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SÍNTESIS DE AMIDAS CON POTENCIAL ACTIVIDAD INHIBITORIA AL INHIBIDOR PAI-1 Luis Diego Solano Vega
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SÍNTESIS DE AMIDAS CON POTENCIAL ACTIVIDAD INHIBITORIA AL
INHIBIDOR PAI-1
Luis Diego Solano Vega
Universidad de Costa Rica
Facultad de Ciencias Básicas
Escuela de Química
SÍNTESIS DE AMIDAS CON POTENCIAL ACTIVIDAD INHIBITORIA DEL INHIBIDOR PAI-1
Tesis sometida a la consideración de la comisión de trabajos finales de graduación para optar por el grado de Licenciatura en Química
Luis Diego Solano Vega
Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, San Pedro de Montes de Oca,
2017
Esta tesis fue aceptada por la comisión de trabajos finales de graduación de la
Escuela de Química de la Universidad de Costa Rica, como requisito para optar
por el grado de Licenciatura en Química.
Dr. Germán Vidaurre Fallas Presidente del Tribunal
Dra. Giselle Tamayo Castillo Directora del Trabajo final de
Graduación
Dr. Juan José Araya Barrantes Asesor del Trabajo Final de
Graduación
Lic. Allan Jiménez Ardón Asesor del Trabajo Final de
Graduación
Dra. Rosaura Romero Chacón Miembro del Tribunal
Luis Diego Solano Vega Postulante
Dedicatoria
Este trabajo se dedica a todas aquellas personas que estuvieron a lo largo de mi
carrera apoyándome. A mis profesores, amigos y a mi familia.
A todas esas personas que estuvieron ahí cuando los necesitaba,
Muchas gracias.
Agradecimientos
Al Instituto Nacional de Biodiversidad (INBio) por permitirme el acceso a
material necesario para mi tesis, permitirme formarme en sus instalaciones, como
investigador y educarme como profesional. Agradezco al químico Víctor Vásquez,
el cual a lo largo de mi voluntariado en la institución me capacitó y brindó apoyo en
mi formación en aislamiento y purificación de compuestos. A su vez, agradezco
inmensamente el apoyo del Lic. Allan Jiménez, por sus consejos y amistad
incondicional.
A todos los miembros del equipo de investigación de la profesora Giselle
Tamayo: Luis Manuel Quirós, Ignacio Morales, Oscar Fernández y Francisco
Venegas: gracias por sus consejos, experiencias, tardes de café y compañerismo
durante toda la parte experimental.
A la profesora Giselle Tamayo: gracias por la guía académica, por
permitirme realizar mi investigación en su laboratorio, retarme, enseñarme, pulirme
como profesional y aún más importante, por darme consejos más allá de un
trabajo de graduación; consejos para toda una vida profesional.
Palabras Clave:
Amidación: reacción química para la formación de un amida.
C.L.A.R: Cromatografía liquida de Alta resolución
Dépsidos: esteres fenólicos, que constan de dos o más anillos aromáticos.
Fibrina: proteína con la capacidad de formar agregados plaquetaria.
Fibrinógeno: forma inactiva de la proteína fibrina.
Fibrinólisis: degradación de las redes de fibrina.
Hemoestasis: conjunto de mecanismos aptos para detener los procesos
hemorrágicos.
ICBG: International Cooperative Biodiversity Groups
INBio: Instituto Nacional de Biodiversidad.
IR: Infrarrojo
MEC: Matriz extracelular
Plasmina: enzima que actúa en la disolución de coágulos sanguíneos.
Plasminógeno: precursor inactivo de la enzima plasmina.
RMN: Resonancia Magnética Nuclear
Serpina: super familia de proteína identificada de la inhibición de proteasa.
Vitronectina: Glicoproteína de la familia de la hemopexina.
Zimógeno precursor enzimático inactivo.
Resumen:
El PAI-1 constituye el más importante inhibidor del activador del
plasminógeno, que a su vez se ha asociado a varias enfermedades como:
aterogénesis, daño en múltiples órganos, osteopenia, osteoporosis, fibrosis de
tejidos y cáncer, lo cual ha hecho imperativo el estudio de inhibidores de éste. En
la última década, los investigadores Daniel Lawrence y Cory Emal han trabajado
arduamente en este enfoque, en donde sus resultados en aislamiento y síntesis
química, han permitido modelar y evaluar otros posibles inhibidores. Por otro lado,
el fraccionamiento guiado por bioensayo de extractos etanólicos de líquenes en
custodia de INBio, en el marco del Proyecto ICBG (International Cooperative
Biodiversity Groups) en ejecución desde el año 2005, ha determinado que los
compuestos ácido lecarónico, y el ácido 2’-O-metilanziaico, presentan una
prometedora actividad inhibitoria ante el PAI-1.
Este tipo de compuestos en general, presentan la dificultad de poseer una
relativa labilidad a la hidrólisis debido a la función éster. Por esta razón se ha
propuesto realizar la síntesis de compuestos análogos a los descritos por
Lawrence y Emal, y a los encontrados por INBio. La hipótesis que se planteó se
basó en sustituir la función éster por un grupo amida, con el fin de aumentar su
estabilidad ante la hidrólisis, disminuir la hidrofilicidad de los grupos hidroxilos para
evaluar el efecto en su actividad biológica y romper la planaridad incorporando un
carbono a la cadena que une al grupo amida con el polifenol.
De esta manera, se lograron sintetizar 11 compuestos semejantes en
estructura, protegiendo los grupos hidroxilos y variando la extensión de cadena
entre los anillos aromáticos para estudiar el efecto en la actividad biológica contra
el PAI-1. A su vez, en el desarrollo del trabajo de investigación se reporta la
síntesis por “serendipia” del compuesto novedoso 5-cloro-N-fenil-2,4-
dimetoxibenzamida.
Se analizó la actividad inhibitoria de los nuevos compuestos sintetizados en
colaboración con el Dr. Daniel Lawrence y el Dr. David H. Sherman de la
Universidad de Michigan, EUA, encontrándose que solo el compuesto N-fenil-2-
metoxibenzamida (Código A-2MOBz) presentó actividad inhibitoria con un
potencial interés al PAI-1 en el ámbito de los 100 µM.
De esta manera, basado en los resultados de actividad biológica, se
determinó que ni el rompimiento de la planaridad ni la sustitución con metilos y
carbonilos representó un aumento en la actividad con PAI-1. Sin embargo se logró
asociar parcialmente la disminución de la hidrofilicidad con el aumento de la
actividad biológica, al identificar que la protección en la posición orto al carbonilo
genera una promisoria señal de actividad, la cual no se observa en compuestos
homólogos estudiados en este trabajo.
ÍNDICE GENERAL
PARTE INTRODUCTORIA: ............................................................................................................ 1
I. ANTECEDENTES: ................................................................................................................... 3
Estrategias modernas en el proceso de descubrimiento de medicamentos: ...................... 5
PAI-1 y su papel en el sistema plasminógeno/plasmina ........................................................ 7
PAI-1: Blanco para el desarrollo de moléculas con actividad biológica ............................. 10
La remodelación de la Matriz Extracelular y su relación con distintas enfermedades .... 13
Resultados preliminares en la inhibición del PAI-1 ............................................................... 15
Hipótesis del trabajo ................................................................................................................... 22
II. MARCO TEÓRICO:................................................................................................................ 24
Síntesis de Amidas: ................................................................................................................... 24
Metilación de grupos hidroxilos fenólicos: .............................................................................. 31
Caracterización química: ........................................................................................................... 33
Técnicas de purificación: ........................................................................................................... 38
Cristalización: .............................................................................................................................. 39
Cromatografía: ............................................................................................................................ 39
Objetivo general: ......................................................................................................................... 42
Objetivos específicos: ................................................................................................................ 42
III. MATERIALES Y MÉTODOS: ........................................................................................... 43
Materiales: ................................................................................................................................... 43
Síntesis de Amidas con actividad inhibitoria al PAI-1: .......................................................... 46
Protección de los grupos hidroxilos ..................................................................................... 46
Formación del metil éster a partir del ácido carboxílico: .................................................. 48
Amidación: ............................................................................................................................... 49
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN: ........................................................................................ 54
Síntesis de Amidas con potencial actividad inhibitoria al PAI-1: ......................................... 54
Protección Grupos Hidroxilo ................................................................................................. 55
Protección del grupo carbonilo ............................................................................................. 60
Amidación: ............................................................................................................................... 63
Caracterización compuestos novedosos: ............................................................................... 72
Análisis de Actividad Biológica de los compuestos sintetizados: ....................................... 83
Lecciones aprendidas en el voluntariado en el Instituto Nacional Biodiversidad: ............ 87
Aislamiento de dépsidos de líquenes costarricenses: ...................................................... 87
Procedimiento de aislamiento de dépsidos de líquenes costarricenses: ...................... 89
Productos elucidados durante el entrenamiento en INBio: .............................................. 92
CONCLUSIONES ........................................................................................................................... 93
REFERENCIAS: ............................................................................................................................. 95
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Pasos básicos en el desarrollo de moléculas activas contra una enfermedad en específico. .......................................................................................................................................... 6 Figura 2. Cascada de eventos proteolíticos involucrados en el sistema plasminógeno/plasmina.(adaptado:(Manuel Nolasco et al., 2007)) ......................................... 8 Figura 3. A) Forma Activa del PAI-1 y B) forma latente del PAI-1(Dewilde, Strelkov, Rabijns, & Declerck, 2009). .......................................................................................................... 11 Figura 4. Inhibición de serinas proteasas (PA) por PAI-1(adaptado: (Lee & Huang, 2005). ........................................................................................................................................................... 12 Figura 5. Estructura de la Tiplaxtinina(ChemAxon, 2015) ...................................................... 17 Figura 6. Ejemplos de los derivados sintetizados por el grupo de Lawrence(Cale & Lawrence, 2007). ............................................................................................................................ 18 Figura 7. Ejemplos de las bis arilsulfonamidas sintetizadas por el grupo de Emal(El-Ayache et al., 2010). ...................................................................................................................... 19 Figura 8. Estructura del ácido lecanórico (izquierda) y el ácido 2’-O-metilanziaico (derecha).......................................................................................................................................... 20 Figura 9.Diagrama de los posibles productos que se desean sintetizar en el desarrollo del trabajo de investigación ................................................................................................................. 23 Figura 10. Mecanismo propuesto en la literatura para la formación cloruros de ácido(Montalbetti & Falque, 2005). .............................................................................................. 26 Figura 11.Mecanismo general de la formación de una amida a partir de un cloruro de ácido(Montalbetti & Falque, 2005). .............................................................................................. 27 Figura 12. Formación de anhídridos a partir de ácidos carboxílicos, empleando DCC para su formación(Montalbetti & Falque, 2005). ................................................................................ 28 Figura 13. Formación de Amidas a partir de un anhídrido(Montalbetti & Falque, 2005). .. 29 Figura 14. Mecanismo reportado para la formación de amidas utilizando CDI(Montalbetti & Falque, 2005). ............................................................................................................................. 30 Figura 15. Productos sintetizados con protección de hidroxilos(ChemAxon, 2015) .......... 46 Figura 16. Análisis retro sintético de la estructura de los dépsidos aislados. ((ChemAxon, 2015)................................................................................................................................................. 54 Figura 17. Mecanismo de metilación utilizando yodometano. ............................................... 56 Figura 18. Mecanismo de metilación utilizando sulfato de dimetilo. ..................................... 58 Figura 19. Mecanismo para la protección del ácido carboxílico ............................................ 61 Figura 20. Mecanismo de formación de haluros mediante PPh3(Nelson, 2007). ................ 64 Figura 21. Estructura del bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico. ................................................... 65 Figura 22. Formación del complejo de Vils Meier Hack(Zhang et al., 2009) ....................... 66 Figura 23. Ciclo Catalítico del N,N-DMF en la formación de cloruros de ácido(Montalbetti & Falque, 2005). ............................................................................................................................. 67 Figura 24. Amidas sintetizadas con potencial actividad inhibitoria al PAI-1. ....................... 68 Figura 25. Estructura del 3-cloro-2,4-dimetoxi-N-Fenilbenzamida. ....................................... 69 Figura 26. Mecanismo propuesto para la formación del compuesto clorado. ..................... 70
Figura 27. 1H RMN del 4-Amino-2-metilbenzoato de metilo tomado en cloroformo-d y referenciado con ese disolvente. Se muestran las integraciones y los desplazamientos químicos en azul. ............................................................................................................................ 73 Figura 28. HMBC mostrando las correlaciones de los metoxilos a 3.88 y el metilo a 2.64 δppm. ................................................................................................................................................ 74 Figura 29. Análisis reportado de la muestra X aportando la masa detectada y la formula molecular que le corresponde dentro de parámetros óptimos de detección y con un error de 2 ppm. ......................................................................................................................................... 74 Figura 30. Análisis reportado del 3-Cloro-2,4-dimetoxi-N-fenilbenzamida aportando la masa detectada y la formula molecular que le corresponde dentro de parámetros óptimos de detección y con un error de 2 ppm. ........................................................................................ 77 Figura 31. 1H RMN de la muestra 3-Cloro-2,4-dimetoxi-N-fenilbenzamida tomado en cloroformo-d y referenciado con ese disolvente. Se muestran las integraciones y los desplazamientos químicos en azul. ............................................................................................. 77 Figura 32. 13C de la muestra 3-Cloro-2,4-dimetoxi-N-fenilbenzamida tomado en cloroformo-d y referenciado con ese disolvente. Se muestran las integraciones y los desplazamientos químicos en azul. ............................................................................................. 78 Figura 33. Experimentos 2D HSQC tomado en cloroformo-d y referenciado con ese disolvente. Se muestran las correlaciones y desplazamientos químicos en azul. ............... 79 Figura 34. Experimento 2D HMBC tomado en cloroformo-d y referenciado con ese disolvente. Se aprecian las correlaciones pertinenes a la muestra. ...................................... 80 Figura 35. Simulaciones realizadas en el software MestreNova de distintos halógenos en la posición 4 del compuesto. Se determina que la simulación con Cl es la más semejante a la muestra. .................................................................................................................................... 81 Figura 36. Estructura elucidada mediante difracción de rayos X del 3-cloro-2,4-dimetoxi-N-fenilbenzamida ............................................................................................................................ 82 Figura 37. Ejemplo de amidas con diferencia en la planaridad de su estructura. .............. 84 Figura 38. Amidas con diferencias estructurales en su anillo aromático. ............................ 84 Figura 39. Actividad biológica correspondiente al compuesto N-fenil-2-metoxibenzamida. ........................................................................................................................................................... 85 Figura 40. Compuestos homólogos al compuesto A2-MOBz (estructura 9). ...................... 86
PARTE INTRODUCTORIA:
La interacción, integridad y buen funcionamiento de las células son parte
esencial en el mantenimiento del equilibrio y el buen funcionamiento del
organismo. Estas interacciones en las células son soportadas por una matriz
extracelular (MEC), las cuales cuentan con una constante remodelación regulada
principalmente por el sistema de activación plasminógeno/plasmina (encargado de
la degradación de componentes de la MEC como fibrina y colágenos)(Manuel
Nolasco, Salcedo, & Vázquez-Ortiz, 2007).
La importancia de este sistema se evidencia al existir una lesión en el
endotelio del sistema vascular que provoca la activación del sistema de
coagulación formando, mediante la vasoconstricción y la agregación de plaquetas,
un coágulo constituido principalmente por fibrina. La fibrina generada permite
desarrollar una estructura apropiada para que el sistema inmune corporal pueda
reparar el tejido dañado(Diebold, Kraicun, Bonello, & Görlach, 2008; Manuel
Nolasco et al., 2007).
El sistema plasminógeno/plasmina comprende una pro-enzima inactiva
denominada plasminógeno, que puede ser convertida a su forma activa por
activadores fisiológicos del plasminógeno, denominados el tisular (t-PA) y el tipo
uroquinasa (u-PA). Estos activadores son regulados por un inhibidor de plasmina
libre denominado α-2 plasmina y tres inhibidores de los activadores del
1
plasminógeno (PAI) (Désiré Collen, 2001). La concentración de
plasmina/plasminógeno y de fibrina/fibrinógeno son regulados cuidadosamente en
un delicado equilibrio denominado equilibrio hemostático.
Sin embargo, este sistema también ha sido ligado a condiciones patológicas
como enfermedades cardiovasculares, renales y pulmonares; además, con
enfermedades crónicas como cáncer, aterosclerosis, diabetes tipo 2 y se le ha
asociado un rol protagónico en la angiogénesis (generación de nuevos tejidos) ya
sea de origen fisiológico como tumoral(UNC Eshelman School of Pharmacy,
2015). Esta serie de padecimientos ha sido asociada al PAI-1, el principal inhibidor
de la fibrinólisis, en donde cumple una función vital en lo que respecta al equilibrio
hemostático mencionado anteriormente.
Es por esta razón que se propone a PAI-1 como un blanco para el
desarrollo de potenciales moléculas inhibitorias que puedan posteriormente
extenderse a terapias de cáncer, diabetes tipo 2 y obesidad. Por lo tanto, bajo la
premisa anterior se engloba la importancia del presente trabajo, el cual se centra
en el desarrollo de inhibidores del PAI-1.
2
I. ANTECEDENTES:
El descubrimiento de medicamentos ha evolucionado con el paso del
tiempo, para integrar nuevas técnicas, metodologías y estrategias; sin embargo la
meta continúa siendo la misma: encontrar nuevos compuestos activos para el
tratamiento de enfermedades. Históricamente, el desarrollo de medicamentos ha
estado ligado a principios activos obtenidos de plantas y de algunos
microorganismos. Estas sustancias aisladas eran de una consistente calidad, pero
con el inconveniente que solo pocas probaban tener una satisfactoria acción
terapéutica ó bien demostraban ser muy tóxicas o adictivas (caso de la morfina y
cocaína)(Patil, 2012).
La síntesis química ha dominado dentro de las estrategias pasadas y
actuales, en donde por un lado se reproducen motivos estructurales encontrados
en cientos de productos naturales bioactivos con el propósito de disminuir
toxicidad y aumentar selectividad, y por otro lado generar colecciones de cientos o
miles compuestos con variaciones estructurales pequeñas, para un tamizaje
acelerado de actividad biológica(Thomas, 2007).
Se considera que el primer desarrollo racional de un medicamento fue
realizado por Paul Ehlirch y Sacahiro Hata, los cuales desarrollaron el índice
quimioterapéutico con el cual se logró comparar la efectividad de distintos
medicamentos contra su nivel de toxicidad. Esta herramienta permitió a los
científicos evaluar las distintas moléculas existentes y definir cuáles podrían tener
3
un mayor impacto contra una enfermedad; aún hoy en día su variante moderna
conocida como índice terapéutico continúa siendo de gran ayuda para determinar
la efectividad de un medicamento(Thomas, 2007).
A partir de estos primeros indicios mencionados por Ehlirch y el desarrollo
de nuevas tecnologías, otros investigadores se dieron a la tarea de relacionar
cuantitativamente la estructura molecular de las drogas con su acción biológica
siendo pioneros en este tema Hansh y Fujita (primeros hallazgos en
Q.S.A.R.)(Thomas, 2007). A partir de estos primeros hallazgos, se determinó la
importancia del estudio del entorno molecular con el cual las moléculas activas
deben interactuar y que involucra: receptores, enzimas, cavidades en proteína y
glicoproteínas, entre otros. Así, se logró determinar la estrecha relación
Compuesto Activo/Sitio Receptor, y se determinó que un compuesto es más activo
cuando su estructura y distribución electrónica es complementaria con el sitio
receptor a la acción biológica deseada. Este concepto a su vez aportó la noción de
cómo la estructura influye a nivel biológico reflejándose en la observación de
efectos secundarios, los cuales pueden ser mitigados mediante la modelación de
los medicamentos.
4
De esta manera conceptos como la influencia de la estructura molecular en
la absorción, transporte, distribución y excreción molecular en un sistema biológico
tomaron mayor relevancia, proporcionando las herramientas necesarias para el
desarrollo de la rama de la ciencia conocida como Química Medicinal. Estos
conceptos han demostrado la importancia de la presencia de los diferentes grupos
funcionales a la hora de la activación o inactivación de un sitio activo, en donde
por ejemplo la modificación estructural provoca la potenciación o la disminución en
la actividad de una molécula(Patil, 2012; Thomas, 2007).
Bajo este mismo concepto, también se hizo obligatorio el conocimiento claro
del sitio activo (blanco molecular) en el cual se desea que la molécula diseñada
actúe. Esta concepción finalmente deriva en el estudio del acoplamiento y enlace
adecuado a la diana gracias al uso del modelaje molecular y de la evaluación en
pruebas biológicas de colecciones grandes de compuestos.
Estrategias modernas en el proceso de descubrimiento de medicamentos:
La aproximación moderna en el diseño y descubrimiento de moléculas
terapéuticamente activas radica principalmente en el desarrollo claro del objetivo
del proyecto que se desea desarrollar. Estos objetivos pueden abarcar desde
cambios en la farmacocinética de un compuesto existente, aislamiento de un
compuesto de un recurso novedoso, hasta el desarrollo de un compuesto
completamente nuevo(Zhao & Guo, 2009).
5
Se puede considerar que en el desarrollo y descubrimiento de moléculas
activas, en donde el punto de partida es mejorar la actividad farmacocinética con
respecto a otras moléculas ya existentes, se basa particularmente en 6 pasos:
Figura 1. Pasos básicos en el desarrollo de moléculas activas contra una enfermedad en específico.
Como se observa en la figura 1, el desarrollo debe partir de una 1)
investigación básica de la bioquímica relacionada a la enfermedad ó al proceso
biológico asociado, y usar la información reunida para decidir 2) el “blanco
molecular” al cual se desea enfocar el desarrollo de la molécula activa. Obtenida
esta información y determinado el blanco molecular en el cual se desea actuar, se
determina 3) qué estructuras moleculares en la literatura han mostrado actividad
biológica y qué modificaciones estructurales pueden potenciar los resultados
6. Pruebas Clínicas
5. Evaluación actividad biológica/Selección compuestos
4. Diseño de la ruta sintética/Sintésis compuestos
3. Hipótesis de estructuras activas sobre el blanco
2. Determinación Blanco Molecular
1. Investigación Básica/Valoración procesos bioquímicos
6
mostrados. A partir de la decisión de un “set” de moléculas con potencial actividad
4) se diseña la ruta sintética más eficiente para el desarrollo de los compuestos
con potencial actividad y se realiza la síntesis química(Patil, 2012; Thomas, 2007).
Finalmente los compuestos sintetizados se someten a 5) una evaluación biológica
para determinar su actividad con respecto al sistema biológico que está en
estudio, en donde los prospectos más prometedores finalmente pasan a la fase
más rigurosa 6) de pruebas clínicas (Thomas, 2007).
En el caso del presente trabajo final de graduación, a continuación se
expondrá una revisión del proceso realizado para la selección del PAI-1 como
blanco molecular enfocado a su papel determinante en el sistema
plasminógeno/plasmina.
PAI-1 y su papel en el sistema plasminógeno/plasmina
El sistema plasminógeno/plasmina juega un rol vital en la modulación de
hemoestasis, trombosis y otros procesos biológicos. La labor principal que lleva a
cabo es la conversión de plasminógeno (zimógeno) a plasmina (forma activa),
mediante dos activadores fisiológicos del plasminógeno: el tisular (t-PA) y el tipo
uroquinasa (u-PA)(Désiré Collen, 2001),(Fay, Garg, & Sunkar, 2007). Ahondando
en su composición estructural, todas las enzimas presentes en este sistema son
serinas proteasas (presenta la tríada catalítica de serina, ácido aspártico e
histidina) y sus inhibidores pertenecen a la superfamilia de las serpinas
(inhibidoras de serinas proteasas)(D Collen, 2001).
7
El sistema plasminógeno/plasmina participa tanto en el proceso de
degradación de la matriz extracelular como de tejidos “sólidos” dentro del sistema
sanguíneo, por lo que se considera que participa activamente en el proceso de
fibrinólisis. La fibrinólisis consiste en la remodelación de los componentes de la
MEC que se genera mediante una cascada de eventos proteolíticos (figura 2).
Figura 2. Cascada de eventos proteolíticos involucrados en el sistema plasminógeno/plasmina.(adaptado:(Manuel Nolasco et al., 2007))
8
La activación del sistema se da cuando el organismo percibe un daño en el
endotelio, que provoca la activación del sistema de coagulación, formando
mediante la vasoconstricción y la agregación plaquetaria un coágulo constituido
principalmente por fibrina (trombo), el cual sirve de soporte para la recuperación
de la lesión(M Nolasco, Salcedo, & Vázquez, 2007).
La remoción del coágulo (ver figura 2) se da al activarse el plasminógeno: la
conversión de plasminógeno a plasmina se realiza por una proteólisis parcial,
propiciada por la serina proteasa PA (activador del plasminógeno) la cual puede
ser de 2 tipos: tisular (t-PA) y uroquinasa (u-PA). De esta manera la plasmina
generada participa en la degradación de los coágulos (trombos) produciendo la
fibrinólisis del complejo de fibrina.
La regulación de la degradación de fibrina en fibrinógeno en este sistema es
llevada a cabo mediante 2 componentes: α-2 plasmina y los inhibidores de los
activadores del plasminógeno (P.A.I por sus siglas en inglés)(Gorlatova et al.,
2007). El α-2 plasmina se encarga de inhibir el exceso de plasmina libre, y
mediante esta inhibición se evita la degradación de los trombos. Por otra parte el
PAI, mediante la inhibición de los activadores del plasminógeno, evita que se
genere plasmina impidiendo la remoción del coágulo. De los inhibidores de los
activadores del plasminógeno, el PAI-1 se considera como el principal inhibidor de
la fibrinólisis representando un rol vital en lo que respecta a la hemostasia.
9
De esta forma ya que PAI-1 es un factor clave en el sistema
plasminógeno/plasmina, y a su vez se ha asociado a varias enfermedades, este
inhibidor se perfila como un objetivo prometedor para el desarrollo de moléculas
que lo inactivan.
PAI-1: Blanco para el desarrollo de moléculas con actividad biológica
El PAI-1 comprende a una gran glicoproteína de alrededor de 50 kDa, la
cual pertenece a una superfamilia de inhibidores de proteasas denominadas
serpinas(Yepes, Loskutoff, & Lawrence, 2007). Su estructura terciaria exhibe 3
láminas β, nueve hélices α y un bucle (RCL) que contiene el sitio activo de Arg
346-Met 347, los cuales son designados como P1-P1’, que actúan directamente
en la inhibición de las serinas proteasas. Presenta la particularidad de poseer 2
formas conformacionales: una forma activa que mantiene expuesto el bucle
reactivo y una forma latente la cual inserta dentro de la lámina β principal, su bucle
central reactivo inhibiendo su capacidad para interactuar con los sustratos(M
Nolasco et al., 2007). Este paso de su forma activa a latente se ha asociado a
varios factores entre ellos: a una estabilización espontánea, disminución del pH e
interacción con moléculas en el sitio activo; en donde esta última ha sido objeto de
estudio para el desarrollo de inhibidores de la misma (figura 3).
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Figura 3. A) Forma Activa del PAI-1 y B) forma latente del PAI-1(Dewilde, Strelkov, Rabijns, & Declerck, 2009).
En el caso de su papel como inhibidor, el PAI-1 forma un complejo
estequiométrico 1:1 con su proteasa diana (t-PA ó u-PA) en el bucle reactivo
(RCL), en donde inhibe a esta mediante una rápida formación de un enlace
covalente entre el sitio activo (hidroxil serina) de PA y el grupo carbonílico del
residuo P1 de PAI-1; una vez finalizado este proceso el complejo covalente lleva a
cabo un cambio conformacional para optar por una forma más estable(Lee &
Huang, 2005). (Figura 4)
11
Figura 4. Inhibición de serinas proteasas (PA) por PAI-1(adaptado: (Lee & Huang, 2005).
Su papel a nivel fisiológico radica en la inhibición uPA y tPA, en donde
mediante la interacción de los complejos PAI-1-uPA ó PAI-1-tPA provoca la
inhibición de las proteasas mencionadas y por lo tanto evita la formación de la
plasmina que se utiliza en la degradación de la MEC (Matriz Extracelular) y en la
fibrinólisis. Esta regulación es vital para mantener la interacción correcta en el
equilibrio dinámico dentro de la MEC, sin embargo se ha visto involucrada en un
12
gran número de enfermedades, en donde el efecto de ésta es muy variable
dependiendo la patología (Manuel Nolasco et al., 2007).
La remodelación de la Matriz Extracelular y su relación con distintas
enfermedades
La Matriz Extracelular (MEC) es una estructura altamente dinámica que
presenta un delicado equilibrio en lo que respecta al desarrollo y la hemoestasis
de los tejidos. Este entretejido que rodea las células es altamente complejo y
específico en lo que respecta a su composición y función, mostrando un alto grado
de organización y evolución en su funcionamiento. En los componentes que
presentan un considerable esfuerzo como huesos, cartílagos y tendones, MEC le
confiere un mayor soporte en lo que respecta a propiedades mecánicas(Lu, Takai,
Weaver, & Werb, 2011).
Se conoce que la MEC es una organización que presenta un constante
recambio de los componentes que la conforman. Este tipo de remodelación, la
cual puede darse por un cambio de componentes menguados ó dañados, afecta
directamente a la célula modificando su metabolismo, expresión génica e incluso
su morfología debido a que las proteínas que las conforman pueden estar en
contacto directo con la superficie celular(Manuel Nolasco et al., 2007).
13
PAI-1 ayuda a mantener la integridad de la MEC de dos maneras: 1)
bloquea directamente la acción de u-PA que desemboca en la disminución de la
actividad proteolítica de la plasmina, 2) reduce los niveles de u-PA activo en la
superficie celular, lo que aumenta la endocitosis provocada por el receptor de
lipoproteína de baja densidad (LRP), y promueve la fibrosis.
Sin embargo se pueden dar cambios anómalos en la matriz que se reflejan
en comportamientos anormales a nivel celular tanto en proliferación como en
disminución de la actividad celular, por lo que en ocasiones se genera el inicio de
enfermedades desde fibrosis de tejidos hasta cáncer(Lu et al., 2011).
Por ejemplo, se ha determinado que la disminución o aumento de las
funciones de ciertos elementos de la MEC, provoca una serie de defectos en la
morfogénesis de la ramificación del epitelio (proceso en el cual un grupo de
células expanden su área superficial). En el caso de la MEC presente en huesos
maduros, es continuamente remodelada por la actividad de los osteoclastos que
degradan la matriz ósea y de los osteoblastos que regeneran la matriz ósea; al
presentarse un desbalance en este equilibrio se observa que enfermedades como
osteopetrosis, osteopenia y osteoporosis se hacen presentes(Lu et al., 2011).
14
A su vez se ha determinado que una deficiencia de plasminógeno
promueve el desarrollo de aterogénesis, daño en múltiples órganos y
enfermedades sistémicas. En el estudio del sistema plasminógeno/plasmina y sus
implicaciones en diversas enfermedades se resalta el papel del inhibidor del
plasminógeno tipo I (PAI-1) el cual ha demostrado en distintos estudios su rol
esencial en el desarrollo de enfermedades relacionadas a patologías
vasculares(Fay et al., 2007).
Resultados preliminares en la inhibición del PAI-1
El mecanismo por medio del cual PAI-1 participa en el desarrollo de
enfermedades, actualmente no es totalmente claro. Se cree puede actuar por la
ruta de la fibrinólisis, a través de la regulación de los activadores del
plasminógeno, o bien influenciar directamente la remodelación de tejidos a través
de la migración celular. Sin embargo no hay certeza sobre cómo interviene,
aunque si se le ha asociado a la aparición de las enfermedades citadas.
Por otro lado la estructura flexible del PAI-1 y su complejo sitio activo limitan
el desarrollo de nuevos compuestos inhibitorios(Gorlatova et al., 2007). Sin
embargo, ha habido esfuerzos concretos en el desarrollo de moléculas pequeñas
que inhiban el PAI-1. Inicialmente estos esfuerzos se concentran en el estudio de
los residuos arginina (Arg103) presente en la vitronectina, inhibidor natural de
éste.
15
La vitronectina es una glicoproteína de alrededor de 75KDa con la
particularidad de interactuar con varios componentes de la MEC. Su estructura
está compuesta por varios dominios, en donde destaca el dominio Somatomedina
B (SMB por sus siglas en inglés) que presenta una alta afinidad para el PAI-1 en
su forma activa. La afinidad del PAI-1 a la vitronectina (Vn) se ha asociado a un
simple mecanismo de estabilización, en donde el complejo formado entre PAI-Vn
disminuye la velocidad de transición del PAI a su forma latente al bloquear el
deslizamiento de las hebras de éste hacia dentro de su lámina β. Esto provoca
que la especificidad del PAI-1 se altere, provocando que no pueda realizar la
inhibición de serinas proteasas(Schröck, 2004)(Zhou, Huntington, Pannu, Carrell,
& Read, 2003).
Un ejemplo de un compuesto que ha mostrado presentar una inhibición
similar a la vitronectina es el compuesto PAI-039, mejor conocido como
tiplaxtinina. Este fue descubierto mediante un tamizaje de librerías de compuestos,
y ha mostrado reducir los efectos fisiológicos del PAI-1 en modelos animales(Cale
et al., 2010) infiriéndose que participa en la inhibición por un mecanismo asociado
al sitio activo de enlace de vitronectina.
16
La tiplaxtinina (ver figura 5) presenta un perfil prometedor inhibitorio in vitro
e in vivo; pero con la complicación de no poseer una alta afinidad por PAI-1 y ser
inhibido por la presencia del cofactor vitronectina (Elokdah & Abou-Gharbia, 2004;
Gorlatova et al., 2007). La tiplaxtinina desarrollada por el equipo de Wyeth Ayerst,
demuestra que derivados del ácido indoloxacético pueden presentar perfiles
prometedores de inhibición(Cale & Lawrence, 2007).
Figura 5. Estructura de la Tiplaxtinina(ChemAxon, 2015)
Los resultados obtenidos con tiplaxtinina, han desencadenado el interés de
probar otros motivos estructurales. Dentro de estas iniciativas destaca el trabajo
realizado por Daniel Lawrence (Universidad de Michigan) y colaboradores. Los
investigadores realizaron inicialmente un tamizaje agresivo de una librería de
compuestos sintéticos y naturales, de los cuales cinco comprenden compuestos
polifenólicos de origen natural e inhiben al PAI-1. A partir de estos hallazgos se
diseñó una segunda generación de compuestos, con la intención de probar la
relación estructura-actividad de los compuestos polifenólicos. Se encontró que los
derivados estudiados de ésteres del ácido gálico (figura 6) presentaron actividades
17
en el orden de 10 a 200 nM, lo cual es un incremento de 10 a 1000 veces en lo
que respecta a actividad al PAI-1 comparado con otros resultados previamente
reportados(Cale et al., 2010).
O
O
O
O
O
O OHOH
OHOH
HO
HO
OHHO
HO
O
OO
OHO
HOOH
OH
OHOH
CDE-082 CDE-008
Figura 6. Ejemplos de los derivados sintetizados por el grupo de Lawrence(Cale & Lawrence, 2007).
En otro estudio efectuado por Daniel Lawrence en colaboración con Cory
Emal (Universidad del Este de Michigan), se ensayaron bisarilsulfonamidas
(Figura 7) y arilsulfonamidas que mostraron una mayor actividad inhibitoria que la
tiplaxtinina. La estrategia en esta ocasión consistió en desarrollar compuestos con
2 residuos polifenólicos unidos por unidades de distintas longitudes a través de
una función sulfonamida. La decisión de utilizar sulfonamidas respondió a que este
tipo de grupo funcional es ampliamente utilizado en el ámbito farmacéutico, y la
extensión de cadena permite acceder a una mayor diversidad estructural. Este
trabajo determinó la importancia de la sustitución de los hidrógenos ácidos de los
grupos hidroxilos de los anillos aromáticos por motivos más hidrófobos y la
extensión de la cadena que une a los dos grupos arilos, en la que sugiere una
18
relación intrínseca de los mismos con el aumento en la actividad inhibitoria (El-
Ayache, Shin-hon, Warnock, Lawrence, & Emal, 2010).
SO
NN
SO
MeO
MeOOMe
OMe
O
OS
O
NN
SO
HO
HOOH
OH
O
O
Figura 7. Ejemplos de las bis arilsulfonamidas sintetizadas por el grupo de Emal(El-Ayache et al., 2010).
El tamizaje realizado por Lawrence incluyó una colección de extractos que
se habían generado por el Instituto Nacional de Biodiversidad (INBio) en el marco
del Proyecto ICBG (International Cooperative Biodiversity Groups) en ejecución
desde el año 2005 y en estrecha colaboración con el Dr. David Sherman de la
Universidad de Michigan. Mediante un fraccionamiento guiado por bioensayo de
extractos etanólicos de líquenes (asociaciones simbióticas entre un alga y un
hongo que podría incluir o no una cianobacteria)(Chaves, Lucking, Sipman, &
Umaña, 2009) se determinó que los compuestos ácido lecarónico, y el ácido 2’-O-
metilanziaico, presentaban una prometedora actividad inhibitoria ante el PAI-1
(Figura 8).
19
Figura 8. Estructura del ácido lecanórico (izquierda) y el ácido 2’-O-metilanziaico (derecha).
El ácido lecanórico (ver figura 8) se ha asociado a la inhibición de la
histamina descarboxilasa como hemoestasis microcirculatoria, secreción gástrica,
inflamación y algunas funciones neuronales20, antioxidante21 y antimicrobiana
contra la tuberculosis22.
En resumen, varios investigadores han enfocado sus esfuerzos al estudio
de compuestos capaces de inhibir la actividad del PAI-1. Cabe destacar las
alianzas estratégicas del Instituto Nacional de Biodiversidad (específicamente de
la Unidad de Bioprospección) entorno a la investigación en productos naturales
como potenciales inhibidores en el marco del Proyecto ICBG (International
Cooperative Biodiversity Groups). El trabajo de este instituto junto con la
colaboración de la Universidad de Michigan ha permitido perfilar un proyecto de
química medicinal, brindando su apoyo y experiencia en lo pertinente a técnicas
de purificación y caracterización de compuestos con similitudes.
20
A su vez se debe destacar el apoyo del Dr. Daniel Lawrence y el Dr. David
H. Sherman, los cuales han brindado su experiencia en la evaluación de la
actividad biológica de compuestos con actividad prometedora desde la División de
Medicina Interna de la Escuela de Medicina de la Universidad de Michigan, Ann
Arbor.
21
Hipótesis del trabajo
Basados en los resultados reportados y expuestos anteriormente, se han
planteado varios postulados los cuales se desean validar:
1. La labilidad de la función éster en los compuestos inhibitorios reportados
por Lawrence provoca que estos presenten una menor actividad biológica in
vivo. Por lo tanto, la sustitución de esta función por una amida, más robusta
y menos lábil, aumentaría su vida media en sistemas in vivo.
2. La planaridad de las moléculas puede influir directamente en la actividad
biológica al PAI-1. Por ello, el aumentar la flexibilidad de los compuestos
puede afectar directamente la actividad biológica de las moléculas.
3. Se ha evidenciado una relación entre la actividad biológica y la protección
de los grupos hidroxilos, por lo que se infiere que una disminución de la
hidrofilicidad provoca que los compuestos adquieran mejores
características como componentes activos.
22
De esta manera se plantea la síntesis de los siguientes derivados:
Figura 9.Diagrama de los posibles productos que se desean sintetizar en el
desarrollo del trabajo de investigación
23
II. MARCO TEÓRICO:
Síntesis de Amidas:
La formación de amidas se considera esencialmente una reacción de
condensación, en la cual se produce un equilibrio constante y dinámico que
involucra fuerzas termodinámicas. Estas fuerzas involucran el equilibrio entre la
formación de la amida y sus precursores: la formación del enlace carbono-
nitrógeno contra la escisión vía hidrólisis(Montalbetti & Falque, 2005).
Este proceso de condensación, basándose en que se parte de un ácido
carboxílico y una amina, se ve comprometido por dos pasos vitales: activación del
ácido y la aminólisis. La activación del ácido se refiere a transformar al grupo
carboxílico a una función mucho más reactiva para facilitar el acoplamiento de la
amina, y así proceder a la aminólisis para obtener la amida de interés(Montalbetti
& Falque, 2005).
Por lo tanto, llevar a cabo una amidación exitosa puede considerarse en
muchos casos un proceso estratégico, en el cual se debe tomar en cuenta:
1. El tipo de reactivo que se utilizará para activar el ácido carboxílico
2. El intermediario que se acoplará a la amina en el proceso de amidación
3. La amina que se desea acoplar.
Estos parámetros deben ser estudiados cuidadosamente para evitar
disminuir los problemas típicos que acarrean este tipo de síntesis: bajos
24
rendimientos, racemización, degradación y dificultades en la purificación de los
compuestos. A continuación se citarán los métodos clásicos citados por la
literatura en la formación de amidas:
Amidación mediante la formación de haluros de acilo: Los haluros de acilo,
comúnmente llamados haluros de ácido, son uno de los intermediarios más
sencillos para la síntesis de amidas. Este tipo de síntesis consiste en dos pasos, la
formación del compuesto activado y el acoplamiento con la amina. En la familia de
los haluros de ácidos el más común es el cloruro de ácido el cual es el más usado
en sus aplicaciones de acoplamientos, sin embargo la literatura también reporta la
utilización de bromuro de acilo y fluoruro de acilo(Pattabiraman & Bode, 2011).
La formación del cloruro de ácido, es realizada con reactivos comerciales
como el cloruro de tionilo (SOCl2), cloruro de fosforilo (POCl3) y tricloruro de
fosforo(PCl3), entre otros(Montalbetti & Falque, 2005), los cuales reaccionan con
un ácido carboxílico para dar lugar al compuesto de interés. El mecanismo
aceptado para la formación de estos compuestos es el siguiente:
25
Figura 10. Mecanismo propuesto en la literatura para la formación cloruros de ácido(Montalbetti & Falque, 2005).
Uno de los mayores inconvenientes de la utilización de estos agentes de
halogenación es la producción de HCl (g) durante la formación del cloruro de ácido.
Debido a esto, varios autores recomiendan la utilización de una base no
nucleofílica (ejemplo: trietilamina) durante la reacción para mantener las
condiciones básicas del medio(Pattabiraman & Bode, 2011).
En lo que respecta al acoplamiento del cloruro de ácido (forma activada del
ácido carboxílico) con la amina, está se lleva a cabo en un medio seco para evitar
la descomposición del derivado activado del ácido. A su vez, se utiliza una
cantidad equivalente de base no nucleofílica (trietilamina, Base de Huning, entre
otras) para evitar la conversión de la amina a su forma inactiva como sal-
HCl(Pattabiraman & Bode, 2011). Por otro lado, la reacción puede ser acelerada
mediante la adición de una gota de DMF, una cantidad catalítica de DMAP ó
piridina, los cuales generan intermediarios más robustos con grupos voluminosos
26
que facilitan el acoplamiento (figura 11)(Han & Kim, 2004; Montalbetti & Falque,
2005).
Figura 11.Mecanismo general de la formación de una amida a partir de un cloruro de ácido(Montalbetti & Falque, 2005).
Cabe mencionar que el acoplamiento utilizando este tipo de reactivos,
aunque representa una opción ampliamente estudiada de un acoplamiento
relativamente sencillo, presenta los inconvenientes de ser susceptibles a la
hidrólisis, racemización, escisión de grupos funcionales y la posibilidad de tener
reacciones alternas a las esperadas en el proceso.
Amidación a partir de la formación de anhídridos: Los anhídridos son conocidos
por su reactividad hacia una amplia gama de nucleófilos como tioles, alcoholes y
aminas. La formación del anhídrido se realiza a partir de una forma menos reactiva
(ejemplo un ácido carboxílico), y seguidamente se aprovecha su reactividad
haciéndolo reaccionar con la amina deseada.
La formación de anhídridos, en general se realiza mediante el
calentamiento de equivalentes del respectivo ácido en presencia de 1 equivalente
de un reactivo que permita la formación del anhídrido. La literatura recomienda la
27
diciclohexilcarbodiimida (DCC), reacción que reporta excelentes rendimientos
mediante su fuerza motriz que es la formación de un derivado de urea como
subproducto(Montalbetti & Falque, 2005).
Figura 12. Formación de anhídridos a partir de ácidos carboxílicos, empleando DCC para su formación(Montalbetti & Falque, 2005).
El anhídrido generado, puede reaccionar con la amina seleccionada
formando el compuesto deseado. Este método presenta la ventaja de no necesitar
una base adicional, ya que el ión carboxilato se genera de forma in situ. El factor
limitante para este tipo de síntesis es la utilización de 2 equivalentes de ácido en la
formación del anhídrido, lo cual significa que uno de los equivalentes es
desechado. Este factor es importante si el ácido con el que se trabaja es costoso ó
se tiene una cantidad limitada de éste.
28
Figura 13. Formación de Amidas a partir de un anhídrido(Montalbetti & Falque, 2005).
Debido a estos inconvenientes, también se han encontrado otras
alternativas “asimétricas” en las cuales se puede formar un anhídrido reactivo sin
la necesidad de utilizar 2 equivalentes de ácido. Entre las opciones que muestra la
literatura se destacan la formación de intermediarios aciloxoboro y la utilización de
carbodiimidas como agente acoplante.
Amidación utilizando Diimidazolcarbonilo (CDI)
Los diimidazolcarbonilos (CDI) son reactivos para las reacciones de
acoplamientos, ya que representan una opción de formación de amidas mediante
la técnica “one-pot”. Esta reacción presenta la ventaja de no necesitar la activación
del ácido carboxílico en el medio, no hay generación de HCl(g), y la reacción es
termodinámicamente favorecida por la liberación de CO2. Debido a las ventajas
que presenta es generalmente utilizada en reacciones de péptidos a nivel
industrial. (figura 14)(Montalbetti & Falque, 2005).
29
Figura 14. Mecanismo reportado para la formación de amidas utilizando CDI(Montalbetti & Falque, 2005).
Amidación mediante la utilización de sales de fosfonio:
El hexafluorofosfato de benzotriazolil-N-oxi-tris(dimetilamino)fosfonio,
conocido como el reactivo de Castro, es una opción en la formación de enlaces
peptídicos muy utilizada a nivel sintético. El acoplamiento utilizando este tipo de
reactivos que se da de manera “one pot”, ocurre mediante la mezcla del ácido, la
amina en presencia del reactivo de Castro y una amina terciaria o base de Huning.
La fuerza motriz que mueve a este tipo de reacción es la formación espontánea
del óxido del reactivo de Castro. El inconveniente del reactivo de Castro y sus
homólogos, es la generación de subproductos tóxicos como la triamida
hexametilfosfórica. Adicionalmente este tipo de reacciones deben darse en
condiciones de humedad mínima(Montalbetti & Falque, 2005).
30
Metodologías Modernas para la formación de amidas:
Debido a la importancia de la formación de amidas a nivel sintético, se han
investigado otras alternativas que permitan la formación de este tipo de
compuestos. Entre las metodologías actuales se puede mencionar el empleo de
ácidos borónicos, catálisis organocatalítica, utilización de proteasas y amidas y
utilización de microondas.(Montalbetti & Falque, 2005)
Los ácidos borónicos, se utilizan como agentes acoplantes los cuales
generan un éster activo el cual a su vez genera la amida deseada con la formación
de un residuo el cual se utiliza en reacciones posteriores. La catálisis
organocatalítica por su parte representa una opción con altos rendimientos, en
donde se utiliza paladio o cobre/plata, con los beneficios de una excelente
economía de átomos sin la necesidad de aditivos como bases ó ácidos para la
formación de la amida.(Montalbetti & Falque, 2005)
Metilación de grupos hidroxilos fenólicos:
La protección de grupos fenólicos, se puede considerar muy similar a la
química utilizada en la protección de alcoholes, con la salvedad que hay una
diferencia considerable de pKa entre ambos grupos funcionales(Greene & Wutz,
2007). Esta diferencia de pKas provoca que el proceso de protección y escisión
varíe considerablemente entre grupos funcionales, por ejemplo: la protección
31
mediante metil ésteres en alcoholes se considera poco práctica y engorrosa,
siendo todo lo contrario en fenoles(Clayden, Geeves, & Warren, 2012).
Históricamente, el método más conocido para la metilación de fenoles es
mediante la reacción del fenóxido con un haluro de alquilo. Este método se conoce
como la reacción de Williamson, enunciada en 1850, y presenta el inconveniente
de realizarse en condiciones agresivas, por lo que con los años se ha desarrollado
métodos más efectivos para la protección de hidroxilos.(Clayden et al., 2012)
Hoy en día predomina la utilización de agentes metilantes como MeI y
Me2SO4. Ambos agentes metilantes se reportan en la literatura como opciones
eficaces para la metilación de fenoles, siendo la utilización de sulfato de dimetilo la
más indicada en la protección de más de un equivalente de hidroxilo. El
mecanismo que predomina en este tipo de adición es de tipo SN2, en donde bases
fuertes no son requeridas debido al incremento de la acidez de los hidroxilos
aromáticos. Esto a su vez obliga a examinar la acidez individual de los
compuestos fenólicos, si existe más de uno dentro del anillo aromático, ya que
esta característica puede provocar reacciones alternas que disminuyen el
rendimiento de la reacción(Furniss, Hannaford, Rogers, Smith, & Tatchell,
1989),(Bruckner, 2010).
32
Otra opción de metilación de hidroxilos fenólicos consiste en la utilización
de compuestos más reactivos como lo es el diazometano en éter dietílico, con la
dificultad de que el diazometano es un compuesto altamente reactivo y engorroso
de utilizar a nivel de laboratorio(Greene & Wutz, 2007; Morgan, 1990).
Caracterización química:
La caracterización química es un componente vital para la determinación
del éxito en lo que respecta a la síntesis de productos químicos. Desde este punto
vista, la espectroscopia ha brindado herramientas vitales para la identificación de
los productos generados mediante síntesis, siendo la espectroscopia de
resonancia magnética nuclear una de las herramientas más versátiles en este
campo(Macomber, 1998),(Silverstein, Webster, & Kiemle, 2005).
La resonancia magnética nuclear consiste en el estudio de la estructura
molecular a través de la medición de la interacción de un campo de radio-
frecuencia oscilante con un espín nuclear inmerso en un fuerte campo magnético.
A partir de esta técnica se puede obtener información detallada sobre estructura
molecular que puede resultar difícil, o incluso imposible mediante otra
técnica(Macomber, 1998).
En lo que respecta a la técnica requiere de núcleos atómicos que posean
una propiedad particular llamada espín. Esta propiedad la poseen elementos que
tengan masa impar, número atómico impar o ambos. Se considera que los núcleos
33
más comunes que poseen espín son el
34
Precisando un poco más en lo que respecta a un espectro protónico, es un
espectro el cual su escala abarca de 0 a 14 ppm. En este tipo de espectros se
puede inferir mediante el desplazamiento químico y su acoplamiento entre las
señales, el tipo de ambiente químico que presentan los protones del compuesto.
Por otro lado un espectro
, permite determinar el número de átomos de carbono no equivalentes presentes e identificar a qué tipo de grupo pertenecen (metilo, metileno, metino, aromático, carbonilo), y por lo tanto elucidar el esqueleto al cual pertenecen la molécula. Al igual que un espectro protónico, la electronegatividad, la hibridación y el efecto anisotrópico provocan diferencias en los desplazamientos químicos(Silverstein et al., 2005). Una diferencia considerable con los espectros protónicos, es que rutinariamente los espectros
35
frecuencias de dos núcleos idénticos (homonuclear) o distintos (heteronuclear).
Esta técnica es de gran ayuda cuando se desea revelar y corroborar la estructura
de un compuesto con una estructura molecular compleja, en donde se observa
claramente la correlación entre protones y sus vecinos, carbonos con protones y
carbonos con hidrógenos a más de un enlace de distancia(Macomber, 1998).
Ente los experimentos más utilizados en 2D se pueden citar el 1H COSY,
HSQC y HMBC. Los experimentos de resonancia magnética nuclear denominados
COSY, reciben su nombre del nombre COrrelation SpectroscopY, la cual consiste
en un complejo sistema de interacción de espines entre protones que permite
relacionar su acoplamiento a núcleos adyacentes y vecinos. En general permite
ubicar de manera detallada el acoplamiento entre protones (experimento
homonuclear) y así elucidar la estructura de un componente (ubicando la posición
de los protones en un esqueleto de carbono). Por otro lado las técnicas
heteronucleares se pueden considerar muy similares a COSY con la diferencia de
que se obtienen correlaciones entre 2 distintos núcleos (el más común entre 13C y
1H) ya sea a 1 enlace de distancia o más.
A su vez una técnica que se ha consolidado como vital para la elucidación
estructural de compuesto es la espectrometría de masas. En esta técnica en lugar
de medir características de moléculas individuales, el espectrómetro de masas
debe generar iones para que puedan ser movidos y manipulados con campos
eléctricos y magnéticos externos. El espectrómetro de masas está conformado por
36
3 partes esenciales: la fuente de ionización, el analizador y el detector. De esta
manera, la muestra al ingresar a la fuente de ionización es ionizada, y es
acelerada al analizador en donde los iones se separan basados en su relación
masa:carga (m/z). Los iones separados son percibidos por el detector y
almacenados respecto a su abundancia, permitiendo generar un espectro m/z.
La información que provee el espectrómetro va a depender, entre otras
cosas, de su capacidad resolutiva y de la fuente de ionización empleada. En una
primera instancia, se pretende obtener el peso molecular de un compuesto; si el
espectrómetro tiene analizadores con una capacidad de resolución alrededor de
10,000, se puede obtener la masa exacta con cuatro decimales, con la cual se
puede obtener la fórmula del compuesto dentro de un margen de error menor a 3
ppm (por ejemplo con un analizador de cuadrupolo acoplado a tiempo de vuelo).
Adicionalmente, dependiendo del tipo de fuente de ionización, se pueden obtener
patrones de fragmentación que se generan durante la ionización de las moléculas.
Los iones moleculares son energéticamente inestables y en ocasiones presentan
escisiones en fragmentos más pequeños, en el caso más sencillo, un ión positivo y
un radical libre no cargado. El ión positivo viajará a través del espectrómetro y
producirá una señal en el espectro, en donde mediante los diferentes señales se
pueden proponer reacciones de escisión que confirman la estructura del
compuesto propuesto(Silverstein et al., 2005).
37
Por otro lado la difracción de rayos X con monocristal se ha convertido en
otra herramienta de gran ayuda para la corroboración estructural de compuestos
orgánicos. Esta técnica no destructiva proporciona información detallada sobre la
red interna de sustancias cristalinas, dimensiones unitarias, longitudes y ángulos
de enlace. La técnica consiste en un haz de rayo x que pasa por un mono-cristal
que interactúa con sus electrones y se refleja en un patrón de dispersión único. A
su vez, el detector de área recopila múltiples imágenes mientras el cristal rota en
el rayo x. Finalmente mediante análisis computacional intensivo se logra generar
un estructura tridimensional de la molécula. Aunque es una técnica de alta
exactitud para la corroboración estructural, tiene la desventaja de necesitar un
cristal de alta pureza para la realización adecuada del experimento(C. Clark &
Dutrow, 2016; Kenkel, 2014).
Técnicas de purificación:
Al finalizar todo proceso de síntesis, la presencia de excesos de reactivos,
reacciones secundarias y disolventes, provoca que el producto obtenido se
encuentre en mezcla. Por lo tanto para la separación y elucidación de productos
sintetizados se necesitan varias técnicas misceláneas para la obtención del
producto puro. A continuación las técnicas más utilizadas:
38
Cristalización:
Esta es la técnica más simple de purificación, la cual consiste en un
proceso en el cual moléculas del producto de interés generan una red cristalina de
elevado grado de ordenación excluyendo la participación de impurezas. Este
proceso se realiza en un medio/disolvente en donde el producto es soluble a altas
temperaturas e insoluble a temperaturas menores. De esta manera al enfriar la
disolución se sature el sistema y se produce la cristalización de manera
espontanea(Clayden et al., 2012).
Por lo general se recomienda la utilización de un disolvente con un punto de
ebullición que sobrepase los 60°C pero no exceda los 100°C y a su vez que sea
menor a 10°C del punto de ebullición del producto a cristalizar. En el proceso de
cristalización en sí, el enfriamiento debe producirse lentamente para que la
formación de cristales se haga de manera progresiva y se excluya las impurezas
dentro de la estructura cristalina.
Cromatografía:
La cromatografía es la técnica por excelencia para la separación de
compuestos, la cual consiste en la separación de componentes de una mezcla
mediante un sistema bifásico equilibrado. El éxito de la separación va a depender
de la distribución de sus componentes: fase móvil, fase estacionaria y la mezcla a
separar. La fase móvil, la cual puede ser un gas o un líquido, se utiliza para
39
transportar los componentes de la mezcla a través de la fase estacionaria. La fase
estacionaria por su parte es una estructura fija que permite separar los
componentes mediante afinidad hacia la misma(Hostettmann, Hostettmann, &
Marston, 1985).
Entre las técnicas cromatográficas más importantes se encuentran:
cromatografía de capa fina (CCD o TLC, thin layer chromatography),
cromatografía preparativa de capa fina (CCP o PTLC preparative thin layer
chromatography), cromatografía en columna (CC) cromatografía líquida al vacío
(VLC del inglés vacuum liquid chromatography), y cromatografía de alta eficiencia
(CLAR) (Hostettmann et al., 1985; Kenkel, 2014).
La cromatografía de capa fina consiste en un soporte (plástico, aluminio ó
vidrio) el cual presenta una capa depositada de un adsorbente (gel de sílice,
alúmina o celulosa); se aplica la muestra sobre la parte inferior de la placa y esta
se coloca posteriormente en un recipiente cromatográfico de modo que solo una
parte inferior de la placa sea sumergida en el disolvente. Existe la variante
conocida como cromatografía preparativa de capa fina, en la cual se prepara la
placa cromatográfica con el grosor de adsorbente deseado, lo que permite utilizar
una cantidad mayor de muestra en la aplicación y separar componentes para ser
analizados posteriormente(Hostettmann et al., 1985).
40
A medida que el disolvente sube a través de la placa establece un
equilibrio entre las moléculas adsorbidas y el disolvente, provocando que las
afines al disolvente se muevan hacia arriba de la placa. De esta manera,
dependiendo de la solubilidad y la fuerza de adsorción, los componentes se van
separando. Al final, la placa cromatográfica puede visualizar la separación usando
un revelador químico o mediante la adsorción de luz UV empleando una lámpara
ultravioleta. Debido a su simplicidad es una técnica muy utilizada en los
laboratorios para monitorear reacciones y para el análisis cualitativo de los
productos de una reacción.
La cromatografía en columna, por su parte se basa en un principio similar a
la cromatografía TLC. Consiste en una columna de vidrio vertical que se llena con
un adsorbente sólido, y a su vez en la parte superior se coloca la mezcla que se
desea separar. La columna se llena con la fase móvil, que por efecto de la
gravedad, va haciendo que la muestra se mueva a través de la columna
separando sus componentes mediante la interacción entre la fase móvil y la fase
estacionaria. Por lo general se utiliza un gradiente del eluente para mejorar la
separación de los componentes deseados(Harris, 2006).
41
Objetivo general:
Sintetizar una serie de amidas, con el propósito de estudiar el efecto en la
disminución de hidrofilicidad, diminución de labilidad en la hidrólisis y el
rompimiento de la planaridad molecular como potenciales factores en la actividad
inhibitoria al PAI-1.
Objetivos específicos:
1) Sintetizar amidas estructuralmente similares a los dépsidos liquénicos y a
compuestos reportados con actividad inhibitoria al PAI-1, con el fin de
aumentar su resistencia a hidrólisis.
2) Confirmar mediante técnicas espectroscópicas la estructura de los
compuestos sintetizados.
3) Estudiar el efecto de las variaciones estructurales en la inhibición del PAI-1.
42
III. MATERIALES Y MÉTODOS:
Materiales:
Se utilizaron los siguientes reactivos de la casa comercial Sigma Aldrich (St
Louis, Missouri):
Cuadro I. Reactivos utilizados en la síntesis de amidas con potencial actividad inhibitoria al PAI-1
# SKU Reactivos Sigma-Aldrich
1 190500 Cloruro de t-butildimetilsililo 97%
2 I202 Imidazol ReagentPlus®, 99%
3 230464 Cloruro de tionilo ReagentPlus®, ≥99%
4 D137510 Dimetilamina (DMA)
5 14409 Zinc
6 15140 Cloruro de bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfinico ≥ 97.0% (AT)
7 241512 Fluoruro de de tetrabutilamonio hidratado 98%
8 283746 Ácido 4-(aminometil)benzoico
9 CDS009457 Ácido 4-((propilamino)metil)benzoico
10 691437 Ácido 4-amino-2-metilbenzoico
11 CDS009450 Ácido 4-((isopropilamino)metil)benzoico
12 256811 Hidruro de diisobutilaluminio
13 D109401 Ácido 2,4-dihidroxibenzoico
43
Los reactivos se caracterizaron mediante técnicas espectroscópicas y se
utilizaron tal y como se obtuvieron del proveedor.
Otros reactivos: Los disolventes de uso diario del laboratorio (acetonitrilo,
etanol, metanol, tolueno, hexano, xileno, entre otros) fueron obtenidos de la
proveeduría de reactivos químicos de Escuela de Química de la Universidad de
Costa Rica, los cuales fueron purificados, destilados y caracterizados previos a su
uso. Para los análisis mediante T.L.C (Thin Layer Chromatography) se utilizó ácido
acético, diclorometano y hexano perteneciente a la marca comercial Reactivos
Gamma dispensada por Laboratorios Químicos Arvi S.A, Alto de Ochomogo,
Cartago, Costa Rica. El metanol EMSURE for analysis index 603-001-00-X., así
como el acetonitrilo Lichrosolv isocratic grade for liquid chromatography index:
608-001-00-3 pertenecen a la casa comercial Merck, Darmstadt, Alemania.
Equipos: La caracterización espectroscópica se realizó empleando los
instrumentos de la Universidad de Costa Rica: unidad de RMN de 400 MHz
Bruker Innova de la Escuela de Química-INBio y la unidad de 600 MHz Bruker
Innova de CIPRONA. A su vez, se utilizó la unidad de espectrometría de masas
Synapt Water QTOF del CIPRONA para determinar la masa exacta hasta el cuarto
decimal de los compuestos químicos sintetizados y la unidad de espectroscopia
infrarroja Paragon PE de la Escuela de Química.
44
Por su parte para la corroboración estructural de compuestos sintetizados
con un alto grado de pureza y en estado cristalino, se utilizó la unidad de
difracción de rayos-X de la Escuela de Química de la Universidad de Costa Rica
que cuenta con un difractómetro Bruker D8 Advance con detector LynxEye.
En el Instituto Nacional de Biodiversidad se obtuvo el apoyo con el equipo
de CLAR Waters PDA acoplado a un detector UV-vis y a un detector ELSD
(Evaporative Light Scattering Detector), software Millenium, columna luna 1.0 x
250 mm 10 μm y el equipo construido a pedido por Varian: BioXplore modelo 300,
acoplado a un detector UV-Vis y a un detector ELSD (Evaporative Light Scattering
Detector), software LCReSponder, columna empacada Kromasil 100 Å.
45
Síntesis de Amidas con actividad inhibitoria al PAI-1:
El desarrollo de la síntesis de amidas se realizó en varias etapas:
1. Protección de los grupos hidroxilos
2. Formación del metil éster a partir del ácido carboxílico
3. Amidación
Protección de los grupos hidroxilos
La metilación de los grupos hidroxilo presentes en los ácidos: 1. ácido 2-
hidroxibenzoico, 2. 4-hidroxibenzoico y 3. 2,4-dihidroxibenzoico, se basó en el
procedimiento propuesto por Vyas y Shah.(Vyas & Shah, 1967), el cual establece
la utilización de sulfato de dimetilo como agente de formación de grupos metoxi
(figura 16).
Figura 15. Productos sintetizados con protección de hidroxilos(ChemAxon, 2015)
46
Síntesis de éteres O-metilados de ácidos benzoicos: Se disolvieron 100 mg
(1 equivalente) del ácido correspondiente en 5 mL de etanol anhidro, añadiendo
los equivalentes de hidróxido de sodio. La disolución se mantuvo con
calentamiento por 15 minutos para disolver por completo el ácido. Seguidamente
se añadió 4 equivalentes del sulfato de dimetilo anhidro y se mantuvo la disolución
en reflujo por 4 horas. Finalizado el tiempo de reflujo, el exceso de sulfato de
dimetilo se eliminó utilizando 1 mL de amoniaco concentrado. El crudo obtenido se
trató con lavados de carbonato de sodio al 10%, y se recristalizó disolviendo
completamente en metanol y saturando el medio al añadir agua gota a gota.
Ácido 2-metoxibenzoico (40%, 43 mg). Caracterización: 1H-RMN (400.13 MHz,
CD3OD): 7.82 (dd, J = 1.9, 7.8 Hz, 1H), 7.52 (ddd, J = 8.4, 7.4, 1.9 Hz, 1H), 7.12
(dd, J = 8.4, 1.0 Hz, 1H), 7.01 (td, J = 1.0, 7.5, 7.5 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H).
Ácido 4-metoxibenzoico (90%, 88 mg). Caracterización: 1H-RMN (400.13 MHz,
CD3OD): 7.97 (d, J = 9 Hz, 2H), 6.98 (d J = 8.9, 2H), 3.86 (s, 3H).
Ácido 2,4-dimetoxibenzoico (80%,80 mg). Caracterización: 1H-RMN (400.13 MHz,
CD3OD): 7.87 (d J = 8.7 Hz, 1H), 6.63 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.59 (d J = 8.7, 2.3 Hz,
1H), 3.91 (s, 3H), 3.86 (s, 3H).
47
Formación del metil éster a partir del ácido carboxílico:
La formación del metil ester a partir del ácido carboxílico se basó en el
artículo de Brenner(Brenner & Huber, 1953).
Síntesis de 4-aminobenzoato de metilo: Se tomaron 2 mL de cloruro de
tionilo y se vertieron en un balón de 3 bocas, enfriando la disolución en un baño
frío de agua/sal/acetona a una temperatura inferior a 0° Celsius. Por otro lado, se
preparó una disolución de 100 mg del ácido carboxílico en 5 mL de metanol. La
disolución del ácido se vertió lentamente con la ayuda de un embudo de adición al
cloruro de tionilo. Al finalizar la adición, la disolución se llevó a reflujo por 4 horas.
La reacción se monitoreó mediante cromatografía de capa fina (eluente tolueno,
metanol, ácido acético en proporciones: 90:25:4). El crudo obtenido se colocó en
hielo para eliminar los residuos de cloruro de tionilo, y se extrajo con 2 porciones
de 5 mL de acetato de etilo. Los extractos orgánicos se lavaron con porciones de
10% de NaHCO3 y se secaron sobre Mg2SO4. El producto cristalino se corroboró
con cromatografía de capa contra un patrón del 4-aminobenzoato de metilo (102
mg.
4-Aminobenzoato de metilo (95%, 102 mg). Caracterización: 1H-RMN (400 MHz,
MeOD): 7.73 (pseudo-d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.63 (pseudo-d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.81 (s,
3H).
48
Amidación:
La formación de amidas durante el desarrollo del trabajo de investigación, se
desarrolló mediante la metodología clásica enunciada en el libro de texto Vogel's
Textbook of Practical Organic Chemistry.(Furniss et al., 1989) De esta manera, la
amidación se llevó a cabo en dos etapas: a) Formación del cloruro de ácido a
partir del ácido carboxílico protegido respectivo y b) Formación de la amida a partir
del cloruro de ácido y amina.
a) Formación de cloruros de acilo a partir del Ácido carboxílico:
En un balón de 50 mL seco y caliente, se añadieron 50 mg (1 equivalente)
del ácido carboxílico provisto por la proveeduría de la Escuela de Química de la
Universidad de Costa Rica junto a una pastilla de agitación magnética.
Seguidamente se añadió 0.5 mL de cloruro de tionilo (Sigma-Aldrich, utilizado sin
previa purificación), junto a 50 µL de N,N-dimetil formamida (con previa
purificación) provisto por la proveeduría de la Escuela de Química de la
Universidad de Costa Rica. La disolución incolora se mantuvo en reflujo por 6
horas, obteniéndose una disolución amarilla. El exceso de cloruro de tionilo se
eliminó mediante destilación. Los cloruros de acilo se utilizaron directamente en la
amidación sin más purificación ni caracterización.
b) Síntesis de amidas por reacción con el cloruro de acilo y aminas:
49
En un balón de 50 mL se añadió 1 equivalente del cloruro de
correspondiente previamente preparado, disuelto en 5 mL de diclorometano seco.
A su vez se preparó una disolución de 1 equivalente de la amina en 1 mL
diclorometano y se agregaron 2 equivalentes de trietilamina. La disolución de la
amina se añadió gota a gota a la disolución previamente preparada de cloruro de
ácido. La disolución se mantuvo en agitación constante y con reflujo por 2 horas.
Finalizado el tiempo de reflujo, se realizó un “quench” en agua, y se extrajo con
diclorometano el producto. Al crudo obtenido se le realizó una re cristalización en
metanol/agua.
1. N-fenilbenzamida (95%): 1H-RMN (400.13 MHz, Cloroformo-d) δ 7.88 (m
(pseudo-d), 1H), 7.80 (sbr, N-H), 7.65 (m (pseudo-d), 1H), 7.55 (m, 1H),
7.50 (m (pseudo-t), 7.38 (m (pseudo-t; J=8.5, 7.4), 1H), 7.16 (m (pseudo-t;
J=7.4, 7.3), 1H). 13C-RMN (100.62 MHz, Cloroformo-d) δ 165.6, 138.1,
135.2, 132.0, 129.3, 129.0, 127.1, 124.7, 120.3. EM (m/z): 198.0921
[M+H]+ correspondiente a la fórmula C13H12NO (calc. 198.0919, error 1.0
ppm). Punto de Fusión: 155-160°C.
2. N-Bencilbenzamida (92%): 1H RMN (400.13 MHz, Cloroformo-d) δ 7.79 (m,
2H), 7.50 (m, 1H), 7.44 (m, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.32 (m, 1H), 6.40 (sbr 1H),
4.66 (d, J = 5.6 Hz, 2H). EM (m/z): 212.1073 [M+H]+ correspondiente a la
fórmula C14H14NO (calc. 212.1075, error 0.9 ppm). Punto de Fusión:
136,1°C.
50
3. 4-Metoxi-N-fenilbenzamida (90%): 1H RMN (400.13 MHz, Cloroformo-d) δ
7.84 (d (J = 8.8 Hz), 1H), 7.80 (s br, 1H), 7.63 (m (pseudo-d, J = 8.11 Hz),
1H), 7.36 (dd (J = 8.6, 7.4 Hz) 1H), 7.13 (m, (pseudot-t J = 7.4 Hz), 1H),
6.97 (d (J = 8.8 Hz), 1H), 3.87 (s, 2H). EM (m/z): 228.1022 [M+H]+
correspondiente a la fórmula C14H14NO2 (Calc. 228.1025, error 1.3 ppm).
Punto de fusión: 164-167°C
4. 2-Metoxi-N-fenilbenzamida (55%): 1H RMN (400.13 MHz, Cloroformo-d) δ
9.80 (s, 1H) 8.29 (dd, (J=7.8, 1.9) 1H), 7.67 (m (pseudo-d), 2H), 7.50 (m,
1H), 7.36 (m (pseudo-t; J=8.5, 7.4), 2H), 7.14 (m, 2H), 7.04 (m, (pseudo-d;
J= 8.4), 1H), 4.06 (s, 3H). EM (m/z):): 228.1020 [M+H]+ correspondiente a
la fórmula C14H14NO2 (calc. 228.1025, error 2.2 ppm). Punto de fusión:
172,2-175,3°C.
5. 4-Metoxi-N-bencilbenzamida (89%): 1H RMN (400.13 MHz, Cloroformo-d) δ
7.76 (pseudo-d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.37 – 7.27 (m, 5H), 6.92 (pseudo-d, J =
8.8 Hz, 2H), 6.29 (sbr, 1H), 4.64 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 3.84 (s, 3H). Punto de
fusión: 157-159°C.
6. 5-Cloro-2,4-dimetoxi-N-fenilbenzamida (40%): 1H RMN (400.13 MHz,
Cloroformo-d) δ 9.60 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 7.64 (d, 2H), 7.35 (t, 2H), 7.13 (t,
1H), 6.54 (s, 1H), 4.08 (s, 3H), 3.97 (s, 3H). 13C RMN (100.62 MHz,
Cloroformo-d) δ 162.1, 158.6, 157.3, 138.4, 133.8, 129.1, 124.3, 120.6,
115.8, 115.2, 96.3, 56.9, 56.6. EM (m/z): 292.0737 [M+H]+ correspondiente
51
a la fórmula C15H15NO3Cl (calc. 292.0740, error 1.0 ppm). Punto de fusión:
128,0-131,6. Datos cristalográficos de este compuesto en el apéndice.
7. 2,4-Dimetoxi-N-fenilbenzamida (42%): 1H RMN (400.13 MHz, Cloroformo-d)
δ 9.70 (s, 1H), 8.26 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.66 (pseudo-d, J = 8.8 Hz, 2H),
7.35 (m, 2H), 7.15 (m, 1H), 6.65 (d, J = 8.8, 2.3 Hz, 1H), 6.54 (d, J = 2.3 Hz,
1H), 4.03 (s, 3H), 3.88 (s, 3H). EM (m/z): 258.1127 [M+H]+ correspondiente
a la fórmula C15H16NO3 (calc. 258.1130, error 1.2 ppm). Punto de
fusión:161,3-164,6°C.
8. 4-(4-Metoxibenzamido)benzoato de metilo (80%): 1H RMN (400.13. MHz,
Cloroformo-d) δ 8.05 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.85 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.73 (d, J
= 8.8 Hz, 2H), 6.99 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.89 (s, 3H). EM (m/z):
286.1075 [M+H]+ correspondiente a la fórmula C16H16NO4 (calc. 286.1079,
error 1.4 ppm). Punto de fusión: 82,6-87,5°C.
9. 4-(4-Metoxibenzamido)-2-metilbenzoato de metilo (82%): 1H RMN (400.13
MHz, Cloroformo-d) δ 7.97 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.84 (pseudo-d, J = 8.8 Hz,
2H), 7.79 (s, 1H), 7.56 (m, 2H), 6.99 (pseudo-d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.88 (s br,
6H), 2.64 (s, 3H). EM (m/z): 300.1230 [M+H]+ correspondiente a la fórmula
C17H18NO4 (calc. 300.1236, error 2.0 ppm).
10. 4-(Benzamidometil)benzoato de metilo (86%): 1H RMN (400 MHz,
Cloroformo-d) δ 8.01 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.80 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.52 (m,
1H), 7.48 – 7.37 (m, 4H), 6.54 (sbr, 1H), 4.71 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 3.91 (s,
52
3H). EM (m/z): 270.1128 [M+H]+ correspondiente a la fórmula C16H16NO3
(calc. 270.1130, error 0.7 ppm).
11. 4-((4-Metoxibenzamido)metil))benzoato de metilo (83%): 1H RMN (400.13
MHz, Cloroformo-d) δ 8.02 (pseudo-d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.77 (pseudo-d, J =
8.8 Hz, 2H), 7.42 (pseudo-d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.94 (pseudo-d, J = 8.9 Hz,
2H), 6.38 (sbr, 1H), 4.70 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.85 (s, 3H). EM
(m/z): 300.1232 [M+H]+ correspondiente a la fórmula C17H18NO4 (calc.
300.1236, error 1.3 ppm).
53
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
Síntesis de Amidas con potencial actividad inhibitoria al PAI-1:
Para el diseño de la estrategia sintética de los derivados se procedió a
estudiar la estructura base encontrada en la literatura(Cale et al., 2010; El-Ayache
et al., 2010) para inhibidores de PAI-1, con el objetivo de realizar un análisis retro-
sintético y determinar la ruta más adecuada. (Figura 16).
Figura 16. Análisis retro sintético de la estructura de los dépsidos aislados. ((ChemAxon, 2015)
La desconexión fundamental indica una reacción de un ácido carboxílico y
una amina. La forma más común para la síntesis de amidas, es a partir de un
compuesto derivado del ácido benzoico el cual mediante la activación de su
función carboxílica reaccionará con un compuesto homólogo en estructura con
una función amina. Si existieran funciones hidróxilicas, éstas deben ser
54
protegidas. De esta manera, la síntesis se basó en ácidos hidroxibenzoicos
debido a su similitud estructural con varios compuestos y metabolitos con actividad
inhibitoria al PAI-1.
La protección de los grupos hidroxilos fue vital, debido a 2 factores en
particular: a) la formación de amidas a partir de la activación del grupo carboxílico,
no puede llevarse a cabo si existen hidroxilos libres, pues éstos provocan la
desactivación de este grupo(J. Clark, 2015); b) se desea evaluar la disminución de
la hidrofilicidad y su relación con la actividad biológica según los hallazgos
reportados por Corey D. Emal, quién reportó que grupos hidroxilos libres dan
inhibición del PAI-1 de manera inespecífica.(El-Ayache et al., 2010)
Protección Grupos Hidroxilo
Para la protección de los grupos hidroxilos se postularon 2 distintas
variaciones: a) metilación utilizando yodometano y b) su variante más fuerte con
sulfato de dimetilo,
De esta manera, para la metilación de los grupos hidroxilo el procedimiento
que se utilizó fue el procedimiento de metilación propuesto por Vyas y Shah(Vyas
& Shah, 1967), el cual establece la utilización de yodometano o el sulfato de
dimetilo como alternativas para la metilación de los grupos hidroxilos. Ambas
metodologías se basan en la activación nucleofílica de los hidroxilos en un medio
básico, en donde la alta reactividad de los agentes metilantes favorece el proceso
55
de reacción (figura 17). En primera instancia, el reactivo utilizado fue el
yodometano debido a que presenta la ventaja de proceder como un agente
metilante más benigno y seguro en comparación al sulfato de dimetilo.(Vyas &
Shah, 1967)
Figura 17. Mecanismo de metilación utilizando yodometano.
Al utilizar este agente metilante, se procedió a optimizar la metodología
variando las condiciones de síntesis. A continuación los resultados obtenidos
mediante la metilación utilizando yodometano:
56
Cuadro II. Resultados obtenidos mediante la metilación utilizando yodometano.
O
O
OH
OCH3
CH3K2CO3 MeI Reflujo
Acetona
O
O
OH
OCH3
CH3
Reacción K2CO3 MeI Tiempo Rendimiento LDS-1-C-2 2 eq. 2 eq. 4 h No se obtiene producto LDS-1-PTLC-3 2 eq 2 eq 4h No se obtiene producto LDS-1(2)-6 2 eq. 2 eq 6 h No se obtiene producto LDS-1(3)-6 3 eq. 3 eq. 6 h No se obtiene producto LDS-1(4)-(2+3) 3 eq 4 eq 6 h No se obtiene producto LDS-1(4)-7 3.5 eq. 4 eq. 6 h No se obtiene producto LDS-1(5)-(3+4+5) 4 eq 4 eq 6h 14% *Los resultados mostrados refleja la reacción con mejor rendimiento.
El yodometano muestra en las diversas variantes una baja eficiencia, un
crudo con características que dificultaban su purificación, dificultades para la
metilación selectiva en la posición orto al ácido carboxílico y rendimientos en
promedio que se mantuvieron por debajo del 14% para ambas metilaciones. Esta
dificultad se infiere a la posible interacción por puente de hidrógeno con el grupo
carbonilo el cual produce un aumento de la pka del hidroxilo en posición orto, por
lo tanto provoca que se necesite un agente metilante más fuerte para realizar la
protección completa de los compuestos.(Filarowski, Koll, Kochel, Kalenik, &
Hansen, 2004)
Al utilizar el sulfato de dimetilo (figura 18), se propició de manera más
eficiente la protección de los hidróxilos. Para la optimización de este
57
procedimiento, se determinó que la utilización de sulfato de dimetilo destilado
previamente antes de cada reacción es vital, ya que este reactivo con el tiempo
genera residuos de ácido sulfúrico los cuales disminuyen la reactividad de la
reacción (se necesita un medio netamente básico para asegurar la desprotección
total de los hidroxilos que se desean metilar).
RO
H
O
SO
OOCH3
CH3
RO
-R
O
CH3
O
SO
O-
OCH3
B BH
Figura 18. Mecanismo de metilación utilizando sulfato de dimetilo.
Del cuadro III la reacción en medio alcalino con sulfato de dimetilo se probó
en distintos sustratos, en pruebas realizadas por duplicado, demostrando ser un
método óptimo para protección de este tipo de hidroxilos fenólicos. A su vez, se
optó por eliminar el exceso de reactivo metilante una hidrólisis con amoniaco, para
evitar reacciones alternas post reflujo(Lunn & Sansone, 1985).
58
Cuadro III. Resultados obtenidos en la metilación utilizando sulfato de dimetilo
Condiciones Producto Esperado Rendimiento NaOH Me2SO4 Tiempo
2 eq. 3 eq. 2 h
O
O
OH
OCH3
CH3
No se obtiene producto
4 eq. 3 eq. 4 h
O
O
OH
OCH3
CH3
No se obtiene producto
4 eq. Exceso 4 h
O
OH
O
CH3
82%
4 eq. Exceso 4 h
O
OH
OCH3
72%
4 eq. Exceso 4 h
O
O
OH
OCH3
CH3
80%
*Los resultados mostrados refleja la reacción con mejor rendimiento.
La metodología mostró una mayor eficiencia y rapidez comparada a su
variante con yodometano, ya que se logró obtener rendimientos superiores al 80%
después de purificar mediante PTLC (cromatografía de capa fina preparativa) y
recristalización del crudo obtenido. Es importante apreciar que este tipo de
59
reacción no mostró ser regioselectiva con respecto a los grupos hidroxilo, ya que
se observaron durante la purificación del crudo residuos, compuestos metilados
variados.
Protección del grupo carbonilo
Similarmente se escogió la formación de éster de metilo a partir del ácido
carboxílico para proteger esta función, si existiese, en la amina. La alternativa
vigente a utilizar fue la propuesta por Brenner y Hüber, basada en la formación de
una función activada como el cloruro de ácido para realizar la formación de un
ester en presencia de un alcohol(Brenner & Huber, 1953). La formación de un
derivado benzoato, mediante el método de Brenner aprovecha la alta reactividad
del cloruro de ácido. El grupo carboxílico ataca el centro electropositivo del azufre
del cloruro de tionilo, generando un grupo voluminoso en el carbonilo el cual es
extremadamente lábil a la sustitución por el metanol que se encuentran en exceso
en el medio (Figura 19).
60
Figura 19. Mecanismo para la protección del ácido carboxílico
Este tipo de reacción mostró ser altamente selectiva, mostrando
porcentajes de rendimiento aceptables (60-80%), y con la ventaja de poder
purificar el crudo de manera sencilla, permitiendo recuperar el ácido que no
reaccionó. El compuesto protegido fue corroborado mediante RMN y TLC. (Cuadro
IV).
61
Cuadro IV. Prueba de concepto de metilación del grupo carbonilo.
Condiciones Producto Esperado Rendimiento MeOH SOCl2 Tiempo
Exceso 4 eq 1 h
NH2
O
OCH3
80%
Exceso 4 eq. 1h
NH2
O
OCH3
CH3
82%
Exceso 4 eq. 1 h O
OCH3
CH3NH2
81%
*Los resultados mostrados refleja la reacción con mejor rendimiento.
62
Amidación:
Para la formación de amidas se probaron varias metodologías, buscando
encontrar aquella que permitiera la mayor eficiencia en la formación y purificación
del producto.
Cuadro V. Diferentes metodologías de amidación probadas a lo largo de la investigación.
Reacción Reactivo Base Disolvente Rendimiento LDS-Amidación PPH3 CCl4
Trifenilfosfina NaOH CCl4 35%
LDS-TBAHS TBAHS X CH2Cl2 40%
LDS-BOP Cl BOP-Cl X CH2Cl2 No se obtiene producto
LDS-XSDA SOCl2 X CH2Cl2 95% *Los resultados mostrados refleja la reacción con mejor rendimiento.
La utilización de trifenilfosfina en tetracloruro de carbono, representó una
opción atractiva según la literatura(Nelson, 2007), la formación de una sal de
fosfonio permite la formación in situ del cloruro de ácido en condiciones suaves
(ver figura 20). Sin embargo, la utilización de CCl4, y su conocida toxicidad
desestimaron su utilización. Además, en la prueba realizada se obtuvo un 35%
frente a otros métodos con mayor rendimiento.
63
Figura 20. Mecanismo de formación de haluros mediante PPh3(Nelson, 2007).
.Por su parte la metodología de amidación reportada por Bhattacharyya
(Bhattacharyya, 2012), se basa en una síntesis mediada por una transferencia de
fase en diclorometano, utilizando NaOH triturado como la base no nucleofílica en
el proceso, e hidrogenosulfato de tetrabutilamonio como reactivo de transferencia
de fase. Esta metodología en particular se utilizó para propiciar la realización de la
síntesis de amidas más comprometidas tanto por la función ácida que presentaba,
como por la dificultad de activar el nitrógeno de aminas e indoles. Esta
metodología dio resultados comparables con la metodología clásica, en lo que
respecta a acoplamientos de ácidos y bases sencillas, pero no con respecto a
compuestos con mayor sustitución como los deseados.
La utilización del cloruro de bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico, mejor
conocido como BOP-Cl (figura 21), fue de interés debido a su amplias aplicaciones
en el acoplamiento de péptidos. Sin embargo, debido a las cantidades
equivalentes necesarias para realización de la amidación, sus condiciones de
atmosfera inerte y de humedad, se decantó por utilizar un método más clásico
para el desarrollo de la síntesis(Han & Kim, 2004).
64
PO
NN
ClO
O
O
O
Figura 21. Estructura del bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico.
Por lo tanto, la estrategia de amidación que se utilizó, en última instancia,
fue la basada en la metodología clásica enunciada en el libro de texto Vogel's
Textbook of Practical Organic Chemistry(Morgan, 1990). La amidación se llevo a
cabo en dos etapas: A) Formación del cloruro de ácido a partir del ácido respectivo
y B) Formación de la amida a partir de la mezcla del cloruro de ácido y la amina
(figura 22).
Figura 22. Etapas de amidación basado en el libro Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry(Morgan, 1990).
65
A esta metodología a su vez se le hicieron varias acotaciones para mejorar
su rendimiento entre ellos, la utilización de DMF en cantidades catalíticas para
facilitar la formación del cloruro de ácido(X. Wang et al., 1998). La adición de DMF
permite la formación in situ del complejo de Vilsmeier Haack, un intermediario ion
iminio ɑ -clorinado, el cual presenta una mayor electrofilicidad en comparación al
cloruro de tionilo(Z. Wang, 2010) (ver figura 23).
Figura 22. Formación del complejo de Vils Meier Hack(Zhang et al., 2009)
Este intermediario activado, permite una rápida interacción con el ácido
carboxílico el cual genera el cloruro de acilo necesario para la formación de la
amida correspondiente, con la ventaja sintética de regenerar el DMF para así
formar nuevamente el complejo de Vils Meier Hack (figura 24)(Montalbetti &
Falque, 2005).
66
Figura 23. Ciclo Catalítico del N,N-DMF en la formación de cloruros de ácido(Montalbetti & Falque, 2005).
De esta manera, se determinó en concreto que para la realización de los
compuestos derivados, se debe realizar una protección tanto de los grupos
hidroxilos en el ácido carboxílico; además, si la amina tiene un ácido carboxílico,
se debe convertir en un éster.
De esta manera según la metodología escogida, inicialmente se procedió a
sintetizar derivados estructuralmente similares a los dépsidos aislados
previamente, con diferencias en el anillo A y B, y en la extensión de cadena (ver
figura 10). Así se logró sintetizar 11 compuestos, los cuales presentan diferencias
estructurales interesantes para ser evaluadas mediante actividad biológica, (ver
figura 25).
67
Figura 24. Amidas sintetizadas con potencial actividad inhibitoria al PAI-1.
68
Cabe destacar que al realizar la síntesis del 2,4-dimetoxi-N-fenilbenzamida,
realizada mediante el acoplamiento del ácido 2,4 dihidroxibenzoico, activado
previamente al reaccionar con cloruro de tionilo, y anilina se obtuvo la formación
por serendipia de un compuesto el cual no estaba previsto: el 3-cloro-2,4-dimetoxi-
N-fenilbenzamida (figura 26).
Figura 25. Estructura del 3-cloro-2,4-dimetoxi-N-Fenilbenzamida.
La formación de este compuesto, se ha atribuido a un reacción descrita por
Otto Soidinsalo y Kristiina Wähälä (Soidinsalo & Wähälä, 2007), los cuales
propone al cloruro de tionilo como un agente de cloración. De esta manera, se
infiere mediante lo reportado que al realizar la amidación de los sustratos de
manera “one pot”, el cloruro de tionilo remanente, reacciona con el anillo aromático
para la formación in situ del compuesto clorado. Este proceso se ve facilitado por
el reflujo que se mantuvo para favorecer la formación de la amida correspondiente.
69
A su vez, la selectividad por la posición 3 en la cloración se ha determinado debido
a la activación de esta misma por los grupos metoxi del anillo aromático.
De esta manera, el mecanismo que se puede inferir para la formación del
compuesto clorado obtenido, basado en el homólogo propuesto por Kristiina
Wähälä y Otto Soidinsalo , se inicia con el anillo aromático activado que ataca el
azufre parcialmente positivo del cloruro de tionilo liberando un Cl-. La fuerza motriz
de la misma va a radicar en la recuperación de la aromaticidad del anillo aromático
y la liberación de SO gaseoso del sistema favoreciendo la espontaneidad de la
misma (figura 27).
Figura 26. Mecanismo propuesto para la formación del compuesto clorado.
70
Desafortunadamente, aunque se intentó reproducir las condiciones para
obtener nuevamente el producto con un mayor rendimiento, los esfuerzos no
dieron frutos y se obtuvo únicamente el compuesto no clorado.
Cabe aclarar, que la formación de las amidas antes mencionadas ocurrió en
un porcentaje de rendimiento promedio por debajo del 80%. El bajo rendimiento
reportado se ha achacado: a la formación del cloruro de ácido y su conocida
inestabilidad en presencia de humedad, se llevó a la conclusión que realizar la
amidación seguidamente de la formación de este compuesto, puede hacer que
residuos de HCl reaccionaran con la amina que se deseaba acoplar, formando un
par conjugado de bajo potencial nucleofílico. Para resolver este inconveniente se
optó por utilizar una base no nucleofílica tal como lo es la trietilamina para evitar la
disminución de su actividad.(Montalbetti & Falque, 2005) Sin embargo los
rendimientos aunque mejoraron, no fueron los esperados. Esto a su vez puede ser
explicado ya que en la literatura mencionan y recomiendan evitar el uso de
cloruros de ácido debido a su rápida hidrólisis y alto porcentaje de formación de
reacciones alternas.(Montalbetti & Falque, 2005)
71
Caracterización compuestos novedosos:
4-Amino-2-metilbenzoato de metilo:
Una vez purificado el producto, se tomaron 5 mg y se realizaron los análisis
espectroscópicos de rigor. El espectro de 1H RMN muestra un sistema AA’BB’
típico de un anillo aromático para sustituido a 7.84 y 6.99 δppm; ambas señales
integran para dos hidrógenos y correlacionan en el experimento HSQC, con los
carbonos a 128.8 y 114.0 δppm respectivamente. Adicionalmente, se observa un
doblete a campo bajo (7.97 δ ppm), que por COSY acopla con un multiplete que
sale a 7.56 δ ppm y que integra para 2 hidrógenos, indicando la presencia de un
anillo trisustituido. Los hidrógenos a 7.56 y uno de los metoxilos a 3.88 δ ppm
correlacionan a larga distancia con un carbonilo a 162.7 δ ppm, que corresponde
al éster carbometoxilo. Finalmente, se observa una señal para el metilo aromático
a 2.64 δ ppm que integra para 3 hidrógenos, y una única señal a 3.88 δ ppm que
integra para 6 hidrógenos. Esta señal genera dos correlaciones con carbono en el
HSQC, uno a 51.8 y otro a 55.7 δ ppm, indicando la presencia de dos grupos
metoxilo. Para corroborar finalmente que el compuesto corresponde a la fórmula
C17H17NO4 se realizó su medición de masa exacta en el instrumento Synapt
Waters qTOF del Ciprona; de esta forma, se ionizó la muestra por infusión en el
ESI positivo y se obtuvo con un error de 2 ppm, la fórmula C17H18NO4 a partir de la
detección de su ión [M+H]+ a 300.1230 m/z.
72
Figura 27. 1H RMN del 4-Amino-2-metilbenzoato de metilo tomado en cloroformo-d y referenciado con ese disolvente. Se muestran las integraciones y los desplazamientos químicos en azul.
73
Figura 28. HMBC mostrando las correlaciones de los metoxilos a 3.88 y el metilo a 2.64 δppm.
Figura 29. Análisis reportado de la muestra X aportando la masa detectada y la formula molecular que le corresponde dentro de parámetros óptimos de detección y con un error de 2 ppm.
74
3-Cloro-2,4-dimetoxi-N-fenilbenzamida:
Al término de la reacción, se realizó la purificación del producto sólido (25
mg) obtenido por medio de una cromatografía delgada, empleando una lámina de
aluminio cubierta con gel de sílice. Tal y como se había observado en la
cromatografía control de la reacción, se observaron dos manchas principales que
se recolectaron, F3 (7 mg) y F5 (4 mg). Los desplazamientos frontales de ambos
compuestos diferían, por lo que se midieron sus respectivos espectros protónicos
de RMN. Curiosamente, ambos eran muy similares.
El espectro de 1H-RMN de F3 presentaba las señales típicas de un anillo
aromático monosustituido (7.64, pseudoblete, 2H; 7.35 pseudotriplete, 2H; y 7.13 δ
ppm, pseudotriplete, 1H) pero aportaba solamente dos hidrógenos aromáticos a
8.29 y 6.54 δ ppm que integran para un hidrógeno, infiriendo la presencia de un
anillo aromático tetrasustituido. Claramente había ocurrido una reacción en el
anillo A del compuesto deseado. Por esta razón, se realizaron experimentos de
13C y de dos dimensiones, con el propósito de elucidar qué había ocurrido en la
reacción.
El espectro de 13C muestra sin embargo los 13 carbonos esperados; el
experimento de HSQC produjo correlaciones 1J para 7 de esos carbonos, dejando
6 carbonos sin hidrógeno, dentro de los cuales, estaba el carbonilo de la amida a
162.1 δ ppm y confirmando la presencia de la tetrasustituición; sin embargo, no
75
añadía ningún átomo de carbono más a la estructura. Por esta razón, se pensó
que se podía tratar de un dímero, pero no se encontró un compuesto con esa
masa al realizar la infusión para la determinación de la masa exacta en el Synapt.
Una revisión de la reacción y sus condiciones, hizo pensar que la cuarta
posición en el anillo podría provenir de un cloro o de un grupo funcional con
azufre, que debió haberse incorporado en la activación con cloruro de tionilo.
Se realizaron cálculos para verificar la presencia o ausencia de halógenos o
sulfóxidos en la molécula. La presencia de un átomo de cloro en la posición
proyectada desplazaría la señal de 128.5 teórica a campo alto, alrededor de 115 δ
ppm, mientras que un átomo de azufre, la desplazaría a campo bajo (alrededor de
130 δ ppm). Con esta información se procedió a verificar la masa exacta y fórmula
molecular, hallándose con un error de 1 ppm la masa de 292.0737 para
C15H15NO3Cl.
Dichosamente, se logró obtener un cristal de este compuesto, que fue
sometido a análisis de rayos X confirmado la estructura.
76
Figura 30. Análisis reportado del 3-Cloro-2,4-dimetoxi-N-fenilbenzamida aportando la masa detectada y la formula molecular que le corresponde dentro de parámetros óptimos de detección y con un error de 2 ppm.
Figura 31. 1H RMN de la muestra 3-Cloro-2,4-dimetoxi-N-fenilbenzamida tomado en cloroformo-d y referenciado con ese disolvente. Se muestran las integraciones y los desplazamientos químicos en azul.
77
Figura 32. Experimento 13C de la muestra 3-Cloro-2,4-dimetoxi-N-fenilbenzamida tomado en cloroformo-d y referenciado con ese disolvente. Se muestran las integraciones y los desplazamientos químicos en azul.
78
Figura 33. Experimentos 2D HSQC tomado en cloroformo-d y referenciado con ese disolvente. Se muestran las correlaciones y desplazamientos químicos en azul.
79
Figura 34. Experimento 2D HMBC tomado en cloroformo-d y referenciado con ese disolvente. Se aprecian las correlaciones pertinentes a la muestra.
80
Figura 35. Simulaciones realizadas en el software MestreNova de distintos halógenos en la posición 4 del compuesto. Se determina que la simulación con Cl es la más semejante a la muestra.
81
Difracción de rayos X de monocristal:
Datos Cristalográficos: fórmula C15H14NO3Cl, peso molecular: 291.72 g/mol,
triclínico, P-1, a=9,7942(4) Å, b=11.3157(4) Å, c=12.7758(5) Å, α=98.1180(10),
β=95.2680(10), γ=101.8760(10), V= 1361.01(9) Å3, Dcalculada= 1.424 g/cm3,
µ=0.287 mm.1, F(000)=608, T=100(2) k. Se recogieron un total de 2550 marcos. El
tiempo total de exposición fue de 6,63 horas. Los marcos se integraron con el
paquete de software Bruker SAINT. Los datos se corrigieron para los efectos de
absorción utilizando el método Multi-Scan (SADABS). La relación de mínima a
máxima transmisión aparente fue de 0,973. La estructura fue resuelta y refinada
usando el paquete de software Bruker SHELXTL.
Figura 36. Estructura elucidada mediante difracción de rayos X del 3-cloro-2,4-dimetoxi-N-fenilbenzamida
82
Análisis de Actividad Biológica de los compuestos sintetizados:
Los ensayos de actividad biológica se realizaron con la colaboración del Dr.
Daniel Lawrence y la División de Medicina Interna de la Escuela de Medicina de la
Universidad de Michigan. En el ensayo se evaluaron los 11 compuestos
sintetizados utilizando PAI-1 humana glicosilada activa (PAI-1glyc), PAI-1
recombinante no glicosilada (PAI-1) o PAI-1 recombinante murina (mPAI-1)(Cale
et al., 2010),(Li & Lawrence, 2011) La actividad esperada al realizar en este
ensayo, es observar la inhibición eficiente del PAI-1 sin afectar directamente la
actividad proteolítica.
De esta manera, basados en los resultados de actividad biológica se
determinó que el rompimiento de planaridad entre amidas similares (Figura 38), no
reflejo un cambio significativo en la actividad biológica.
83
Figura 37. Ejemplo de amidas con diferencia en la planaridad de su estructura.
A su vez diferencias estructurales como inclusión de metilo y grupos
carbonilos (figura 39) en los anillos aromáticos, tampoco representaron cambios
relevantes en términos de actividad.
Figura 38. Amidas con diferencias estructurales en su anillo aromático.
84
Sorpresivamente, de los datos obtenidos para los 11 compuestos, se
determinó el 2-metoxi-N-fenilbenzamida (Código A-2MOBz) como el único
resultado interesante al inhibir al PAI-1 en el ámbito de los 100 µM (Figura 40).
Este resultado llama la atención debido a la simplicidad que presenta el
compuesto, únicamente presentando una sustitución metoxi orto al carbonilo.
Figura 39. Actividad biológica correspondiente al compuesto N-fenil-2-metoxibenzamida.
Si bien su inhibición no es tan prometedora como los compuestos
reportados por Lawrence, si da un indicio de cómo la sustitución en posición 2 , de
un hidróxilo protegido favorece la inhibición de la actividad del PAI-1, confirmando
en parte lo reportando por Emal al describir la relación entre la protección de
hidróxilos y su aumento de actividad en la inhibición del sistema PAI-1(El-Ayache
et al., 2010). Cabe destacar que la inhibición no se presento en los compuestos
homólogos al A2-MOBz, por lo que se demuestra que no solo el grupo Metoxi es
quien favorece la inhibición, si no la importancia de la posición del mismo.
85
Figura 40. Compuestos homólogos al compuesto A2-MOBz (estructura 9).
86
Lecciones aprendidas en el voluntariado en el Instituto Nacional Biodiversidad:
Debido a que en la síntesis de los compuestos deseados, las técnicas de
purificación y caracterización química eran vitales, se dispuso realizar un
entrenamiento en estas técnicas por un período de 8 meses en el Instituto
Nacional de Biodiversidad (INBio). Durante este período se logró aprehender más
a fondo sobre técnicas de purificación mediante cromatografía de capa fina,
reveladores y la utilización a fondo de la cromatografía líquida de alta eficacia.
A su vez durante este entrenamiento se colaboró con el aislamiento de 3
compuestos los cuales ya antes el Instituto había estudiado como potenciales
inhibidores del PAI-1. A continuación, una descripción del aislamiento de estos
productos:
Aislamiento de dépsidos de líquenes costarricenses:
Mediante la colaboración de INBio, en lo que respecta a sus instalaciones y
equipo, se logro aislar los compuestos ácido ácido 2´-O-metilanziaico y ácido
lecanórico.
El acido lecanórico fue aislado a partir del liquen Canoparmelia caroliniana,
un liquen folioso el cual crece generalmente sobre cortezas, madera y micrositios
como áreas de pastoreo y a orillas de camino(Chaves et al., 2009), de donde a
partir de 800 mg de extracto etanólico facilitado por la Unidad de Bioprospección
87
de INBio, se logró aislar 96 mg del compuesto de interés con un porcentaje del
compuesto en el liquen de 32% m/m. El aislamiento del dépsido se basó en la
observación preliminar del extracto etanólico en una placa TLC, el cual mostró ser
el compuesto mayoritario mediante revelación con permanganato de sodio (la
oxidación de los compuestos orgánicos revela la presencia de productos en una
placa cromatográfica).
De esta manera para la purificación del mismo se procedió a realizar una
recristalización, aprovechando su alta solubilidad en metanol y provocar una
cristalización del mismo al saturar el medio con agua. El compuesto obtenido se
purificó mediante cromatografía VLC (vacuum liquid chromatography), técnica que
presenta una ventaja en lo que respecta a simplicidad, robustez y una rápida
separación con respecto a la cromatografía de columna
convencional.(Hostettmann et al., 1985)
En el caso del asilamiento del Ácido 2’-O-metil-anziaico, se llevó a cabo
mediante cromatografía líquida de alta resolución, debido a que el extracto
etanólico del liquen Parmotrema tinctorum mostró presentar una serie de
impurezas las cuales presentaban RF similares al compuesto de interés. La
particularidad de la separación, radicó en la utilización del equipo Bioxplore
modelo 300, equipo de cromatografía de gran escala el cual soporta inyecciones
de hasta un gramo de crudo, para así poder depurar y aislar de manera más
88
precisa el producto deseado, haciendo una única inyección. De esta manera, se
logró aislar 101,5 mg del compuesto.
Procedimiento de aislamiento de dépsidos de líquenes costarricenses:
Ácido Lecanórico: Se parte de 313.3 mg del extracto seco del liquen
Canoparmelia caroliniana el cual mediante TLC (Thin Layer Chromatography), se
determina la presencia de impurezas. Se realiza una recristalización con
metanol/agua, disolviendo completamente el extracto en metanol y añadiendo gota
a gota agua destilada hasta saturar el medio, se eliminan impurezas coloreadas
con carbón activado y se separa el compuesto en la fracción 4 mediante VLC
(Vacuum Liquid Chromatography). Mediante TLC y HPLC, se determina la pureza
de la fracción 4 y se confirma mediante espectroscopia de resonancia magnética
nuclear la estructura del ácido lecarónico. HPLC Waters PDA (eluente en
gradiente HOAc 0.1%: MeCN; 15 min 65:35, 10 min 100% MeCN) tr (min): 11.17.
VLC diámetro de columna 4 cm, altura 1 cm de sílica, (gradiente 15 mL Hexano
(100%), hexano: diclorometano (1:1), diclorometano (100%) y diclorometano:
metanol (1:1). (Figura 42)
89
600-1116
neto: 313.3 mg
Recristalización
600-1116-C
neto: 208.6 mg
600-1116-C-C
neto: 120.8 mg
Recristalización con carbon activado
VLC
600-1116-C-C
Fracción 1
Hexano
neto: 2.6 mg
600-1116-C-C
Fracción 2
Hexano-Dicloro 1:1
neto: 4.8 mg
600-1116-C-C
Fracción 3
Diclorometano
neto: 7.9 mg
600-1116-C-C
Fracción 4
Diclorometano-Metanol
neto: 91.6 mg
O
O
O
OHOH
OH
OH
CH3
CH3
Ácido Lecarónico
Figura 42. Esquema de separación del ácido lecarónico
Ácido 2’-O-metil-anziaico: Se realiza TLC al extracto proveniente del liquen
Parmotrema tinctorum, y se determina realizar la depuración con la ayuda del
equipo Bioxplore modelo 300, para así poder depurar y aislar de manera más
precisa el producto deseado inyectando el crudo en una única inyección. Se
obtienen 9 fracciones (ver Figura 43), en donde mediante TLC se determinó que
las fracción 8 presentaban un único compuesto obteniéndose (258.9 mg). La
estructura del compuesto en la fracción 8 se elucidó mediante espectroscopia de
resonancia magnética nuclear determinando la presencia del ácido 2-O-metil-
anziaico con un porcentaje de extracción del 29.7%. BioXplore modelo 300
(eluente en gradiente H2O: MeCN; 5 min 6:4, 5 min 4:6, 15 min 2:8, 5 min 100%
90
MeCN) tr (min): 5 (Fracción 1), 6(Fracción 2), 7.5 (Fracción 3), 10 (Fracción 4), 13
(Fracción 5), 15(Fracción 6), 16.5 (Fracción 7), 19 (Fracción 8), 21 (Fracción 9).
600-6610
Neto:871.5 mgSeparación mediante
Bioxplore modelo 300
600-6610
Fracción 2
neto: 34.9 mg
600-6610
Fracción 3
neto: 32.8 mg
600-6610
Fracción 4
neto: 34 mg
600-6610
Fracción 5
neto: 51.4 mg
600-6610
Fracción 6
neto: 25.6 mg
600-6610
Fracción 7
neto: 239 mg
600-6610
Fracción 1
neto: 94.5 mg
600-6610
Fracción 9
neto:16.9mg
600-6610
Fracción 8
neto:258.9mg
O
O
CH3
O
OH
CH3
O
OH
OH
CH3
Ácido 2-O-metil-anziaico
Figura 43. Esquema de separación del ácido 2’-O-Metilanziaico
91
Productos elucidados durante el entrenamiento en INBio:
Acido Lecanórico: 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ 2.58(s), 2.65(s), 6.23 (d, J=2.5),
6.30 (d, J=2.5), 6.51 (d, J=2.5), 6.57 (d, J=2.5).
Ácido 2-O-metil-anziaico:1H NMR (400 MHz, MeOD): δ 0.89 (m, 3H), 1.35 (m, 2H),
1.64 (m, 4H), 2.99 (m, 2H), 6.40 (q, J=2.6, 2H), 6.64 (d, J=2.5, 1H), 6.76 (d, J=2.5,
1H).
92
CONCLUSIONES
En el presente trabajo, se sintetizaron 11 amidas las cuales se deseaba
estudiar su actividad biológica con respecto al PAI-1. Para la síntesis de estas
amidas la protección de los grupos funcionales (hidroxil y carbonilo) presentes en
los anillos fue de importancia, ya que , demostraron interfiere en la reacción de
amidación, mediada con la utilización de cloruro de tionilo De esta manera para la
protección de estos, se tomo en cuenta las distintas pKas de los hidróxilos y el
ácido carboxílico, para crear una ruta sintética adecuada: utilización de sulfato de
dimetilo para la protección de hidróxilos y utilización del método de Brenner
generó esteres de alta pureza y rendimientos aceptables para el desarrollo de la
síntesis de amidas. Así aunque la amidación utilizando cloruro de tionilo permitió la
síntesis de varios productos, se recomienda estudiar metodologías alternas para la
realización de la amidación directamente empleando el ácido carboxílico y la
amida. Se puede citar la utilización de reactivos como el carbonildiimidazol (CDI) o
bien, reactivos de transferencia de fase, para solventar la necesidad de síntesis
más limpias y con menores desafíos sintéticos que las utilizadas en este estudio.
Finalmente, basados en los resultados de actividad biológica, se concreto
que en las amidas sintetizadas no se obtuvo evidencia de que el aumento en la
extensión de la cadena entre los anillos aromáticos y la sustitución de metilos y
carbonillos confiriera una actividad biológica al PAI-1. Sin embargo, se determinó
que la sustitución metoxi en posición orto al carbonilo presenta un indicio
93
promisoria de actividad. Esta actividad, valida en parte la hipótesis que se planteó
inicialmente sobre la disminución de hidrofilicidad aumentando la actividad sobre
PAI-1, ya que únicamente se refleja este comportamiento en el compuestoA2-
MoBz, y no en sus homólogos Por lo tanto, al observar este comportamiento que
indica claramente que la posición orto al carbonilo está involucrado en la inhibición
del PAI.1, se alienta al estudio de sustitución en esta posición, la cual puede dar a
nuevos indicios para el desarrollo de compuesto novedosos en el campo de la
inhibición de este blanco de interés.
94
REFERENCIAS:
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