme, agente de hialohifomicosis diseminada en un paciente

con leucemia aguda (Melcher et al., 1993) y F. acutatum aislado de una herida en el pie

de un paciente diabético (Taj-Aldeen et al., 2006).

2.2 Taxonomía de Fusarium

Fusarium es un género muy heterogéneo, difícil de identificar y clasificar (Nelson et al.,

1983; Guadet et al., 1989; Nelson et al., 1994). Además uno de los problemas en

taxonomía de hongos se debe a la doble nomenclatura, una para el estado sexual y otra

para el estado asexual (Summerbell y Schroers, 2002). En el género Fusarium se incluyen

formas asexuales de diferentes géneros de ascomicetos de la familia Nectriaceae, orden

Hypocreales; los géneros que representan a Fusarium como teleomorfo son Albonectria,

Gibberella y Haematonectria (Leslie y Summerell, 2006).

La taxonomía clásica de Fusarium se ha basado en la definición de los caracteres

morfológicos presentes en el hongo y características de crecimiento en cultivo. Las

características macroscópicas propias de las colonias del hongo incluyen, textura

algodonosa, rara vez levaduriforme, con pigmentos salmón, morado, rosado, café claro,

amarillo o gris; vistos al microscopio, los hongos presentan hifas hialinas, septadas y

filamentosas, pueden producir tres tipos de conidias y mesoconidias, microconidias,

macroconidias y clamidosporas. Los caracteres primarios para identificar especies son la

morfología de la macroconidia; presencia o ausencia, morfología o disposición de

microconidias; morfología de los microconidióforos (simples o ramificados) portadores

de células conidiógenas con un desarrollo fialídico; y presencia o ausencia de

clamidosporas (Leslie y Summerell, 2006).

12

Siguiendo las pautas de la taxonomía clásica, la identificación de especies del género

Fusarium es una tarea ardua y no siempre se obtienen resultados convincentes debido a

que son organismos que exhiben una gran variación en sus caracteres morfológicos y

fisiológicos; por lo que en muy pocas ocasiones se logra la identificación de la especie,

aún en los laboratorios especializados de microbiología. A nivel de especie muchos

caracteres fenotípicos presentan gran variación y son afectados por condiciones de

cultivo, además los aislamientos pueden tener demandas nutricionales diferentes lo cual

perjudica su crecimiento, por ejemplo la observación de macroconidias es difícil cuando

son obtenidas en cultivo (Hennequin et al., 1997; Hue et al., 1999). Por otro lado, el

procedimiento es dispendioso y de alto costo por los insumos necesarios y el tiempo de

dedicación (Dignani y Anaissie. 2004). La capacidad de variación explica en cierta

medida el hecho de que las especies del género puedan colonizar nichos ecológicos muy

dispares, sin embargo, también es la razón por la que actualmente todavía no se dispone

de un sistema de clasificación estable y de acogimiento general (Leslie y Summerell,

2006).

A principios del siglo XX, se llegaron a contabilizar cientos de especies de Fusarium ya

que se describían en función del huésped donde se encontraban; sin embargo,

Wollenweber y Reinking (1935) llevaron a cabo una importante exploración del género,

limitando el número de especies a 65, las cuales se agruparon en 16 secciones teniendo

en cuenta características macroscópicas y microscópicas como la morfología de la colonia

y los conidios, respectivamente. Así una sección agrupa especies con características

morfológicas similares. A su vez, estas especies contenían 55 variedades y 22 formas,

cepas morfológicamente similares caracterizadas por su adaptación a diferentes

hospederos y éstas, a su vez, en razas (Guadet et al., 1989; Nelson et al., 1994). Esta

primera clasificación no resultó muy conveniente ya que los caracteres morfológicos en

los que se basaba la división de especies eran poco estables y variaban en función de las

condiciones ambientales y del medio de cultivo utilizados. Años más tarde, en 1940 y

1954, Snyder y Hansen redujeron a nueve el número de especies (Snyder y Hansen, 1941;

Snyder y Hansen, 1945), de forma que, en general, cada una de ellas se correlacionaba

con las secciones establecidas en el sistema anterior, pero este sistema resultó

exageradamente simple.

13

Un claro reflejo de la controvertida taxonomía del genero Fusarium es la publicación

hasta la fecha de cerca de 10 propuestas de clasificación diferentes (Leslie y Summerell,

2006). El trabajo de revisión del género más reciente, publicado por Leslie y Summerell

en 2006 “The Fusarium Laboratory Manual”, incluye 70 especies, y no tiene en cuenta

las secciones consideradas anteriormente. Esta publicación incorpora los conceptos de

especie morfológica, biológica y filogenética. Además incluye de forma detallada

técnicas y métodos para el aislamiento, crecimiento e identificación de cepas de Fusarium

sp, seguido por una detallada descripción de cada una de las 70 especies.

Aunque el sistema de clasificación de Fusarium por secciones todavía sigue citándose en

la literatura científica, diversos trabajos basados en técnicas moleculares ha puesto de

manifiesto que se trata de un sistema de clasificación artificial (Cai et al., 2003).

2.3 Técnicas Moleculares de Valor Taxonómico.

La taxonomía del genero Fusarium, hasta hace quizás menos de una década, se basaba

solamente en el estudio de caracteres morfológicos. Sin embargo, este enfoque presenta

algunas limitaciones tales como la dificultad de diferenciar hongos estrechamente

relacionados, delimitar eficientemente algunos taxa y la laboriosidad de los métodos

(Guarro et al., 1999). Es por ello que actualmente, se han incorporado las técnicas de

biología molecular como apoyo a la taxonomía clásica para resolver estas limitaciones.

El uso de secuencias moleculares con un relativo grado de conservación permite la

definición y diagnóstico de unidades moleculares taxonómicas operacionales (MOTU’s:

Molecular Operational Taxonomic Units). El uso de MOTU’s permite la rápida y efectiva

identificación de muchos taxa, incluso aquellos que no han sido descritos anteriormente.

Esta metodología tuvo sus inicios en un contexto no molecular, OTU (Operational

Taxonomic Units; Unidades Taxonómicas Operacionales) propuesta por Sokal R. y

Sneath P. en 1963, en donde se utilizaba tantos caracteres como fuese posible, sin conocer

el verdadero valor taxonómico de cada carácter. En este mismo contexto las secuencias

de ADN pueden ser usadas para definir OTU’s debido a que cada secuencia puede ser

considerada como un grupo de caracteres sin un valor a priori. Basado en lo anterior

14

Floyd y colaboradores en 2002 introdujeron el concepto MOTU el cual define aquellas

entidades identificadas en un contexto molecular; esta metodología revela el grado de

variación de secuencias entre taxa estrechamente relacionadas con base en cortas regiones

genómicas específicas (Floyd et al., 2002).

Este método ha demostrado una gran utilidad en diversos estudios realizados tanto con

procariotas como con organismos eucariotas. Por ejemplo, en animales ha sido utilizado

en el establecimiento de la diversidad de tardígrados en distintas zonas de Escocia

(Blaxter et al., 2013); en plantas se ha usado por ejemplo en el inventario y estimación de

diversidad de árboles presentes en la zona tropical Amazónica (González et al., 2009).

En el caso de los hongos, esta metodología ha permitido establecer la diversidad de

muestras ambientales y su posterior clasificación formal dentro de los modelos actuales

de clasificación (Hibbett et al., 2011). Incluso ha permitido la revisión y establecimiento

de la tipificación, taxonomía y filogenia de géneros anamorfos de hongos ascomicetos

como son Acremonium, Cosmospora, Fusarium, Stilbella y Volutella (Gräfenhan et al.,

2011). En el caso específico de su aplicación a la taxonomía en Fusarium, éste ha sido

aplicado de manera individual tanto a grupos de especies con interés agrícola, como es el

caso de F. dimerum (Schroers et al., 2009), y reconocimiento de F. chlamydosporium

como endófito de orquídeas en Malasia. A nivel clínico ha permitido el refinamiento de

la taxonomía de las especies más representativas de este género (Nelson et al., 1994) y al

igual que en la taxonomía a nivel intra e inter complejos de especie y filogenia del genero

Fusarium (Watanabe et al., 2011). Estos estudios demuestran que este método puede ser

aplicado tanto a hongos meiospóricos como mitospóricos y que se pueden diferenciar

especies aparentemente indistinguibles por criterios de especie biológica y morfológica

(Kasson et al., 2013).

El establecimiento de estas unidades taxonómicas puede representarse gráficamente

mediante dendrogramas que actúan como modelos de la identidad y descripción de la

jerarquía obtenida para un grupo determinado de organismos. Para la taxonomía a partir

de datos moleculares se utilizan diferentes métodos. Entre estos métodos se encuentran

aquellos basados en distancias genéticas y métodos basados en caracteres conservados.

Entre los métodos basados en distancias genéticas se encuentran: Neighbor-Joining

15

(Agrupamiento de Vecinos Cercanos) y UPGMA (Unweighted Pair Group Method

with Arithmetic Mean; Método de Pares Agrupados usando Promedio Aritmético sin

Ponderación), los cuales se basan en el establecimiento de que tan diferente es un taxa

con relación a otro, basado en la estimación de la similitud total entre los diferentes

caracteres, establecido esto por un análisis estadístico que permite la construcción de

dichas distancias entre cada par de taxones. Los métodos basados en caracteres

conservados, los cuales son de gran aplicación en estudios taxonómicos y filogenéticos,

métodos Bayesianos y métodos estadísticos de inferencia como Verosimilitud y

Parsimonia, se basan inicialmente en la definición de un criterio de optimalidad o función

objetiva, con el fin de evaluar un árbol dado, es decir la asignación de un puntaje y usado

en la comparación de los arboles obtenidos posteriormente; seguido del uso de un

algoritmo con el fin de medir el criterio de optimalidad asignado y en la búsqueda de los

árboles que alcanzan los mejores valores de acuerdo a este criterio (Hillis et al., 1996).

Existen diversos paquetes informáticos que manejan estos métodos, dentro de los más

importantes se encuentran MEGA 5 (Molecular Evolutionary Genetics Analisys)

(Tamura et al., 2011) y BEAST (Bayesian Evolutionary Analysis by Sampling Trees)

(Drummond et al., 2012).

La fiabilidad de las agrupaciones taxonómicas obtenidas, una vez se han alcanzado los

dendrogramas y/o arboles; por uno u otro método, es reflejada por un método estadístico

que estima los niveles de confianza de los agrupamientos obtenidos, de éstos el más

utilizado es el análisis de bootstrap que determina la frecuencia en que un determinado

grupo fue hallado a partir de un número de réplicas (generalmente 1000) en el análisis

(Felsenstein, 1985; Hillis y Bull, 1993). Se considera que un valor superior al 75% indica

un buen soporte estadístico para las ramas constituyentes de dendrograma, al igual que el

de las distancias genéticas entre MOTU’s (Felsenstein J. 1985).

2.3.1 Genes Utilizados en Taxonomía Molecular de Fusarium

Entre las secuencias utilizadas comúnmente para el estudio taxonómico de hongos se

encuentran los genes que codifican para los ARN ribosómicos (ARNr) y sus regiones

espaciadoras internas (ITS). Sin embargo, en la mayoría de análisis se ha observado una

16

marcada tendencia a secuenciar más de un gen con el fin de realizar análisis multigénicos

para incrementar la fiabilidad de los resultados obtenidos. Para el género Fusarium, los

genes utilizados, además de los anteriores, suelen ser genes estructurales que codifican

proteínas como β-tubulina (BT2, TUB), el factor de elongación 1α de la traducción (EF-

1α) y la calmodulina (CAL) (Taylor y Fisher, 2003). Al utilizar la metodología de

MOTU's se obtiene mayor consistencia de los diferentes taxa y grupos taxonómicos, ya

que éstos pueden corroborarse de manera individual, ya sea por uno o varios genes

diferentes y también en análisis concadenados de las secuencias (Floyd et al., 2002).

Algunos ejemplos relevantes de genes utilizados para análisis de sistemática molecular

de Fusarium se describen a continuación. La región 28S del ADN ribosómico nuclear -

también llamada LSU - ha sido útil en el análisis de la historia evolutiva del complejo

Gibberella fujikuroi, que incluye las especies F. verticillioides, F. proliferatum, F.

subglutinans y otras especies relacionadas; también ha permitido detectar múltiples

orígenes evolutivos dentro del complejo de especies Fusarium oxysporum, relacionado

con la enfermedad de Panamá en banano causada por una forma especial de este

complejo, igualmente ha sido útil en la resolución de especies del complejo de especies

de F. solani (FSCS) que causan enfermedades tanto en humanos y plantas; y además en

la genotipificaciòn y diversidad filogenética de brotes de queratitis en Estados Unidos

(O’Donnell y Cigelnik, 1997; O’Donnell et al., 1998; O'Donnell et al., 2000; Zhang et

al., 2006; O’Donnell et al., 2007). El gen que codifica para la subunidad menor

mitocondrial (mtSSU) ha permitido por ejemplo la confirmación de aislamientos de F.

verticillioides a partir de muestras de banano en Japón; incluso ha sido útil en la

identificación de una nueva especie de Fusarium denominada F. commune la cual fue

aislada de Pisum sativum (arveja) en la región norte de Europa, y en complemento a ello

se identificó filogenéticamente la estrecha cercanía de F. commune con el complejo de

especies F. oxysporum. La región mtSSU además ha sido usada en el análisis de la

distribución geográfica del complejo de especies de F. oxysporum en enfermedades de

origen nosocomial en los Estados Unidos (O’Donnell y Cigelnik, 1997; O’Donnell et al.,

1998; O'Donnell et al., 2000; Hirata et al., 2001; Skovgaard et al., 2003; O’Donnell et

al., 2004). La región ITS del ADN ribosómico nuclear se usó en un estudio que implicó

la detección de nuevas especies que componen el complejo de especies Gibberella

17

fujikuroi (O'Donnell et al., 2000; Zhang et al., 2006). Ninguna de las secuencias

ribosomales antes señaladas ha reflejado un adecuado poder de resolución a nivel de

especie, incluso han llegado a ser problemáticos en el momento de ser usados en conjunto

con otros genes; actualmente su uso se limita a la identificación de especímenes a nivel

de género (Balajee et al., 2009). Otro genes estructurales como el que codifica para la

Calmodulina (CAM), la β-tubulina (O’Donnell y Cigelnik, 1997; O’Donnell et al., 1998;

O'Donnell et al., 2000), el gen erg-3, que codifica para la enzima esterol C-14 reductasa

(Zhang et al., 2006) y el gen que codifica para el factor de elongación de la traducción 1α

(EF-1α) (O’Donnell et al., 1998; O'Donnell et al., 2000; Hirata et al., 2001; Skovgaard et

al., 2003; O’Donnell et al., 2004; Zhang et al., 2006; O’Donnell et al., 2007), se han

utilizado para la reconstrucción filogenética de miembros que componen el complejo de

especies de Gibberella fujikuroi y otros complejos de especies de Fusarium muy

cercanos, para el esclarecimiento del origen de enfermedades causadas por miembros del

complejo de especies Fusarium oxysporum, incluso en la filogenia del complejo de

Gibberella fujikuroi y de F. verticillioides en bananos exportados por diversas zonas

productoras de México y llevadas al oriente de Asia (Zhang et al., 2006). El gen erg-3,

se ha usado también para estudiar la relación de miembros del complejo de especies de

Fusarium solani con el origen de enfermedades en cultivos agrícolas y a su vez en el

personal que tiene contacto con este tipo de cultivos. El gen RPB2, que codifica para la

segunda subunidad mayor de la enzima ARN polimerasa II se ha usado para la

identificación de miembros del género Fusarium implicados en infecciones oculares

durante los años 2005 y 2006 (O’Donnell et al., 2007).

De los genes estructurales mencionados solo el EF-1α y el RPB2 han demostrado tener

un alto nivel de resolución para el género Fusarium, es decir discriminan especies aun

dentro de complejos de especies, aunque RPB2 no es muy adecuado para el complejo F.

oxysporum, que es quizá el grupo de mayor dificultad taxonómica del género y uno de

los más importantes en plantas y humanos. Actualmente se dispone de una base de datos

denominada FUSARIUM-ID (Fusarium identification), que alberga un número

considerable de secuencias de estos dos genes y además secuencias de β-tubulina, IGS,

ITS 1 y ITS2, rDNA y RPB1; que pueden ser usados como referencia para una

18

identificación, tipificación y taxonomía y filogenia más precisa de aislamientos de

Fusarium (Geiser et al., 2004; Balajee et al., 2009).

2.3.2. Importancia del Factor de elongación de la traducción 1α (EF-1α) en

Fusarium.

La síntesis proteica puede ser divida en tres etapas fundamentales: iniciación, elongación

y terminación, la elongación de la traducción requiere de varios y diferentes proteínas

solubles denominadas factores de elongación (eEF’s). El paso final de la expresión génica

tiene lugar en los ribosomas en donde el ARNm se traduce en proteína. En eucariotas, el

alargamiento de la cadena polipeptídica requiere la acción orquestada de tres factores. El

complejo eucariota factor de elongación 1 (eEF1= aa-ARNt, aminoacil-ARNt; mant-

GDP, 2’-(ó-3’)-O-(N-metilantraniloil) guanosina 5’-difosfato, hace entrega de la

molécula de aminoacil-ARNt (aa-ARNt) al sitio-A libre del ribosoma en pleno proceso

de elongación (Carvalho et al., 1984). El EF-1α es una proteína G clásica que actúa como

un “activador molecular” para los estados activos e inactivos basados en la presencia y

unión de GTP o GDP (Bourne et al., 1991). En el momento en que se da la unión del

codón y el anticodón, el ribosoma actúa como un activador de la actividad GTP-asa en el

estímulo de la hidrolisis de GTP, dando como resultado la liberación del GDP unido a

EF-1α del ribosoma. En organismos eucariotas este factor también actúa en la unión de

actina y en la construcción de proteínas, siendo su homólogo en procariotas la proteína

bacteriana EF-Tu (Pittman et al., 2006). La interacción EF-1α-actina está plenamente

conservada desde las levaduras a mamíferos, sugiriendo la importancia del EF-1α en la

integridad del citoesqueleto (Kinzy et al., 1994, Pittman et al., 2009).

Actualmente el EF-1α es considerado como el gen esencial en análisis multigénicos por

las siguientes razones: 1) La presencia de una única copia en el genoma de Fusarium, 2)

la no detección de copias ortólogas, 3) su riqueza de regiones intrónicas y alto nivel de

polimorfismo entre especies estrechamente cercanas y 4) la posibilidad de generar

cebadores universales; que permiten estudios a través de los limites filogenéticos del

género (Geiser et al., 2004; O’Donnell et al., 2004). Además, la gran utilidad de la

secuencia del EF-1α es debida principalmente a que de los 656 nucleótidos que lo

19

componen en promedio 39 de ellos son considerados cladísticamente significativos, los

que a su vez se encuentran en un 95 % en regiones exónicas, con algunas pequeñas

excepciones donde se han observado fenómenos de transición de bases, lo que conlleva a

un 50 % más de información que el gen que codifica para la pequeña subunidad ribosomal

de la mitocondria del ARNr (mtSSU) (Figura 1). Al parecer el gen EF-1α ha estado bajo

pocas restricciones evolutivas como se deduce de los patrones de mutación que incluyen

delecciones de bases (O’Donnell et al., 1998). El EF-1α ha mostrado mejores resultados

que el uso de secuencias que codifican para proteínas como la β-tubulina, Calmodulina e

Histona H3 que también tienen porciones ricas en intrones, y siguen siendo útiles como

marcadores genéticos en estudios de filogenia y taxonomía específicamente de Fusarium

(Nitschke et al., 2009; Sampietro et al., 2010), como el complejo G. fujikuroi y el

complejo de especies de F. oxysporum entre otros (O’Donnell et al., 1998). Por todo lo

anterior el gen codificante para el factor de elongación de la traducción ha comenzado a

ser el marcador de elección no solo como único gen utilizado para la identificación de

Fusarium (Ferrer et al., 2005; Kvas et al., 2009; Nitschke et al., 2009; Park et al., 2010;

Sampietro et al., 2011), sino también para análisis en conjunto con varios marcadores

moleculares (multi-locus) (O’Donnell et al., 2008; Park et al., 2010; Sampietro et al.,

2010). El EF-1α ha demostrado ser altamente informativo, al punto que la base de datos

denominada FUSARIM-ID se fundamenta principalmente en este gen, aunque contiene

también secuencias para la β-tubulina, RPB1, RPB2 57, RPB2 711, IGS, ITS 1 y 2,

(Geiser et al., 2004). FUSARIM-ID se ha puesto a disposición del público en

combinación con otra serie de recursos, como la plataforma de Genómica Comparativa

de Fusarium (FCGP) y la plataforma de la Comunidad de Fusarium (FCP) (Harrow et

al., 2010), las tres se integran en Ciberinfraestrutura para Fusarium (CiF) (Park et al.,

2010).

20

Figura 1. Mapa de la región de EF-1α, con la localización de los cebadores. Tomado y

adaptado de Geiser y colaboradores (2004).

2.3.3. Importancia de la segunda subunidad mayor de la ARN polimerasa II (RPB2)

en Fusarium

Los genes nucleares codificantes de proteínas implicadas en la replicación, transcripción

y traducción de la información genética se han considerado apropiados para estudios

taxonómicos y filogenéticos debido en gran medida a que no sufren procesos de

transferencia horizontal de genes en eucariotas (Liu y Hall, 2004). El gen de la segunda

subunidad mayor de la ARN polimerasa II, se encuentra en una sola copia dentro del

genoma de hongos haploides (James et al., 1991; Liu et al., 1999).

Las ARN polimerasas nucleares eucariotas I, II y III son las responsables de la síntesis de

los ARN ribosomales mayores, pre-ARN mensajero (no maduro o transcripto primario)

y de pequeños ARN ribosomales (SSU) y del ARN de transferencia, respectivamente

(ARNt). La similitud en la estructura de la segunda subunidad mayor de estas ARN

polimerasas entre los organismos eucariotas indica que son muy conservadas, cada una

de las tres polimerasas contiene de 9 a 14 péptidos con actividad transcripcional; algunas

de las subunidades son compartidas entre las ARN polimerasas, mientras que otras son

exclusivas de la enzima de cada grupo de organismos (Sweetser et al., 1987). Los genes

que codifican para las subunidades de las ARN polimerasas I, II y III coexisten desde su

ancestro eucariota inicial el cual ha sido predicho por análisis de homología en secuencias

intrónicas de Arabidopsis sp (Liu y Hall, 2004). Uno de estos genes, el RPB2, codifica

para la segunda subunidad mayor de la ARN polimerasa II, tiene como función transcribir

el ARN mensajero. Su importancia radica en que se encuentra en una sola copia dentro

21

del genoma de los ascomicetes y posee una tasa evolutiva relativamente baja, quizás

debido a que desempeña una función básica para la célula, aunque suficiente para ser

usada en taxonomía (Liu y Hall, 2004). El papel que posee esta ARN polimerasa en las

características estructurales y evolutivas de la célula es tan general que es poco afectada

por las principales fuerzas de adaptación evolutiva (Liu y Hall, 2004).

La ARN polimerasa II, que transcribe el pre-ARNm; está formada de complejos

agregados cuyas subunidades estructurales están bien definidas (Sweetser et al., 1987;

Liu et al., 1999). El gen que codifica para la segunda subunidad mayor de la ARN

polimerasa II tiene una longitud aproximada de 1.8 kb (O’Donnell et al., 2007), que

codifica para una proteína de 138750 Dalton, que contiene aminoácidos implicados en la

unión de nucleótidos de purinas e iones de zinc, como es el caso del sitio catalítico para

la síntesis de ARN de la ARN polimerasa de Escherichia coli (Sweetser et al., 1987;

O’Donnell et al., 2007; Ruprich-Robert G y Thuriaux P. 2010). El uso de la RPB2 como

marcador molecular se inició como alternativa a la región de la pequeña subunidad del

ribosoma nuclear (SSU ADNr) comúnmente usada en la sistemática molecular de

ascomicetes (Liu et al., 1999; Hansen et al., 2005) (Figura 12).

Las diversas regiones del gen tienen diferentes tasas de evolución, y por tanto

dependiendo del segmento usado, pueden ser útiles para análisis de taxonomía y filogenia

a nivel de especies (Hansen et al., 2005). Las secuencias de la RPB2 por lo general tienden

a generar alineamientos poco conflictivos y con más sitios informativos que las

secuencias ribosomales (Wang et al., 2004). La región de la RPB2, de mayor tasa

evolutiva y por lo tanto de mayor importancia de análisis de taxonomía, es aquella que se

encuentra entre los dominios 6-7 (Liu et al., 1999; Hansen et al., 2005). A nivel de

especie, esta región posee mayor resolución y soporte de clados que la LSU y β-tubulina

(Hansen et al., 2005; Matheny, 2005).

Análisis estadísticos no ponderados de Máxima Parsimonia, revelaron que el gen RPB2

contiene aproximadamente 608 caracteres informativos en el género Fusarium

(O’Donnell et al., 2007). La región de la RPB2 cuenta con el mayor número de caracteres

informativos potencialmente parsimoniosos (58.95%), en comparación con el segmento

22

5’ del LSU ADNr (22.56 %) y de la β-tubulina (18.49 %), es decir es 1.48 veces mayor

señal filogenética (Hansen et al., 2005). Conjuntamente los exones de la RPB2 exhiben

un alto porcentaje como potenciales caracteres informativos para análisis de parsimonia,

en relación con los exones de LSU y β-tubulina los cuales poseen porcentajes similares

entre sí (Hansen et al., 2005). Doce regiones altamente conservadas, con un 85 % de

identidad en sus secuencias de aminoácidos fueron, identificadas por comparación de las

secuencias RPB2 de hongos, plantas y animales (Liu et al., 1999); cuatro intrones están

presentes en la secuencia de la RPB2, pero la presencia o ausencia de estos intrones parece

haberse dado al azar dentro del orden Pezizales. Esto confirma los resultados de Liu y

colaboradores (1999), que sugieren que los intrones en el gen pudieron haber sido

ganados o perdidos frecuentemente durante la evolución de los hongos (Liu et al., 1999;

Hansen et al., 2005).

Con el uso del gen RPB2 se han encontrado excelentes resultados como marcador

taxonómico y filogenético en diferentes grupos fúngicos a diferentes niveles de la escala

taxonómica como lo son clases y subclases del reino Fungí, principalmente de los

Pezizales (Liu y Hall, 2004; Frøslev et al., 2005). En el caso específico del genero

Fusarium y sus complejos de especies se ha observado bajos niveles de resolución de

clados basales como el complejo de especies de F. solani y el complejo de F. dimerum, y

sobre todo del complejo de especies de F. oxysporum. Por esto es necesario la búsqueda

de otros loci filogenéticamente más informativos para contribuir a resolver la taxonomía

de todo el género Fusarium (O’Donnell et al., 2007).

Partiendo de lo anterior y teniendo en cuenta que la identificación morfológica es

compleja y requiere de especialistas y su criterio aun genera preguntas taxonómicas no

ofrece una garantía en la identificación de especies de Fusarium y dada la importancia

económica de este género, se hace necesaria el uso de metodologías complementarias

pero nunca suplementarias como la aplicación de técnicas moleculares para su

identificación. Es indispensable el uso de múltiples loci para aumentar la precisión en las

técnicas de identificación molecular de especies, sobre todo en especies de Fusarium

implicadas o relacionadas a humanos con enfermedades como son: F. solani y F.

oxysporum.

23

Casos como el del complejo de especies Gibberella fujikuroi en donde se sabe que es un

grupo monofilético que contiene una mezcla de especies de Fusarium sp con rasgos

morfológicos similares que complica su identificación en cualquiera de sus dos estados,

sexual o asexual, la aplicación de este tipo de estrategias ha permitido revelar que este

complejo está compuesto por al menos 50 especies, de las cuales 34 se han logrado

diferenciar mediantes caracteres morfológicos y 10 por criterios de fertilidad sexual; 20

de ellas producen uno o más micotoxinas, demostrando nuevamente la alta variabilidad

de este género (Kvas et al., 2009).

El complejo de especies de F. oxysporum alberga especies de alto grado de ubicuidad y

especialmente de patogenicidad a cultivos de importancia agrícola, en este caso la

aplicación de herramientas moleculares corrobora la heterogeneidad de dicho complejo,

de tal manera que las topologías obtenidas mediante el uso de diferentes marcadores como

ADNr 18S y 28S, EF-1α, MAT-1 (1-2), no son totalmente coincidentes en un grupo de

muestras evaluadas por Lievens y colaboradores en el año 2009, las cuales abarcaron

puntos clave de la geografía mundial especialmente por su importancia agrícola y la

repetida presentación de casos de infección de plantas con este complejo de especies

(Lievens et al., 2009).

Otro caso de gran relevancia es el presentado en el complejo de especies de F. solani ya

que sus miembros son responsables de aproximadamente dos tercios de los casos de

fusariosis en humanos, animales y además algunos son fitopatógenos de importancia

económica. La aplicación de estudios filogenéticos moleculares ha permitido diferenciar

alrededor de 45 especies dentro de este complejo, distribuidas en tres clados (O’Donnell

et al., 2008).

En el caso específico del complejo de especies de F. graminearum hasta hace pocos años

se creía que se trataba de una sola especie cosmopolita teniendo en cuenta solo

caracterización morfológica, pero la aplicación de técnicas moleculares ha permitido

distinguir al menos 11 especies filogenéticamente distintas con una marcada y clara

distribución biogeográfica. Esto es importante ya que dentro de este complejo se incluye

24

importantes patógenos de cereales fuente primaria de alimentación en algunos países en

desarrollo (O’Donnell et al., 2008).

Otro caso de gran importancia debido a la similitud de los patrones de reportes médicos

se presenta entre Cylindrocarpon lichenicola y Acremonium falciforme con miembros del

complejo de especies F. solani, los cuales generaron un alto grado de preocupación y por

ende la revisión de su cercanía y afinidades filogenéticas a pesar de que sus caracteres

morfológicos conidiales son diferentes; fue resuelto gracias a métodos de secuenciación

y uso de secuencias para análisis de filogenia multilocus, permitiendo el esclarecimiento

de estas dudas y devolviendo el nombre original de Fusarium lichenicola C. B.

Massalongo 1951 y proponiendo la nueva especie denominada Fusarium falciforme

(Taylor et al., 2000; Summerbell y Schroers, 2002).

Análisis de filogenia hechos por Knutsen y colaboradores, (2004) basándose en la

secuencia del gen EF-1α, permitieron revalidar la clasificación de F. langsethiae como

un taxa separado en la sección Sporotrichiella de F. sporotrichioides, mientras que F.

kyushuense es taxón hermano de F. poae (Knutsen et al., 2004).

Figura 2. Mapa de la región RPB2, las cajas negras y los números anteriores representan

los 12 motivos de aminoácidos que se conservan en todos los eucariotas. Las posiciones

de los cebadores se representan mediante flechas.

25

3. OBJETIVOS.

3.1 Objetivo General.

Estudiar la taxonomía y diversidad de aislamientos de Fusarium obtenidos a partir de

muestras clínicas mediante el uso de dos marcadores moleculares de referencia.

3.2 Objetivos específicos.

3.2.1 Estimar la variabilidad molecular de los aislamientos de Fusarium con base en

secuencias de los genes: factor de elongación de la traducción 1α (EF-1α) y la segunda

subunidad mayor de la ARN polimerasa II (RPB2).

3.2.2 Analizar la relación evolutiva entre los genotipos de Fusarium con base en la

secuenciación de los genes factor de elongación de la traducción 1α (EF-1α) y la segunda

subunidad mayor de la ARN polimerasa II (RPB2).

26

4. METODOLOGÌA

4.1 Población y muestra.

Las cepas de Fusarium fueron obtenidas de 59 individuos que acudieron de manera

particular o remitidos por alguna institución prestadora de salud (IPS), al laboratorio de

Micología Médica y Experimental (MME) de la Corporación para Investigaciones

Biológicas (CIB) en el periodo comprendido entre los años 2004 y 2006; con el fin de

realizarse un exámen directo y cultivo de la lesión. Cada paciente se sometió a una

encuesta donde se incluían datos sociodemográficos (edad, residencia, ocupación),

antecedentes y consumo de antimicóticos entre otros. Posteriormente se procedió a la

toma de la muestra. Las muestras fueron obtenidas a partir de uñas de manos y pies,

córnea, piel, abdomen y fueron sembradas en agar Saboraud, PDA y Mycosel, e incubadas

a temperatura ambiente por un periodo entre 1 y 3 semanas. Una vez se obtuvo

crecimiento macroscópico, las colonias identificadas como Fusarium sp. se almacenaron

en viales con agua estéril hasta su posterior uso. Este procedimiento fue llevado a cabo

en el laboratorio de Micología Médica y Experimental (MME) de la CIB (Giraldo, 2010).

4.2 Cepas.

Las cepas de Fusarium spp obtenidas a partir de aislamientos clínicos, fueron cultivadas

en los medios Agar PDA, Mycosel y/o Saboraud a temperatura ambiente (25ºC) y

mantenidas en agua estéril antes de realizar el procedimiento de extracción de ADN, en

las instalaciones del Laboratorio de Biología Molecular Bloque 19 de la Universidad

Nacional de Colombia sede Medellín (Giraldo, 2010). La confirmación de la identidad de

cada aislamiento como perteneciente al género Fusarium por descripción de las

características morfológicas y por detección molecular fue llevada a cabo durante la tesis

de maestría en Biotecnología de Giraldo D. en 2010, con la ayuda de cepas de referencia

donadas por el laboratorio de Microbiología y Fitopatología de la Universidad de los

Andes, LAMFU al laboratorio de Micología de la CIB (Giraldo, 2010).

27

4.3 Extracción y purificación de ADN

Después de diez días de incubación, en una cámara de flujo laminar, una porción del

cultivo de cada aislamiento se maceró con Nitrógeno líquido para proceder a realizar la

extracción de ADN por el método de Fenol-Cloroformo Alcohol-Isoamílico descrito

previamente por Sambrook y Russell (2001). Posterior a la extracción, el ADN se

resuspendió en 40 μL de agua estéril, se cuantificó a 260 nm en un espectrofotómetro

(Nanodrop 2000, Thermo Fisher Scientific) y se cualificó mediante electroforesis en gel

de Agarosa al 2 % teñido con 5 µl de Bromuro de Etidio 0,5 µg/ml en Buffer TBE 1.0 X

a 70 V por una hora. Después de conocer la concentración de ADN se hizo la

correspondiente dilución con el fin de obtener una concentración de 25 ng/µl de ADN

para todas las cepas.

4.4 Amplificación por PCR de los genes EF-1α y RPB2.

La amplificación del fragmento de 716 pb del gen que codifica para el factor de

elongación de la traducción EF-1α se hizo con el par de oligonucleótidos ef1H y ef2T,

dichos cebadores fueron diseñados mediante la comparación de las secuencias de

miembros de los complejos más representativos de Fusarium como son sus teleomorfos

Gibberella fujikuroi, G. zeae, F. solani, y F. oxysporum, (Figura 3A). (Tabla 1)

(O’Donnell et al., 2008), bajo las siguientes condiciones: una etapa de desnaturalización

inicial a 94 ºC por 5 min, seguido por 35 ciclos de desnaturalización a 95ºC por 30 seg,

alineamiento a 57 ºC por 1 min y extensión a 72 ºC por 1min, por último una etapa de

extensión a 72 ºC por 10 min (O’Donnell et al., 2008). Los dos fragmentos del gen que

codifican para la segunda subunidad mayor de la ARN polimerasa II, RPB2-57 y RPB2-

711, se amplificaron con los pares de oligonucleótidos; RPB2-57 5f2/7cR y RPB2-711

7cF/11aR, respectivamente; estos cebadores fueron diseñados por Liu y colaboradores en

1999 durante un estudio que comparó 27 secuencias de especies de organismos

ascomicetes y su amplio uso en el género Fusarium se inició por O’Donnell y colaborados

en el año 2008 (Liu et al., 1999; O’Donnell et al., 2008) (Tabla1), que en conjunto

amplifican un fragmento de aproximadamente 1738 pb (O’Donnell et al., 2008). Las

condiciones de amplificación por PCR para RPB2-57 y RPB2-711 fueron: una etapa de

28

desnaturalización inicial a 94 ºC por 90 seg, seguido por 40 ciclos de desnaturalización a

94 ºC por 30 seg., alineamiento a 55 ºC y 57 ºC (para RPB2-57 y RPB2-711,

respectivamente) por 90 seg. y extensión a 68 ºC por 2 min, por último una etapa de

extensión a 68 ºC por 5 min (O’Donnell et al., 2008). Las condiciones de las mezclas de

PCR para cada fragmento se detallan en la Tabla 2.

Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en diferentes termocicladores

(T3000® BIOMETRA, PTC-100 MJ ResearchTM y MultiGene Labnet Gradient). Como

control negativo se utilizó la misma mezcla para la PCR pero sin ADN.

Las cepas de F. solani (código 030790), F. oxysporum (código 041898) y F.

verticillioides (código 032989) se utilizaron como control positivo y fueron donadas por

el laboratorio de Microbiología y Fitopatología de la Universidad de los Andes, LAMFU

(Bogotá, Colombia) al laboratorio de Micología de la CIB. Los productos finales de la

amplificación fueron purificados con el kit de Qiagen, siguiendo las indicaciones del

fabricante y mantenidos a - 20 ºC hasta el momento de su secuenciación.

Tabla 1. Descripción de los cebadores utilizados para la amplificación por PCR y

secuenciación parcial de los genes EF-1α y RPB2 de aislamientos de Fusarium spp.

procedentes de muestras clínicas.

Región de

amplificación Cebador Uso Secuencia ( 5’- 3’)a

Tamaño

del

fragmento

Temperatura

de

alineamiento

(°C)

EF-1α ef-1H

ef-2T Amplificación

5’-ATGGGTAAGGAAGACAAGAC-3

5’-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3’ ~716 pb 57

EF-1α ef3

ef22T Secuenciación

5’-GTAAGGAGGASAAGACTCACC-3’

5’-AGGAACCCTTACCGAGCTC -3’ N/A N/A

RPB2-57 5F2

7cR

Secuenciación

Amplificación

5’-GGGGWGAYCAGAAGAAGGC-3’

5’-CCCATRGCTTGYTTRCCCAT-3’ ~977 pb 55

RPB2-711 7cF

11aR

Secuenciación

Amplificación

5’-ATGGGYAARCAAGCYATGGG-3’

5’-GCRTGGATCTTRTCRTCSACC-5’ ~1135 pb 57

(N/A: No aplica). a S = C ó G, W = A ó T, R = A ó G, Y = C ó T.

29

Tabla 2. Composición de las mezclas de PCR para la amplificación de los fragmentos de

los genes EF-1α y RPB2 de aislamientos de Fusarium sp .procedentes de muestras

clínicas.

Reactivo EF-1α RPB2-57 RPB2-711

Agua Mili-Q 16.49 µl 16.62 µl 16.62 µl

Buffer de Taq polimerasa 2,5 µl (10X) 2,5 µl (10X) 2,5 µl (10X)

MgCl2 1, 5 µl (25 mM) 1,25 µl (mM) 1,25 µl (mM)

dNTP 2 µl (20 mM) 1 µl (mM) 1 µl (mM)

Cebadores 0,63 µl (20 µM) 1 µl (mM) 1 µl (mM)

BSA - 0,5 µl 0,5 µl

Taq polimerasa 0,25 µL (5U/µl) 0,13 µL 5 U/ µl 0,13 µL 5 U/ µl

ADN molde 1 µl (25µg) 1 µl (25µg) 1 µl (25µg)

Volumen final (µl) 25µl 25 µl 25 µl

4.5 Electroforesis, procesamiento y análisis de imágenes

Todos los productos de PCR amplificados fueron confirmados mediante electroforesis.

De cada producto se corrió 4 µl en un gel de agarosa al 1 % teñido con 5 µl de Bromuro

de Etidio 0,5 µg/ml y 1 % GelStar® 0,01 µg/ml para EF-1α y RPB2 respectivamente, en

Buffer TBE 1.0 X a 70 V por una hora. Posteriormente se observaron a través de un

transiluminador de luz ultravioleta y/o un transiluminador de luz visible, respectivamente

para ser fotografiados y grabados en un computador. El tamaño de cada fragmento se

determinó por comparación con el marcador de peso molecular de 100pb Plus DNA

Ladder (Fermentas®) (Sambrook y Russell, 2001) (Figura 3).

4.6 Secuenciación de fragmentos de los genes EF-1α y RPB2 de aislamientos de

Fusarium sp.

Los productos de la amplificación por PCR de los genes EF-1α y RPB2 (RPB2-57 y

RPB2-711), fueron secados en una Eppendorf Vacufuge Concentrator Basic, a

temperatura ambiente, resuspendidos en 10 µl de agua Mili-Q y se enviaron a Macrogen®

Korea para su secuenciación. Los fragmentos del gen EF-1α fueron secuenciados con los

cebadores ef3 y ef22T (Tabla 1); los fragmentos de RPB2-57 con los cebadores 5f2 y 7cR

(Tabla 2) y los fragmentos de RPB2-711 con los cebadores 7cF y 11aR (Tabla 2)

30

(O’Donnell et al., 2008). Cada fragmento se secuenció en ambas direcciones en un

secuenciador automático capilar ABI3730XL, en Macrogen Korea.

4.7 Edición y análisis de secuencias

La edición de secuencias que codifican para el factor de elongación de la traducción EF-

1α y la segunda subunidad mayor de la ARN polimerasa II RPB2, se hizo con el programa

BioEdit (Hall T, 1999); a continuación se determinó la secuencia consenso de cada

aislamiento mediante la edición manual y alineamiento de las secuencias en ambos

sentidos. Posteriormente se realizó un alineamiento múltiple con todas las secuencias de

cada gen con el programa Clustal W (Larkin et al., 2007).

4.8 Identificación molecular a nivel de complejos de especie de aislamientos del

género Fusarium procedentes de muestras clínicas

El alineamiento permitió agrupar las secuencias con base en su similitud para determinar

las regiones variables y conservadas dentro de éstas. Seguidamente se realizó un análisis

BLAST (Basic Local Alignment and Search Tool), de cada secuencia, en la base de datos

Fusarium-ID disponible en la página web: (http://isolate.Fusariumdb.org/blast.php) de la

base de datos Cyber-infrastructure for Fusarium (CiF) con el objetivo de determinar la

especie a que pertenece cada aislamiento.

4.9 Variabilidad evolutiva y análisis de secuencias

El análisis de entropía de las secuencias se realizó con base en la diversidad haplotípica

y divergencia genética, además se identificaron los sitios monomórficos, polimórficos,

parsimoniosamente informativos, singletones, InDels (Inserciones-Delecciones),

patrones de sustitución de nucleótidos y matrices de distancia con los paquetes

informáticos BioEdit (Hall T., 1999), DAMBE (Xia, X., 2013), DnaSP (Librado, P. y

Rozas J., 2009) y MEGA (Tamura et al., 2011), los cuales permitieron observar la

separación de los aislamientos en grupos que corresponden o no a especies o complejos

de especies. En este análisis se incluyó secuencias de genotipos de cepas de referencia de

31

Fusarium y como grupo externo, Fusarium dimerum ET-grFD_01824 para EF-1α y

Fusarium dimerum ET-grFD_01824 para RPB2 para los análisis de la totalidad de los

aislamientos; para los análisis que involucraron las aislamientos identificados como

miembros del complejo de especies de Fusarium solani y de Fusarium oxypsorum por

separado, se usaron como grupos externos, las secuencias de los genes EF-1α y RPB2 de

Fusarium chlamydosporum FD_01697, Fusarium dimerum ET-grFD_01824 y Fusarium

napiforme FD_01181 como miembro del complejo de especies de Gibberella fujikuroi,

estas secuencias fueron obtenidas de la base de datos Fusarium-ID (O’Donnell et al.,

2010).

4.10 Taxonomía de aislamientos de Fusarium a partir de los genes EF-1α y RPB2.

Las secuencias consenso de los genes EF-1α y RPB2 de cada aislamiento fueron alineadas

mediante el uso de MUSCLE (Edgar, 2004). Posterior a ello se llevó a cabo un cálculo

de distancias genéticas de acuerdo al modelo de sustitución Kimura-2-parámetros y se

construyeron los dendrogramas de cada gen, mediante los algoritmos de Neighbor-

Joining¸ Máxima Verosimilitud y Máxima Parsimonia (bootstrap = 5000), al igual que la

concatenación de las secuencias de dichos genes para todos los aislamientos identificados

y de manera separada para los aislamientos pertenecientes a los complejos de especies de

F. oxysporum y F. solani. Al consenso de bootstrap se le colapsaron las ramas con valores

superiores al 50%, dispuesto en el paquete informático MEGA (Tamura et al., 2011).

Posteriormente se procedió a la elaboración de árboles para cada conjunto de secuencias

mediante métodos bayesianos, permitiendo observar los nodos que tuvieran una

probabilidad posterior de clado ≥ 70%, mediante el uso del paquete informático BEAST

(Drummond et al., 2012).

4.11 Correlación de especies de Fusarium con variables epidemiológicas.

Posteriormente, la identificación molecular de la especie de cada aislamiento clínico de

Fusarium, se correlacionó con los siguientes datos epidemiológicos: edad, género,

patología y ubicación de la lesión, con el fin de intentar establecer alguna correspondencia

entre dichas variables y los aislamientos analizados.

32

5. RESULTADOS

5.1 Amplificación por PCR de los genes EF-1α y RPB2.

La amplificación por PCR, con el juego de cebadores ef-1H y ef-2T, del fragmento de

EF-1α de los 59 aislamientos de Fusarium dio como resultado amplificados de

aproximadamente 716 pares de bases que corresponde a la región comprendida entre el

primer y cuarto (ultimo) exón del gen, el cual a su vez contiene tres intrones (Figura 1).

En el presente estudio se amplifico esta región génica a partir del ADN de todos los 59

aislamientos estudiados.

La amplificación por PCR de la sección 5-7 del gen codificante para RPB2 con los

cebadores 5F2 y 7cR, abarca los dominios de mayor grado de conservación del gen RPB2,

dando como resultado un amplicon de aproximadamente 977 pares de bases (Figura 2 y

Figura 3B). (Liu et al., 1999; O’Donnell et al., 2008).

La amplificación de la región 7-11 del gen codificante para RPB2 con los cebadores 7cF

y 11aR dio como resultado un amplificado de aproximadamente 1135 pares de bases,

(Figura 3C). De igual manera estos cebadores fueron diseñados por Liu y colaboradores

(1999) y adoptados años más tarde al análisis de aislamientos de Fusarium por O’Donnell

(Liu et al., 1999; O’Donnell et al., 2008).

Las regiones 5-7 y 7-11 del gen RPB2 fueron amplificadas a partir del ADN del total de

los 59 aislamientos analizados (Figura 3C).

33

Figura 3. Electroforesis de fragmentos amplificados por PCR de los genes EF-1α, RPB2

5-7 y RPB2 7-11 de aislamientos clínicos del género Fusarium. A. Fragmentos

amplificados con el juego de cebadores ef-1H/ef-2T. Carril 1: 55444; 2: 55496; 3: 55498;

4: 56665; 5: 56868; 6: 57081; 7: 58025; 8: 63414; 9: 63901; 10: 64927; 11: 65068; C+

Control positivo 030790; C- Control negativo. B. Fragmentos amplificados con el juego

de cebadores 5F2 y 7cR. Carril 1: 55588; 2: 56301; 3: 57228; 4: 63550; C+ Control

positivo 041898; C- Control negativo. C. Fragmentos amplificados con el juego de

cebadores 7cF y 11aR. Carril 1: 55399; 2: 56094; 3: 57239; 4: 63316; C- Control

negativo; C+ Control positivo 032989, MP Marcador de Peso Molecular 100 pb plus.

5.2 Identificación molecular a nivel de complejo de especie de aislamientos clínicos

de Fusarium spp.

En este estudio el análisis BLAST de las secuencias del gen EF-1α en la base de datos

Fusarium-ID permitió identificar cada uno de los 59 aislamientos, 33 pertenecen al

complejo F. oxysporum, 25 al complejo F. solani y un único aislamiento (56665) al

complejo F. incarnatum-equiseti (Tabla 3). Los resultados estadísticos referentes a

34

valores de coincidencia exacta o de similitud absoluta (100%), con las secuencias de

aislamientos encontradas en la base de datos fue solo observada en 33 aislamientos (19

aislamientos del complejo de Fusarium oxysporum y 14 aislamientos del complejo de

Fusarium solani y los 26 aislamientos restantes presentaron porcentajes de similitud por

encima del 98.25 %.

El análisis BLAST de las secuencias codificantes para el gen RPB2 en la base datos

Fusarium-ID arrojó incongruencias, en la identidad de los 59 aislamientos, definidas estas

como diferencias en la identidad obtenida a nivel de complejos de especies y/o

aislamientos, siendo marcadamente distintas a las registrados por EF-1α y sin el mismo

soporte estadístico, correspondiendo a 42 aislamientos identificados como miembros del

complejo F. solani y 17 como F. staphylae. Los valores estadísticos que soportan estas

identidades demostraron que solo 22 aislamientos presentaron porcentajes de

coincidencia exacta o similitud absoluta (100 %), mientras que los 37 aislamientos

restantes mostraron dichos valores tan bajos como del 84.82 % (aislamiento 55498),

sumado a ello los valores (Score) de similitud máxima de 999.99 se presentaron en 53

aislamientos, mientras los restantes seis aislamientos presentaron valores de 575;

resultados en los valores E (Expect) de 0 fueron observados en 54 aislamientos, pero en

cinco del total de los aislamientos se observaron valores lejanos de 0, siendo el más lejano

de 1E-165 correspondiendo a una posibilidad significativa de encontrar más de un registro

de referencia con la misma secuencia.

El análisis BLAST de las secuencias codificantes para el gen RPB2 en la base datos

Fusarium-ID arrojó incongruencias en la identidad de varios de los 59 aislamientos,

respecto a la determinada por EF-1α, 42 aislamientos se identificaron como miembros del

complejo F. solani y 17 como F. staphylae. Los valores estadísticos que soportan estas

identidades mostraron que solo 22 aislamientos presentaron porcentajes de coincidencia

exacta o similitud absoluta (100 %), mientras que los 37 restantes mostraron valores entre

99.88 % y el 84.82 % (aislamiento 55498), sumado a ello los valores (Score) de similitud

máxima de 999.99 se presentaron en 53 aislamientos, mientras los restantes seis

aislamientos presentaron valores de 575. El valor E (Expect) de 0 fue observado en 54

aislamientos, los cinco restantes el valor fue lejano de 0, como 1E-165, que indica una

posibilidad significativa de encontrar más de un registro de referencia con la misma

35

secuencia. Partiendo de lo anterior y para fines prácticos la identidad de los 59

aislamientos se basó en los resultados obtenidos por las secuencias de EF-1α, de acuerdo

a sus altos valores estadísticos obtenidos y altos niveles de confianza demostrada.

Tabla 3. Identificación molecular a nivel de complejos de especie de aislamientos del

género Fusarium obtenidos de muestras clínicas.

Aislamiento

Genero

del

Hospedero

Localización

de la lesión

Identidad molecular

asignada (%) BLAST

Fusarium-ID EF-1α

Puntaje

/Valor E

de EF-1α

Identidad molecular

asignada (%) BLAST

Fusarium-ID RPB2

Puntaje

/Valor E

de RPB2

55347 F Uña pie

F. solani species

complex 2-b

NRRL43373

(100%)

999.99/0

F. solani species

complex 2-e

NRRL43458

(92.93%)

999.99/0

55349 F Uña pie

F. solani species

complex 2-a

NRRL43433

(99.85%)

999.99/0

F. solani species

complex 2-j

NRRL43649

(99.88%)

999.99/0

55444 M Uña pie

F. oxysporum

species complex 5

NRRL22533

(99.7%)

999.99/0

F. solani species

complex 27-a

NRRL37625

(100%)

999.99/0

55466 M Uña pie

F. oxysporum

species complex 33

NRRL38515

(100%)

999.99/0

F. solani species

complex 27-a

NRRL37625

(98.15%)

999.99/0

55496 F Uña pie

F. oxysporum

species complex 52

NRRL38540

(99.54%)

999.99/0

F. solani species

complex 25-a

NRRL31169

(100%)

999.99/0

55498 F Uña pie

F. oxysporum

species complex 22

NRRL38608

(99.7%)

999.99/0

F. solani species

complex 27-a

NRRL37625

(84.82%)

575.00/1

E-165

55529 M Uña pie

F. oxysporum

species complex 147

NRRL36251

(99.85%)

999.99/0

F. solani species

complex 27-a

NRRL37625

(85.3%)

674.00/

1,00 E-60

36

Aislamiento Genero

del

Hospedero

Localización

de la lesión

Identidad molecular

asignada (%) BLAST

Fusarium-ID EF-1α

Puntaje

/Valor E

de EF-1α

Identidad molecular

asignada (%) BLAST

Fusarium-ID RPB2

Puntaje

/Valor E

de RPB2

55583 M Desconocido

F. oxysporum

species complex 33

NRRL38515

(100%)

999.99/0 Fusarium

staphyleae (98.34%) 999.99/0

55585 F Uña pie

F. oxysporum

species complex 33

NRRL38515

(99.7%)

999.99/0 Fusarium

staphyleae (85.29%)

700.00/

8,00 E-70

55588 F Piel

F. oxysporum

species complex 33

NRRL38515

(100%)

999.99/0 Fusarium

staphyleae (99.31%) 999.99/0

55762 F Uña pie

F. oxysporum

species complex 33

NRRL38515

(99.85%)

999.99/0 Fusarium

staphyleae (97.96%) 999.99/0

55787 F Uña pie

F. oxysporum

species complex 195

NRRL38322

(100%)

999.99/0 Fusarium

staphyleae (99.65) 999.99/0

55827 F Uña pie

F. oxysporum

species complex 16

NRRL38597

(99.68%)

999.99/0

F. solani species

complex 27-a

NRRL37625

(85.2%)

706.00/

1,00 E-66

55861 F Uña pie

F. oxysporum

species complex 33

NRRL38515

(100%)

999.99/0 Fusarium

staphyleae (99.88%) 999.99/0

55945 F Uña pie

F. oxysporum

species complex 33

NRRL38515

(100%)

999.99/0

F. solani species

complex 27-a

NRRL37625

(99.88%)

999.99/0

55979 M Córnea

F. oxysporum

species complex 33

NRRL38515

(100%)

999.99/0 Fusarium

staphyleae (99.88%) 999.99/0

56054 M Piel

F. solani species

complex 3+4-ss

NRRL32729

(100%)

999.99/0

F. solani species

complex 3+4-b

NRRL43537

(100%)

999.99/0

37

Aislamiento Genero

del

Hospedero

Localización

de la lesión

Identidad molecular

asignada (%) BLAST

Fusarium-ID EF-1α

Puntaje

/Valor E

de EF-1α

Identidad molecular

asignada (%) BLAST

Fusarium-ID RPB2

Puntaje

/Valor E

de RPB2

56094 F Uña pie

F. oxysporum

species complex 33

NRRL38515

(100%)

999.99/0 Fusarium

staphyleae (100%) 999.99/0

56212 F Uña pie

F. oxysporum

species complex 33

NRRL38515

(100%)

999.99/0

F. solani species

complex 1-c

NRRL43812

(100%)

999.99/0

56240 F Uña pie

F. solani species

complex 1-a

NRRL28546

(100%)

999.99/0

F. solani species

complex 1-c

NRRL43812

(99.54%)

999.99/0

56301 F Uña pie

F. solani species

complex 2-b

NRRL43373

(100%)

999.99/0

F. solani species

complex 2-j

NRRL43649

(100%)

999.99/0

56320 F Uña pie

F. oxysporum

species complex 33

NRRL38515

(100%)

999.99/0

F. solani species

complex 17-a

NRRL22157

(84.86%)

682.00/

7,00 E-59

56321 F Uña mano

F. solani species

complex 29-a

NRRL28008

(99.12%)

999.99/0

F. solani species

complex 2-g

NRRL43490

(97.79%)

999.99/0

56323 F Uña pie

F. oxysporum

species complex 232

NRRL39464

(100%)

999.99/0

F. solani species

complex 27-a

NRRL37625

(100%)

999.99/0

56337 F Uña pie

Fusarium solani

FD_01371

(100%)

999.99/0

F. solani species

complex 5-l

NRRL32791

(100%)

999.99/0

56340 F Uña pie

F. solani species

complex 34-a

NRRL46703

(99.4%)

999.99/0

F. solani species

complex 5-l

NRRL32791

(98.63%)

999.99/0

56363 F Uña pie

F. oxysporum

species complex 33

NRRL38515

(100%)

999.99/0 Fusarium

staphyleae (97.67%) 999.99/0

38

Aislamiento Genero

del

Hospedero

Localización

de la lesión

Identidad molecular

asignada (%) BLAST

Fusarium-ID EF-1α

Puntaje

/Valor E

de EF-1α

Identidad molecular

asignada (%) BLAST

Fusarium-ID RPB2

Puntaje

/Valor E

de RPB2

56604 F Uña pie

F. solani species

complex 2-v

NRRL32838

(99.85%)

999.99/0

F. solani species

complex 2-g

NRRL43490

(95.69%)

999.99/0

56665 F Piel

F. incarnatum-

equiseti species

complex 1-a

(98.25%)

999.99/0

F. solani species

complex 12-d

NRRL32309

(99.88%)

999.99/0

56780 F Uña pie

F. solani species

complex 2-k

NRRL31165

(99.85%)

999.99/0

F. solani species

complex 2- j

NRRL43649

(100%)

999.99/0

56868 F Uña pie

F. solani species

complex 2-b

NRRL43373

(99.7%)

999.99/0

F. solani species

complex 2-j

NRRL43649

(99.88%)

999.99/0

56891 M Uña pie

Fusarium solani

FD_01371

(100%)

999.99/0

F. solani species

complex 5-d

NRRL43681

(100%)

999.99/0

56894 M Uña pie

F. solani species

complex 1-a

NRRL28546

(100%)

999.99/0

F. solani species

complex 1-c

NRRL43812

(99.84%)

999.99/0

56988 M Córnea

F. solani species

complex 25-a

NRRL31169

(99.11%)

999.99/0

F. solani species

complex 25-a

NRRL31169

(100%)

999.99/0

57221 F Uña pie

F. solani species

complex 1-a

NRRL28546

(100%)

999.99/0

F. solani species

complex 1-c

NRRL43812

(100%)

999.99/0

57228 F Uña pie

F. oxysporum

species complex 47

NRRL26225

(100%)

999.99/0

F. solani species

complex 27-a

NRRL37625

(100%)

999.99/0

57335 F Uña pie

F. solani species

complex 2-b

NRRL43373

(100%)

999.99/0

F. solani species

complex 2-j

NRRL43649

(98.97%)

999.99/0

39

Aislamiento Genero

del

Hospedero

Localización

de la lesión

Identidad molecular

asignada (%) BLAST

Fusarium-ID EF-1α

Puntaje

/Valor E

de EF-1α

Identidad molecular

asignada (%) BLAST

Fusarium-ID RPB2

Puntaje

/Valor E

de RPB2

57560 F Uña pie

F. oxysporum

species complex 195

NRRL38322

(99.56%)

999.99/0 Fusarium

staphyleae (98.45%) 999.99/0

57721 F Uña pie

F. oxysporum

species complex 33

NRRL3851

(100%)

999.99/0

F. solani species

complex 1-c

NRRL43812

(98.8%)

999.99/0

57885 M Uña pie

F. oxysporum

species complex

33 NRRL38515

(99.85%)

999.99/0 Fusarium

staphyleae (100%) 999.99/0

57949 F Uña pie

F. solani species

complex 3+4-c

NRRL43536

(100%)

999.99/0

F. solani species

complex 3+4-c

NRRL43536

(100%)

999.99/0

58023 F Uña pie

F. oxysporum

species complex 232

NRRL39464

(99.12%)

999.99/0

F. solani species

complex 3+4-c

NRRL43536

(99.88%)

999.99/0

58025 M Uña pie

F. solani species

complex 7-b

NRRL32323

(99.7%)

999.99/0

F. solani species

complex 7-c

NRRL32794

(98.58%)

999.99/0

62698 M Abdomen

F. oxysporum

species complex 33

NRRL38515

(100%)

999.99/0 Fusarium

staphyleae (100%) 999.99/0

62802 F Uña pie

F. oxysporum

species complex 33

NRRL38515

(99.56%)

999.99/0

F. solani species

complex 19-b

NRRL22346

(96.32%)

999.99/0

63145 F Uña pie

F. oxysporum

species complex 195

NRRL38322

(100%)

999.99/0 Fusarium

staphyleae (99.2%) 999.99/0

63200 F Uña pie

F. solani species

complex 2-v

NRRL32838

(100%)

999.99/0

F. solani species

complex 2-v

NRRL32838

(100%)

999.99/0

40

Aislamiento Genero

del

Hospedero

Localización

de la lesión

Identidad molecular

asignada (%) BLAST

Fusarium-ID EF-1α

Puntaje

/Valor E

de EF-1α

Identidad molecular

asignada (%) BLAST

Fusarium-ID RPB2

Puntaje

/Valor E

de RPB2

63316 F Uña pie

F. oxysporum

species complex 33

NRRL38515

(99.85%)

999.99/0 Fusarium

staphyleae (100%) 999.99/0

63414 M Uña pie

F. oxysporum

species complex 5

NRRL22533

(99.7%)

999.99/0

F. solani species

complex 27-a

NRRL37625

(100%)

999.99/0

63447 F Uña pie

F. solani species

complex 2-b

NRRL43373

(100%)

999.99/0

F. solani species

complex 2-e

NRRL43458

(100%)

999.99/0

63613 F Uña mano

F. oxysporum

species complex 33

NRRL38515

(99.41%)

999.99/0 Fusarium

staphyleae (85.29%) 694.00/0

63635 F Uña pie

F. solani species

complex 2-k

NRRL31165

(99.85%)

999.99/0

F. solani species

complex 2-g

NRRL43490

(96.71%)

999.99/0

63649 F Uña pie

F. oxysporum

species complex 33

NRRL38515

(100%)

999.99/0 Fusarium

staphyleae (95.72%) 999.99/0

63666 F Uña mano

F. oxysporum

species complex 195

NRRL38322

(100%)

999.99/0

F. solani species

complex 12-d

NRRL32309

(99.65%)

999.99/0

63749 M Uña mano

F. solani species

complex 20-d

NRRL32858

(99.1%)

999.99/0

F. solani species

complex 5-d

NRRL43681

(100%)

999.99/0

63768 F Uña pie

F. oxysporum

species complex 33

NRRL38515

(100%)

999.99/0 Fusarium

staphyleae (99.88%) 999.99/0

63917 F Uña pie

F. solani species

complex 2-b

NRRL43373

(99.85%)

999.99/0

F. solani species

complex 2-e

NRRL43458

(99.71%)

999.99/0

41

Aislamiento Genero

del

Hospedero

Localización

de la lesión

Identidad molecular

asignada (%) BLAST

Fusarium-ID EF-1α

Puntaje

/Valor E

de EF-1α

Identidad molecular

asignada (%) BLAST

Fusarium-ID RPB2

Puntaje

/Valor E

de RPB2

64765 F Uña pie

F. solani species

complex 1-a

NRRL28546

(100%)

999.99/0

F. solani species

complex 1-c

NRRL43812

(99.54%)

999.99/0

65068 F Uña pie

F. solani species

complex 1-a

NRRL28546

(100%)

999.99/0

F. solani species

complex 1-c

NRRL43812

(100%)

999.99/0

5.3 Variabilidad evolutiva y análisis de secuencias

5.3.1 Caracterización de las secuencias.

La cantidad de sitios monomórficos de las regiones secuenciadas representan cerca del

48 % de la longitud total del gen EF-1α (858 pb) y del 39 % de RPB2 (1870 pb) (Tabla

4). El análisis de abundancia de sitios polimórficos fue de 23,5 % para el gen EF-1α y de

33 % para RPB2; por otro lado el número de sitios parsimoniosamente informativos

representó el 68 % para EF-1α y 71 % para RPB2, del polimorfismo observado en estas

secuencias; los cuales demuestran el grado de variabilidad suficiente para llevar a cabo la

diferenciación de aislamientos en complejos de especies del genero Fusarium. El número

de singletons, fue relativamente bajo, correspondió a 7,5 % y 9,5 % para EF-1α y RPB2.

El número de fenómenos de inserciones/delecciones detectados en los dos conjuntos de

secuencias fue muy similar, ya que representó el 11,6 % para EF-1α y el 11,8 % de RPB2

Además de los conjunto de secuencias se determinaron 55 haplotipos con EF-1α y 58 con

RPB2, lo que corresponde con un alto grado de variabilidad haplotípica, de 0,9977 para

EF-1α y de 0,9994 para RPB2 (Tabla 4).

42

Tabla 4. Características e información de los alineamientos de las secuencias de EF-1α y

RPB2.

Marcador

(longitud)

Sitios

Monomórficos

Sitios

Polimórficos

Sitios

Parsimoniosamente

informativos

Singletones InDels

(I)

N° de

Haplotipos

(h)

Diversidad

Haplotípica

(Hd)

EF-1α

(858 pb) 412 202 138 64 100 55 0,9977

RPB2

(1870pb) 744 618 439 179 221 58 0,9994

5.3.2 Estimación de patrones de sustitución.

El análisis de patrones de sustitución corroboró que la probabilidad presentarse

fenómenos de transición es mayor que la probabilidad de fenómenos de transversion, el

cambio de bases entre pirimidinas fue del 19,7 % en promedio y del 17,7 % para los

cambios Citosina (C) a Timina (T) y 21,69 % para los cambio de Timina (T) a Citosina

(C), específicamente, para el conjunto de secuencias de EF-1α, lo que justifica en gran

medida la presencia de zonas de marcada entropía, sitios parsimoniosamente informativos

y variabilidad monomórfica y polimórfica a nivel de nucleótidos (Tabla 5).

Igualmente el análisis de probabilidad compuesta de patrones de sustitución para el

conjunto de datos correspondientes a las secuencias de RPB2, demostró que las

probabilidades de los fenómenos de transición son mayores que las probabilidades de

transversión, la probabilidad de cambios entre pirimidinas (Citosina (C) y Timina (T))

fue del 20,9 % y 23,77 % respectivamente (Tabla 6).

43

Tabla 5. Máxima estimación de probabilidad compuesta de patrón de sustitución de

nucleótidos de EF-1α.

A T C G

A - 5.11 6.26 9.76

T 4.59 - 21.69 4.51

C 4.59 17.7 - 4.51

G 9.94 5.11 6.26 -

Tabla 6. Máxima estimación de probabilidad compuesta de patrón de sustitución de

nucleótidos de RPB2.

A T C G

A - 3.99 4.53 10.51

T 4.33 - 23.77 4.53

C 4.33 20.9 - 4.53

G 10.05 3.99 4.53 -

5.3.3 Distancias genéticas.

Los valores de distancias genéticas entre el conjunto de datos de EF-1α obtenidos en este

análisis mostraron una marcada distancia entre los aislamientos de los complejos de

especies de Fusarium solani, Fusarium oxyporum y Fusarium incarnatum-equiseti,

corroborando la clara asignación de identidades a cada uno de los aislamientos evaluados

y la agrupación de los aislamientos con base en los complejos de especies asignados. Es

de resaltar la marcada distancia observada entre los aislamientos de los complejos de

Fusarium oxysporum y de Fusarium solani (0,222) y entre los aislamientos de los

complejos de Fusarium incarnatum-equiseti y de Fusarium solani (0,238) y la posible

cercanía existente entre los miembros de los complejos de Fusarium oxysporum y

Fusarium incarnatum-equiseti, con una distancia registrada menor (0,163).

Adicionalmente estas relaciones se ven confirmadas con los bajos valores en la variación

estándar mostrada por las distancias de los diferentes complejos de especies analizados

de Fusarium (Tabla 7).

44

Las distancias genéticas obtenidas entre las secuencias de RPB2 evaluadas mostraron la

marcada distancia entre los aislamientos de los complejos de Fusarium oxysporum y de

Fusarium solani (0,161), y entre los miembros de los complejos de Fusarium incarnatum-

equiseti y de Fusarium oxysporum (0,159); en contraste se observó la poca distancia entre

los individuos de los complejos de Fusarium incarnatum-equiseti y de Fusarium solani

(0,034), lo que es consistente con los valores de desviación estándar de dichas distancias

genéticas entre los aislamientos de los diferentes complejos de especies (Tabla 8).

Al comparar los análisis de distancias genéticas para las secuencias de los dos genes, se

puede observar la incongruencia existente entre dichos resultados, ya que a diferencia de

la marcada distancia existente entre los tres complejos de especies identificados Fusarium

oxysporum, Fusarium solani y Fusarium incarnatum-equiseti por análisis de EF-1α, los

resultados de RPB2 muestran, además de menores valores de distancia, una marcada

cercanía entre los complejos de especies de Fusarium incarnatum-equiseti y de Fusarium

solani, debiéndose lo anterior muy posiblemente al bajo poder de resolución de este

marcador en el complejo de especies de Fusarium oxysporum que a su vez afecta las

distancias obtenidas entre los demás complejos de especies.

Tabla 7. Matriz de Distancias Genéticas de EF-1α.

Variación estándar

Distancias F. solani F. oxysporum F. incarnatum-equiseti

F. solani __ 0,021 0,021

F. oxysporum 0,222 __ 0,017

F. incarnatum-equiseti 0,238 0,163 __

Tabla 8. Matriz de Distancias Genéticas de RPB2.

Variación estándar

Distancias F. solani F. oxysporum F. incarnatum-equiseti

F. solani __ 0,011 0,005

F. oxysporum 0,161 __ 0,011

F. incarnatum-equiseti 0,034 0,159 __

45

5.3.4 Análisis de entropía de secuencias.

El alineamiento de las 59 secuencias de EF-1α fue editado manualmente en BioEdit y

reducido al tamaño de la secuencia más corta (673 pb), con el fin de obtener la gráfica de

entropía de las secuencias. Esta gráfica mostró claramente cuatro regiones con alto nivel

de entropía, denominadas Hot Spot (zonas calientes: zonas de alta variabilidad

nucleotídica), separadas por tres regiones de baja entropía. La última Hot Spot (extremo

3’) presentó mayor grado de entropía (Figura 4).

Las 59 secuencias codificantes de RPB2, igualmente fueron editadas manualmente con

BioEdit y posterior a su alineamiento se redujo su tamaño al de la secuencias más corta

(1643 pb), con el fin de obtener la gráfica de entropía. Ésta reveló el alto nivel de entropía

en el conjunto de secuencias analizadas, distribuido a lo largo de todo el alineamiento sin

destacar zonas de separación de bajo grado de entropía (Figura 5).

Figura 4. Grafica de Entropía de EF-1α y comparación con las zonas amplificadas.

46

Figura 5. Distribución de la localización de nucleótidos informativos a través de los

intrones y exones del gen EF-1α, de taxa analizados. Las flechas indican las únicas

sustituciones informativas dentro de los exones. Tomado y adaptado de O’Donnell y

colaboradores (1998).

Figura 6. Grafica de Entropía de RPB2 y comparación con las zonas amplificadas.

47

El análisis de secuencias mostró que el número de sitios monomórficos detectados en las

secuencias de EF-1α es mucho mayor (48 %) que los detectados en las secuencias de

RPB2 (39 %), sin embargo, es necesario considerar que el tamaño del fragmento de EF-

1α es de 716 pb aproximadamente, mientras el de RPB2 es de alrededor de 1879 pb. Esto

contrasta y ratifica la utilidad de estos marcadores. De igual manera, la proporción de los

sitios polimórficos de las secuencias de EF-1α fue más baja (23,5 %) en comparación a

los de RPB2 (33 %), pero esta baja proporción se contrarresta con el buen grado de sitios

parsimoniosamente informativos, del 68 % y 71 % para EF-1α y RPB2 respectivamente.

Además, se encontró que la proporción de singletones es baja y similar para los dos

conjuntos de secuencias, 7,5 % para EF-1α y 9,5 % para RPB2, al igual que el número de

InDel’s, 11,6 % y 11,8 % para EF-1α y RPB2 respectivamente. Las secuencias

permitieron la definición de un alto número de haplotipos, 55 para EF-1α con una

variabilidad haplotípica de 0,9977 y de 58 haplotipos para RPB2 con una variabilidad de

0,9994. Por otra parte las gráficas de entropía de los grupos de secuencias revelaron que

las zonas variables de EF-1α en su gran mayoría corresponden a exones, con algunas

pequeñas regiones de intrones. Caso contrario se observó en la gráfica de entropía de

RPB2, ya que 7 dominios (5-11), de los 12 que constituyen este gen, tuvieron un frecuente

nivel de entropía a lo largo de toda su secuencia.

5.4 Taxonomía molecular de aislamientos de Fusarium.

De acuerdo a los resultados obtenidos mediante la evaluación de diversos métodos

estadísticos de inferencia como lo son: Máxima Verosimilitud, Máxima Parsimonia e

Inferencia Bayesiana, el método de Neighbor-Joining es aquel que mejor representa las

relaciones existentes entre los aislamientos de los distintos complejos de especies

identificados; los resultados de los demás métodos son presentados en la sección de

anexos para su respectiva consulta.

El dendrograma construido por el método de Neighbor-Joining a partir de las secuencias

que codifican para EF-1α, agrupó cada aislamiento en uno de los tres principales

clústeres, I, II, y III, asociados con los complejos de Fusarium solani, Fusarium

oxysporum o Fusarium incarnatum-equiseti, respectivamente (Figura 7). Los miembros

identificados dentro del complejo de Fusarium solani clúster I, con soporte de boostrap

de 100 %, se agruparon en el sub-clúster I o sub-clúster II, con un soporte de boostrap de

48

87 % y de 99 % respectivamente. El sub-clúster I estuvo constituido por ocho

aislamientos, seis obtenidos de uñas de pie, un aislamiento de uña de mano (56321, mujer)

y un aislamiento de córnea (56988, hombre). El sub-clúster II con 17 aislamientos, de los

cuales 15 se obtuvieron de uñas de pie, uno de uña de mano (63749, hombre) y uno de

piel (56054, hombre) (Figura 7).

49

Figura 7. Dendrograma de la región EF-1α de 59 aislamientos clínicos de Fusarium

construido usando el método de Neighbor-Joining. Los porcentajes ≥ 50 % de bootstrap

(5000 réplicas) son mostrados en cada nodo. El dendrograma fue enraizado usando la

secuencia de EF-1α de Fusarium dimerum ET-grFD_01824, obtenida de la base de datos

Fusarium-ID.

F. incarnatum-equiseti 56665

63145F. oxysporum

57560F. oxysporum

55787F. oxysporum

63666F. oxysporum

55444F. oxysporum

63414F. oxysporum

55529F. oxysporum

55498F. oxysporum

57228F. oxysporum

58023F. oxysporum

56323F. oxysporum

55827F. oxysporum

55861F. oxysporum

62698F. oxysporum

62802F. oxysporum

55979F. oxysporum

63316F. oxysporum

55945F. oxysporum

55466F. oxysporum

63649F. oxysporum

55583F. oxysporum

63768F. oxysporum

55762F. oxysporum

57721F. oxysporum

56363F. oxysporum

56212F. oxysporum

55585F. oxysporum

55496F. oxysporum

56094F. oxysporum

55588F. oxysporum

57885F. oxysporum

63613F. oxysporum

56320F. oxysporum

57335F. solani

63917F. solani

56301F. solani

55347F. solani

63447F. solani

56868F. solani

55349F. solani

56604F. solani

63200F. solani

56054F. solani

63635F. solani

56780F. solani

57949F. solani

56891F. solani

56337F. solani

63749F. solani

56340F. solani

56321F. solani

56988F. solani

58025F. solani

57221F. solani

56894F. solani

65068F. solani

64765F. solani

56240F. solani

F. dimerum

96

6687

89

99

8558

54

54

52

90

100

99

98

8875

7268

57

99

55

85

72

61

87

100

59

Localización de lesión Convención

Uña pie

Uña mano

Piel

Cornea

Abdomen

Desconocido

Sub

-clu

ster

IS

ub-c

l us t

er I I

Su b

- cl u

s te r

III

Su b

- cl u

s te r

IVC

l us t

e r I

Cl u

ster

II

Cluster III

50

Los aislamientos identificados como miembros del complejo de Fusarium oxysporum

clúster II, también con un soporte de boostrap del 100 %, se agruparon dentro del sub-

clúster III o IV. El sub-clúster III incluyó 27 aislamientos, 22 obtenidos de uñas de pie,

uno de uña de mano (63613, mujer), uno de piel (55588, mujer), uno de córnea (55979,

hombre), uno de abdomen (62698, mujer) y un aislamiento de origen desconocido (5558,

hombre), con soporte de boostrap de 90 %. El sub-clúster IV estuvo compuesto por seis

aislamientos, cinco obtenidos de uñas de pie y uno de uña de mano (63666, mujer), con

valor de boostrap de 99 %. Finalmente, el clúster III estuvo definido por un único

aislamiento (56665) identificado en el complejo de especies de Fusarium incarnatum-

equiseti y procedente de la piel de una mujer, con un soporte estadístico de boostrap de

59 % (Figura 7). Es de considerar que en ninguno de los clústeres o sub-clústeres

formados se observa la agrupación de los aislamientos basados en el tejido afectado ni

por el género del paciente (Figura 7).

En el caso del dendrograma que describe la relación de las secuencias codificantes para

RPB2 de los 59 aislamientos, obtenido por el método de Neighbor-Joining se encontró la

formación de dos clústeres. El clúster I, conformado por los sub-clústeres I, II, II, contiene

la mayoría de los aislamientos de Fusarium solani, tal como el clúster I de la Figura 7,

además de 12 de los aislamientos del complejo de Fusarium oxysporum, en el sub-clúster

I se encuentran 17 aislamientos de Fusarium oxysporum y un aislamiento de Fusarium

oxysporum; en el sub-clúster II se encuentra conformado en su mayoría por 10

aislamientos de Fusarium oxysporum, junto con siete aislamientos de Fusarium solani y

el único aislamiento del complejo Fusarium incarnatum-equiseti y el sub-clúster III se

encuentra conformado por un único aislamiento del complejo Fusarium oxysporum. El

clúster II en su mayoría incluyó aislamientos de Fusarium oxysporum, los cuales se

encuentra distribuidos en dos sub-clúster, el sub-clúster IV contiene seis aislamientos de

Fusarium oxysporum y un único aislamiento de Fusarium oxysporum, por su parte el sub-

clúster V está compuesto en su totalidad por 15 aislamientos de Fusarium oxysporum. El

sub-clúster I constituido por 18 aislamientos, 15 de ellos obtenidos de uñas de pies, dos

obtenidos de piel (56321 y 56054 mujeres) y uno de uña de mano (63749 hombre), con

un soporte de estadístico alto de boostrap de 95 %, mostró de manera clara la agrupación

de 17 (68 %) de los aislamientos identificados como miembros del complejo de Fusarium

51

solani en comparación a los 25 aislamientos del clúster I de la Figura 7, además de uno

de los 33 aislamientos identificados como miembros del complejo de Fusarium

oxysporum. El sub-clúster II constituido por 18 aislamientos, de los cuales 15

aislamientos se obtuvieron de uñas de pies, uno de uña de mano (63666, mujer), uno de

córnea (56988, hombre) y el único aislamiento del complejo de Fusarium incarnatum-

equiseti aislado de la piel de una mujer, estuvo soportado por un valor de boostrap de 75

%, y constituido por la presencia de diferentes miembros de los tres complejos de especies

identificados en este trabajo; 11 (33 %) del complejo de Fusarium oxysporum, siete (28

%) de los aislamientos del complejo de Fusarium solani y el único aislamiento

identificado como miembro del complejo de especies de Fusarium incarnatum-equiseti.

El sub-clúster III constituido por un aislamiento del complejo de especies de Fusarium

oxysporum y obtenido de uña de pie (62802, mujer) posee una valor de soporte de

boostrap de 88 %. El sub-clúster IV se encuentra constituido por cinco aislamientos del

complejo de especies de Fusarium oxysporum, junto con un aislamiento del complejo de

especies de Fusarium solani, obtenido de uña de pie (56604, mujer), este sub-clúster

además presenta un soporte de boostrap de 51 %. El sub-clúster V se encuentra

constituido en su totalidad por 15 aislamientos del complejo de especies de Fusarium

oxysporum, en donde siete de dichos aislamientos fueron obtenidos de uñas de pie, un

aislamiento de uña de mano (61613, mujer) un aislamiento de piel (55588, mujer) un

aislamiento de córnea (55979, hombre), un aislamiento de abdomen (62698, hombre) y

un aislamiento de origen desconocido (55582, hombre), este clúster presenta soporte de

boostrap de 100 %. Es importante resaltar que al igual como se observó en el árbol

obtenido por las secuencias de EF-1α, no se evidenció una relación de las agrupaciones

resultantes con base en el tejido infectado y/o el género del paciente (Figura 8).

52

Figura 8. Dendrograma de la región RPB2 de 59 aislamientos clínicos de Fusarium

construido usando el método de Neighbor-Joining. Los porcentajes ≥ 50 % de bootstrap

(5000 réplicas) son mostrados en cada nodo. El dendrograma fue enraizado usando la

secuencia de EF-1α de Fusarium dimerum ET-grFD_01824, obtenida de la base de datos

Fusarium-ID.

F. 63635solani

F. 55349solani

F. 56301solani

F. 56868solani

F. 63200solani

F. 56780solani

F. 56321solani

F. 56891solani

F. 57335solani

F. 63917solani

F. 55347solani

F. 63447solani

F. 57949solani

F. 56054solani

F. 58023oxysporum

F. 56337solani

F. 56340solani

F. 63749solani

F. 58025solani

F. 63414oxysporum

F. 55444oxysporum

F. 55945oxysporum

F. 57228oxysporum

F. 56323oxysporum

F. 55466oxysporum

F. 63666oxysporum

F. 56665incarnatum-equiseti

F. 56988solani

F. 55496oxysporum

F. 57221solani

F. 57721oxysporum

F. 64765solani

F. 56894solani

F. 56212oxysporum

F. 56240solani

F. 65068solani

F. 62802oxysporum

F. 56604solani

F. 55585oxysporum

F. 56320oxysporum

F. 55827oxysporum

F. 55529oxysporum

F. 55498oxysporum

F. 63613oxysporum

F. 56363oxysporum

F. 55861oxysporum

F. 55762oxysporum

F. 63768oxysporum

F. 55583oxysporum

F. 63145oxysporum

F. 55979oxysporum

F. 57560oxysporum

F. 63649oxysporum

F. 55588oxysporum

F. 56094oxysporum

F. 62698oxysporum

F. 63316oxysporum

F. 57885oxysporum

F. 55787oxysporum

F. dimerum

100

60

100

5458

60

52

100

71100

100

9196

100

100

100

8299

98

63

53

72

7063

5056

95

92

90

81

75

94

88

71

51

F.

Sub

-clu

ster

V

Sub

-clu

ster

II

Sub

-clu

ster

I

Localización de lesión Convención

Uña pie

Uña mano

Piel

Cornea

Abdomen

Desconocido

Sub-cluster III

Sub

-clu

ster

IV

Cl u

ster

II

Clu

ster

I

53

Al momento de obtener el dendrograma por el método de Neighbor-Joining basado en la

concatenación de las secuencias de EF-1α y RPB2, para los 33 aislamientos identificados

como miembros de complejo de especies de F. oxysporum y definidos como Cluster II

(Figura 7), se logra apreciar claramente la fragmentación de los diferentes sub-cluster; de

esta manera se ve alternada la agrupación de los miembros de Sub-cluster III sub Sub-

cluster IV, incluso con secuencias usadas como grupo externo al complejo de especies de

F. oxysporum, como F. chlamydosporum y Gibberella fujikuroi. Además es importante

resaltar los altos valores de boostrap que soportan dichas agrupaciones, siendo para todas

ellas de 99 % (Figura 9).

54

Figura 9. Dendrograma consenso de la concatenación de las secuencias de las regiones

EF-1α y RPB2 de 33 aislamientos clínicos del complejo de especies Fusarium oxysporum

construido usando el método de Neighbor-Joining. Los porcentajes de bootstrap (5000

réplicas) son mostrados en cada nodo. El árbol fue enraizado usando las secuencias de

EF-1α y RPB2 de Fusarium dimerum ET-grFD_01824, junto con la presencia de

secuencias de referencia obtenidas de la base de datos Fusarium-ID.

F. oxysporum 55945

F. oxysporum 55466

F. oxysporum 56323

F. oxysporum 57228

F. oxysporum 63414

F. oxysporum 55444

56665F. incarnatum-equiseti

F. oxysporum 63666

F. oxysporum 58023

55496F. oxysporum

F. oxysporum 56212

F. oxysporum 57721

62802F. oxysporum

Fusarium chlamydosporum

F. oxysporum 55498

F. oxysporum 63613

F. oxysporum 55529

55585F. oxysporum

F. oxysporum 56320

F. oxysporum 55827

Gibberella fujikuroi

F. oxysporum 55583

F. oxysporum 55762

F. oxysporum 63768

F. oxysporum 55861

F. oxysporum 56363

F. oxysporum 62698

F. oxysporum 63316

F. oxysporum 63145

F. oxysporum 55787

F. oxysporum 57560

F. oxysporum 55979

F. oxysporum 56094

F. oxysporum 57885

F. oxysporum 55588

F. oxysporum 63649

Fusarium dimerum

100

9467

99

100

100

100

99

76

45

47

65

97

47

62

99

99

93

99

5597

3531

42

42

42

40

99

54

0.05

Sub-cluster I

Sub-cluster IV

Sub

-clu

ster

VS

ub-c

lust

er V

Sub

-clu

ster

IV

Sub

-clu

ster

IIS

ub- c

lust

er II

Localización de lesión Convención

Uña pie

Uña mano

Piel

Cornea

Abdomen

Desconocido

EF-1α + RPB22420 pb

Sub-cluster III

Sub-cluster II

55

En el caso del dendrograma obtenido para los 25 aislamientos identificados como

miembros del complejo de especies de Fusarium solani, usando el método de Neighbor-

Joining y con base en la concatenación de las secuencias de EF-1α y RPB2, se logra

convalidar las agrupaciones obtenidas para todos los aislamientos del Cluster I definido

por el análisis de Neighbor-Joining de las secuencias de EF-1α a la totalidad de

aislamientos identificados en el presente trabajo (Figura 7); tanto las relaciones de los

miembros del Sub-cluster I como el Sub-cluster II se ven soportadas por altos valores de

boostrap, siendo de 75 % para el Sub-Cluster II y del 95 % para el Sub-Cluster I, al estar

en presencia de secuencias de referencia de miembros de los diferentes complejos de

especie de Fusarium sp de importancia clínica (Figura 10).

56

Figura 10. Dendrograma consenso de la concatenación de las secuencias de las regiones

EF-1α y RPB2 de 25 aislamientos clínicos del complejo de especies Fusarium solani

construido usando el método de Neighbor-Joining. Los porcentajes de bootstrap (5000

réplicas) son mostrados en cada nodo. El árbol fue enraizado usando las secuencias de

EF-1α y RPB2 de Fusarium dimerum ET-grFD_01824, junto con la presencia de

secuencias de referencia obtenidas de la base de datos Fusarium-ID.

F. solani 63447

55347F. solani

F. solani 63917

57335F. solani

56301F. solani

F. solani 56868

F. solani 63200

55349F. solani

56780F. solani

F. solani 63635

56054F. solani

F. solani 57949

F. solani 56340

F. solani 63749

F. solani 56337

F. solani 56891

F. solani 56604

58025F. solani

F. solani 56988

F. solani 57221

F. solani 56894

F. solani 65068

F. solani 56240

F. solani 64765

56321F. solani

56665F. incarnatum-equiseti

Fusarium chlamydosporum

Gibberella fujikuori

Fusarium dimerum

34

57

100

100

100

99

8999

94

95

82

67

89

4549

30

28

73

72

59

75

70

47

49

0.05

Sub

-clu

ster

I

Sub

-clu

ster

II

Clu

ster

I

Localización de lesión Convención

Uña pie

Uña mano

Piel

Cornea

Abdomen

Desconocido

EF-1α + RPB22420 pb

57

Al establecer una comparación de los diferentes dendrogramas obtenidos por el método

de Neighbor-Joining, se puede observar que el dendrograma basado en las secuencias de

EF-1α genera claramente la formación de los tres clústeres, basados en los tres complejos

de especies identificados mediante análisis de BLAST para secuencias de EF-1α,

viéndose un alto soporte estadístico de las réplicas de boostrap (100 %) para los

aislamientos reconocidos como miembros de los complejos de Fusarium solani (Clúster

I) y de Fusarium oxysporum (Clúster II) y un moderado valor estadístico (59 %) para el

miembro del complejo de especies de Fusarium incarnatum-equiseti (Clúster III) en el

dendrograma de EF-1α; en el caso de las representaciones de las relaciones obtenidas por

el método de Neighbor-Joining, con base en las secuencias de RPB2 para la totalidad de

los aislamientos objeto del presente trabajo, se observa que a pesar de que no existe un

grado de correspondencia aceptable, se genera la agrupación de los aislamiento con base

a su identidad en clúster y sus respectivos sub-clústeres con altos valores de boostrap para

las secuencias analizadas de este gen (Figura 11).

58

Figura 11. Comparación de los dendrogramas construidos bajo el método de Neighbor-

Joining. A. Dendrograma de EF-1α y B. Dendrograma de RPB2.

Al momento de concatenar y alinear las secuencias de los genes EF-1α y RPB2 se obtuvo

un grupo de datos con una longitud de 2420 pb para cada uno de los 59 aislamientos

clínicos. Este grupo de secuencias fue objeto de un análisis de Neighbor-Joining con el

fin de estimar las relaciones de dichos aislamientos con base a la previa identificación y

asignación de complejos de especies en la base datos Fusarium-ID. A diferencia de la

F. incarnatum-equiseti 56665

63145F. oxysporum

57560F. oxysporum

55787F. oxysporum

63666F. oxysporum

55444F. oxysporum

63414F. oxysporum

55529F. oxysporum

55498F. oxysporum

57228F. oxysporum

58023F. oxysporum

56323F. oxysporum

55827F. oxysporum

55861F. oxysporum

62698F. oxysporum

62802F. oxysporum

55979F. oxysporum

63316F. oxysporum

55945F. oxysporum

55466F. oxysporum

63649F. oxysporum

55583F. oxysporum

63768F. oxysporum

55762F. oxysporum

57721F. oxysporum

56363F. oxysporum

56212F. oxysporum

55585F. oxysporum

55496F. oxysporum

56094F. oxysporum

55588F. oxysporum

57885F. oxysporum

63613F. oxysporum

56320F. oxysporum

57335F. solani

63917F. solani

56301F. solani

55347F. solani

63447F. solani

56868F. solani

55349F. solani

56604F. solani

63200F. solani

56054F. solani

63635F. solani

56780F. solani

57949F. solani

56891F. solani

56337F. solani

63749F. solani

56340F. solani

56321F. solani

56988F. solani

58025F. solani

57221F. solani

56894F. solani

65068F. solani

64765F. solani

56240F. solani

F. dimerum

96

6687

89

99

8558

54

54

52

90

100

99

98

8875

7268

57

99

55

85

72

61

87

100

59

Localización de lesión Convención

Uña pie

Uña mano

Piel

Cornea

Abdomen

Desconocido

Sub

-clu

ster

IS

ub-c

lust

er II

Sub

-clu

ster

III

Sub

-clu

ster

IVC

lust

er I

Clu

ster

II

Cluster IIIAB

63635F. solani

55349F. solani

56301F. solani

56868F. solani

63200F. solani

56780F. solani

56321F. solani

56891F. solani

57335F. solani

63917F. solani

55347F. solani

63447F. solani

57949F. solani

56054F. solani

58023F. oxysporum

56337F. solani

56340F. solani

63749F. solani

58025F. solani

63414F. oxysporum

55444F. oxysporum

55945F. oxysporum

57228F. oxysporum

56323F. oxysporum

55466F. oxysporum

63666F. oxysporum

56665F. incarnatum-equiseti

56988F. solani

55496F. oxysporum

57221F. solani

57721F. oxysporum

64765F. solani

56894F. solani

56212F. oxysporum

56240F. solani

65068F. solani

62802F. oxysporum

56604F. solani

55585F. oxysporum

56320F. oxysporum

55827F. oxysporum

55529F. oxysporum

55498F. oxysporum

63613F. oxysporum

56363F. oxysporum

55861F. oxysporum

55762F. oxysporum

63768F. oxysporum

55583F. oxysporum

63145F. oxysporum

55979F. oxysporum

57560F. oxysporum

63649F. oxysporum

55588F. oxysporum

56094F. oxysporum

62698F. oxysporum

63316F. oxysporum

57885F. oxysporum

55787F. oxysporum

F. dimerum

100

60

100

5458

60

52

100

71100

100

9196

100

100

100

8299

98

63

53

72

7063

5056

95

92

90

81

75

94

88

71

51

Sub-cluster V

Sub-cluster II

Sub-cluster I

Localización de lesión Convención

Uña pie

Uña mano

Piel

Cornea

Abdomen

Desconocido

Sub-cluster IIIS

ub-cluster IV

Cluster II

Cluster I

59

clara agrupación de los distintos aislamientos con base a la pertenencia de los distintos

complejos de especies obtenidos en la gráfica 7, este análisis no permite soportar de

manera eficiente el Sub-cluster I que agrupa los aislamientos identificados en el complejo

de especies de F. solani, debido específicamente al incorrecto soporte estadístico del

aislamiento 56321 (Uña de mano; Mujer); en cuanto al Sub-cluster II y el correspondiente

Cluster I se observan altos valores de soporte de nodo, siendo estos de 77 % y 100 %

respectivamente. En el caso del Cluster II y los Sub-cluster III y Sub-cluster IV que lo

componen no se observa un adecuado soporte estadístico de dichos sub-cluster, pero de

manera contraria se registra un alto valor de soporte para el Cluster I siendo este de 92 %

que contiene a los miembros del complejo de especies de F. oxyporum. En el caso de

Cluster III compuesto por el único aislamiento miembro del complejo de especies de F.

incarnatum-equiseti este se encuentra soportado con un valor de estadístico de nodo de

60 %, pero con la particularidad de que también soporta al aislamiento F. dimerum, usado

como grupo externo (Figura 12).

60

Figura 12. Dendrograma consenso de la concatenación de las secuencias de las regiones

EF-1α y RPB2 de 59 aislamientos clínicos de Fusarium construido usando el método de

Neighbor-Joining. Los porcentajes ≥ 50 % de bootstrap (5000 réplicas) son mostrados

en cada nodo. El árbol fue enraizado usando las secuencias de EF-1α y RPB2 de Fusarium

dimerum ET-grFD_01824, obtenida de la base de datos Fusarium-ID.

56094F. oxysporum

63649F. oxysporum

57885F. oxysporum

55979F. oxysporum

62698F. oxysporum

63316F. oxysporum

55861F. oxysporum

55762F. oxysporum

55583F. oxysporum

63768F. oxysporum

55588F. oxysporum

56363F. oxysporum

63145F. oxysporum

57560F. oxysporum

55787F. oxysporum

55498F. oxysporum

63613F. oxysporum

55529F. oxysporum

55827F. oxysporum

55585F. oxysporum

56320F. oxysporum

62802F. oxysporum

55496F. oxysporum

56212F. oxysporum

57721F. oxysporum

63666F. oxysporum

63414F. oxysporum

55444F. oxysporum

57228F. oxysporum

56323F. oxysporum

55945F. oxysporum

55466F. oxysporum

58023F. oxysporum

56240F. solani

64765F. solani

65068F. solani

56894F. solani

57221F. solani

56988F. solani

58025F. solani

56321F. solani

56340F. solani

63749F. solani

56337F. solani

56891F. solani

56054F. solani

57949F. solani

56604F. solani

63200F. solani

55349F. solani

56780F. solani

63635F. solani

63447F. solani

55347F. solani

63917F. solani

56868F. solani

56301F. solani

57335F. solani

F. incarnatum-equiseti 56665

F. dimerum

100

100

100

53

62

100

99

99

97

95

84

76

93

73

69

77

63

100

6399

72

57

95

100

100

9994

100

100

100

9175

98

97

93

72

72

59

92

92

60

Cluster III

Sub

-clu

ster

IS

ub-c

lust

er II

Clu

ster

IS

ub-c

lust

er IV

Sub

-clu

ster

IVS

ub-c

lust

er II

IS

ub-c

lust

er II

IS

ub-c

lust

er II

I Clu

ster

II

Localización de lesión Convención

Uña pie

Uña mano

Piel

Cornea

Abdomen

Desconocido

EF-1α + RPB22420 pb

61

5.5 Correlación de especies de Fusarium con variables epidemiológicas

En el periodo comprendido entre el 2004 y el 2006 se obtuvieron, en la Unidad de

Micología Médica y Experimental (MME) de la Corporación para Investigaciones

Biológicas (CIB), 59 aislamientos de hongos compatibles con el género Fusarium,

procedentes de lesiones de 59 pacientes. En la tabla 3 se relaciona el género del paciente

con la especie de Fusarium identificada a partir de la secuencia parcial del gen EF-1α en

la base de datos Fusarium-ID, (Tabla 3) y la localización de la lesión. Las especies del

genero Fusarium son reconocidas principalmente como agentes causales de onicomicosis

en humanos, razón que explica que el 88.13 % de los aislamientos provengan de lesiones

de uñas y, se presenten en mayor proporción en mujeres (76,27 %), que manifestaron

realizarse frecuentemente el arreglo de uñas en centros de belleza.

Tabla 9: Especies de Fusarium de aislamientos clínicos y localización de la lesión entre

la población femenina y masculina incluida en este estudio.

Género Localización de la lesión Complejo de especies Número de aislamientos

Femenino

Piel F. oxysporum 1

F. incarnatum-equiseti 1

Uña mano F. oxysporum 2

F. solani 1

Uña pie F. oxysporum 22

F. solani 18

Total mujeres 45

Masculino

Abdomen F. oxysporum 1

Córnea F. oxysporum 1

F. solani 1

Desconocido F. oxysporum 1

Piel F. solani 1

Uña pie F. oxysporum 5

F. solani 3

Uña mano F. solani 1

Total hombres 14

Total muestras 59

62

El complejo de especies F. oxysporum se destacó como el complejo más frecuentemente

detectado tanto en hombres como en mujeres, seguida por el complejo de especies F.

solani. La proporción de estos dos complejos se mantuvo aproximadamente constante en

mujeres y hombres. Así, de un total de 45 aislamientos en mujeres, 25 pertenecen al

complejo F. oxysporum y 19 al complejo F. solani; y de un total de 14 aislamientos en

hombres, 8 al complejo F. oxysporum y 6 corresponden al complejo F. solani. El

complejo de especies F. solani se destaca porque en hombres fue causante de tres tipos

de lesiones en localizaciones diferentes (córnea, piel y uñas), mientras en mujeres solo de

una (Figura 7).

63

6. DISCUSIÓN

6.1 Identificación molecular a nivel de género y especie de aislamientos clínicos de

Fusarium

El principal objetivo de este trabajo fue estudiar la taxonomía y variabilidad de 59

aislamientos clínicos de Fusarium sp. por secuenciación de las regiones que codifican

para el factor de elongación de la traducción 1α (EF-1α) y la segunda subunidad de la

ARN polimerasa II (RPB2). Estos loci fueron elegidos debido a que poseen una mayor

diversidad nucleotídica comparado con otros loci como Calmodulina, IGS, ITS 1 y 2

(O’Donnell et al., 2009).

Las regiones codificantes de proteínas, a partir de ADN nuclear, implicadas en procesos

celulares vitales y altamente conservados han sido ampliamente usadas en la

identificación de diferentes microorganismos; particularmente, en la identificación de

especies de Fusarium se han usado las regiones ITS, β-tubulina, Calmodulina y las

regiones 28S y 5.8S del ADN ribosomal (Hennequin et al., 1999; Balajee et al., 2007;

Dyavaiah et al., 2007).

En la actualidad las regiones más utilizadas para la identificación de Fusarium a nivel de

especie son el gen del factor de elongación de la traducción 1α (EF-1α), y los genes de

la segunda subunidad mayor de la ARN polimerasa II (RPB2 y RPB1). Otras regiones

también estudiadas con fines de identificación a nivel de especie incluyen, genes de

apareamiento (MAT), genes que codifican para la Celobiosa-C y la Topoisomerasa II, el

gen que codifica para la β-tubulina, Calmodulina, entre otros (Atkins y Clark, 2004.,

Hatsch et al., 2004; Hinojo et al., 2004; Wilson et al., 2004; Bogale et al., 2006; Dyavaiah

et al., 2007; Alustrey-Izquierdo et al., 2008). Esto, demostrando la poca utilidad de las

regiones ribosomales para la identificación de Fusarium a nivel de especie, ya que son

demasiado conservadas y por la tanto tienen menor capacidad de resolución y han

generado taxonomías y filogenias erróneas y junto con ello el bajo grado de confiabilidad

64

en procesos de identificación (Sakai et al., 2006; Dyavaiah et al., 2007; Zaccardelli et al.,

2008).

La identificación molecular a nivel de complejo de especies mediante análisis BLAST en

la base de datos de Fusarium-ID, se construyó como respuesta a la imperante necesidad

de determinar la especie de aislamientos de Fusarium de importancia toxigenica y clínica,

antes reconocidas solo por caracteres morfológicos (Geiser et al., 2004). En sus inicios

esta base de datos conto únicamente con secuencias correspondientes al gen EF-1α; que

es a la fecha el mejor marcador molecular para identificar aislamientos de Fusarium, pero

a medida que aumentó la facilidad en los procesos de secuenciación, aumentó el número

de aislamientos y el número de marcadores empleados en la identificación, como son

RPB2, RPB1, IGS, ITS1, ITS2, ADNr (Geiser et al., 2004).

Al momento de comparar las secuencias codificantes para el factor de elongación de la

traducción EF-1α de los 59 aislamientos de Fusarium sp por medio de la herramienta

BLAST en la base de datos Fusarium-ID, se logró determinar que los aislamientos

pertenecen a uno de tres complejos de especies, F. oxysporum, F. solani y F. incarnatum-

equiseti¸ con altos valores estadísticos de soporte (Figura 6, Tabla 3). La mayoría de ellos,

33, se ubicaron en el complejo Fusarium oxysporum, seguido por 22 en el complejo de

especies de Fusarium solani. Estos datos, concuerdan con los reportados por Giraldo, en

2010 que detectó por PCR 52 y 28 aislamientos de los complejos de especies de Fusarium

oxysporum y de Fusarium solani, respectivamente, a partir de un total de 101 aislamientos

de Fusarium.

Las secuencias codificantes para la segunda subunidad de la ARN polimerasa II (RPB2)

al ser analizadas por la herramienta BLAST en la base de datos de referencia Fusarium-

ID, identificaron 42 aislamientos como miembros del complejo de especies F. solani y

17 como F. staphyleae. (Figura 11, Tabla 3).

Sin embargo, las secuencias de EF-1α presentaron mayores valores de identidad absoluta

en comparación a los registrados por las secuencias de RPB2, además la diferencia entre

los valores máximos y mínimos de porcentaje identidad fue menor en la secuencias de

65

EF-1α, de igual manera los registros (score) de coincidencia de identidad de todas las

secuencias de EF-1α fueron el máximo posible obtenido, en comparación con lo

observado con las secuencias de RPB2, cinco del total de la secuencias confrontadas,

mostraron valores demasiado inferiores de coincidencia con las secuencias dispuestas o

de referencia en la base datos Fusarium-ID; al igual que lo observado. Con respecto a los

valores de E todas las secuencias de EF-1α obtuvieron valores de 0, que indica que la

posibilidad de observar cambios o múltiples coincidencias en la búsqueda es nula, de

manera contraria las mismas cinco secuencias de RPB2 mostraron altos valores de cambio

o coincidencia múltiple en los procesos de búsqueda lo que conlleva a bajos niveles de

confiabilidad (Tabla 3); adicionalmente valores de similitud (score), revelan niveles de

coincidencia de la secuencia consulta frente a las secuencias de referencia dispuestas en

dicha base de datos, obteniéndose los máximos valores posibles, siendo de 999.99 y E

(Expect = Esperado), lo cual indica la posibilidad de cambio o coincidencia múltiple de

secuencias, durante la búsqueda en la ya mencionada base datos es nula y cuyo valor

máximo es 0, siendo similar para todos los aislamientos identificados, correspondiendo a

valores de 999.99 y 0 respectivamente (Tabla 3). Todo lo anterior puede ser debido a la

posible presencia de variantes alélicas, existencia de nuevas especies, falta de una

secuencia representativa en la base de datos o a que la secuencia consulta no se encuentra

bien definida o al bajo grado de resolución (Geiser et al., 2004), este último factor ya se

ha reportado a nivel del complejo de especies de Fusarium oxysporum (O’Donnell et al.,

2007).

El gen nuclear del factor de elongación de la traducción 1-α (EF-1 α), codifica una parte

esencial de la maquinaria de traducción proteica, dicho gen codifica una proteína G que

hace entrega del aminoacil-tRNA al sitio A del ribosoma, durante el proceso de

traducción de proteínas. La estructura primaria del EF-1α es altamente conservada entre

todos los eucariotas y procariotas, además se ha identificado como una de las proteínas

de mayor abundancia en eucariotas (más del 5 % del total de proteínas del citosol)

(Mateyak y Kinzy, 2010; Eltschinger et al., 2012).

La utilidad de EF-1α se basa en que cerca del 6 % de los nucleótidos que lo conforman

son considerados cladísticamente significativos (39/656 nucleótidos), el 95 % de estos

66

nucleótidos se encuentran en regiones exónicas, en donde se han detectado procesos de

transición de bases, lo que genera un 50 % más de información que otros genes usados

en Fusarium, tal como mtSSU, β-tubulina, Calmodulina, que le otorga un mayor nivel de

confianza y utilidad (Geiser et al., 2004). Todo lo anterior al parecer indica que el gen

EF-1α ha estado bajo pocas restricciones evolutivas, como se deduce de los patrones de

mutación que incluyen delecciones de bases (O’Donnell et al., 1998; Kristensen et al.,

2005). Otra ventaja del gen EF-1α es que este se presenta en una única copia en el genoma

de Fusarium (Geiser et al., 2004).

Como consecuencia de las características de EF-1α y de los resultados obtenidos en la

identificación de los aislamientos del presente trabajo, se mantuvo las identidades de

dichos aislamientos con base en este gen y no las determinadas por RPB2, justificado lo

anterior en los observaciones hechas por Balajee y colaboradores en 2009, en donde

demuestran la cuestionada y baja utilidad de este marcador en la identificación y uso en

técnicas de tipificación de secuencias multilocus, específicamente en miembros de

complejo de especies de Fusarium oxysporum (Balajee et al., 2009).

Diferentes autores han demostrado la complejidad genética del género Fusarium, que

sustenta el hallazgo de un gran número de especies filogenéticas dentro los complejos de

especies F. solani, F. graminearum y F. oxysporum (O´Donnell et al., 2004; Bogale et

al., 2006; Leslie y Summerell, 2006; O´Donnell et al., 2008; Balajee et al., 2009).

Además, varios de estos complejos son polifiléticos. Este hecho explica que, aislamientos

que pertenecen a un mismo complejo de especies de F. oxysporum o de F. solani pueden

tener grandes diferencias genéticas, producto de orígenes filogenéticos diferentes

(Nelson et al., 1994; González et al., 2009; Bogale et al., 2006, 2007; Leslie et al., 2007;

O´Donnell et al., 2008; Balajee et al., 2009). Es posible que muchos o algunos de los

aislamientos del complejo de especies F. oxysporum y F. solani obtenidos en este estudio

provengan de linajes diferentes, lo que explicaría que los dendrogramas y/o árboles

arrojen politomias difíciles de resolver, excepto por el método de Inferencia Bayesiana y

de Neighbor-Joining. Aunque, este trabajo no buscaba hacer un análisis de la filogenia de

los aislamientos de Fusarium, sí se tuvo en cuenta en el análisis de las secuencias, con el

fin de determinar si podría soportar los taxa determinados. En el caso específico de los

67

análisis de las secuencias de EF-1α se pudo observar una gran congruencia entre el

dendrograma obtenido por Neighbor-Joining y el árbol obtenido por métodos bayesianos,

ya que se observó una total correspondencia entre los clústeres y clados junto con sus

respectivos sub-clústeres y sub-clados soportado por altos valores estadísticos cuando se

comparó estos métodos con el grupo de secuencias de RPB2, no se observó una

correspondencia clara con respecto a los clústeres y clados obtenidos, ni con sus sub-

clústeres y sub-clados respectivamente. El dendrograma obtenido por el método de

Neighbor-Joining mostró la formación de dos clúster y el árbol obtenido por métodos

bayesianos generó cinco clados; sin embargo a pesar de estas incongruencias, las distintas

agrupaciones contienen los miembros de los diferentes complejos de especies

reconocidos en el presente trabajo, con altos soportes estadísticos.

6.2 Variabilidad evolutiva y análisis de secuencias

La proporción de sitios monomórficos y polimórficos observados en los análisis del grupo

de secuencias de los marcadores EF-1α y RPB2, sugirió una mayor variabilidad de las

secuencias de RPB2, quizás más útil en la discriminación de miembros de complejos

especies estrechamente cercanos y difíciles de diferenciar con otras secuencias. Este gen

RPB2 evidenció el alto grado de diversidad de la muestra clínica evaluada en este estudio,

dentro de los complejos de especie de Fusarium, quizás debida a que los pacientes llegan

a este laboratorio de Micología Médica remitidos por diferentes Entidades Promotoras de

Salud (Tabla 4).

La estimación de probabilidad compuesta de patrones de sustitución de nucleótidos en

los dos conjuntos de secuencias de EF-1α y RPB2 permitió observar el alto porcentaje de

probabilidad para los fenómenos de transición, cerca del doble respecto a la transversión,

específicamente entre pirimidinas Citosina (C) y Timina (T), tanto para EF-1α como para

RPB2. Estos datos corroboran los altos niveles de entropía observados para estos grupos

de secuencias nucleotídicas, que no afectan en gran medida la secuencia aminoacídica

final, ni la funcionalidad de estas proteínas, específicamente, reportado al nivel de los

ascomicetos (Liu et al., 1999; Hibbett et al., 2007) y específicamente en Fusarium (Chang

68

et al., 2006; Balajee et al., 2007; O’Donnell et al., 2007; O’Donnell et al., 2008;

O’Donnell et al., 2010; Park et al., 2010).

Con relación a los valores resultantes de las matrices de distancias genéticas obtenidas a

partir de las secuencias de EF-1α, se encontró una clara separación de los miembros de

los tres complejos de especies Fusarium oxysporum, Fusarium solani y Fusarium

incarnatum-equiseti, especialmente entre los complejos Fusarium oxysporum - Fusarium

solani y Fusarium solani - Fusarium incarnatum-equiseti y la relativa baja distancia entre

los complejos Fusarium oxysporum y Fusarium incarnatum-equiseti (0,163) lo que

sugiere una cercana relación entre estos complejos, datos que se respaldan por los análisis

de O’Donnell y colaboradores en 2009, en donde se usan secuencias de los genes EF-1α,

RPB2, RPB1, β-tubulina, Calmodulina, y diferentes regiones ribosomales, siendo

evaluada la utilidad de cada uno de estos marcadores moleculares en diferentes complejos

de especies de Fusarium de importancia clínica por Balajee y colaboradores 2009

(Balajee et al., 2009).

Al estimar las distancias genéticas de los diferentes complejos de especies mediante las

secuencias codificantes de RPB2, se encontró que la distancia obtenida entre los

complejos Fusarium oxysporum y Fusarium solani son menores a las reportadas por las

secuencias del EF-1α (0,161); igualmente la distancia obtenida entre los complejos

Fusarium solani y Fusarium incarnatum-equiseti (0,034) fue menor a los obtenida con

las secuencias de EF-1α, lo que contrasta con los altos valores de distancias entre los

complejos Fusarium oxysporum y Fusarium incarnatum-equiseti, que indica y reitera la

moderada-baja utilidad que poseen las secuencias del gen RPB2 en la identificación de

individuos pertenecientes al complejo de especies de Fusarium oxysporum (Balajee et al.,

2009).

Los niveles de entropía revelados en los alineamientos realizados al conjunto de

secuencias de EF-1α, demuestran la presencia de cuatro zonas de alto grado de entropía

bien definidas y separadas por tres regiones de alto grado de conservación, lo que coincide

con los análisis realizados por O’Donnell y colaboradores en 1998, (Figura 5) gran parte

de estas zonas con altos niveles de entropía y constituidas en parte por regiones

69

conservadas corresponden a los tres dominios estructurales de esta proteína,

denominados; dominio de unión a GTP o exón 2, responsable de un cambio

conformacional mediado por la hidrolisis de GTP a GDP (Moller et al., 1987); dominio

2 o exón 3, implicado en un cambio estructural a barril-β encargado en la unión de ARNt

(ARN de transferencia) que va a ser cargada (Nissen et al., 1995) y dominio 3 o exón 4,

ubicado en el extremo c-terminal y adopta una estructura de barril-β involucrado en la

unión de la molécula de ARNt y del factor de elongación EF-1β) (Wang et al., 1997). Los

mismos análisis practicados al grupo de secuencias de RPB2 no permiten observar zonas

de altos niveles de entropía bien diferenciadas ni la separación de estas por zonas amplias

de conservación de nucleótidos, indicando ello el alto número de dominios estructurales

de importancia (12) y de múltiples motivos funcionales distribuidos ampliamente en las

secuencias codificantes de la segunda subunidad mayor de la ARN polimerasa II (Cramer

et al., 2001; Ruprich-Robert G, Thuriaux P. 2010), separadas por zonas de conservación

o bajos niveles de entropía, lo que concuerda de igual manera con el trabajo de Frøslev y

colaboradoes (2005) en donde se observa zonas de entropia bien distribuidas a lo largo

de las secuencias de RPB2, aunque a nivel de secuencias aminoacidicas el grado de

conservacion es bastante marcado, que conllevo al uso de este marcador molecular para

estudiar las relaciones del filum Basidiomicota. Posteriormente se implementó al estudio

de la taxonomia y filogenia del genero Fusarium.

Es de resaltar que aunque se muestra altos niveles de entropía en regiones codificantes

para los grupos de secuencias de RPB2, a nivel de las secuencias aminoacídicas y

funcionalidad de las mismas estas demuestran un alto grado de conservación (Sweetser

et al., 1987; Kinzy et al., 1994; O’Donnell et al., 1998; Liu et al., 1999; Pittman et al.,

2009); lo que se traduce en un excelente balance entre el grado de variabilidad

intraespecifica y variabilidad interespecifica, necesaria en los procesos de identificación

y sistemática molecular de Fusarium en la actualidad (Figura 4 y Figura 5).

El análisis de la variabilidad generada por los dos conjuntos de secuencias de los genes

EF-1α y RPB2, como son el número de sitios monomórficos, polimórficos, singletones,

fenómenos de inserción-delección y parsimoniosamente informativos, facilita la

detección de variabilidad y conservación a través de las secuencias, permitiendo analizar

70

la presencia del alto grado de zonas informativas y de zonas variables que separaron los

diferentes aislamientos de origen clínico analizados en el presente trabajo.

6.3 Taxonomía molecular de aislamientos de Fusarium.

La evaluación de los distintos métodos estadísticos de inferencia usados en este trabajo

como lo son Neighbor-Joining, Máxima Verosimilitud, Máxima Parsimonia e Inferencia

Bayesiana, permitieron reconocer la gran utilidad del método de Neighbor-Joining para

estimar las relaciones existentes entre los aislamientos de origen clínicos objeto del

presente trabajo, el cual no requiere de métodos estadísticos complejos para evidenciar

de manera sencilla las relaciones entre la totalidad de las muestras; además estos

resultados fueron respaldados por los resultados de Inferencia Bayesiana llevados a cabo

mediante el programa BEAST (Drummond et al., 2012).

El dendrograma obtenido por el método de Neighbor-Joining a partir de las secuencias

de EF-1α reveló una clara agrupación de los aislamientos previamente identificados como

miembros de los complejos de especies Fusarium oxysporum, Fusarium solani y

Fusarium incarnatum-equiseti (Figura 7). Cabe notar que el único miembro del complejo

de especies Fusarium incarnatum-equiseti tuvo una mayor relación con los miembros de

Fusarium oxysporum. Estos resultados coinciden con la revisión hecha por Balajee y

colaboradores en 2009, en donde proponen, definen, evalúan y aceptan la formación de

siete complejos de especies de interés clínico, que incluyen F. solani, F. oxysporum, F.

incarnatum-equiseti, F. chlamydosporum, F. tricinctum, F. dimerum y Gibberella

fujikuroi (O’Donnell et al., 2010; Park et al., 2011). La agrupación de estos complejos se

basó en la presencia de dos clúster (MOTU’s) (Clúster I = sub-clúster I - sub-clúster II y

Clúster II = sub-clúster III y sub-clúster IV) (Figura 7).

La construcción del dendrograma que describe la relación de las secuencias codificantes

para RPB2 de los 59 aislamientos, obtenido por el método de Neighbor-Joining, permitió

la identificación de tres clústeres, similar a lo presentado en el dendrograma de EF-1α,

pero se diferenció en la no formación de sub-clústeres claramente definidos. Es de resaltar

que estos clústeres (I, II y III) no incluyeron al total de integrantes de los complejos de

71

especies determinados en este trabajo (Fusarium solani, Fusarium oxysporum y

Fusarium incarnatum-equiseti), de esta manera el clúster I conformado en su mayoría por

aislamientos del complejo Fusarium oxysporum (21 aislamientos) y un aislamiento del

complejo de especies Fusarium solani, el cluster II formado por 19 aislamientos de los

tres complejos de especies identificados, en su mayoría aislamientos del complejo

Fusarium oxysporum (11 aislamientos), y el clúster III constitutivo por 18 aislamientos,

todos del complejo de especies Fusarium solani, excepto un único aislamiento del

complejo de especies Fusarium oxysporum (Figura 8). Las relaciones obtenidas por el

método de Neighbor-Joining a los aislamientos del complejo F. oxysporum evidencio de

manera detallada el baja utilidad que posee este tipo de secuencias en la identificación y

resolución de relaciones taxonómicas de los aislamientos de origen clínico analizados

(Figura 8).

Al momento de analizar las relaciones obtenidas mediante el análisis del método de

Neighbor-Joining, por la concatenación de las secuencias de EF-1α y RPB2, para aquellos

aislamientos identificados como miembros del complejo de especies de F. oxysporum,

nuevamente se observa la aceptable agrupación de estos aislamientos de acuerdo a los

sub-cluster definidos previamente, mediante el análisis de las secuencias de RPB2 para

la totalidad de los aislamientos analizados en el presente trabajo, por el método de

Neighbor-Joining (Figura 9). De esta manera se observa la clara irrupción de algunos

miembros del Sub-cluster I y Sub-cluster III en el MOTU que contiene a la totalidad de

los aislamientos del Sub-cluster II, caso similar se observa en el agrupación de los

miembros del Sub-cluster IV ya que se ven ubicadas al extremo de esta agrupación,

miembros de los complejos de especies de F. chlamydosporum y G. fujikuroi quienes

sirven como grupos externos al análisis de las relaciones del complejo de especies F.

oxysporum; en el caso de los aislamientos del Sub-cluster V, su agrupación no se ve

afectada por ningún otro aislamiento o grupo externo (Figura 9).

Estas observaciones encuentran un alto grado de coincidencia por los análisis de

concatenación de las secuencias de EF-1α y RPB2 por el método de Neighbor-Joining,

realizados de manera individual a los aislamientos identificados como miembros del

complejo de especie F. solani, tanto a nivel de los dos sub-cluster que componen el

72

Cluster I, teniendo como base las agrupaciones obtenidas por este mismo método pero

con base solo en las secuencias de EF-1α (Figura 7); así los valores estadísticos de

bootstrap que soportan estas agrupaciones, 75 % para el Sub-cluster II y de 95 % para el

Sub-cluster I, logran sustentar nuevamente dichas agrupaciones establecidas en la

identidad de cada uno de los aislamientos (Figura 10).

Es importante resaltar que no se observó la agrupación de aislamientos en relación con el

tejido afectado ni con el género del paciente (Figura 7, Figura 8, Figura 9 y Figura 10).

Resultados similares ocurrieron en el estudio de Wang y colaboradores (2011), en donde

se probaron los juegos de cebadores e-1H/ef-2T para EF-1α, 5F2/7cR para la región

RPB2-57 y 7cF/11aR para la región RPB-711 específicos para los diversos complejos de

especies de Fusarium sp, los cuales amplificaron el ADN de cepas de referencia de siete

complejos de especies. O’Donnell y colaboradores (2008) probaron y validaron estos tres

pares de cebadores; al usarlos con diferentes aislamientos de interés clínico de los

diferentes complejos de especies Fusarium encontraron un excelente grado de

discriminación en todos los complejos de especies evaluados (O’Donnell et al., 2008).

Al comparar los dendrogramas obtenidos por análisis separados de las secuencias de EF-

1α y RPB2 se puede observar la clara inexistencia de relación entre las agrupaciones

obtenidas por cada grupo de secuencias para los 59 aislamientos evaluados; además no se

observa de igual manera ningún grado de correspondencia de acuerdo con los complejos

de especies obtenidas por las secuencias de EF-1α; de esta forma se corrobora el elevado

grado de confianza y correcta identificación de aislamientos de Fusarium de muestras

clínicas por el factor de elongación de la traducción 1α (EF-1α), siendo mayor que el

registrado por la segunda subunidad mayor de la ARN polimerasa II (RPB2), que coincide

con las observación hechas por Balajee y colaboradores en 2009 (Figura 11).

De igual modo, la concatenación de las secuencias codificantes de las proteínas EF-1α y

RPB2 permitió corroborar de manera aceptable las relaciones obtenidas para los distintos

aislamientos de origen clínico con base a los tres complejos de especies identificados en

el presente trabajo mediante el método de Neighbor-Joining, teniendo como antecedente

73

el análisis basado en las secuencias de EF-1α, ya que se observa la conformación de los

mismos cluster (I, II y III), soportado por altos valores estadísticos de boostrap para

dichos nodos, junto con algunas pequeñas diferencias al momento de la definición de los

distintos sub-cluster (I, II, III y IV) de dichos cluster, debido en gran medida la bajo grado

de utilidad y de resolución de relaciones a nivel de complejos de especies por parte de las

secuencias de RPB2 induciendo a errores en los análisis taxonómicos. Al comparar estos

análisis de concatenación con las relaciones obtenidas en las secuencias de RPB2

igualmente por el método de Neighbor-Joining no se observa ningún tipo de similitud en

distribución de los aislamientos con base en los Cluster (I y II) y los distintos Sub-cluster

que los componen, ratificando la confiabilidad de las relaciones establecidas por el

método Neighbor-Joining basado en el grupo de secuencias de EF-1α (Figura 12).

Se ha reportado que las secuencias del factor de elongación son las más apropiadas para

la taxonomía, filogenia e identificación de especies de Fusarium, seguidas por las

regiones de la segunda subunidad mayor de la ARN polimerasa II y la β-tubulina en la

identificación y en estudios de taxonomía y filogenia (O’Donnell et al., 2008). Estos

resultados son acordes con otros estudios en donde se han usado estas regiones de manera

separada y/o concatenada en la identificación, taxonomía y/o filogenia de especies de

Fusarium (Healy et al., 2005; Monod et al., 2006; Sakai et al., 2006; Alfonso 2008;

Zaccardelli et al., 2008). Esto concuerda con la variabilidad genética marcada de este

complejo (O’Donnell et al., 2000; Godoy et al., 2004; Leslie y Summerell, 2006;

Dyavaiah et al., 2007; O’Donnell et al., 2008; Zaccardelli et al., 2008). Por todo lo

anterior es claro deducir que el método que mejor describe las relaciones taxonómicas

existentes entre los 59 aislamientos clínicos de Fusarium es el de Neighbor-Joining, junto

con la variabilidad expresada por el conjunto de secuencias de EF-1α, justificado en gran

medida por la clara y evidente agrupación de los aislamientos de acuerdo a los complejos

de especies identificados, el soporte estadístico de boostrap de los nodos que soportan

dichos clústeres y sus respectivos sub-clústeres y a la muy alta afinidad y/o

distanciamiento existente entre los miembros de dichos complejos de especies.

Al llevar a cabo una evaluación profunda de las relaciones existentes entre los diferentes

aislamientos, teniendo como base su identificación por comparación de las secuencias en

74

la base de datos Fusarium-ID, se puede establecer el alto grado de grado de utilidad y

resolución de EF-1α con respecto a los resultados de las relaciones obtenidas por las

secuencias codificantes para RPB2, ratificado además por la correcta agrupación de los

diferentes aislamientos con base al complejo de especies perteneciente.

6.4 Correlación de especies identificadas de Fusarium sp con variables

epidemiológicas de pacientes analizados

Diversos estudios llevados a cabo en pacientes inmunocompetentes reportan que las

infecciones por Fusarium spp tienen mayor incidencia en zonas como uñas, ojos y piel

(Castro, 2004; Nardin et al., 2006; Ranawaka et al., 2008; Azor et al., 2009). En este

estudio se observó el mismo esquema reportado para este tipo de hialohifomicosis, ya que

del total de 59 aislamientos el 88,13 % de los aislamientos provenían de lesiones de uñas,

principalmente de los pies, el 5,08 % de piel y el 3,38 % de córnea. Esto concuerda con

que la mayoría de las lesiones de uñas es difícil erradicar el agente causal, especialmente

si se trata de mohos como Fusarium, del cual se conoce su poca respuesta a los

antimicóticos disponibles; lo que conlleva a que estas lesiones sean de duración

prolongada y difícil tratamiento (Castro, 2004; Alustrey-Izquierdo et al., 2008; Azor et

al., 2008; Tortorano et al., 2008; Azor et al., 2009) (Tabla 6).

De los 59 aislamientos, la mayoría derivo de pacientes del género femenino (n = 45),

principalmente de lesiones de uñas. Esta observación es muy común en diferentes

estudios, y se explica por la práctica generalizada del arreglo de uñas entre las mujeres,

por la mayor exposición a traumas y humedad asociados con labores manuales en el hogar

y al uso frecuente de calzado cerrado (De Bedout et al., 2001; Escobar y Carmona, 2003;

Castro, 2004; Zuluaga et al., 2005; Calado et al., 2006; Guilhermetti et al., 2007) (Tabla

6).

Posterior a las lesiones en uñas, los miembros del genero Fusarium son una causa

frecuente de infecciones oculares en zonas tropicales y subtropicales como Brasil, México

y Florida (EE.UU.); además están implicados en la mayoría de los brotes reportados de

queratitis en Asia y es el principal hongo que causa esta patología en Estados Unidos

(Dignani y Anaissie, 2004; Dóczi et al., 2004; Godoy et al., 2004; O’Donnell et al., 2008;

75

Perez et al., 2009). Opuesto a las lesiones en uñas, la queratitis es más frecuente en

hombres que en mujeres, principalmente en agricultores o granjeros. Aunque en este

estudio las muestras de córnea fueron pocas (n = 1), cabe resaltar que esta provenía de un

hombre, lo cual puede asociarse con el hecho de que los hombres están más relacionados

con actividades fuera del hogar, como la agricultura, lo que les crea una mayor exposición

a traumas en el ojo con material vegetal, particulado o metálico, ocasionando lesiones a

nivel de córnea y conllevando al desarrollo de queratitis (Dóczi et al., 2004; Godoy et al.,

2004; Alfonso et al., 2006; Zhang et al., 2006; Alfonso, 2008;). Otra causa que se asocia

al desarrollo de esta patología es el uso de lentes de contacto o sus soluciones de limpieza

contaminados con esporas de Fusarium (Alfonso et al., 2006; Dyavaiah et al., 2007).

Debido a que no se posee la suficiente información del paciente, no podemos concluir

cuál de éstas es la causa de esta micosis en este individuo. Con relación al agente causal

de la queratitis, las tres especies asociadas molecularmente a los complejos de especies

F. solani, F. oxysporum y F. incarnatum-equiseti estuvieron implicadas en estas

infecciones, lo que concuerda con lo reportado en la literatura, donde F. oxysporum y F.

solani son las especies más registradas como agentes causales de esta patología, aunque

F. incarnatum-equiseti con una menor incidencia también ha sido reportado ((Nucci y

Anaissie, 2007) (Tabla 6).

Asimismo F. solani está fuertemente asociado con el desarrollo de micosis invasivas

especialmente en pacientes con el sistema inmunológico comprometido donde las

lesiones superficiales se convierten en el punto de acceso del hongo (Baran et al., 1997;

Girardi et al., 1999; Chade et al., 2003; Mansoory et al., 2003; Ninet et al., 2005; Calado

et al., 2006, Zhang et al., 2006). Este hallazgo es similar a lo reportado en el estudio de

Ranawaka y colaboradores, (2008), donde de un grupo de seis pacientes, uno era diabético

con una lesión en la uña de dos años de duración, causada por F. solani. Igualmente Nir-

Paz y colaboradores en 2004, analizaron un grupo de 68 pacientes inmunocompetentes,

de los cuales 23 eran diabéticos; aunque en este estudio no se determinó la especie de

todos los aislamientos, F. solani fue reportado como una de los principales agentes

causales (Nir-Paz et al., 2004) (Tabla 6).

A nivel local, en dos estudios realizados en la Universidad de los Andes (Bogotá,

Colombia) por Reyes (2001) y Castro (2004), se logró la identificación por métodos

76

morfológicos la especie de varios aislamientos provenientes de onicomicosis;

encontraron que la especie más frecuente identificada fue F. solani, seguida por F.

oxysporum, y en menor proporción F. verticillioides y F. subglutinans.

77

7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Este estudio revelo la importancia de regiones nucleares codificantes de genes implicadas

en funciones vitales y altamente conservadas y demostró que EF-1α es un gran marcador

molecular, con un alto grado de fiabilidad en la identificación de aislamientos de

importancia clínica pertenecientes al género Fusarium.

La utilidad mostrada por secuencias codificantes de proteínas como marcadores

moleculares en estudios de sistemática molecular de hongos fue ratificada nuevamente en

este estudio. Es de resaltar el alto grado de resolución y establecimiento de la variabilidad

intra-complejo de especies, además de sus patrones evolutivos; que posee el factor de

elongación de la traducción (EF-1α) debido en gran medida al número, calidad y

proporciones de zonas informativas y regiones conservadas siendo mucho mejor que las

características demostradas por las secuencias de la segunda subunidad mayor de la ARN

polimerasa II (RPB2), que permite la adecuada identificación y establecimiento de la

taxonomía de aislamientos clínicos de Fusarium, ya que este posee un nivel moderado de

utilidad en el complejo de especies de Fusarium oxysporum.

La utilidad que poseen la secuencias moleculares como un sistema acertado en la

identificación de agentes causales de infecciones causadas por hongos se ve ratificada

nuevamente, ya que las relaciones existentes en las diversas variables epidemiológicas

evaluadas en cada uno de los casos, y la posibilidad de obtener la identidad de dicho

patógenos en cuestiones de 72 horas mejoraría la calidad y tiempo de los tratamientos

hacia este tipo de infecciones.

El uso de un tercer marcador molecular permitiría hacer mejor análisis, que soporten la

identificación y relaciones existentes entre aislamientos de interés clínico, solventando

los bajos niveles de utilidad otros marcadores, en especial del genero Fusarium, con el

fin de llevar a cabo análisis multilocus, ya que se ha reportado que el factor de elongación

de la traducción 1α es el único que posee altos niveles de resolución en todos los

complejos de especies de Fusarium.

78

AGRADECIMIENTOS

Ofrezco enorme gratitud a la Dra. Adelaida María Gaviria Rivera directora de mi tesis de

maestría por haberme permitido desarrollar mi investigación a su lado, por sus

sugerencias y apoyo durante la realización del mismo.

Agradezco a la Dra. Sandra Uribe Soto, docente del posgrado en Biotecnología por los

conocimientos transmitidos durante de mi tesis de maestría, por sus importantes

sugerencias, al igual que por el gran apoyo y ayuda brindados durante este periodo.

Manifiesto gran aprecio y agradecimiento a Richard Hoyos M.Sc PhD (c), por la gran

ayuda y conocimientos en el área de la sistemática molecular, que me aportó durante la

investigación, además por sus sugerencias, constante apoyo y motivación.

Doy mi más sincera gratitud al Grupo de Investigación en Sistemática Molecular y al

grupo de trabajo del Laboratorio de Biología Celular y Molecular de la Universidad

Nacional de Colombia sede Medellín, quienes me apoyaron completamente en el

desarrollo de mi tesis con sus conocimientos y valiosos recursos de investigación, además

de la motivación manifestada por cada uno de sus integrantes.

Manifiesto también mi gran aprecio y agradecimiento a los profesores del posgrado en

Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín: Mauricio

Alejandro Marín, Pablo Andrés Gutiérrez, Mauricio Salazar Yepes, Rafael Arango Isaza,

Edna Judith Márquez y Héctor Alejandro Rodríguez, por los conocimientos y consejos

aportados en el desarrollo de mis estudios y trabajo de investigación en las diversas áreas

aplicadas.

Agradezco a mis amigos de la UNAL y UdeA; Bibiana Betancur, Nevar García, Catalina

Camargo, Diego Carrero, María Angélica Contreras, Yesica Ardila, Liliana Acevedo,

Jibram León, Lorena García, Isabel Cadavid, Federico Álvarez, José Rangel, por su gran

e invalorable ayuda académica y personal en esta importante etapa.

Ofrezco sinceros agradecimientos al personal de la dirección del Posgrado en

Biotecnología de la Universidad Nacional, Dr. Mario Evelio Arias, Dr. Cesar Augusto

79

Velásquez, Leidy Londoño, Gloria Rivas, Neyi Pulgarín y Gloria Elena Gómez por su

buen ánimo y enorme colaboración ofrecida en los trámites administrativos relacionados

con el desarrollo de mi maestría.

Por ultimo este trabajo está dedicado a mis padres, Mercedes y José Domingo por todos

sus sacrificios y constante apoyo; y muy especialmente a Diana Marcela Trujillo Jiménez

por todo tu amor, paciencia y enseñanzas más importantes que esta maestría y mil

doctorados juntos.

80

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EF-1α Máxima Verosimilitud

ANEXOS.

Anexo 1. Arboles obtenidos mediante los métodos de Máxima Verosimilitud, Máxima

Parsimonia e Inferencia Bayesiana. Los porcentajes ≥ 50 % de bootstrap (5000 réplicas)

son mostrados en cada nodo. Los árboles fueron enraizados usando las secuencias de EF-

1α y RPB2 de Fusarium dimerum ET-grFD_01824, obtenida de la base de datos

Fusarium-ID.

56301F. solani

56868F. solani

55347F. solani

57335F. solani

63447F. solani

63917F. solani

55349F. solani

63200F. solani

56604F. solani

56780F. solani

63635F. solani

56337F. solani

56891F. solani

57949F. solani

56340F. solani

63749F. solani

56054F. solani

56988F. solani

56321F. solani

58025F. solani

64765F. solani

56240F. solani

56894F. solani

57221F. solani

65068F. solani

56665F. incarnatum-equiseti

55498F. oxysporum

56323F. oxysporum

55827F. oxysporum

58023F. oxysporum

55728F. oxysporum

63414F. oxysporum

55444F. oxysporum

57560F. oxysporum

63666F. oxysporum

63145F. oxysporum

55787F. oxysporum

55861F. oxysporum

55979F. oxysporum

55945F. oxysporum

63316F. oxysporum

56212F. oxysporum

62802F. oxysporum

56094F. oxysporum

55466F. oxysporum

55583F. oxysporum

62698F. oxysporum

56320F. oxysporum

56363F. oxysporum

63768F. oxysporum

55585F. oxysporum

63613F. oxysporum

55588F. oxysporum

55762F. oxysporum

57721F. oxysporum

57885F. oxysporum

63649F. oxysporum

55496F. oxysporum

55529F. oxysporum

F. dimerum

99

99

93

92

7775

72

50

50

99

8151

64

100

94

70

96

6489

Sub

-cla

do IV

Sub

-cla

do II

IS

ub-c

lado

III

Sub

-cla

do I

Sub

-cla

do II

Cla

do I

Cla

do II

Localización de lesión Convención

Uña pie

Uña mano

Piel

Cornea

Abdomen

Desconocido

Clado III

99

EF-1α Máxima Parsimonia

F. oxysporum 55583

55466F. oxysporum

57721F. oxysporum

55979F. oxysporum

63649F. oxysporum

55762F. oxysporum

63768F. oxysporum

63613F. oxysporum

55861F. oxysporum

63316F. oxysporum

57885F. oxysporum

55945F. oxysporum

55585F. oxysporum

56094F. oxysporum

56212F. oxysporum

55588F. oxysporum

62698F. oxysporum

56363F. oxysporum

62802F. oxysporum

56320F. oxysporum

55496F. oxysporum

56323F. oxysporum

55827F. oxysporum

58023F. oxysporum

55728F. oxysporum

63414F. oxysporum

55444F. oxysporum

57560F. oxysporum

55787F. oxysporum

63145F. oxysporum

63666F. oxysporum

55498F. oxysporum

55529F. oxysporum

57221F. solani

56894F. solani

64765F. solani

65068F. solani

56240F. solani

58025F. solani

56988F. solani

56321F. solani

56340F. solani

63749F. solani

56337F. solani

56891F. solani

56054F. solani

57949F. solani

56780F. solani

63635F. solani

63200F. solani

56604F. solani

55349F. solani

57335F. solani

55347F. solani

63447F. solani

56301F. solani

63917F. solani

56868F. solani

56665F. incarnatum-equiseti

F. dimerum

99

90

88

7380

70

99

99

7563

74

99

97

76

96

88

84

66

51

57

99

58

Sub

-cla

do II

IS

ub-c

lado

III

Sub

-cla

do IV

Su b

-cla

do II

Sub

-cla

do I

Cla

do I

Cla

do II

Localización de lesión Convención

Uña pie

Uña mano

Piel

Cornea

Abdomen

Desconocido

Clado III

100

EF-1α Inferencia Bayesiana

Localización de lesión Convención

Uña pie

Uña mano

Piel

Cornea

Abdomen

Desconocido

Sub-

clad

o IV

Su b

-cla

d o II

I Cl a

do I

I

S ub-

clad

o I

S ub-

clad

o I I

Cl a

do I

Clado III

101

RPB2 Máxima Verosimilitud

F. solani 56780

55349F. solani

63635F. solani

56301F. solani

56868F. solani

63200F. solani

56321F. solani

57335F. solani

63917F. solani

55347F. solani

63447F. solani

56054F. solani

57949F. solani

58023F. oxysporum

56891F. solani

56340F. solani

63749F. solani

56337F. solani

62802F. oxysporum

56988F. solani

55496F. oxysporum

56240F. solani

65068F. solani

57721F. oxysporum

57221F. solani

56212F. oxysporum

56894F. solani

64765F. solani

63666F. oxysporum

56665F. incarnatum-equiseti

56323F. oxysporum

57228F. oxysporum

63414F. oxysporum

55444F. oxysporum

55945F. oxysporum

55466F. oxysporum

58025F. solani

56604F. solani

55498F. oxysporum

63613F. oxysporum

55529F. oxysporum

55827F. oxysporum

55585F. oxysporum

56320F. oxysporum

56363F. oxysporum

55861F. oxysporum

55762F. oxysporum

63768F. oxysporum

63145F. oxysporum

55583F. oxysporum

55588F. oxysporum

62698F. oxysporum

63649F. oxysporum

57560F. oxysporum

63316F. oxysporum

55979F. oxysporum

56094F. oxysporum

57885F. oxysporum

55787F. oxysporum

F. dimerum

100

9489

100

100

65

100

70

100

100

85

52

99

99

83

67

87

5999

80

79

6898

66

69

70

57

Sub

- Cla

do I

Sub

-cl a

do I

IC

lado

II

Localización de lesión Convención

Uña pie

Uña mano

Piel

Cornea

Abdomen

Desconocido

Sub-clado III

Cla

do I

Sub

-cla

do I

VS

ub-c

lado

V

102

RPB2 Máxima Parsimonia

.

56780F. solani

56301F. solani

56868F. solani

63635F. solani

55349F. solani

57335F. solani

63200F. solani

56321F. solani

63917F. solani

55347F. solani

63447F. solani

58023F. oxysporum

57949F. solani

56054F. solani

56891F. solani

56340F. solani

63749F. solani

56337F. solani

F. oxysporum 62802

56988F. solani

55496F. oxysporum

57721F. oxysporum

57221F. solani

56894F. solani

64765F. solani

56212F. oxysporum

56240F. solani

65068F. solani

58025F. solani

63666F. oxysporum

56665F. incarnatum-equiseti

56323F. oxysporum

55945F. oxysporum

57228F. oxysporum

55466F. oxysporum

63414F. oxysporum

55444F. oxysporum

56604F. solani

55498F. oxysporum

63613F. oxysporum

55529F. oxysporum

55827F. oxysporum

55585F. oxysporum

56320F. oxysporum

56363F. oxysporum

63768F. oxysporum

63145F. oxysporum

55861F. oxysporum

55762F. oxysporum

55583F. oxysporum

55588F. oxysporum

55787F. oxysporum

56094F. oxysporum

57885F. oxysporum

63316F. oxysporum

62698F. oxysporum

63649F. oxysporum

55979F. oxysporum

57560F. oxysporum

F. dimerum

99

9396

99

99

70

99

99

99

99

99

99

97

77

77

74

71

64

71

51

74

57

79

Sub

-cla

do I

Sub

-cl a

do II

Cla

do II

Localización de lesión Convención

Uña pie

Uña mano

Piel

Cornea

Abdomen

Desconocido

Sub

-cla

do II

I

Cla

do I

103

RPB2 Inferencia Bayesiana

Localización de lesión Convención

Uña pie

Uña mano

Piel

Cornea

Abdomen

Desconocido Cla

do I

I

Sub-

clado

II

Sub-

clad

o I

Cla

do I

Cla

do I

II

Clado IV

104