TALLER DE LICENCIATURA: EFECTO POLINICIDA DE SALES CÚPRICAS EN FLORES

DE PALTO cv. HASS.

Alumno: Sebastián Arredondo. Profesor Guía: Ricardo Cautín.

Profesor Corrector: Eugenio López.

Quillota, 2008

Pontificia Universidad Católica de Valparaíso Fundación Isabel Caces de Brown Estación Experimental La Palma

Casilla 4-D, Quillota-Chile Teléfonos 56-32-274501- 56-33-310524

Fax 56-32-274570, 56-33-313222 http://www.agronomia.ucv.cl

Índice.

Resumen Summary 1. Introducción....................................................................................................................... 1 2. Revisión bibliográfica ........................................................................................................ 3 2.1 Antecedentes generales ................................................................................................. 3 2.1.1 La flor ........................................................................................................................... 3 2.1.2 El estambre .................................................................................................................. 3 2.1.3 El polen ........................................................................................................................ 4 2.1.4 El tubo polínico ............................................................................................................ 5 2.1.5 El estilo y el estigma .................................................................................................... 6 2.2 Antecedentes sobre la flor del palto ............................................................................... 7 2.2.1 La flor de palto ............................................................................................................. 7 2.2.2 Polen de palto .............................................................................................................. 8 2.2.3 Tubo polínico en palto ................................................................................................. 9 2.3. Antecedentes de Stem end rot .................................................................................... 10 2.3.1 Stem end rot............................................................................................................... 10 2.3.2 Ciclo de la enfermedad y epidemiología ................................................................... 10 2.3.3 Control de Stem end rot............................................................................................. 11 2.4. Efectos de los fungicidas sobre el polen y el estigma de la flor ................................. 11 2.4.1 Alteraciones provocadas por fungicidas en polen y estigma de la flor..................... 11 2.4.2. Antecedentes de los efectos del cobre sobre el polen ............................................ 12 3. Materiales y métodos...................................................................................................... 14 3.1. Ubicación del ensayo................................................................................................... 14 3.2 Descripción de los tratamientos ................................................................................... 14 3.3. Descripción del ensayo................................................................................................ 15 3.3.1 Ensayo in vitro ........................................................................................................... 15 3.3.2 Ensayo in vivo ............................................................................................................ 17 3.4. Diseño experimental .................................................................................................... 17 4. Resultados y discusión ................................................................................................... 19 4.1 Viabilidad del polen....................................................................................................... 19 4.2 Porcentaje de germinación ........................................................................................... 22 4.3 Receptividad de estigmas............................................................................................. 25 5. Conclusión ...................................................................................................................... 30 6. Literatura citada .............................................................................................................. 31

Resumen

La aplicación de fungicidas cúpricos es una práctica habitual en diversas especies para control de variadas enfermedades. En palto se utilizan estos productos para el control del Stem end-rot, enfermedad provocada por un complejo de hongos, que se aloja primeramente en las flores, pero que sus síntomas se presentan hasta que el fruto alcanza la madurez. Existen antecedentes que el cobre, usado en forma de sal cúprica, es polinicida, y dado que en paltos no existen antecedentes del efecto de éste sobre el polen. Por esto se plantea que el uso de fungicidas cúpricos afectaría negativamente tanto el porcentaje de germinación del polen como el crecimiento del tubo polínico. Para dilucidar esta inquietud se realizaron ensayos in vitro e in vivo. El ensayo in vitro consistió en colocar polen de palto en placas petri sobre un medio sólido, luego fue puesto en una incubadora durante 3 h, en las cuales fueron aplicados diferentes productos: oxicloruro de cobre (3,5 g/L), oxido cuproso (2,5 g/L), hidróxido de cobre (2,5 g/L), sulfato de cobre pentahidratado (3,0 g/L), y un producto alternativo (ditiocarbamato) como es el tetrametil tiuram bisulfuro (2,5 g/L), que fueron aplicados en tres diferentes momentos en el transcurso de las 3 h. El ensayo in vivo consistió en la polinización manual de flores de palto de la variedad Hass con polen de la misma variedad, que fueron aplicadas con los mismos productos que en el ensayo in vitro en 3 diferentes momentos después de la polinización. Luego de 3 h, fueron colectadas para observar el efecto del cobre sobre el crecimiento del tubo polínico. Los resultados obtenidos determinaron que el efecto de las sales cúpricas sobre el polen del palto es polinicida en condiciones in vitro. Por factores climáticos (temperatura, baja humedad relativa, viento), no se pudo precisar el efecto de las sales cúpricas sobre el crecimiento del tubo polínico en condiciones in vivo. A pesar de esto último, se observó que las aplicaciones de sales cúpricas disminuyen la receptividad del estigma. La aplicación de sales cúpricas disminuye significativamente la germinación del polen de palto. Además, la viabilidad del polen disminuyó con las aplicaciones de sales cúpricas. En el tratamiento alternativo con tetrametil tiuram bisulfuro, no se observaron evidencias de que éste producto afecte negativamente el polen del palto, por lo que podría ser una alternativa al uso de sales cúpricas.

Summary The application of copper fungicides is a regular practice in various species for the control of several diseases. These products are used in avocados for the control of stem end rot, disease provoked by fungi, which settles first in flowers, but symptoms appear when the fruits reach maturity. Background information indicates that copper used as copper salt is a pollen killer; in avocados no information is available on the effect of this on pollen. For this reason it is suggested that the use of copper fungicides would negatively affect both the percentage of pollen germination and the growth of pollen tube. In order to elucidate this, in vitro and in vivo test were conducted. The in vitro test consisted in placing avocado pollen on petri dishes on a solid medium; then, it was put into an incubator for 3 h; during that time different products were applied: copper oxychloride (3.5 g/L), cuprous oxide (2.5 g/L), copper hydroxide (2.5 g/L), pentahtydrated copper sulphate (3.0 g/L), and an alternative product (dithiocarbamate) as tetramethyl thiuram disulphide (2.5 g/L), which were applied in three different moments during the 3 h. The in vivo test consisted in hand pollination of Hass-variety-avocado flowers with pollen of same variety, which was applied with the same products used in the in vitro test in 3 different times after pollination. After 3 h, they were collected to observe the effect of copper on the growth of pollen tube. The results determined that the effect of copper salts on the avocado pollen is a pollen killer under in vitro conditions. Because of climatic factors (temperature, low relative humidity, wind), the effect of copper salts on the growth of pollen tube under in vivo conditions could not be specified. In spite of this, it was noticed that the applications of copper salts decrease the receptivity of stigma. The application of copper salts significantly decreases the germination of avocado pollen. Besides, the viability of pollen was reduced with the applications of copper salts. In the alternative treatment of tetramethyl thiuram disulphide, no proofs of negative effect of this product on avocado pollen were observed, which could become an alternative to the use of copper salts.

1. Introducción

La aplicación de diversos productos fitosanitarios es algo habitual en todo el mundo,

porque es necesario para el control de agentes dañinos en las plantas y que podrían

afectar negativamente la producción. Entre los productos fitosanitarios más usados y más

económicos, están los fungicidas basados en cobre que se utilizan para variadas

enfermedades en muchas especies. Sin embargo, hay antecedentes que señalan que el

cobre tiene efecto polinicida en cítricos (Mesejo et al., 2006).

En algunos lugares donde se cultiva el palto, como por ejemplo Argentina, se presenta

una enfermedad llamada Stem-end rot, causada por un complejo de hongos que se alojan

en las flores, pero sin causar daño en ese momento. Es sólo hasta que el fruto alcanza su

madurez fisiológica cuando se presentan los síntomas de esta enfermedad.

El principal y el más económico control para el Stem-end rot, son las aplicaciones de

fungicidas basados en sales de cobre en la época de floración, momento cuando éstos

patógenos colonizan la flor. Pero estas podría afectar negativamente al polen y por lo

tanto la fecundación del óvulo y, a su vez, la producción de fruta.

Por ello la necesidad de investigar el efecto que tienen las sales cúpricas sobre el polen

de palto en el crecimiento del tubo polínico, porque en este cultivo no existen

antecedentes sobre el efecto de las sales cúpricas sobre el polen de palto.

Se plantea como hipótesis que el uso de fungicidas basados en cobre, afecta

negativamente tanto el porcentaje de germinación del polen, como el crecimiento del tubo

polínico en palto.

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1.1 Objetivo general

• Determinar, mediante ensayos in vitro e in vivo, el efecto de las sales cúpricas

sobre el polen del en flores de palto.

1.2 Objetivos específicos

• Determinar el efecto de las sales cúpricas sobre la viabilidad del polen y sobre el

estigma de la flor del palto.

• Determinar el efecto de las sales cúpricas sobre el porcentaje de germinación de

polen de palto.

• Evaluar fungicidas alternativos libre de cobre, que no dañen el polen de palto.

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2. Revisión bibliográfica

2.1 Antecedentes generales

2.1.1 La flor

La flor es una estructura, constituida por un eje (receptáculo) y ápices florales (partes

florales u órganos). Las partes florales se dividen en estériles y fértiles o reproductoras

(Esau, 1985).

Los apéndices florales son similares a las hojas, pero que sufrieron numerosos cambios

evolutivos, esto se reafirma con el descubrimiento de genes homeóticos (Flores-Vindas,

1999).

Las partes florales fértiles están compuestas por el gineceo o parte femenina, y el

androceo o parte masculina. Del primero la unidad básica es el carpelo, el cual encierra el

óvulo u óvulos. Un gineceo puede tener uno o más carpelos. Además, el gineceo consta

de pistilo, donde se encuentran el estilo y el estigma. En el androceo, la unidad elemental

es el estambre, donde se encuentra la antera, la cual contiene los sacos polínicos (Esau,

1985).

2.1.2 El estambre

El estambre es un filamento provisto de una simple vena que lleva en el extremo superior

una antera bilobulada y tetralocular, la cual es filogenéticamente una estructura avanzada.

Este filamento es atravesado por un solo haz vascular, pero en algunas familias

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taxonómicas tienen tres venas vasculares. El tejido fundamental de este filamento es un

parénquima vacuolado desprovisto de un sistema de espacios intercelulares (Esau, 1985).

El estambre consta de un filamento y de antera. La antera es la parte fértil, formada de

dos partes o tecas, unidas por tejido conectivo. Cada teca, por lo general, cuanta con dos

sacos polínicos, donde se encuentran las microsporas, que son las que darán origen a los

granos de polen (Paniagua et al., 2002).

El filamento es muy simple en su estructura, consta de un haz vascular rodeado por

parénquima. La epidermis del filamento puede ser pubescente, y tanto en el filamento

como en la antera se pueden encontrar estomas (Flores-Vindas, 1999).

2.1.3 El polen

En el interior de cada saco polínico se forma el tejido esporógeno por división, cuyas

células directamente después de la mitosis, constituyen las células madre de las

microsporas (diploide). Inicialmente estas células tienen paredes normales de celulosa.

Posteriormente, las mismas células degradan su pared y las del tapete. Después, las

células madres segregan calosa, siendo ésta su nueva pared. Luego, estas células, a

través de dos meiosis sucesivas, generan una tétrada de microsporas, la cual será el

grano de polen (Paniagua et al., 2002).

Posteriormente, la calosa se reabsorbe y es sustituida por pared primaria de celulosica.

Esta pared es llamada primexina. Cada microspora sufre una mitosis y forma dos núcleos

dentro del mismo citoplasma. Uno es mayor y menos denso y tiene funciones vegetativas

(núcleo vegetativo), mientras el otro núcleo es más pequeño y denso y tiene funciones

germinales (núcleo espermático). Una vez formados los dos núcleos, dejamos de llamarla

microspora y pasa a llamarse grano de polen (Paniagua et al., 2002).

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Luego, el núcleo espermático se divide por mitosis, quedando así tres núcleos: dos

generativos (gametos masculinos) y uno vegetativo. Cuando germina el grano de polen, el

núcleo vegetativo se encuentra en el extremo del tubo polínico como guía, siendo el

primero que alcanza el rudimento seminal (Paniagua et al., 2002).

El polen esta compuesto generalmente por dos capas, la exina (membrana exterior) y la

intina (membrana interior). La exina esta formada por una sustancia lipoide, la

esporopolenina, que es menos soluble que la cutina y la suberina (Esau, 1985).

La mayoría de los granos de polen están colpados, esto quiere decir, que tienen surcos o

colpos, en donde la exina es muy delgada y la intina esta bien desarrollada. Cuando se

produce la germinación del polen, es este lugar por donde emerge el tubo polínico, esto lo

realiza haciendo a un lado la intina. El número de colpos varía de uno a muchos. En

muchas especies, la exina muestra espinas, depresiones, aerolaciones (divisiones en

diferentes espacios) y otros ornamentos, los cuales son característicos de cada especie y

pueden ser usados para estudios taxonómicos. La intina esta compuesta por poliurónidos

o por una mezcla de estos y polisacáridos, pero en su parte interna contiene también

celulosa (Esau, 1985).

2.1.4 El tubo polínico

Cuando el tubo polínico emerge del grano de polen, crece en su ápice por adición de

material de la membrana. La membrana del tubo contiene celulosa y esta cutinizada.

También ha sido descrita como poseedora de una lámina externa de pectina y una lámina

interior de una mezcla de calosa y celulosa, pero también ha sido descrita como

poseedora de una laminilla externa de pectina y una interna con una mezcla de calosa y

celulosa. La partes más viejas del tubo polínico, que se van alargando, quedan

sucesivamente cerradas por tapones de calosa (Esau, 1985).

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El tubo polínico tienes tres zonas funcionales. La zona apical y la subapical, que

contienen un citoplasma denso con numerosos dictiosomas y vesículas. La zona nuclear

contiene el núcleo vegetativo y una célula generativa. La última zona, es la vacuolización

y formación de tampones de calosa, los que tienen por función mantener el protoplasto

concentrado en la parte apical y subapical (Flores-Vindas, 1999).

El crecimiento del tubo ocurre a una velocidad de varios milímetros por hora, dependiendo

tanto de la especie como de las condiciones climáticas y de la calidad del polen. Dicho

crecimiento se realiza solamente entre los 3-5 µm terminales de la punta del tubo polínico

(Paniagua et al., 2002).

2.1.5 El estilo y el estigma

El estilo y el estigma tienen peculiaridades estructurales y fisiológicas que hacen posible

la germinación del polen y el desarrollo del tubo polínico desde el estigma hasta el óvulo.

La epidermis glandular del estigma está constituida por células ricas en citoplasma, a

menudo papiliformes y cubiertas de cutina, en donde también se secreta una sustancia

azucarada, recordando por estructura y función a un nectario. Además, el estigma esta

conectado con el interior del ovario mediante un tejido similar al tejido glandular

estigmático, ésto se interpreta como una forma de facilitar el recorrido del tubo polínico a

través del estilo, y ayuda a su desarrollo con sustancias alimenticias, se le ha asignado el

nombre de tejido estigmatoide (Esau, 1985).

En el estilo se encuentra un tejido similar al tejido glandular estigmático, el cual facilita el

recorrido del tubo polínico a través del estilo y ayuda al desarrollo con sustancias

nutritivas, este se denomina tejido estigmatoide. Hay estilos abiertos y macizos, los

primeros están provistos de un canal, donde el estilo puede tener un canal común o tener

cada componente su propio canal (ejemplo: géneros Lilium, Citrus). El tejido que recubre

este canal es similar al tejido estigmático (Esau, 1985).

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Las células epidermáticas del estigma, a menudo emiten prolongaciones a modo de

papilas recubiertas de cutícula y segregan una sustancia viscosa a la que se pegan los

granos de polen. Estas sustancias ayudan en la posterior germinación del polen por un

proceso quimiotrópico (Paniagua et al., 2002).

En relación a los factores que podrían intervenir en el crecimiento del polen hacia el óvulo,

algunos investigadores señalan que habría una atracción quimiotáctica entre el tubo

polínico, los tejidos del estigma y del óvulo; otros en cambio consideran que la estructura

del tejido estigmatoide y su distribución en el pistilo, seria suficiente para explicar la

dirección del crecimiento del tubo polínico (Esau, 1985).

2.2 Antecedentes sobre la flor del palto

2.2.1 La flor de palto

La flor del palto es bisexual, y tiene en completo desarrollo tanto los órganos femeninos

como los masculinos (Gazit y Degani, 2002).

La flor de palto es actinomorfa (flores con una disposición regular o estrellada), está

compuesta de nueve estambres fértiles y un ovario sésil con un estilo alargado. Es una

flor pequeña, mide de 0,5 a 1,5 cm de diámetro cuando esta completamente abierta, es

de un color amarillo verdoso y pubescente. Esta flores van dispuestas en una

inflorescencia denominada panícula (Gardiazábal, 1998).

El palto presenta un comportamiento floral llamado dicogamia de tipo protogínea, ésto

implica que las partes de la flor maduran en momentos diferentes, pero hay un momento

del día en que todas las flores son masculinas y otro momento dentro del mismo día que

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son femeninas. Su denominación de tipo protogínea es por que la parte femenina madura

antes que la masculina (Gardiazábal, 1998).

En paltos, los diferentes cultivares tienen dos tipos de comportamiento floral, están los

cultivares tipo A, los cuales abren sus flores en estado femenino por la mañana. La flor se

cierra al mediodía, para abrir de nuevo al día siguiente por la tarde como masculina, al

final de la tarde se vuelven a cerrar. Los cultivares tipo B, abren las flores en estado

femenino por primera vez en la tarde, después la flor se cierra al final de la tarde, para

abrir nuevamente al día siguiente por la mañana al estado masculino, y se vuelve a cerrar

al mediodía (Gardiazábal, 1998).

La longitud media desde el estigma hasta el óvulo es de 4 mm, en la variedad Fuerte, por

lo que si hay una tasa de crecimiento constante del tubo polínico, el proceso de

fecundación duraría aproximadamente 28,5 h, pero este proceso esta supeditado a las

condiciones ambientales (temperatura y humedad relativa), a la variedad que pertenece el

polen y la longitud relativa del estilo (Schroeder, 1954).

2.2.2 Polen de palto

El grano de polen maduro es esférico, no presenta poro germinal y esta cubierto por

numerosas espinocidades cónicas. El diámetro del grano de polen seco, es cercano a

30µm. Existen leves diferencias entre los granos de polen de los diferentes cultivares

(Gazit y Degani, 2002).

La exina del grano de polen es muy delgada, menor a 1µm; la intina tiene un espesor

cercano a 2µm. El grano de polen es propenso a la ruptura de su membrana como

respuesta a la presión y/o a la absorción de agua (Gazit y Degani, 2002).

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El número de granos de polen producido por un estambre dentro de la flor es constante e

independiente a la posición de la flor en el árbol. Este número es de aproximadamente

615 granos por estambre, en la variedad Fuerte (Schroeder, 1955).

El número de granos de polen que se producen por flor va entre 4000 y 10000,

dependiendo de la variedad y de las condiciones ambientales. En la variedad Hass, se

producen cerca de 7600 granos de polen por flor (Schroeder, 1955).

El polen ha mostrado que se puede mantener viable durante seis días en condiciones

naturales, a temperaturas de 20.6º-32.8ºC y a una humedad relativa entre 57 a 63%

(Papademetrius, 1974a).

2.2.3 Tubo polínico en palto

El crecimiento del tubo polínico en palto esta supeditado a la secreción del estigma,

además del reconocimiento del polen por parte del estigma (Sedgley, 1979), debido a que

éste contiene carbohidratos, lípidos y proteínas (Gazit y Degani, 2002).

Después de 15 min desde que ocurre la polinización, los granos de polen germinan y el

tubo polínico comienza a crecer entre las células papilosas. Estas células son ricas en

almidón, el cual también está presente en el tubo polínico. El tubo polínico joven crece

dentro de la secreción del estigma, entre la cutícula y la pared de las células papilosas,

para luego crecer en las sustancias intercelulares, entre las células papilosas y las células

de tejido transmisor (Sedgley, 1979). Alcanza la base del estilo dentro de 1 a 3 horas,

penetrando el ovario y creciendo a lo largo de su pared, para luego acceder al micrópilo,

donde ocurre la fecundación del óvulo (Gazit y Degani, 2002).

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La temperatura óptima para el crecimiento del tubo polínico en la mayoría de los cultivares

es de 25ºC. El tubo polínico demora alrededor de 3 h en llegar a la base del estilo, pero la

penetración de éste hasta el óvulo demora entre 18 a 24 h luego de la polinización

(Gardiazábal y Rosenberg, 1991).

2.3. Antecedentes de Stem end rot

2.3.1 Stem end rot

Los patógenos que causan el problema del Stem end rot son principalmente: Dothiorella

spp., Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griff. And Maubl., Thyronectria pseudotrichia

(Schwein.) seeler, Colletotrichum gloeosporioides, Phomopsis perseae Zerova, y

Fusarium decemcellulare Brick (Pegg et al., 2002).

Los síntomas comienzan con una descomposición que empieza en la zona de inserción

peduncular y se disemina a través de toda la fruta. Para la mayoría de los tipos de Stem-

end rot, los síntomas externos aparecen con una coloración café oscuro pasando a una

pudrición negra con los bordes bien definidos. El crecimiento de micelio es especialmente

sobre la superficie de las lesiones, durante una etapa avanzada de desarrollo del síntoma

y bajo condición de almacenaje húmeda. Pero la excepción es el Stem-end rot provocado

por C. gloeosporioides, en donde hay una decoloración de los tejidos vasculares, antes

del síntoma de desgarramiento de la pulpa (Pegg et al., 2002).

2.3.2 Ciclo de la enfermedad y epidemiología

Muchos de los patógenos que provocan el Stem-end rot pasan como endofitos en el tejido

del pedúnculo. Esto hace pensar que al ser endofitos pueden colonizar la inflorescencia y

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los tejidos del pedúnculo más próximos al fruto. Las esporas producidas por los variados

hongos que producen Stem-end rot caen sobre hojas muertas, ramillas y ramas, también

son fuente de la infección primaria. La infección puede ocurrir a través de heridas o, como

en el caso de algunos hongos como C. gloeosporioides, por penetración directa. La

infección puede también ocurrir en la cosecha a través de cortes en la superficie del

pedicelo del fruto. La mayoría de las infecciones permanecen quiescentes hasta que la

fruta comienza a madurar (Pegg et al., 2002).

2.3.3 Control de Stem end rot

Las aplicaciones de fungicidas basados en cobre, dan algún control sobre Stem end rot.

Recientes estudios han demostrado la eficacia de azoxystrobin en el control de esta

enfermedad. En poscosecha el tratamiento es con prochloraz, dando un buen control de

Stem end rot causado por C. gloeosporioides, pero es ineficiente contra otros patógenos

que producen Stem end rot. La poda de árboles, la remoción de hojas y madera muerta,

pueden ayudar a reducir el nivel de inóculo. Cuando el Stem end rot se presenta por una

colonización endofítica, se puede reducir manteniendo un buen vigor en el árbol. Evitar el

stress hídrico es muy importante. En algunos casos, se puede reducir la incidencia de la

enfermedad removiendo los pedicelos en la cosecha o encerando el pedicelo con cera

con fungicida. El control biológico con especies de Bacillus, han dado buenos resultados

(Pegg et al., 2002).

2.4. Efectos de los fungicidas sobre el polen y el estigma de la flor

2.4.1 Alteraciones provocadas por fungicidas en polen y estigma de la flor

Yi et al. (2003a), observaron en almendro (Prunus dulcis (Mill.) D. A. Webb), que algunos

fungicidas provocaron un colapso y la destrucción de células estigmáticas, además de

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producir una acumulación de exudación estigmática, lo que podría ser perjudicial para el

proceso de polinización y fecundación del óvulo.

También en almendro (Prunus dulcis (Mill.) D. A. Webb), Yi et al. (2003b), se realizó un

ensayo con variados fungicidas, a diferentes concentraciones, donde se pudo observar

que a la dosis recomendada por los fabricantes de estos fungicidas, se produjo la mayor

reducción, tanto en el porcentaje de germinación como en el largo del tubo polínico.

En otro ensayo realizado en arandano (Vaccinium corymbosum L.); Bristow (1981),

utilizando el fungicida Triforine, se observó que este producto produjo una severa

disminución en la germinación del polen.

Eaton (1963), en un ensayo realizado en manzanos de diferentes variedades, en donde

se aplicó Captan, se observó una reducción significativa en la germinación del polen, sin

embargo, esto no se observó de igual manera en todas las variedades utilizadas.

2.4.2. Antecedentes de los efectos del cobre sobre el polen

Abbott et al. (1991), observaron que en dos variedades de melón (Cucumis melo L.), a las

que se les hicieron aplicaciones de variados fungicidas para probar cual era su efecto

sobre la germinación del polen, el fungicida que producía los más bajos porcentajes de

germinación, con cerca de un 5%, fue hidróxido de cobre, teniendo en cuenta que el

testigo obtuvo un porcentaje cercano al 60%.

Según Sawidis y Reiss (1995), en ensayos sobre polen de Lilium longiflorum, se demostró

que el Cu+2 tiene un efecto negativo sobre el porcentaje de germinación del polen y

reduce drásticamente el crecimiento del tubo polínico.

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Por otra parte Tuna et al. (2002), en ensayos sobre polen de Nicotiana tabacum L.,

observaron una drástica disminución del porcentaje de germinación, de un 92%, con

respecto al tratamiento control, mientras, en los efectos sobre el largo del tubo polínico, se

apreció una disminución del 77% con respecto al tratamiento control.

Entre tanto, Mesejo et al. (2006), realizaron un ensayo sobre mandarino Fortune, y en sus

resultados in vitro observaron, que con la adición al medio de germinación de 25 mg/L de

CuSO4 inhibe completamente la germinación del polen. Además, cuando se aplicó 25

mg/L de CuSO4 después de 8 h desde el comienzo de la incubación, se detuvo el

crecimiento del tubo polínico, mientras que en su parte in vivo, observaron una baja

significativa en el porcentaje de germinación del polen en comparación con el control.

En arveja (Pisum sativum L.), Ramaškevičiene et al. (2006), realizaron ensayos con

plantas regadas con soluciones con sulfato de cobre, y observaron que se produjo una

disminución cercana al 40% en la viabilidad del polen.

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3. Materiales y métodos

3.1. Ubicación y fecha de realización del ensayo

El ensayo se realizó en un huerto de paltos plantados el año 2000, perteneciente a la

Estación Experimental La Palma, y en los Laboratorios de Docencia y de Semillas,

dependientes de la Facultad de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de

Valparaíso, ubicada en el sector de la Palma, comuna de Quillota, Región de Valparaíso,

Chile.

El ensayo comenzó en el mes de septiembre del 2007 y concluyó en el mes de enero del

2008.

3.2 Descripción de los tratamientos

Los tratamientos consistieron en la aplicación de cinco productos utilizados como

fungicidas en base a cobre, oxicloruro de cobre, oxido cuproso, hidróxido de cobre, sulfato

de cobre pentahidratado, además, un producto alternativo como es el tetrametil tiuram

bisulfuro (Pomarsol o Thiram, del grupo ditiocarbamato), el cual en su composición no

contiene cobre, todos fueron aplicados en su formulación comercial, además del

tratamiento control en que se aplicó agua. Estos productos fueron aplicados en tres

momentos dentro de cada ensayo.

Los tratamientos se aplicaron tanto en ensayos in vitro como in vivo, ambos en primavera.

El ensayo in vitro se realizó con el fin de contrastar con el ensayo in vivo, que fue el más

importante, porque es donde más se asemejan las condiciones de campo.

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Cuadro 1. Características técnicas de los fungicidas usados en los diferentes ensayos.

Ingrediente activo Nombre comercial Dosis (g/L)

oxicloruro de cobre Oxi-cup® 3,5

oxido cuproso Cuprodul® 2,5

hidróxido de cobre Hidro-cup ® 2,5

sulfato de cobre pentahidratado ---- 3,0 *

tetrametil tiuram bisulfuro Pomarsol® 2,5

Fuente: AFIPA, 2005. *Fuente: Reyes, 1998.

3.3. Descripción del ensayo

En ambos ensayos se cuantificaron los siguientes parámetros: porcentaje de germinación

del polen y largo del tubo polínico.

3.3.1 Ensayo in vitro

El polen utilizado fue obtenido de árboles de la variedad Hass, de un huerto establecido el

año 2000. Éste fue obtenido de flores que se generaron en la floración de primavera,

entre los meses de agosto a diciembre del año 2007. Estas flores deben estar en estado

masculino, cuando las anteras están dehicentes, pues en este estado el polen se

encuentra maduro.

El medio de cultivo que se utilizó fue un medio líquido, con pH 7, que contiene 15% de

sucrosa y 1000 mg/L de Ca (NO3)2-H2O, 300 mg/L MgSO4, 100 mg/L de KNO3 y 100

mg/L de H3BO3 . A esta solución se le agregó el polen anteriormente colectado, y con una

pipeta se depositó esta solución sobre una placa petri con agar sólido a una

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concentración del 1% (también contiene 15% de sucrosa, más los minerales de la

solución liquida) (Sahar y Spiegel-Roy, 1984).

Una vez emplazado el polen sobre el agar, se sellaron con Parafilm, luego estas placas se

dispusieron en una cámara de incubación a una temperatura constante de 27ºC por 3 h.

La aplicación de los tratamientos se realizo de la siguiente manera (Cuadro 2):

• En un grupo de placas, a las cuales ya tenían polen, se les aplicó uno de los

fungicidas antes de introducir las placas a la incubadora.

• Un segundo grupo de placas se les aplicó uno de los fungicidas una hora después

de introducir las placas en la incubadora, luego reingresaron a la incubadora para

completar las 3 h.

• Un tres tercer grupo de placas se les aplicó uno de los fungicidas 2 h después de

introducir las placas a la incubadora, luego reingresaron a la incubadora para

completar las 3 h.

Para cada fungicida, además del tratamiento control, se aplican de la misma forma todos

los tratamientos.

Después de las horas se aplicó FDA (Diacetato de Fluoresceína) y se observó en un

microscopio de fluorescencia (Sahar y Spiegel-Roy, 1984).

17

3.3.2 Ensayo in vivo

En este ensayo se polinizaron manualmente flores de palto de la variedad Hass con polen

de la misma variedad. Los tratamientos fueron aplicados de la siguiente forma (Cuadro 2):

• Un grupo de flores se les aplicó uno de los fungicidas inmediatamente después de

ser polinizada, luego se dejo en el árbol hasta completar 3 h.

• Un segundo grupo de flores se les aplicó uno de los fungicidas después de 1 h

desde que fue polinizada, luego se dejo en el árbol hasta completar 3 h.

• Un tercer grupo de flores se les aplico uno de los fungicidas después de 2 h

desde que fue polinizada, luego se dejo en el árbol hasta completar 3 h.

Luego de tres horas desde que se realizó la polinización, se colectaron dichas flores y se

procedió a fijarlas con F.A.A (10% de formalina, 80% de alcohol y 10% de ácido acético)

(Martin, 1959). Luego las flores fueron lavadas con agua deionizada por 1 h, para

después sumergirlas en una solución de sulfito de sodio al 5%. Después se realizaron

cortes transversales, desde el estilo hasta el ovario, que fueron teñidos con una solución

de azul anilina al 1% en K3PO4 con una concentración 0,1 N, por 5 min (Herrero y

Dickinson, 1979), siendo después observados en un microscopio de fluorescencia.

3.4. Diseño experimental

El diseño experimental que se utilizó en los ensayos, tanto en la parte in vitro como in vivo

es un diseño completamente al azar (DCA), con arreglo factorial y distintas repeticiones,

para el ensayo in vitro fueron cuatro y para el ensayo in vivo fueron veinte. Esto porque

hay dos factores de variación en el ensayo, tanto los productos que se probaran como el

18

tiempo al cual fueron aplicados. El número total de tratamiento es 18, porque son cinco

productos más el testigo, con tres diferentes tiempos de aplicación (Cuadro 2).

Cuadro 2. Tratamientos utilizados.

Tratamientos Control oxicloruro de cobre

oxido cuproso

hidróxido de cobre

sulfato de cobre tiuram

Tiempo 0 Trat 1 Trat 4 Trat 7 Trat 10 Trat 13 Trat 16 Tiempo 1 Trat 2 Trat 5 Trat 8 Trat 11 Trat 14 Trat 17 Tiempo 2 Trat 3 Trat 6 Trat 9 Trat 12 Trat 15 Trat 18

Para el ensayo in vitro se ocuparon cuatro repeticiones, donde la unidad experimental es

cada placa petri. Para el ensayo in vivo se ocuparon 20 repeticiones, donde la unidad

experimental es cada flor polinizada.

19

4. Resultados y discusión

4.1 Viabilidad del polen

En los tratamientos que se realizaron en el ensayo in vitro, donde se utilizó fungicidas

basados en sales cúpricas, se observó una disminución considerable de la viabilidad del

polen, mientras que el tratamiento alternativo con tetrametil tiuram bisulfuro se observó

que su aplicación no afectó la viabilidad de éste (Figura 1). Se puede observar en la

Figura 2, que el tratamiento alternativo presenta polen viable, dado que éste genera

fluorescencia, al igual como ocurre con el tratamiento control. Por su parte, en los

tratamientos con sales cúpricas, el polen no generó fluorescencia, indicando que el polen

es inviable, o generando una tenue fluorescencia, indicando que su viabilidad es menor

(Figura 2).

Esto es muy concordante con lo que señalan Ramaškevičiene et al. (2006), quienes

observaron que el cobre afecta negativamente la viabilidad del polen.

Los fungicidas basados en cobre, al afectar la viabilidad del polen, afectan además el

proceso de fecundación, ya que no se producirá la germinación de este, lo que

perjudicará la producción de frutos.

La viabilidad del polen está íntimamente relacionada con la germinación de éste, y lo han

señalado otros autores (Bristow y Shawa ,1981; Abbott et al., 1991; Sawidis y Reiss,

1995; Yi et al., 2003b).

20

Figura 1. Porcentaje de viabilidad de polen de palto de la variedad Hass en los diferentes

tratamientos. Ctl: Tratamiento control; Oxc: Tratamiento con oxicloruro de cobre; Oc: Tratamiento con oxido cuproso; Hc: Tratamiento con hidróxido de cobre; Sc: Tratamiento con sulfato de cobre; Th: Tratamiento realizado con tetrametil tiuram bisulfuro. Letras distintas indican diferencias significativas, según el Test de Tukey con α = 0,05.

Los fungicidas cúpricos tienen un efecto negativo en la viabilidad del polen, porque

cuando llega al estigma se hidrata con las secreciones estigmáticas , entrando en su

interior agua y nutrientes para la germinación, este mismo proceso ocurriría con el polen

al estar en contacto con el fungicida, éste ingresa en su interior provocando un daño al

polen, teniendo en antecedentes que el cobre en exceso puede ser fitotóxico (Yruela,

2005), afectando negativamente las células espermáticas, dejando inviable el polen.

21

Figura 2. Prueba de viabilidad de polen de palto variedad Hass en los diferentes

tratamientos. Ctl: tratamiento control; Oxc: tratamiento con oxicloruro de cobre; Oc: tratamiento con oxido cuproso; Hc: tratamiento con hidróxido de cobre; Sc: tratamiento con sulfato de cobre; Th: tratamiento realizado con tetrametil tiuram bisulfuro; 1: polen viable; 2: polen inviable.

22

4.2 Porcentaje de germinación

Como se puede observar en la Figura 3, los tratamientos donde se utilizaron fungicidas

basados en cobre, se aprecia una disminución en el porcentaje de germinación del polen,

mientras que el tratamiento con tetrametil tiuram bisulfuro tiene un porcentaje de

germinación muy similar al tratamiento control. Esto también se puede apreciar en la

Figura 4, donde se observa claramente que en el tratamiento control como en el

tratamiento alternativo (con tetrametil tiuram bisulfuro) hubo presencia de tubos polínicos,

mientras que en los tratamientos con sales cúpricas éstos no se observan.

Este resultado coincide con lo señalado por otros autores (Abbott et al., 1991; Tuna et al.,

2002; Mesejo et al., 2006), quienes observaron una disminución en la germinación del

polen por la aplicación de fungicidas a base de cobre.

Como señalan Sawidis y Reiss (1995) para Lillium longiflorum, el cobre es unos de los

metales pesados que es más tóxico sobre el polen, dado que cantidades pequeñas de

este metal (10 µM), producen una disminución considerable del porcentaje de

germinación del polen, éste es alrededor de un 42%.

Tuna et al. (2002), para polen de tabaco, señalan también que el cobre muestra un efecto

negativo sobre la germinación del polen, disminuyendo el porcentaje de germinación en

un 92%.

También Abbott et al. (1991), para polen de Cucumis melo, señalan que para dos

variedades distintas, el cobre es el que produce la mayor disminución en la germinación,

bajando desde porcentajes cercanos al 80% (control) aproximadamente a un 5%.

23

Figura 3. Influencia de los distintos tratamientos sobre la germinación in vitro de polen de

palto variedad Hass. Ctl: tratamiento control; Oxc: tratamiento con oxicloruro de cobre; Oc: tratamiento con oxido cuproso; Hc: tratamiento con hidróxido de cobre; Sc: tratamiento con sulfato de cobre; Th: tratamiento realizado con tetrametil tiuram bisulfuro.

Otro antecedente sobre el efecto de fungicidas cúpricos afectando la germinación del

polen, es lo que señala Bristow y Shawa (1981) para cranberry, los autores señalan que el

hidróxido de cobre disminuye en un 50% la germinación de polen en ensayos in vivo, a

concentraciones iguales o menores a la recomendadas para aplicaciones en campo.

Además, en ensayo in vitro, observaron que con 100 µg de ingrediente activo/mL, el

porcentaje de germinación del polen es cero.

El efecto que causa el cobre sobre la germinación del polen es interfiriendo en la síntesis

de la pared celular del tubo polínico, pues se produce una interacción de los iones de

cobre con el contenido aniónico de las vesículas secretoras, dado que la pared celular del

tubo polínico contiene una gran cantidad de pectinas, pero una menor cantidad de

24

celulosa. Una gran cantidad de cobre provoca la interferencia de los sitios de calcio

pectinas, produciendo una disminución en la elasticidad de la pared, dado que el calcio es

el responsable de la estabilidad de éstas. Este suceso provocaría una inhibición del

crecimiento normal del tubo polínico (Sawidis y Reiss, 1995).

Figura 4. Pruebas de germinación in vitro de polen de palto variedad Hass, en los

diferentes tratamientos. Ctl: tratamiento control; Cu: tratamientos con fungicidas a base de cobre; Th: tratamiento realizado con tetrametil tiuram bisulfuro; TB: tubo polínico; PM: polen inviable.

Otros antecedentes para tener en consideración, son los ensayos que se han realizado

con otros fungicidas y que han tenido resultados similares a lo ocurrido en este ensayo

(Figura 3). Como lo señala Yi et al. (2003b) para almendro, donde los 10 fungicidas

probados a concentraciones recomendadas por el fabricante para aplicaciones de campo,

todos disminuyeron a cero la germinación de polen.

Del mismo modo Eaton (1963), observó en manzano que el Captan® disminuye

significativamente la germinación del polen. Además, éste interfiere en la elongación del

tubo polínico.

25

4.3 Receptividad de estigmas

Preliminarmente el ensayo in vivo estaría relacionado con la germinación del polen y el

largo del tubo polínico, pero debido a condiciones climáticas desfavorables para una

satisfactoria polinización, posterior germinación y crecimiento del tubo polínico, no se

observaron en los tratamientos ningún tubo polínico (Figura 5), además de una baja

cantidad de polen. Los principales factores que influyeron en este ensayo en forma

negativa, fueron las temperaturas extremas, baja humedad relativa y los fuertes vientos al

momento de la polinización manual.

Las temperaturas al momento de la polinización cumplen un rol importante Gazit y Degani

(2002) señalan que pruebas con polen expuesto a temperaturas bajas se observa que no

hay un efecto perjudicial sobre la germinación, mientras que polen expuesto a

temperaturas altas se observa un efecto negativo con escasa germinación.

Bergh (1967), señala que el calor acompañado por baja humedad relativa disminuye la

cuaja en paltos.

Papademetius (1974b), señala que las temperaturas apropiadas para que el polen esté

viable en condiciones naturales, deben estar entre una mínima de 20,56ºC y una máxima

de 32,78ºC.

Sedgley (1977), observó que la temperatura óptima del día para que el tubo polínico

pueda alcanzar el ovario es de 25ºC, mientras que temperaturas en el día de 33ºC

disminuyen considerablemente el porcentaje de tubos polínicos que alcanzan el ovario.

Sin embargo, a ésta temperatura se observó que la tasa de crecimiento es mayor que a

25ºC, pero al revisar los tubos polínicos se aprecia un comportamiento anormal,

principalmente por la presencia de depositaciones de tampones de calosa.

26

Figura 5. Ensayo in vivo de estimación del largo del tubo polínico. Ctl: tratamiento control;

Oxc: tratamiento con oxicloruro de cobre; Oc: tratamiento con oxido cuproso; Hc: tratamiento con hidróxido de cobre; Sc: tratamiento con sulfato de cobre; Th: tratamiento realizado con tetrametil tiuram bisulfuro.

Sedgley and Annells (1981), observaron que a temperaturas de 33ºC en el día y de 28ºC

en la noche, en paltos de la variedad Hass, el estigma tiene una menor capacidad de dar

soporte al crecimiento del tubo polínico.

Según Sedgley and Grant (1982), en pruebas realizadas a nueve variedades de palto,

sometidos a temperaturas de 17ºC en el día y de 12ºC en la noche, observaron que gran

parte de los tubos polínicos no logran penetrar la superficie del estigma. Estos

antecedentes podrían ser uno de los factores que hicieron fracasar el ensayo, dado que

cuando se hizo la polinización manual, en los meses de octubre y noviembre, se

produjeron temperaturas altas de alrededor de 34ºC, pero en el mes de septiembre se

produjeron temperaturas bajas cercanas a los 15ºC.

La humedad relativa es otro factor importante en la viabilidad del polen, dado que como

señala Papademetius (1974b), la humedad relativa mínima para que el polen se conserve

27

viable en condiciones naturales, debe ser de 57% H.R.. En el período en que se realizó el

ensayo, hubo días de humedad relativa baja, siendo esta alrededor del 50% H.R..

El viento es otro factor que influyó en los resultados, dado que el viento fuerte podría

haber arrastrado el polen del pincel con que se polinizaba manualmente, como desde el

estigma de la flor, a pesar de que éste es pegajoso. Sin embargo, hay que tener presente

la baja humedad relativa y el viento como un factor deshidratante produciendo una mayor

evaporación de los fluidos estigmáticos.

A pesar de obtener un mal resultado en el ensayo inicial, se pudo observar una tendencia

que se repetía en los tratamientos con fungicidas basados en cobre, esto se refiere al

efecto que tienen los fungicidas sobre la receptividad del estigma. Como se puede ver en

la Figura 6, se observó una baja considerable en la receptividad de los estigmas de flores

de palto variedad Hass, a los cuales se les aplicó fungicidas basados en cobre.

Como se observa en la Figura 7, los estigmas que fueron expuestos a fungicidas basados

en cobre, poseen los estigmas fluorescentes, los que quiere decir que tienen calosa, éste

sólo se puede observar en tejidos envejecidos, por lo que se puede decir que estos

estigmas no son receptivos. Además, se aprecia que los estigmas expuestos a fungicidas

basados en cobre, sus papilas estigmáticas están desordenadas mientras que los

tratamientos control y el del fungicida tetrametil tiuram bisulfuro, se observan más

compactos y ordenados.

Este efecto de los fungicidas ha sido descrito por otros autores. Así, señalan Yi et al.

(2003a), que para Prunus dulcis, el efecto que tienen algunos fungicidas, como iprodione,

cyprodinil y myclobutanil es detrimental para las papilas estigmáticas, produciendo el

colapso de células, la descompactación de las papilas y el exceso de sustancias

estigmáticas, lo que interfiere en procesos que ocurren en esta estructura, como son la

adhesión, el reconocimiento, la hidratación y la germinación del polen.

28

Figura 6. Efecto de los distintos tratamientos sobre la receptividad de los estigmas de

flores de palto variedad Hass. Ctl: tratamiento control; Oxc: tratamiento con oxicloruro de cobre; Oc: tratamiento con oxido cuproso; Hc: tratamiento con hidróxido de cobre; Sc: tratamiento con sulfato de cobre; Th: tratamiento realizado con tetrametil tiuram bisulfuro. Letras distintas indican diferencias significativas, según el test de Tukey con α = 0,05.

También, Wetzstein (1990), señaló que para pecano (Carya illinoensis Wangenh C.

Koch), donde se aplicaron fungicidas como benomyl, triphenyltin hydroxide y phosalone,

se pudo observar un colapso de las células papilosas y desorden de la papilas, además

de un incremento en las exudación estigmática.

Los antecedentes anteriormente señalados, muestran que la aplicación de fungicidas es

perjudicial sobre la receptividad del estigma, cuestión que es importante en el éxito de la

producción, dado que al tener una menor cantidad de estigmas receptivos se puede

obtener una menor cuaja y, por lo tanto, una producción menor.

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Figura 7. Efecto de los diferentes tratamientos sobre la receptividad del estigma de flores

de palto variedad Hass. Ctl: tratamiento control; Oxc: tratamiento con oxicloruro de cobre; Oc: tratamiento con oxido cuproso; Hc: tratamiento con hidróxido de cobre; Sc: tratamiento con sulfato de cobre; Th: tratamiento realizado con tetrametil tiuram bisulfuro.

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5. Conclusión

El efecto de las sales cúpricas sobre el polen del palto es polinicida en condiciones in

vitro. Por factores climáticos (temperatura, baja humedad relativa, viento), no se pudo

precisar el efecto de las sales cúpricas sobre el polen en condiciones in vivo.

La aplicación de sales cúpricas disminuye significativamente el porcentaje de germinación

del polen en flores de palto.

La viabilidad del polen de palto disminuyó con las aplicaciones de sales cúpricas.

Las aplicaciones de sales cúpricas disminuyen la receptividad del estigma en flores de

palto.

En el tratamiento con tetrametil tiuram bisulfuro, no observaron evidencias que afecte

negativamente el polen del palto, por lo que podría ser una alternativa al uso de sales

cúpricas.

31

6. Literatura citada

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