sistemas de coloracion

ESTUDIO MICROBIOTICO DE LAS BACTERIAS Y SISTEMAS DE COLORACIN

(INFORME)

2004

INTRODUCCIN

Las bacterias son seres generalmente unicelulares que pertenecen al grupo de los protistos inferiores. Son clulas de tamao variable cuyo lmite inferior est en las 0,2 y

el superior en las 50 ; sus dimensiones medias oscilan entre 0,5 y 1 . Las bacterias

tienen una estructura menos compleja que la de las clulas de los organismos superiores: son clulas procariotas. Igualmente son muy diferentes a los virus, que no pueden

desarrollarse m s dentro de las clulas y que s lo contienen un cido nucleico. Las bacterias juegan un papel fundamental en la naturaleza y en el hombre: la presencia de una flora bacteriana normal es indispensable, aunque grmenes son patgenos. Anlogamente tienen un papel importante en la industria y permiten desarrollar

importantes progresos en la investigaci n, concretamente en fisiolog a celular y en gentica. Para hacer un estudio de estos microorganismos, se suele recurrir a tcnicas especiales que van a permitir el acondicionamiento del material para dicho estudio. Los colorantes y coloraciones se usan en estudios macro y microscpicos, por ejemplo: para estudios de la actividad bioqumica de los microorganismos, clasificacin de los microorganismos, etc. Para efectuar una observacin del microorganismo, los mtodos de coloracin son diversos y adems, constituyen un tem ms que posibilita realizar una clasificacin, es decir, que hay tcnicas que permiten hacer un diagnstico informando cmo reacciona una clula microbiana a ciertas manipulaciones fsicas y qumicas con los colorantes (ej: mtodos de Gram-Nicole, cido-alcohol resistencia, etc.). El descubrimiento del microscopio de contraste de fases y el uso del microscopio electrnico para exmenes de microorganismos, han dejado de lado muchas de las tcnicas de coloracin. A pesar de ello, los colorantes y las coloraciones se siguen usando en trabajo de diagnstico y de investigacin por ser de un manipuleo sencillo y de fcil comprensin e interpretacin. A continuacin realizaremos un estudio microbitico aplicando algunas tcnicas de coloracin.

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Preparar frotis a partir de cultivos bacterianos en diferentes medios, y realizar una

determinada tincin para la identificacin de la estructura, forma, disposicin, etc., de las bacterias.

OBJETIVOS ESPECFICOS

Clasificar las bacterias en grampositivas y gramnegativas. Identificar la importancia que tiene cada una de las coloraciones utilizadas en el

estudio de las bacterias. Identificar las formas bsicas en que se puede visualizar la morfologa bacteriana

en una tincin.

1. TEORA RELACIONADA

Las bacterias, junto con los protozoarios, algas microscpicas, hongos microscpicos (incluyendo levaduras) y virus, constituyen los llamados microorganismos. El trmino microorganismo no tiene un significado taxonmico preciso sino que agrupa a todos los organismos de dimensiones microscpicas (< 0.1 mm) aunque presenten grandes diferencias entre si. As por ejemplo incluye organismos procariotas (bacterias), eucariotas (hongos, protozoarios, algas) y virus. Tambin difieren notablemente en el tamao aunque sean todos microscpicos; en una escala comparativa tenemos:

Protozoarios > levaduras > bacterias > virus

Bacterias

Aunque existen miles de especies de bacterias diferentes, los organismos individuales presentan una de las tres formas generales siguientes:

- elipsoidal o esfrica - cilndrica o en forma de bastn - espiral o helicoidal.

Las bacterias esfricas o elipsoidales se denominan COCOS. Muchas bacterias con esta forma presentan modelos de agrupacin que derivan de los diversos planos de divisin celular. As tenemos:

* cocos en pares (diplococos)----------- Ej. Neisseria * cocos en cadena ---------------------- Ej. Streptococcus * cocos en racimo ---------------------- Ej. Staphylococcus * cocos en ttradas -------------------- Ej. Pediococcus * cocos en cubos ----------------------- Ej. Sarcina * cocos sin distribucin especial

Las clulas bacterianas cilndricas se denominan BACILOS o BASTONES y presentan otros modelos de agrupacin. As tenemos:

* bastones en cadena -------------------------------- Ej. Bacillus * bastones en letras chinas o empalizadas ------------ Ej. Corynebacterium * bastones sin distribucin especial

Las bacterias helicoidales se presentan en general como clulas individuales, independientes; pero las clulas de las distintas especies presentan notables diferencias de longitud, nmero y amplitud de las espiras y rigidez de la pared. La observacin y examen de las bacterias se puede realizar de dos maneras fundamentales:

observando los microorganismos vivos sin teir. observando las clulas fijadas, teidas con colorantes.

Las bacterias vivas, en suspensin acuosa tienen propiedades pticas similares a las del agua y, por lo tanto, son difciles de observar con el microscopio de campo claro debido a la falta de contraste con el medio que las rodea.

Aunque las bacterias no difieren en sus propiedades pticas del medio externo, si son muy diferentes desde el punto de vista qumico; esto es lo que permite distinguir las bacterias por tincin, pues generalmente el colorante reacciona con la clula bacteriana pero no lo hace con el medio. La coloracin de las bacterias tiene como fines: * aumentar el contraste de las clulas con el medio que las rodea. Esto implica mejorar la visualizacin de las bacterias y permitir la distincin de formas y tamao. * diferenciar grupos bacterianos por su reaccin frente a determinados colorantes. * revelar la presencia de distintas estructuras internas. Colorantes

Son compuestos qumicos que poseen un grupo cromforo que otorga color a la molcula y un grupo auxocromo que otorga al colorante la capacidad de disociarse electrolticamente y por lo tanto, formar sales. El grupo auxocromo es el que facilita la unin del colorante a otras sustancias con carga elctrica. Los colorantes se clasifican como colorantes naturales y sintticos. Los colorantes naturales son utilizados principalmente con fines histolgicos. La mayora de las tinciones bacterianas son realizadas con colorantes sintticos, en su mayora anilinas, las cuales derivan del benzeno. Colorantes cidos, bsicos y neutros. Los colorantes ms usados son sales, las cuales estn constituidas por un in cargado positivamente y un in cargado negativamente. Por ejemplo, azul de metileno es actualmente la sal cloruro azul de metileno. a) Tincin bsica es aquella en que el color est dado por el ion cargado positivamente. b) Tincin cida es aquella en que el color est dado por el ion cargado negativamente. c) Tincin neutra es aquella resultante de mezclas entre soluciones acuosas de ciertos colorantes cidos y bsicos. Una reaccin de tincin se debera a una combinacin de reacciones fsicas y qumicas. El pH del medio tiene gran influencia en la tincin ya que permite una mayor o menor disociacin electroltica del grupo auxocromo, permitiendo de esta manera una mayor o menor afinidad por los grupos qumicos sobre los cuales se une.

Si se aumenta el pH del medio existe una mayor afinidad del colorante por la bacteria, sucediendo lo contrario si el pH se hace ms cido. La fijacin de colorantes a la clula bacteriana se facilita con el uso de mordientes, con los que forman compuestos insolubles (yodo, fenol, cido tnico, oxalato de amonio, etc.). Algunos de los colorantes ms empleados en microbiologa son: azul de metileno, violeta de genciana, fucsina bsica, safranina, verde de malaquita, etc. Tinciones

Las tinciones pueden clasificarse en: tinciones simples, diferenciales y especiales. a) Tinciones simples. Son aquellas en que se utiliza un solo colorante. Las bacterias se tien en forma homognea de la misma coloracin. La utilidad de esta tincin es relativa, ya que slo es factible observar forma y agrupacin celular. b) Tinciones diferenciales. Permiten establecer diferencias tintoriales entre grupos de bacterias, debido a ello son las ms utilizadas en la identificacin de bacterias. Estas tinciones se basan en la aplicacin de dos colorantes en etapas sucesivas entre las que se aplican mordientes y compuestos qumicos decolorantes; de esta forma las bacterias de diferente afinidad tintorial se observan teidas de distinto color. c) Tinciones especiales. Permiten poner de manifiesto alguna estructura especial de la clula bacteriana, ej.: material nuclear, membrana citoplasmtica, flagelos, cpsulas, esporas, etc. d) tinciones negativas: Los colorantes no tien el microorganismo, sino el entorno, aumentando de este modo su contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante (nigrosina) En general, el proceso seguido en todas las tinciones conlleva las siguientes etapas: extensin, fijacin, tratamiento con colorantes y observacin.

2. FLUJOGRAMAS

Frotis.

A partir de un cultivo en medio lquido.

Esterilizar asa redonda

Tomar una gota del cultivo lquido

Colocarla en el portaobjetos

Extender la gota uniformemente

Secar al aire

Fijar por calor

Dejar enfriar

Teir

A partir de un cultivo en medio slido.

Colocar gota de solucin salina en el portaobjetos

Esterilizar asa en punta

Tomar una colonia de cultivo slido

Colocarla sobre la gota de solucin salina

Mezclar y extender en el portaobjetos

Secar al aire

Fijar por calor

Enfriar

Teir

Frotis de secrecin faringea.

Visualizar el rea de las amgdalas con el bajalengua

Tomar una muestra de secrecin faringea con el escobilln

Extender uniformemente la muestra sobre el portaobjetos

Secar al aire

Fijar con calor

Colorear Coloraciones o tinciones.

Coloracin con azul de metileno.

Realizar frotis de secrecin faringea

Fijar con calor

Cubrir la lamina con azul de metileno por 2 min.

Lavar con agua destilada

Frotar y hacer presin sobre la zona

Secar al aire

Observar al microscopio con objetivo de inmersin

Reportar la morfologa y disposicin de las bacterias

Coloracin de Gram.

Muestra (medio slido o lquido)

Secar al aire

Fijar con calor

Cubrir el portaobjeto con cristal de violeta 1 min.


Adicionar lugol 1 min.


Decolorar con alcohol acetona 1 min.


Cubrir la lamina con fucsina bsica 30 seg.


Secar



Coloracin de Zielh-Neelsen (cidos alcohol resistentes)

Realizar frotis muestra de tierra

Secar al aire

Fijar con calor

Cubrir portaobjetos con fucsina bsica

Calentar 10 min.

Enfriar


Adicionar cido metileno 2min


Secar



Coloracin de Schaeffer-Fulton (esporas)

Realizar frotis cultivo Bacillus sp. 18-24h.

Secar

Fijar con calor

Cubrir portaobjeto con verde de malequita

Calentar 30seg

Enfriar


Adicionar safranina al 5% 1 min.


Secar


Reportar lo observado

Coloracin de Hiss (cpsula)

Realizar frotis

Secar

Cubrir portaobjetos

Lavar

cultivo de Klebsiella

pneumonie de 36-48h.

con colorante de Hiss o solucin acuosa de 1% de cristal violeta

Solucin acuosa al 20% de sulfato de Cu.

Secar


Reportar lo observado

3. RESULTADOS

Coloracin con azul de metileno

Las bacterias se observaron de color azul, en forma de una mezcla de bastones y esferas. Coloracin de Gram

Las bacterias para los dos frotis (cultivo en medio slido y lquido) se observaron de color rojo-fucsia, tenan forma de esferas en racimos. Coloracin De Zielh-Neelsen (cido Alcohol Resistentes)

Los bacilos cido alcohol resistente se ven rojos o fucsias, los dems se ven azules. Coloracin De Shaeffer-Fulton (Esporas)

Solo se pudo apreciar esferas de color rojo. Coloracin de Hiss (Cpsula )

La cpsula se observa como un halo alrededor de la bacteria de color violeta plido, la bacteria se ve violeta intensa o morado.

4. ANLISIS DE RESULTADOS

Coloracin con azul de metileno

Los microorganismos adquirieron un color azul, por su forma los podemos clasificar en staphilococos, streptococos y cocobacilos.(ver anexo 1) Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie. Coloracin de Gram

Los microorganismos adquirieron un color rojo lo que indica que son gramnegativos, estos adquieren esta coloracin debido a que contienen una pared celular estructuralmente muy diferente a la de los microorganismos Gram positivos, que adquieren un color violeta.

En cuanto a la forma, se puede decir que eran Staphilococos.(ver anexo 2)

En todas las tinciones ordinarias se sabe que la pared celular no se tie, sino solo el protoplasma fuertemente reducido por el proceso de fijacin.

Nota: Al realizar la tincin de Gram, se debe tener la precaucin de no utilizar cultivos bacterianos muy viejos, ya que los resultados obtenidos pueden inducir a error; as en cultivos bacterianos relativamente viejos de bacterias Gram(+), algunas se observan como Gram(-), ello se debe a la acidificacin paulatina del cultivo, disminuyendo la afinidad tintorial.

Coloracin De Zielh-Neelsen (cido Alcohol Resistentes)

La diferencia en la coloracin no se debe a reacciones qumicas con ciertos componentes de la pared sino a la estructura fsica de la misma.

La cido-alcohol resistencia es conferida por la presencia de grandes cantidades de esas sustancias creas sobre la pared celular, a la que se unen estrechamente las molculas del primer colorante que se hace actuar y resisten los lavados con cidos inorgnicos diludos (HCl, H2SO4, HNO3) y alcohol, pues los lpidos residuales estn unidos

fuertemente a la pared y no toman el segundo colorante de contraste.(ver anexo 3)

Coloracin De Shaeffer-Fulton (Esporas)

Debido a la coloracin roja se puede decir que presentaban clulas vegetativas, adems debido a su forma clasificamos a la bacteria como Staphilococos. (ver anexo 4)

Los datos importantes que se obtienen como resultado de esta coloracin son: presencia o ausencia de esporas deformacin o no del cuerpo celular posicin dentro del cuerpo celular

En base a la posicin de la espora dentro de la clula se las clasifica en:

terminales (espora en el extremo del cuerpo celular) centrales (espora en el centro del cuerpo celular) centrales a terminales o subterminales (posicin intermedia)

Coloracin de Hiss (Cpsula ) (ver anexo 5)

5. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

Fundamento qumico celular de la coloracin de Gram Tincin de Gram. Se considera hasta el momento como la tincin bacterias ms

importante. Permite una primera clasificacin de las bacterias en gram-positivas, teidas en azul-violeta, y gram-negativas, organismos rojos. Se encuentra en el principio de toda investigacin bacteriolgica puesto que de su resultado depende la marcha ulterior para el aislamiento e identificacin del germen. El mecanismo de la tincin de gram aun no se entiende del todo. Se supone que se basa en una diferencia de permeabilidad entre las paredes celulares de los organismos grampositivos y gramnegativos: el yodo forma con el cristal violeta un barniz que se une al protoplasto. Este barniz no es soluble en agua, pero si lo es en alcohol-acetona. En la decoloracin la pared celular de las bacterias grampositivas no permite la salida del colorante, mientras que esto es lo que sucede en las gramnegativas. Los grmenes gramnegativos quedan sin teir despus del lavar con alcohol y se tien de rojo con el colorante de contraste, fucsina, mientras los grampositivos mantienen el color violeta. Se ha deducido que la pared celular desempea un papel importante para la tincin de gram por las siguientes observaciones: si se tratan clulas grampositivas con lisocima estas se transforman en protoplastos. Los protoplastos se tien con el violeta de genciana, pero pierden el color al lavar con alcohol, puesto que no hay pared celular que lo impida. De este modo los grmenes grampositivos cuya estructura de pared celular ha llegado a desintegrar se hacen gramnegativos; finalmente es de importancia para el diagnstico saber que los clostridios grampositivos que tienden a la autolisis, es decir a la alteracin de la pared celular, se vuelven gramnegativos en los cultivos viejos. Cul es la finalidad de fijar con calor los frotis bacterianos?

Cualquier tincin precisa una fijacin previa de la preparacin que en la mayoria de los casos se hace en la llama. Con la fijacin se pretende adherir fuertemente la preparacin al portaobjetos, matar al germen, conservar las estructuras visibles de la clula y mejorar su capacidad de tincin. Importancia del lugol en la tcnica de Gram

El lugol es importante debido a que se utiliza como mordiente, para fijar el colorante sobre el sustrato. Este refuerza la accin de un colorante. Qu son los colorantes cidos y bsicos?Cmo actan?

COLORANTES BSICOS

Son sales, que estn en relacin con el componente bsico de su molcula. Su grupo aminado forma una sal con un cido, el cual es soluble en agua; tie estructuras cidas (lacas de hematoxilina, fucsina bsica, azul de metileno, verde de metileno). Existen sustancias tales como las Basofilas, que muestran afinidad por colorantes bsicos alcalinos. COLORANTES CIDOS (colorante aninico)

Son sales que estn con relacin con el componente cido de su molcula; tie estructuras bsicas, contenidas en el citoplasma celular (eosina, fucsina cida), son colorantes citoplasmticos. Adems, se dan sustancias tales como las cido filas, las cuales logran la afinidad por medio de este tipo de colorantes. Dependiendo de la fraccin cromgena (generadora de color) el colorante ser cido (cuando posee carga negativa) o bsico (cuando posee carga positiva) Durante la coloracin las fracciones cromgenas se ligan a componentes tisulares de carga contraria. Qu otras tcnicas de coloracin se conocen para observar estructuras o tipos de microorganismos? RODAMINA-AURAMINA

Los cidos miclicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecfica. Todos los

microorganismos cido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parsitos, se tien con estos colorantes. Un aspecto importante de la coloracin rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser reteidos con la coloracin de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tincin con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersin. De esta forma, los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que adems permiten la diferenciacin morfolgica. NARANJA DE ACRIDINA

El fluorocromo naranja de acridina se une al cido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentracin. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo est vivo y roja si est muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el cido nucleico, el germen viable se inactivar poco tiempo despus de la tincin. El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de estudios ha demostrado que la tincin de hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la deteccin inicial de hemocultivos positivos. BLANCO DE CALCOFLOR

Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Segn fue descrito por Hageage y Harrington, este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales clnicos. Tambin se emplea para aumentar la visualizacin de los elementos morfolgicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos laboratorios ha suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz blanco-azulada o verde manzana, segn la fuente luminosa que se utilice. TINCIN DE ESPORAS (WIRTZ-CONKLIN)

Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.) formndose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante aos. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patgenas para el hombre, por lo que su estudio y observacin son de enorme inters.

TINCIN DE KSTER PARA LA DIFERENCIACIN DE BRUCELAS.

La preparacin fijada se tie con safranina alcalina, se decolora con cido sulfrico diluido y finalmente se tie en contraste con azul de metileno. Las brucelas y las rickettsias tambin se presentan como pequeas estructuras cocoides rojas, en grupos porque se encuentran localizadas intracelularmente, ante un fondo azul claro. Esta tincin tiene un valor extraordinario para el diagnstico diferencial, puesto que permite la deteccin de brucelas en la placenta de una vaca que ha abortado, an cuando exista una contaminacin masiva con bacterias de la putrefaccin. Es unas de las pocas tinciones que proporciona un diagnstico puramente microscpico. Un aborto por brucela puede ser diagnosticado microscpicamente en tanto el investigador aplique las precauciones necesarias, teniendo en cuenta la eliminacin de Coxiella burnetti. Otra tincin que permite un diagnostico (casi) vlido en la tincin capsular de Romanowski-Giemsa para el B. Anthracis, en la que el cuerpo del bacilo aparece azul y la cpsula rosa. Con esta tcnica el diagnstico, en que se requiere gran rapidez, se establece en minutos. Otras tinciones que no se utilizan de modo rutinario pero si para precisar un diagnstico son la empleadas par la observacin de cpsulas, esporas y flagelos. COLORACIN DE HONGOS

Una de las tcnicas ms empleadas para observar estos microorganismos, es la de Guegun, por lo que con ella se pueden observar distintas estructuras presentes. La solucin colorante empleada es: Acido lctico ....................... 100 g Sudn III .............................. 0,1 g Azul de algodn .................. 0,1 g Sol. de I2 alcohlica. ...... 10 a 30 gotas Algunos de los elementos del hongo aparecen as diferenciados: grasas: color rosa o rojo debido al Sudn III (colorante liposoluble). Esto se debe a que el colorante es ms soluble en los lpidos que en el solvente que lo contiene (alcohol) y tiende a abandonar la solucin para ser incorporado en el interior de las gotas de lpidos presentes en la preparacin (proceso de difusin y solubilidad). glicgeno: aparece de color caoba debido a la presencia del iodo. almidn: aparece de color azul debido al iodo.

CONCLUSIN

Por medio del anterior laboratorio realizado y con la ayuda de la bibliografa citada podemos concluir los siguientes aspectos: El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de

ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.

La observacin y examen de las bacterias se puede realizar de dos maneras

fundamentales: Observando los microorganismos vivos sin teir. Observando las clulas fijadas, teidas con colorantes

La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente. A los primeros se les denomina bsicos, mientras a os segundos como bsicos.

Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada

con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el cido tnco. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr atacar el colorante.

BIBLIOGRAFA FEY, Hans. Compendio de bacteriologa general mdica. Ed Acribia. Espaa. 1978. p 35-37.

Disponible en pgina web:

http://coli.usal.es/web/educativo/micro2/tema02.html

http://www.danival.org/notasmicro/tincion/_madre_tincion.html

http://bilbo.edu.uy/~microbio/morfologia.html

http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/general.php?Mostrar=introduccion

http://www.manant.unt.edu.ar/Departamentos/Ecologia/microbiologia/examen_coloracion.htm

http://agronomia.uchile.cl/webcursos/microbiologiagral/pagina%20microbiologia1/word/Guia_Lab_07_(1).doc

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