Síntesis de Nanopartículas Semiconductoras Para Su Biofuncionalización

8/17/2019 Síntesis de Nanopartículas Semiconductoras Para Su Biofuncionalización

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INSTITUTO

POLITECNICO

NACIONAL

U N I D D P R O F E S I O N L I N T E R D I S C IP L I N R I

E N I N G E N I E R ~ TECNOLOG~AS V N Z D S

U P I I T A

Síntesis de Nanopartículas Semiconductoras

para su Biofuncionalización

Para obtener el título de:

Ingeniero en Biónica

Presentan:

Carolina Melchor Andrés

Eladio Jeset Velázquez Fragoso

Asesores:

Dr . en C. José Francisco Sánchez Ramírez

M é x i c o D .F . Jun iofO ío


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U N I D A D P R O F E S I O N A L I N T E R D I S C I P L IN A R I A

E N I N G E N I E R Í A Y T E C N O L O G ~ A SAVANZADAS

U P I I T

Síntesis de Nanopartículas Semiconductoras

para su Biofuncionalización

Para obtener el título de:

Ingeniero en Biónica

Presentan:

Carolina Melchor Andrés


inodales

ing Carlos Ríos Ramírez

Secretario

Asesor Asesor

M é x i c o D.F. Junio2OlO


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Unidad Profesional lnterdisciplinaria en Ingeniería

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Tecnologías vanzadas

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Ingeniería Biónica

Agradecimientos especiales

Al Instituto Politécnico Nacional.

A la Unidad Profesional Interdisciplinaria e n Ingeniera y Tecnologías Avanzadas

A la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla

Al Cen tro de Investigación en Cienc ia Aplicada

y

Tecnología Avanzada Unidad Legaria


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gradecimientos

Agradezco al Instituto Politécnico Nacional la formación académica recibida a lo largo de los

últimos ocho año s desde mis estudios de nivel medio superior hasta la fecha. También quiero

agradecer el tiempo y dedicación de mis profesores de la Unidad Profesional Interdisciplinaria

en Ingeniería y T ecnologías Avanzadas.

A nuestros asesores Dra. en

C.

Lilia Martinez y Dr. en

C.

José Francisco Sánchez por su

tiempo

y

conocimientos com partidos con nosotros durante un año.

A mi compañero Eladio porque formamos un equipo caracterizado por el respeto y el

compromiso.

Dedicatorias

Dedico este trabajo a mi familia porque siempre me apoyaron desde mi niñez hasta mis

estudios superiores. Les agradezco a mis padres Jerónimo Melchor González y Victoria

Andrés Santiago su apoyo cariño. Gracias por creer en mi y por quererme así com o soy.

A mi hermano Jorge con quien en ocasiones no me llevé bien pero siempre me ha alentado a

seguir adelante. Por ayudarme cada vez que acudo a él por un consejo. Desde pequeños

convivir con él ha sido una las mejores cosas de la vida.

A mi hermana Marycruz por haber sido y seguir siendo un gran apoyo para nuestra fam ilia es

una de las mujeres que más admiro por su valentía y por no rendirse cuando se enfrenta a

situaciones adversas.

A Raúl por compartir tu tiempo conmigo. Por dejarme formar parte de tu vida. Gracias por

acompañarme cuando salía tarde de la escuela. Gracias por tu cariño comprensión y apoyo

incondicional. Todo s los mom entos que hemos pasado juntos los atesoraré en mi corazón.

A mis amigos: Jenny José Manuel Enrique Ahuizotl y Daniel por brindarme su cariño. Por

alentarme cuando me encontraba en situaciones adversas. Por apoyarme incondicionalmente.

Gracias por compartir su tiempo conmigo y por sus consejos. También gracias por compartir

sus momentos felices y tristes conmigo por confiar en

mí.

Carolina


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Tecnologías Avanzadas

u ta

Inneniería Biónica

Agradezco a Dios por darme la oportunidad de disfrutar de esta vida y este periodo que de una u otra

manera marca toda mi existencia, tanto por lo vivido en la UPIITA como fuera de ella, y pem~iteener otras

visiones del mundo en el cual estoy inmerso.

Agradezco a mis padres. en primer lugar por haberme dado la vida, por haber cuidado de mi d urante tantos

años, por brindarme las facilidades de estudiar una carrera que si bien al principio no sabía ni de que se

trataba, me ha llenado d e satisfacciones personales, es perando lleguen pronto las profesionales; gracias por

la comprensión mostrada hacía mi carrera, por los desvelos derivados de la misma; gracias les doy por ser

su hijo; los quiero aunque no se pa com o demostrárselos.

Dedico este trabajo, y la parte q ue me haya correspondido hacer a mi.farnilia a quien quiero profundamente

pero en ocasiones no lo demuestro. Y lo dedico también a ti mi a mor, a ti, Erandy Selene Morales G onzólez

a quien debo agradecer en mucho el final satisfactorio de este periodo, pues cuando pensaba que no había

salida, tu siempre estuviste ahí para mostrarme las opciones que yo no podía ver; porque estuviste cuando

más te necesitaba y no quería ni sentía pudiera confiar en nadie más, porque he aprendido much o de

t i

y no

solo personalmente, si no también profesionalmente; porque me has mostrado otra cara de la vida. A ti con

quien he comp artido momentos dificiles para ambos. Con todo mi amor y respeto.

A mis hermanas a quienes en ocasiones dejaba de ver hasta por varios días a pesar de vivir en la misma

casa, quienes me hacían reír cuando no quería o estaban ahí para escucharme cuando me dignaba a hablar,

ja ja. Gracias a

Belem

por ser mi confidente de muchas cosas. Gracias a

Ayde

por el apoyo mostrado

siempre. Gracias a Iris por ayudarme siempre que te lo pedía, y a t i Rogelio gracias por cuidar de mi

hermana y hacerla feliz aunque haya sido poco tiempo, porque sé que juntos me hubieran ay udad o a buscar

trabajo no, no es cierto), pero sé que estarías ahí dispuesto a ayudar si lo necesitaba.

Agradezco también a mis asesores.

A

la Dra. Lilia por el apoyo incondicional brindado siempre, y al Dr.

José Francisco por sus conocimientos transmitidos y para realizar nuestro trabajo, además de hacerme

pensar en mu chas cosas ajenas al Trabajo Terminal.

Gracias a mis amigos Carolina, César, Cynthia, Lidia, Sunaina, Silvia, Sonia, Pablo. Esther, Jesús, por

mostrarme las bondades del trabajo en equipo y brindanne su amistad. Gracias a Caro por soportarme todo

un año y juntos lograr esta meta.

Al M. en C. Lucas Bravo, le tengo gran respeto y agradecimiento por su bondad, y ayudarme cua ndo más lo

necesitaba. Al profesor Valentino por ayudarme de igual manera en un momento difícil. Al profesor

Ricardo Horta por mostrarme un camino a seguir profesionalmente. Agradezco a mis profesores de cuarto

semestre Noé , David, Victor) quienes me brindaron grandes ideas e hicieron nacieran en mi muchas

pasiones por el conocimiento. A los maestros cuyas materias me fueron difíciles, por enseñarme que

siempre que uno q uiera se puede superar cualquier obstáculo.

Agradezco a Pablo por mostrarme el valor del íraba.jo, y el valor de la confianza en uno mismo. Doy gracias

igualmente a la U PllTA en general, por ser como es. Dificil en muchas oca siones pero no imposible.

Y

por último, quiero agradecer a una persona que siempre estuvo conmigo en todo momento y si no hera

por él no estuviera escribiendo esto. Me ha llenado de conocimiento, de satisfacciones, también de

decepciones, pero siempre me ha ayudado a seguir adelante y lograr los objetivos propuestos, así como

mostrarme qu e com o decía mi abuelito) las cosas no mand an, que hay que pelear por lo que se desea, que

querer es poder, que si te caes hay que levantarse, y que siempre hay otros caminos. Te agradezco y te

dedico esto Eladio. A ti, o sea a mi.



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ita


Índice eneral

RESUMEN i11

ABSTRACT x

ABREVIATURAS x

GLOSARIO x11

Capítulo 1 INTRODUCCIÓN

1.1

Estado del Arte 3

.1.2 Nanobiónica 5

1.1.3 Tipos de nanopartículas biomédicas 5

1.1.4 Imagen tumoral in vivo 7

Capítu lo 11

OBJETIVOS 9

2.1 Objetivo General 10

2.2 Objetivos Específicos 10

Capítulo PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

apítulo IV

J U S T I F I C A C I ~ N

E LA

INVESTIGACION

13

Capítulo V MARCO TEÓ RICO 15

5.1 Técnicas de crecimiento de nanopartículas metálicas 16

5.2 M étodos y condiciones ex perimentales de preparación 6

5.2.1 Dispersiones Coloidales de Nanopartículas de oro 16

5.3 Nucleación y crecimiento 18

5.4 Estabilidad de nanoparticulas 19

5.5 Síntesis de nanopartículas semiconductoras 19

5.6 Antic uerpos 21

5.6.1 Meca nismo de acción de los anticuerpos 22

5.6.2 Anticuerpos monoclonales 23

5.7 Aptám ero 24

Capítulo VI DESARRO LLO EXPERIME NTAL 26

6.1 Preparación de dispersiones coloidales de 27

nanopartículas de oro a diferentes razones molares

6.2 Preparación de dispersiones coloidales de nanopartículas 1

semiconductoras InP. 111-V)

6.2.1 Preparación de Mirista to de Indio In MA)3 34

6.2.2 Síntesis de nanocristales de InP 36

6.3 Biof~~ncionalizacióne nanop artícula s sem icondu ctoras InP, 111-V) 37


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Capítulo VI1 RESULT ADO S 3 8

7.1 Nanopartículas coloidales de Oro 39

7.2 Estabilidad

47

7 3

Estabilidad electroestática

48

7.4

Nanopartículas semiconductoras de

InP

50

Capítulo VIII CON CLUSIO NES 52

apítulo IX REFERENCIA

Capítulo X APEN DICE 59


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Índice de iguras

1 1 Seña les de fluorescencia

5.1 Ilustración esquemática de los métodos de preparación de partículas 17

metálicas de tamaño nan ométrico

5.2 Ilustración esquemática del proceso de síntesis de nanopartículas 17

metálicas de oro

5.3 Ilustración esquemática de los tipos de estabilización 19

5.4 Estructura de un anticuerpo 21

5.5 Regiones CDR de un anticuerpo responsables del reconocimiento 22

de antígenos

5.6 Etapas del proceso de eliminación de agentes extraños 23

6.1 Arreglo experimental de la síntesis de nanop artícula s de oro 27

6.2 Imágenes de diferentes tiempos de reacción de dispersiones coloidales 0

de nanopartículas de oro a una razón molar de [CS] 1 [HAuC14] 2.25

6.3 Dispersiones coloidales de oro a obtenidas con diferente razones 31

molares de [CS] 1 [HAuC14]

.4 Instalaciones del laboratorio de Ingeniería Ambiental de la BUAP

33

6.5 Lavado de materiallmaterial limpio 33

6.6 Colocación del material en la cámara lateral de la caja de guante s 34

6.7 Síntesis del precursor 35

6.8 Nanopartículas despué s del proceso de centrifugado 36

7.1 Espectro de absorció n en la región UV -Vis de la solució n de oro con una 39

razón molar [CS]

/

[HAuCI4] 0.25

7.2 Espectros de absorción en la región UV-V is de las solución de oro 42

con diferente razón molar de [CS]/ [HAuC14]

7.3 Posición de la RPS en función de la razón [CS] / [HAuC14] 42

7.4 Micrografias de TEM 43

7.5 Histogramas de frecuencias 45

7.6 Espectros de absorción de las soluciones iónicas de Au en diferentes 7

tiempos de reacción

.7 Espectros de absorción en la región UV -Vis de las soluciones de o ro

48

.8 Presentación del cartel: Efecto de la Concentrac ión de Citrato en el

49

Control del Tam año de Na nopartículas de Oro


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Ineeniería Biónica

7 9

Constancias de la presentación del cartel en el er. Congreso Nac ional.. 50

de Ciencia e Ingeniería en Materiales

7.10 Constancias de la asistencia al curso Microscopia E lectrónica de .. ...................50

Barrido y Microanálisis

7.1 Espectro de absorción de la dispersió n coloidal de las nanop artículas ..

................

51

de InP

7.12 Nanopartículas de InP, después del centrifugad o..

.......................................

.51


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Índ ice de

Tablas

1 Propiedades físicas de los diferentes reactivos utilizados para síntesis de 28

nanopartículas de Oro

NAu)

6 2

Estabilidad

y

razón molar de las diferentes síntesis realizad as 3

1

3 Propiedades físicas de los diferentes reactivos utilizados para sínte sis

32

de NInP


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R SUM N

El presente Trabajo Terminal presenta el m étodo para obtener nanopartículas metálicas de oro

por la ruta coloidal así com o el control de su tam año por medio de la variación en la

concentración de Citrato de Sodio esto como un primer acercamiento para sintetizar

nanopartículas semiconductoras del grupo

111-V.

Se propone un m étodo para realizar la biofuncionalización de nanopartículas semiconductoras

para utilizar aptámeros.

Palabras

clave Aptám ero nanopartíczrla bioniarcador marca dores biológicos


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Ingeniería B ibnica

BSTR CT

his

Terminal Work

presents a method

of

synthesis of metallic gold nanoparticles

y

the colloidal

route and their control size through the variation in the concentration of sodium citrate this as a first

approach to synthesize semiconductor nanoparticles of group Ill-V.

W e propose a method for the semiconductor nanoparticles biofunctionalization to use aptamers

Keywords

Aptam er nanop article bioma rker biological mai-lcer


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BREVI TUR S

Au

CDR

COOH

C S

DDT

Fab

Fc

HAuC14

Ig

InAs

In MA)

InP

R

M

MA

mmol

NH2

nm

NPB

NInP

O D

ODE

PDGF

P TMS13

Oro

Complem entary Determining Regions

Carboxilo

Citrato de Sodio

Dodecanotiol

Antigen Binding Fragment

Crystallizable Fragment

Ácido cloroáurico

Inmunoglobulina

Arseniuro d e Indio

Miristato de Indio

Fosfüro de Indio

Infrarrojo

Molar

Ácido Mirístico

Milimoles

Amino

Nanómetros

Nanopartículas biofuncionalizadas

Nanopartículas de Fosfuro de Indio

Unidades de Densidad Ó ptica

Octadeceno

Factor de crecimiento derivado d e plaquetas

Tris Trimethy1silyl)Phosphine


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QD Quantum Dots

RPS Surface Plasmon Resonance

SELEX

Systematic Evolution o f Ligands by Exponential Enrichrnent

TEM Microscopia Electrónica de Transmisión

UV Ultravioleta

ZnS Sulfüro de Zinc


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GLOSARIO

Absorbancia

La absorbancia,A, es la cantidad de intensidad de luz que absorbe una

determinada muestra. Está definida como:

siendo la intensidad después de haber ocurrido la absorción e

1

la intensidad de la luz qu e se

hace incidir en la muestra.

Aptámero Los aptámeros son macromoléculas de ácidos oligonucleótidos o moléculas

péptido. que se unen a molécu las objetivo específicas.

Biomarcador Sustancia sintetizada por el propio organismo presente en la sangre, en los

tejidos o en o tros líquidos corporales qu e se utiliza para diagno sticar alguna enfermedad.

Bioconjugación Modificación o acoplamiento de nanopartículas con moléculas selectivas.

Sucede después de la biofuncionalización.

Biofuncionalización La biofuncionalización es la adición d e grupos funciona les bioafines en

la superficie de un material por métod os de síntesis química.

Fotodegradación Rom pimiento d e moléculas por acción de la luz.

Fluorescencia La fluorescencia es la propiedad de una sustancia para emitir luz cuando es

expuesta a radiaciones del tipo ultravioleta, rayos catódicos o rayos

X.

Nanobiónica Es una fusión de la biología e ingeniería utilizando los avances de la

nanotecnología.

Nanopartícula Unidades más grandes que los átomos y las moléculas

1

a 100 nanómetros .

No obedecen a

l

química cuántica, ni a las leyes de la física clásica, poseyendo características

propias.

x


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Introducción

Un término usado recientemente en el área de la nanotecnología es el de nanobiónica [l], que

ha empezad o a postularse c omo una de las áreas prioritarias de desarrollo dentro de la misma

nanotecnología.

La nanobiónica es una fusión de la biología e ingeniería utilizando los avances de la

nanotecnología. Su principal objetivo es la búsqueda de la mimetización de sistemas

biológicos para la construcción de nanodispositivos que ayuden a mejorar las condiciones de

vida. El interés por desarrollar esta nueva tecnología, está impulsando la creación y

explotación de biomateriales a escala nanométrica con propiedades diferentes hasta las

conocidas actualmente. Uno de estos biomateriales son las llamadas nanopartículas

biofuncionalizadas

NPB)

cuyas propiedades físicas, químicas y biológicas son, en la mayoría,

diferentes a las existentes de los mism os materiales en bulto y atómic o [2-91. Las

NPB

son

definidas como identidades cristalinas o amorfas con tamaños en el intervalo de a 100

nm

con formas variadas que van desde esféricas hasta irregulares y con superficies modificadas

vía moléculas orgánicas y10 biológicas selectivas para generar su interacción con células

específicas. Para la biocon-jugación directa con células biológicas. las nanopartículas deben

presentar en su superficie, grupos reactivos tales como amino

-NH2),

carboxilo -COO H) o

mercapto -SH). De esta manera, las nanopartículas pueden conju garse con los ligandos

partículas de un compuesto adhesivo que ligan y mantienen unidos d os elementos) bioafines

tales como anticuerpos monoclonales, péptidos, enzimas, ácidos nucleicos o pequeñas

moléculas inhibidoras, formando híbridos inorgánico-orgánicos [lo -1

31

Con el término biomaterial

[ 4]

se designa a los materiales utilizados en la fabricación

de dispositivos que interactúan con sistemas biológicos

y

que se aplican en diversas ramas de

la medicina y biología. Su utilización va desde transportadores de agentes bioactivos hasta su

empleo en sistemas que incrementen o reemplacen tejidos, órganos o miembros del cuerpo

humano.

En particular, las NPB tipo semiconductor del grupo 111-V son una clase de

biomateriales que presentan brillantez, resistencia a la fotodegradación, espectro de emisión

agudo, emisión multicolor en el infrarrojo cercano y alta biocompatibilidad, que hacen de este

tipo de biomateriales fuertes candidatos para el desarrollo de nuevos marcadores biológicos

fluorescentes para la detección d e enfermedad es como el cáncer.


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Las

NPB

del grupo 111-V presentan un potencial de propiedades para resolver las

actuales limitaciones encontradas (menor detectabilidad en comparación con los marcadores

radioinmunológicos, toxicidad, ruido de fondo presente en las m ediciones de fluorescencia) en

los tradicionales marcadores fluorescentes orgánicos (por ejemplo: fluoresceína y los

derivados de la rodamina) y proteínas desarrolladas genéticamente. Actualmente las

NPB

tipo

semiconductor están siendo utilizadas en una extensa variedad de aplicaciones biológicas y

clínicas [l5-231.

En el campo de la síntesis, la habilidad para manipular controladamente el tamaño de

las nanopartículas, por métodos simples y sencillos, es actualmente uno de los principales

desafíos de la nanotecnologia. Controlar su funcionalidad superficial (modificación para

conseguir diferentes propiedades físicas o químicas), sin em bargo, es de vital importancia para

desarrollar una nueva clase de marcadores biológicos fluorescentes para aplicaciones en los

camp os de la biología y m edicina

[24-261.

Aunque ya existen marcadores biológicos fluorescentes que emiten en las regiones

espectrales ultravioleta y visible, estos presentan problemas de interferencia espectral cuando

se desea la detección in vivo Estas interferencias incluyen la atenuación, inhibición o

extinción de la señal por la absorción de los te-jidos y líquidos circundantes, fotodegradación,

florescencia de fondo y descomposición debido a reacciones fotoquímicas con el medio

circundante. Una solución a estos problemas de interferencia es la utilización de marcadores

activos (excitación y detección) en la región del infrarrojo-cercano (650-900 nm). En esta

ventana transparente , la absorción debido a los líquidos biológicos y la autofluorescencia

celular no es significante.

1 1

stado del arte

El cáncer es uno de los principales problemas de salud pública. De acuerdo con la

Organización Mundial de la Salud, esta situación se ha tornado crítica y de no implantarse

diferentes estrategias de prevención, para el año 2030 se estima se presentarán m undialmen te

1 8 millones de muertes por esa causa [27 ].

Las técnicas empleadas actualmente para el diagnóstico de cánceres en clínica son:

obtención de imágenes (Rayos X, Resonancia Magnética Nuclear, Colposcopía), biopsia de

los tejidos y análisis bioanalítico de los fluidos corporales. Sin embargo, todos ellos, por lo

regular, no son suficientemente sensibles y10 específicos para una detección temprana de la

mayoría de los cánceres y sobre todo de los estados precancerígenos. Además. es difícil de


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Ingenie ría Biónica

hacer el diagnóstico de los cánceres analizando únicamente las alteraciones morfológicas en

las células y tejidos. Algunos tumores sólidos solamente se detectan cuando su tamaño es de 1

cm. o más de diámetro, lo que significa que su masa constituye millones de células y hay

posibilidad de metástasis en otros órganos.

Actualmente, en los análisis clínicos para producir las imágenes ópticas, se utilizan

materiales fluoroforo s por lo regular compu estos orgánicos, lantánidos, etc). Cuando un

fluroforo se excita con un cuanto de energía especifica fotón). sus electrones cambian del

nivel básico de energía a uno más alto. Durante este proceso el electrón pierde una parte de

energía obtenida, generalmente debido a emisión de un fonón y como resultado se emite un

fotón de energía m ás baja. Debido a este proceso de em isión de luz, el electrón de un estado de

energía elevada vuelve a su estado normal. Los fluoroforos se dividen en dos categorías

amplias: endógenos los que se usan directamente in vivo y exógenos los que se usan in

vitro .

Al

segundo grupo pertenecen agentes contrastantes basados en nanopartículas

[28]

1 1 1 Marcadores fluorescentes

Para una detección óptima, el marcador d ebe cum plir los siguientes requisitos:

La fluorescencia emitida debe poseer una elevada potencia radiante y se ha de

distinguir claramente del ruido de fondo.

La unión del marcador al anticuerpo o al antígeno no debe tener ningún efecto sobre

sus propiedades inmunológicas.

El coeficiente de absorción molar del marcador ha de ser lo más grande posible y el

rendimiento cuántico en el solvente utilizado debe ser lo mayor posible o aproximarse a la

unidad, mientras que el ruido de fondo de la mayoría de las muestras s e debe a la d ispersión de

la luz y a la fluorescencia d e longitud de onda corta del sue ro o antisuero.

La mayoría de los fluoróforos o compuestos fluorescentes son compuestos orgánicos

con una estructura cíclica.

Un ejemplo de esto es la fluoresceína, sin embargo, a pesar de cumplir con los

requisitos mencionados para s er un buen m arcador, es bastante susceptible a las interferencias

por el ruido de fondo y la dispersión de la luz provocadas por la muestra.


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1 1 2 Nanob iónica

Los nanomateriales, que miden

1 1

000 nm ., permiten la interacción con sistem as

biológicos a nivel molecular. También pueden facilitar importantes avances en la detección,

diagnóstico y tratamiento d e los cánceres hum anos, dando lugar a una nueva disciplina: la

nano-oncología [2 9,30 ].

Las nanopartículas se están desarrollando activamente para obtener imágenes de

tumores in vivo perfiles biomoleculares de biomarcadores de cáncer y suministro específico

de medicamentos. Estas técnicas basadas en la nanotecnología pueden ser aplicadas

ampliam ente en el tratamiento d e diferentes enfermedades m alignas.

El uso de nanopartículas no sólo los puntos cuánticos de diferentes tamañ os sino

también las nanopartículas de oro), permiten la detección y cuantificación simultánea de varias

proteínas en pequeñas muestras de tumores, que finalmente permitirá la adaptación del

tratamiento contra el cáncer específico de cada paciente a un perfil de proteínas específicas del

tumor [311

Diferentes aplicaciones de la nanotecnología se están investigando activamente en el

diagnóstico de cáncer por medio de im ágenes.

Varios ámbitos de la nanotecnologia se han utilizado para mejorar la transmisión de los

agentes de quimioterapia a las células cancerosas con el objetivo de minimizar los efectos

tóxicos en los tejidos sanos.

1 1 3 Tipos de nanopartículas biomédicas

Aunque el número de diferentes tipos de nanopartículas está au mentan do rápidamente,

la mayoría se pueden clasificar en dos tipos principales:

Partículas que contienen moléculas orgánicas como principal material constituyente.

Partículas que utilizan elementos inorgánicos, por lo general los metales, como un

núcleo.

Liposomas, dendrímeros, los nanotubos de carbo no, emulsiones,

y

otros polímeros son

un grupo importante y bien establecido de partículas orgánicas. El uso de estas nanopartículas

orgánicas ya ha producido resultados interesantes. Los liposomas se están utilizando como

vehículos para la administración de fármacos en diferentes tumores humanos, incluyendo el

cáncer de mama.


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Dendrímeros, utilizados en la Imagen por Resonancia Magnética como agentes de

contraste, han ayudado a la visualización de los diversos procesos patológicos. Conjugados

con agentes fannacológicos y las moléculas de orientación, los nanovectores orgánicos son

potentes vehículos para suministrar fármacos y proporcionar una imagen selectiva de los

diferentes tipos de cáncer hum ano.

La mayoría d e las nanopartículas inorgánicas comp arten la misma estructura básica, un

núcleo central que define la fluorescencia y las propiedades ópticas, magnéticas y eléctricas d e

la partícula, con un recubrimiento orgánico de protección en la superficie. Esta capa exterior

proteg e al núcleo de la degradación en un entorno fisiológico agresivo y puede formar enlaces

covalentes o electrostáticos, o ambos, con agentes de carga positiva y las biomoléculas de los

grupo s funcionales básicos, tales como las am inas y tioles.

Los puntos cuánticos son nanopartículas fluorescentes con tamaños de 1-1 nm, que

contienen un núcleo de cientos de miles de átomos de los elementos del grupo 11 y VI por

ejemplo, el Cadmio, el Teluro, el Zinc y Selenio)

y

grupo 111 por ejemplo, Tántalo)

y

elementos del grupo V por ejemplo, Indio). Los puntos cuánticos pertenecen a una nueva

clase de marcadores biológicos luminescentes, que superan las limitaciones de los marcadores

orgánicos convencionales. La longitud de onda de la fluorescencia color) depende del tamañ o

de la nanopartícula. Además, los puntos cuánticos de semiconductores son extremadamente

estables y pueden estar expuestos a ciclos de excitación y fluorescencia durante varias horas

sin pérdida de su eficiencia.

Algunas de sus más importantes características son: anchos específicos de excitación y

estrechos espectros de emisión, resistencia a degradación metabólica, altos coeficientes de

extinción y habilidad para ser conjugados con biomoléculas. Recientemente, los puntos

cuánticos de semiconductores están siendo utilizados en estudios biológicos para producir

imágenes luminescentes de células o reacciones bioquimicas. por ejemplo, la reacción

antígeno-anticuerpo para el estudio de cánceres. Estas imágenes se producen de células

biológicas bajo iluminación con luz ultravioleta

UV) o visible y se pueden observar a través

del microscopio óptico ver Figura 1.1).

Las nanopartículas supermagn éticas contienen un núcleo de metal por ejemplo, hierro,

cobalto o níquel), que es magnéticamente activo, y se utilizan como agentes de realce de

contraste para mejorar la sensibilidad de la Resonancia Magnética. Cuando las partículas

magnéticas están cubiertas con una capa exterior orgánica, también pued en ser conjugadas co n

las biomoléculas y se utilizan para suministrar los fármacos en el tratamiento del cáncer. Los


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materiales magnéticos basados en Óxido de Hierro han sido ampliamente utilizados en la

práctica clínica como agentes de resonancia magnética

y

en los estudios de expresión génica,

las imágenes de la angiogénesis,

y

el tráfico celular.

Nanopartículas metálicas, en combinación con moléculas fluorescentes activas pueden

ser utilizadas para obtener im ágenes mediante la resonancia m agnética.

1 1 4 magen tumoral in

vivo

En la actualidad, las nanopartículas magnéticas están llamando la atención d ebido a si1

uso potencial como agentes de contraste para resonancia m agnética. Las venta-jas clave d e las

nanopartículas magnéticas son: baja toxicidad, biocompatibilidad

y

elevado nivel de

acumulación en el tejido objetivo. Aunque las partículas de metal como cobalto y níquel se

han propuesto, las nanopartículas magn éticas que contiene un núcleo de óxido de hierro se han

utilizado con más frecuencia.

Las nanopartículas supermagnéticas 3-1 nm) han sido desarrolladas como agentes de

contraste para resonancia magnética y utilizadas en el diagnóstico clínico como un contraste

negativo por sus efectos en la reducción de la señal en una imagen ponderada en

T2

tiempo

de relajación transversal). Nanopartículas basadas en Bismuto han mejorado en los agentes de

contraste utilizado para la tomografia computarizada, se utiliza un recubrimiento externo de

polímero para proteger de la degradación a las partículas y por lo tanto evitar los efectos

citotóxicos del bismuto. Estas nanopartículas mostraron largo tiempo de circulación en vivo

es decir, más de 2 h)

[32].


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¡¡fa

igura

1.1

A) Señales de fluorescencia roja-naranja muestran un tiimor de próstata en ratones vivos en la

imagen superpuesta izquierda) y un punto cuántico sin mezclar a la derecha). B) Aproximadamente

2

millones de puntos cuanticos de luz verde, amarillo o rojo derecho) fueron inyectados por vía subcutánea en tres

localidades adyacentes en el ratón y visualizadas con una lámpara de excitación de tungsteno o mercurio de a la

izquierda) [32].


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Objetivos

2 1 Objetivo General

Síntesis de nanopartículas semiconductoras del gurpo 111-V

y

proponer un método para

bioconjugarlas potenciando su uso com o marcador biológico de cáncer.

2 2 Objetivos specíficos

.

Realizar síntesis de nanopartículas metálicas de Au y su caracterización.

2.-

Realizar síntesis de nanopartículas semiconductoras de InP

3.- Proponer un método para bioconjugar nanopartículas semiconductoras de InP con el

5 -

tiol-modyfied aptamer para su potencial uso como marcador biológico de cáncer.


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P L N T E M X E N T O

D E L P R O B L E M


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lanteamiento del problema

Las actuales dem andas, en el área d e biología y medicina, para obtener informac ión específica

dentro de mezclas biológicas complejas e in vivo es decir, en el paciente), ha conducido a

científicos a desarrollar biomateriales de identificación fluorescente con mejores propiedades

de sensibilidad, selectividad, estabilidad, operatividad y biocompatibilidad, manteniendo un

alto rendimiento d e procesamiento. A unque las nanopartículas semiconductoras del grupo III-

V son ideales para este gran desafío, su utilización está restringida por la falta de propied ades

superficiales adecuadas que les permita conjugarse con ligandos bioafines como anticuerpos

monoclonales, péptidos, enzimas, ácido nucléico o pequeñas moléculas inhibidoras) formando

híbridos inorgánico-orgánico.

A

pesar de los recientes progresos, todavía queda mucho trabajo

por hacer para lograr la funcionalización superficial específica de nanopartículas

semiconductoras.


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Justificación de la nvestigación

El objetivo principal de la nanobiónica es la búsqueda de la mimetización de sistemas

biológicos para la construcción de nanodispositivos que mejoren la calidad de vida. El interés

por desarrollar esta nueva tecnología, está impulsando la creación y explotación de

biomateriales a escala nanométrica con propiedades diferentes hasta las hoy conocidas. Uno

de estos biomateriales son las llamadas nanopartículas biofuncionalizadas NPB). Com o

resultado de este trabajo s e pretende obtener nano partículas biofuncionalizadas, destinadas a la

detección de cáncer de mam a.

Por otro lado las actuales demandas de imagen biológica en las áreas de investigación

biología) y medicina hospitales) ha inducido el desarrollo de mejores y menos costosas

técnicas de pruebas biomoleculares y agentes de contraste con una mayor sensibilidad,

selectividad, estabilidad, biocompatibilidad

y sobre todo que no presenten problemas de

interferencia cuando se desea la detección

in vivo.

Aunque ya se han realizado diferentes

aproximaciones de desarrollos en esta línea, los biomateriales compuestos de nanocristales

semiconductores del grupo 111-V biofuncionalizados representan una alternativa para resolver

esté desafío. Con el control de las propiedades ópticas y de biofuncionalización de las NPB se

desarrollará tecnología de marcadores biológicos fluorescentes en la región del infrarrojo

cercano para su aplicación en el área biomédica, como son el estudio de procesos

intracelulares a nivel de moléculas individuales

y

para observaciones por tiem pos prolongados

in vivo

de eventos de tráfico celular. En medicina. en la detección de tumores tempranos

como el cáncer de mama) y para el desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico que

permitan en un fututo próximo el diseño de nuevos tratamientos terapéuticos en personas.

Todo lo anterior tendrá un impacto científico y sobre todo social, tanto por lo que hace

referencia a la ciencia básica como por su gran variedad de aplicaciones tecnológicas.


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M R C O T E O R I C O


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Marco Teórico

5 1 T é c n i c a s d e c r e c i m i e n t o d e n a n o p a r t í c u la s m e t á l i ca s

Recientes avanc es en la química coloidal han generado nuevo s procesos sintéticos para obtene r

agrupaciones de átomos y10 moléculas a escala nanométrica. Por ejemplo, partículas metálicas

son obtenidas a partir de la reducción d e iones metálicos en presencia d e diferentes solventes y

materiales orgánicos ligantes, surfactantes o polímeros) que han permitido restringir su

crecimiento en la escala nanométrica. Pero, el control del tamaño, forma, homogeneidad,

composición y estructura cristalina de tales nanoestructuras sigue siendo una de las principales

metas de la investigación para el actual desarrollo de la nanotecnología.

A continuación se describen los métodos experimentales utilizados para obtener

nanopartículas de oro Au) en estado coloidal sin la presencia d e algún tipo de estabilizador

orgánico. Se describen brevemente las técnicas de caracterización utilizadas para tales

nanoestructuras. Para la preparación de nanoestructuras de oro se utilizó el proceso ya

establecido de reducción química utilizando al citrato de

sodio como agente reductor y

estabilizador.

5 2 Métodos

y

Condiciones Experimen tales de Preparación

5 2 1

Dispersiones Coloidales de Nanopartículas de oro

En general, se pueden seguir dos rutas para obtener nanopartículas metálicas de oro,

como se muestra en la Figura 5 1

a) métodos físicos

b)

métodos químicos

Los métodos físicos, tales como espurreo catódico, evaporación térmica, trituración mecánica

y ablación láser involucran la subdivisión del oro en bulto hasta la escala nanométrica

[33]

Aun que esto s métodos son utilizados para preparar diferentes tipos de nanopartículas, tienen la

desventaja de ser poco efectivos para el control del tamaño, forma, homogeneidad, estructura

y composición.

En contraste, los métodos químicos como la reducción química, reducción fotolítica y

reducción radiolítica, juegan un m ejor papel en la síntesis de las nanoestructuras metálicas de

oro con propiedades específicas. Además, su versatilidad y sencillez para controlar el tamañ o,

forma, homogeneidad, estructura interna y composición por medio de la variación de las

cond iciones experimentales, los hacen interesantes para este trabajo de investigación.


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Para preparar los precursores atómicos que son subsecuentemente ag regados a tamaños

nanométricos, comúnmente se usan soluciones de iones de oro los cuales son reducidos

empleando diferentes agentes reductores para reducir los iones a átomos en estado metálico.

Michael Faraday fue el primero en dar a conocer este método químico de preparación.

Figrira 5 1 Ilustración esquemática de los inétodos de pieparacióri de partículas metálicas de tama ño

nanométrico.

La reducción de los iones de las correspondientes sales metálicas en átomos con

valencia cero es un método práctico para sintetizar nanopartículas de oro en un líquido base.

La reducción de iones metálicos por agentes reductores

en

sistemas coloidales, es un de los

mejores métodos para la preparación de nanopartículas de oro. El método de Turkevich ha

sido ya un procedimiento estándar para preparar nanopartículas de oro en agua. Este método

involucra a) la reducción de los iones a átom os metálicos con citrato de sodio, b) la

formación de núcleos, y b) un posterior proceso de crecimiento como se muestra en la Figura

5.2.

Ión itrato de

Metálico Sodio

,

Átomos on

valcncili cero

C?

e

$

úcleo

Creclrnlento

*

Nanopartícula

M e a c a

Figura

5

2

Ilustración esquemática del proceso de sintesis de nanopartículas metálicas dc oro.

7


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Ingen iería Biónica

5 3 Nucleación y Crecimiento

La formación de núcleos y el sucesivo crecimiento, son dos procesos independientes en

que se basa la síntesis de las partículas nanométricas

y

son los principales responsables de los

cambios en parámetros como estructura, forma, tamaño, homogeneidad, composición y

consecuentemente en las propiedades ópticas, térmicas, electrónicas y catalíticas de tales

nanoestructuras. Las velocidades de nucleación

y

crecimiento son determinadas básicamente

por las probab ilidades d e colisiones entre:

La primera clase es la responsable del proceso de nucleación y las dos últimas del

proceso de crecimiento. Cuando la velocidad de reducción es tan alta que casi todos los iones

son reducidos antes de la formación de los núcleos, y las probabilidades de colisiones entre

átomo-átomo son mayores que las otras dos, el tamaño de las partículas resultantes es

monodisperso y determinado por el número de núcleos formados al inicio de la reacción. Así,

todos los parám etros de reacción temperatura, tiempo, concentración de los reactantes, orden

en la cual los reactantes son adicionados a la solución, impurezas, por citar solo algunas) que

promuevan la creación de un gran número de núcleos y que reduzcan la velocidad de

crecimiento, facilitarán la formación de partículas coloidales de oro monodispersas y d e

tamaño nanométrico. Por ejemplo, sistemas reductores con alta afinidad a los iones metálicos

son efectivos para increm entar la velocidad de nucleación. En camb io, sistemas reductores con

baja afinidad hacia los iones metálicos, son ideales para dism inuir la velocidad de crecim iento.

Habitualmente, para que las partículas finales tengan tamaños pequeños y características

uniformes, de be satisfacerse la siguiente condición general: la nucleación y crecim iento deben

ser procesos comp letamente separa dos en el tiempo.

Las ventajas del método de reducción química son:

Es reproducible.

Las partículas obtenidas son nanométricas y homogéneas.

La estructura, tamaño y forma de las particulas pueden ser controladas variando

simplemente las condiciones experimentales de preparación, tales como: el tipo y

concentración d e reductor, contenid o de los iones metálicos, temperatura, y agitación.

8


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Las dispersiones coloidales son estables por meses y presentan extraordinarias

propiedades para diversas aplicaciones.

Se pueden preparar partículas monometálicas

y

bimetálicas.

5 4

stabilidad de nan opartículas

La estabilidad de un sistema coloidal de nanopartículas puede darse por dos tipos Figura 5.3 :

Estabilidad estérica. Esta ocurre mediante la absorción de moléculas de cadena larga

en la superfic ie de la partícula ejem plo polím eros), la cual dificulta la floculación por

aumento de estabilidad.

Estabilidad por carga o electrostática. Este tipo de estabilidad ocurre cuando por

absorción de cargas iones) en la superficie de la partícula, la estabilidad d e un sistema

puede ser alterada, tan solo modificando la concentración de sales disueltas o variando

el

pH de la solución.

2 * 1

9r

d

t

a

: . r o

g

stabilidad estérica stabilidad electroestática

Figiira

5 3 Ilustración esquemática de los tipos de estabilización.

5 5 Síntesis nanopartículas semiconductoras

Las síntesis de nanopartículas de InAs e InP son análogas. Todos los pasos de la

reacción y la manipulación de los reactivos se llevan a cabo bajo atmósfera controlada de gas

Argón o en una caja seca. Los nanocristales producidos son cristalinos y altamente solubles en


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una variedad d e disolventes orgánicos. com o hexano, tolueno y piridina. Las partículas tienen

diámetros que van de 2-1 nm., con estrechas distribuciones de tamaño. Las superficies de los

nanocristales pueden ser modificadas con una variedad de ligandos incluyendo las aminas,

tioles y fosfinas

[35]

La aplicación más prometedora de los nanocristales semiconductores coloidales

(quantum dots o q-dots) es com o emisores en el etiquetado biomédico.

Quantum dots de Cd-Se (Cadmio-Selenio) han sido desarrollados para tales usos. Sin

embargo, CdSe es restringido en el medio ambiente y tiene poco futuro en la industria. Entre

todos los semiconductores 11-VI y 111-V, el Fosfuro de Indio es probablemente el único que

puede ofrecer un compatible, o incluso más amp lio, rango de emisión d e color similar al d e los

quantum dots de CdSe, pero sin toxicidad intrínseca ya que el InP no tiene ni lo s elementos d e

clase A (Cd y Hg), ni los elementos d e clase B (A s y Se). Los problemas respecto a la calidad

de quantum dots de InP incluyen la baja eficiencia de emisión, mal control en la distribución

del tamaño, ba-ja estabilidad. Además, el procedimiento de síntesis para quantum dots de InP

es más com plicado que el de los nanocristales de CdS e.

Los esquemas existentes para la síntesis de quantum dots de InP y de otros del grupo

111-V son comple.jos y no flexibles. Dicha complejidad podría jugar un papel clave en la

determinación de las propiedades deficientes de los quantum dots de InP. En esquemas típicos

de síntesis de quantum dots de InP, la mezcla de reacción de be ser bombeada al vacío durante

varias horas.

La reacción también necesitaría varios días, o los quantum d ots resultantes tendrían un

rango de tamaño limitado. Cuando los ácidos grasos fueron usados como ligandos, la longitud

de la cadena y la concentración de ligandos de ácidos grasos fueron limitadas en un rango

estrecho, y generalmente la temperatura de la reacción necesitaba ser mayor a

250 .

Si la síntesis pudiera llevarse a una temperatura inferior, se podría realizar la síntesis

sin este proceso de desgasificación tan tedioso. La síntesis usando una temperatura menor de

reacción resulta bastante favorable desde un punto de vista operativo y también es más

eficiente en el uso de la energía. Para hacer que el carboxilo de Indio reaccione lo suficiente

para la formación de Fosfuro de Indio. son necesarios los reactivos de activación. Aminas

grasas han sido utilizadas como reactivos comunes de activación y ligando para me-jorar

propiedades de emisión de quantum dots del grupo 11-VI. Por otra parte, las aminas serían

necesarias para el crecimiento eficiente de la coraza de

ZnS en la superficie del InP. Sin


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embargo sólo las aminas grasas con una cadena pueden ser utilizadas debida a la baja

temperatura requerida. Las amin as grasas se han introdu cido junto con P(TMS)3 para suprim ir

aún más la formación de In203 .

5 6

nticuerpos

Los anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig) son un tipo de proteínas denominadas

glicoproteínas. Funcionan como la parte específica del denominado complejo receptor de

células B (BCR) reconociendo al antígeno a nivel de la membrana del linfocito B, y como

moléculas circulantes secretadas por las células plasmáticas procedentes de la activación,

proliferación y diferenciación de células B.

Estructuralmente están formados por dos cadenas polipeptídicas pesadas H (del

término anglosajón Heavy , pesado) y dos cadenas ligeras

L

(del tén nin o anglosajón Light ,

ligero) unidas entre sí mediante enlaces covalentes (ver Figura 5.4). Las cadenas ligeras

consisten en una región variable (VL ) y una constante (CL ) mientras que las pesadas presentan

una región variable (VH)

y

tres constantes (CHl, CH2, CH3). Funcionalmente podemos

distinguir dos porciones en los anticuerpos: una de ellas implicada en el reconocimiento y

unión al antígeno denominada región Fab (por sus siglas en inglés antigen binding Fragrnent)

y otra implicada en las funciones de los anticuerpos y en su vida media en sangre, llamada

región Fc (por sus sig las en inglés crystallizable Fragrnent).

Figura 5 4 Estructura de un anticuerpo

Existen cinco clases diferentes de anticuerpos, que se diferencian entre sí por una serie de

cam bios estructurales qu e les confieren diferentes funciones en el organismo.


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ACIONAL


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In~ eni erí a iónica

5 6 1 Mecanismo de acción de los nticuerpos

La principal función biológica de los anticuerpos es unirse a cualquier sustancia

extraña o antígeno, que haya entrado al organismo, con el fin de facilitar su eliminación. Las

regiones de un antígeno que son reconocidas específicamente por los anticuerpos se

denominan determinantes antigénicos o epítopos. Un antígeno puede presentar diferentes

epítopos y por tanto provocará la producción de una amplia gama de anticuerpos por parte de

diferentes linfocitos B.

Las regiones concretas donde s e produce el reconocimiento por parte de un anticuerpo

hacia un epítopo concreto, se llaman regiones CDR Complem entary Determining Regions).

Hay tres regiones CDR regiones determinantes de complem entariedad o hipervariables)

denominadas CDRI, CDR2 y CDR3 y se localizan todas ellas en las regiones o dominios

variables de cada cadena ligera y pesada) del anticuerpo. Figura 5.4

Las regiones CDR confieren a las inrnunoglobulinas una enorme especificidad y diversidad.

Figura 5 5 Regiones CDR de u anticuerpo responsables del reconociniieiito de antigenos

Los anticuerpos realizan una doble función dentro de la respuesta inmune del

organismo cuanto lo invade un agente externo. Por un lado, se unen específicamente a una

amplia variedad de antígenos y, por otro lado, se unen a un número limitado de moléculas y

células efectoras del Sistema Inmune.


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. .

c:

>< .

.

Figiira 5 6

Etapas del proceso de eliminación de agentes extraños.

En el mecanismo de eliminación de agentes extraños al organismo, los anticuerpos

tienen como función el reconocimiento específico de los antígenos ver Figura 5 3 ,

provoca ndo la respuesta inmun e etapa 3 , y el reclutamiento d e diferentes células y m oléculas

del organismo que serán capaces de destruir y eliminar al antígeno etapa 4 . Un solo antígeno

puede presentar diferentes epítopos en su superficie, es decir, puede estimular la producción

de diferentes anticuerpos, cada uno de los cuales es específico para un epítopo concreto. Una

sustancia extraña que contenga diferentes epítopos al entrar en el organismo provocará la

producción de anticuerpos procedentes de diferentes clones de linfocitos

B.

Este tipo de

anticuerpos con diferente capacidad de reconocer y unirse al antígeno se denominan

anticuerpos policlonales. Mientras que los anticuerpos monoclonales son específicos para un

solo epítopo y están producidos por un único clon celular. Gracias a los avances que han

experimentado disciplinas como la Proteómica y la Genómica, ha sido posible identificar y

caracterizar nuevas moléculas que desempeñan fiinciones importantes en el desarrollo de

ciertas enfermedades autoinmunes, víricas e incluso el cáncer. Las características de los

anticuerpos monoclonales hacen d e ellos unos agentes terapéuticos potentes y prometedores.

5.6.2

Anticuerpos Monoclonales

Hasta el desarrollo de los anticuerpos monoclonales en el año

1975,

el uso de los

anticuerpos en diagnóstico y10 terapia se centraba únicamente en la utilización de sueros

inmunes convencionales. Estos sueros son obtenidos a partir de distintas especies animales y


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contienen, entre otros much os compuestos, una mezcla de anticuerpos producidos por distintos

clones d e linfocitos

B,

por lo que se denominan anticuerpos policlonales. Estos anticuerpos

reconocen en mayor o menor medida el antígeno pero con distinta especificidad y afinidad

cada uno de ellos. En cambio, los anticuerpos específicos para un solo epitopo y producidos

por un único linfocito B y su s clones, se denominan anticuerpos monoclonales.

Un anticuerpo monoclonal es aquel que reconoce específicamente una parte del

antígeno, es decir un epítopo concreto, y que es producido por un clon de linfocitos

B.

Por las propiedades que poseen los anticuerpos, han sido empleados en terapia desde

que la FD en 1986 aprobó el primer anticuerpo mon oclonal para el tratamiento del rechazo

del transplante de riñón. Los anticuerpos monoclonales, por tanto, son empleados en terapia

para el tratamiento de diversas enfermedades formando la familia de fármacos denominados

anticuerpos monoclonales terapéuticos. Debido a la especificidad de unión que poseen los

anticuerpos, son em pleados en la localización y eliminación de patógenos infecciosos como el

virus respiratorio sincitial VR S). Tam bién se utilizan como terapia en la detección de células

concretas del organismo como por ejemplo células tumorales, incluso en la inhibición de

procesos inflamatorios.

5 7 ptámero

Los aptámeros son macromoléculas de ácidos oligonucleótidos o moléculas péptido,

que se unen a moléculas dianas específicas. Los aptám eros normalmente se crean mediante la

selección aleatoria de

15

a

7

nucleótidos de longitud, pero también existen aptámeros

naturales en riboswitches. Los aptámeros pueden ser utilizados tanto en la investigación básica

y clínica con fines como los medicamentos macromoleculares. También se pueden combinar

con ribozimas a hendirse a si mismo en presencia de su molécula objetivo. Estas moléculas

compuestas tienen una investigación adicional, industrial y aplicaciones clínicas.

Los aptám eros pueden ser clasificados como:

a) Aptáme ro ADN o ARN Se componen de líneas generalmente cortas d e oligonucleótidos.

b) Aptámero péptido Se componen de un dominio péptido variable corto, que se adjunta en

amb os extremos a una proteína de andamiaje.


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Los péptidos s e diferencian de las proteínas en que son más pequeños tienen menos de

diez mil o doce m il Daltons)

y

que las proteínas pueden estar formadas por la unión de varios

polipéptidos

y

a veces grupos prostéticos. Un ejemplo de polipéptido es la insulina, compuesta

de

55

aminoácidos y conocida como una hormona de acuerdo a la función que tiene en el

organismo d e los seres humanos.

Una de las propiedades de aptámeros ARN es la capacidad de formar estructuras

complejas. Mediante la fornlación única

y

de estructuras secundarias que confiere alto grado

de especificidad de su molécula objetivo. Ellos son capaces de detectar cambios estructurales

muy pequeños en su molécula objetivo, tales como la presencia o ausencia de metilo o un

grupo hidroxilo. La selección de aptámeros es un proceso in Vitro llamado Evolución

Sistemática de Ligandos por Enriquecimiento Exponencial SELEX por sus siglas en inglés).

Aptámeros de

ARN

pueden ser generados para cualquier objetivo de proteínas, debido a esto,

el

procedimiento SELEX no depende de un sistema in vivo

y

muchas complicaciones con el

sistema animal pueden ser resueltas.


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Desarrollo Experimental

6 1 Preparación d e dispersiones coloidales de nanopartículas de oro a diferentes razones

molares

La síntesis de las dispersiones coloidales de nanopartículas de oro fueron preparadas por el

método de reducción química utilizando al citrato de sodio com o sistema reductor el cual ha

mostrado ser un método d e bajo costo puesto qu e no necesita de equipos de alto vacío o de

algún otro a ditamento sofisticado.

El arreglo experimental de la síntesis de nanopartículas de Au como s e muestra en la

Figura 6.1 consta de una pa nilla de calentamiento la cual posee un regulador q ue controla la

velocidad de agitación y la temperatur a en el reactor. En un extremo se suspende un

termómetro que mide la temperatura alcanzada en el sistema de reacción. Un matraz de bola

con tres bocas es utilizado como reactor. En un extremo es colocado un termómetro que mide

la temperatura de la reacción. El otro extremo es utilizado para introducir la solución

reductora y finalmente en el centro del matraz se coloca un sistema refrigerante necesario

para el proceso de reflujo. Los componentes del reactor siempre fueron limpiados tenazmente

antes de ser usados.

Figura

6.1

Arreglo experimental de la síntesis de nanopartículas d e oro

7


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In ~ en i e r í a ió nica

Utilizando este arreglo experimental se prepararon las dispersiones coloidales de

nanopartículas de oro a diferentes razones en número de moles de [CS]

/

[HA uCI4] sin la

presencia de algú n agente estabilizador.

Las propiedades físicas y10 q uímica s de los reactivos utilizados en la preparación de las

nanopartículas de oro se resumen en la Tabla

6.1

o cloroá

Citrato

de

sodio

Alfa Aes

dilipore

2

Agui

Tab l a 6 1 Propiedades físicas de los diferentes reactivos utilizados para síntesis de N ii

Para llevar a cabo la síntesis de dispersiones coloidales de nanopartículas de A u se

utilizó el método de reducción química. Para tal efecto, se preparó una solución precursora de

ácido cloroáurico (0.033 mmol HAuC14 en 300 m1 de agua) disolviendo los cristales de

HAuC14 en agua. La solución iónica, inicialmente presentó un color am arillo, como se mu estra

en la Figura 6.2 (a). 50 m1 de solución precursora fueron puestos a reflujo a 100 C y en

agitación sobre una parrilla de calentam iento como se muestra en la Figura 6 1 Entonces

2

m1

de una so lución de CS a diferentes concentraciones fu e adicionada y puesta en reflujo por h.

Inmediatamente al inicio de la reacción, la solución se torno incolora solo por algunos

instantes. En aproximadamente 10 seg. la coloración de la solución cambio a azul y luego a

color púrpura indicando la formación de los núcleos de oro. En unos pocos minutos la

solución presentó un color rojo-rubí característico de dispersiones coloidales de partículas de

Au de tamaño nanométrico [34]. La terminación de la reacción toma unos minutos o decenas

de minutos dependiendo de la concentración del CS utilizado. Estas características de cambio

de color fueron observadas para razones molare s de [CS] [HAuC14] en el intervalo de 0.25 a

2.25 y se presentan en la Figura 6 2 Estos resultados son consistentes con los obtenidos por

1.2.3.4

otros autores Para may ores valores de razones mo lares no se observó la presencia del


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ta

color azul

y

púrpura durante la formación de las nanoestructuras. Para determinar las

cantidades de reactivos en gramos realizamos los siguientes cálculos:

Para determinar la cantidad de C itrato de sodio necesario utilizamos la siguiente fórmula:

peso

=

peso molecular

Donde:

n= número de moles= 3) 0.033 mmol)= 0.099 mmol

y

el peso m olecular del Citrato de Sodio es: 258.0 1795

Por lo tanto el peso de C itrato de Sodio es:

peso= n*peso molecular

peso= 0.099) 258.0 1795)= 25.549 mg

m .

d. .

a

al

Natzrre 1 9 7 3 2 4 / 2 0 .

J. Phys Chem 1985 89 1074.

4

J. Colloid Interface Sci 1994 16 5 97.


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Figura 6 2 Imágenes de diferentes tiempos de reacción de dispersiones coloidales de nanopartículas de oro a una

razón molar de [CS] [HAuC14]

2.25

: a) solución de HAuCI?, b) O segundos inicio de la reacción), c) 3 seg,

cc) 9 seg. formación de núcleos de oro),

d) 12 seg,

15

seg. proces o de coarsening)

y e) 20

minutos formación

de nanopartículas de oro).

Para estudiar el efecto de la razón molar [CS ] [HA uCI4] en las propiedades de las

dispersiones coloidales de nanopartículas de oro, se prepararon diferentes soluciones

coloidales de Au, ver Tabla 6.2, manteniendo siempre constante el contenido de iones

metálicos. Las soluciones resultantes fueron entonces puestas a reflujo a 100 O por h con la

razón de concentración de CS correspondiente. Las dispersiones coloidales así obtenidas son

homogéneas y estables por meses. Para una razón de [HAuCId]

1

[CS] 110.25 no se presenta

la formación de nanoestructuras de Au. En la Figura 6.3 se presentan las imágenes de las

correspondientes dispersiones coloidales de Au. S e puede observar claramente la variación d e

color violeta+ rojo rubi+azulado) con el aum ento del conten ido del CS utilizado en la

reacción. Esta variación del color es indicativa de la formación de nanopartículas con

diferentes tamafios 1361.


46/75


Unidad Profesional lnterdiscipl inaria en Ingeniería

y


, ,

La formación y estabilidad a la aglomeración de las partículas coloidales es mostrada como

estable) o inestable).

2 31

7

[HAuCl,]

[Citrato

de Sodio]

-

-

Tnninfio tle

P:irticula

i abla

6.2 Estabilidad y razón molar de las diferentes síntesis realizadas.

Figura

6 3

Dispersiones coloidales de oro a obtenidas con diferente razones molares d e [HAuC14]/[CS].

6.2 Prepara ción de dispersiones coloidales de nanopartículas semicond uctoras InP,

I I I

V)

La síntesis de nano cristales semicondu ctores se realizó en las instalaciones del laboratorio de

Ingeniería Ambiental perteneciente a la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Se

utilizó una caja de guantes para poner tener una atmósfera controlada inerte), mediante gas

Argón. Tam bién fue necesaria una bom ba de vacío para realizar el intercambio y control de la

atmósfera dentro de la caja de guantes ver Figura 6.4).

El esquema de síntesis utilizado está basado en el presentado por Liang Li y Peter

Reiss

[ 3 7 ] Dicho esquema fue desarrollado para quantum dots de InP a temperaturas

relativamente bajas y es muy similar a los desarrollados para nanocristales de Cd-Se,

incluyendo el disolvente, ligandos, los precursores, y la, no necesaria, desgasificación a fondo.

La posición del pico d e absorción del inP podría estar continuamente entre 390 y 7 2 0 nm bajo

este régimen de síntesis. El rango de tamaño accesible de una reacción fue sintonizado con

facilidad por la concentración de las aminas, la concentración y la longitud d e la cadena de los

ácidos grasos uti l izados para disolver I~ I A C ) ~Acetato de Indio), y la temperatura d e reacción

por debajo de

200 C).

Las propiedades físicas y10 químicas de los reactivos utilizados en la

preparación de las nanopartículas de InP, se resume n en la Tabla 6 2


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INSTITUTOPOLITÉCNICO

ACIONAL

A


upiita


Acetato de Indio

-

Ácid

sigma

Aldrich

225 37

Sigma-

Aldrich

ico

Aldrich

Aldrich

1-dodecanoiol

-0ctadecenc

stearato de

zinc H ? C H ~ ) I ~ C O O I ? ~

abla 6.3 Propiedades físicas de lo s diferentes reactivos utilizados

para

síntesis de

NInP

97

90

9

Sigrna-

Sigma-

Aldrich

Riedel de

Haen


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INSTITUTO PO LI TÉ CN IC O ACIONAL

Unidad Profesional lnterdiscipl inaria en Ingeniería

y


ta


F i g u ra

6 4

a Instalaciones del Laboratorio de Ingeniería Ambiental BUA P. b Instalación de alimentación de

Argón.

c

Caja de Guantes. d Bomba de Vacío.

F igura

6 5

Izquierda: lavado de material. D erecha: material limpio.

3


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INSTITUTO POLIT ÉCN ICO ACIONAL

A


y


upllt

lneenieria Biónica

Se lavó el material

y

se limpió el equipo necesario espátula, 2 vasos de precipitados de

20 ml, reactor, enfriador, balanza, soporte universal, pinzas de sujeción, parrilla de

calentamiento, termómetro, matraz con tapón, probeta graduada de 20 ml., vaso de

precipitados de 100ml) ver Figura 6.5. A continuación se colocó este material, así como los

reactivos, dentro d e la cámara lateral de la caja de g uantes; posteriormente se eliminó el aíre

atmosférico de la cámara mediante la bomba de vacío, para eliminar cualquier impureza que

pudiera afectar la reacción; una vez realizado lo anterior, se procede a llenar la cámara con gas

Argón, para homogeneizar la atmósfera con la caja de guantes

y

poder pasar los materiales y

reactivos a la misma. Esta operación se realizó tantas veces fue necesario, debido al tamaño d e

la cámara lateral, que no permite introducir todos lo necesario en un solo paso. Figura 6.6.

Figura 6 6 Colocación del material en la cámara lateral de la caja de guantes.

Una vez teniendo el material, el equipo y los reactivos dentro de la caja de guantes, se

inició con la mezcla de reactivos, para lo cual se pesaron los reactivos necesarios para la

síntesis del precursor: Mirista to de Indio.

6.2.1

Preparación de Miristato de Indio III M A )~

2 mmol de acetato de Indio fueron mezclados ba-jo una atmósfera inerte con mmol d e

ácido mirístico MA ) y 20 m1 de ODE 1-octadeceno) en un matraz de 2 cuellos de 50 m1

equipado con un condensador. La mezcla fu e calentada a 100- 120°C y puesta a reflujo por una

hora al vacío para obtener una solución ópticamente clara; posteriormente el vacio se llenó con

Argón siendo enfriado a tem peratura ambiente. Figura 6.7.

Para determinar la cantidad en gramos de los reactivos se procedió de l siguiente

forma para calcularla, utilizando para ello los pesos moleculares referidos en la tabla 6.2.


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A

Unidad Profesional Interdiscipl inaria en Ingeniería

y


,,iita


Para determinar la cantidad en gram os de Acetato de Indio:

1mmol AcIn 291.95 mg

2 mmol AcIn

X1

X I (2 mmol)( 291.95 mg)/(l mmol) 0.5839mg

Para determinar la cantidad en gram os de ácido mirístico:

mmol MA 228.37 mg

5 mmol AcIn X2

X2= 5 mmo l)( 228.37 m /(

l

mmol) 1.1438mg

igiira 6 7 a) Pesando los reactivos; b) Colocación del ácid o mirístico y el -0ctadeceno en l reactor; c) Síntesis

del precursor; d) Aplicación d e vacío a la cámara d e guantes


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INSTITUTO

POLITÉCNICO

NACIONAL


Unidad Profesional Interdisciplinaria en Ingeniería

y


upiit

6 2 2

Síntesis

de

nanocristales de

InP

Para la síntesis se requirieron 0.1 mmol de miristato de Indio, preparado a partir de

acetato de indio y ácido mirístico

MA),

0.1 mm ol de estearato de zinc, 0.1 mmol de

dodecanotiol DDT ), 0.1 mmo l de

tris trimetilsi1il)fosfina

P TMS)3

y

8 ml de 1-octadeceno

mezclados bajo una atmósfera inerte en un matraz de 2 bocas equipado con un condensador.

La mezcla fue calentada a una temperatura entre 230°C-300°C. La temperatura se mantu vo

durante un tiempo determinado 5 min 2 hrs) para hacer crecer los nanocristales de InP con

coraza de ZnS. Durante el incremento de temperatura, se observó un cambio de color de

incoloro a verde a 60-80°C, indicando que P TM S)3 comenzó a reaccionar con el precursor de

Indio. Para aislar los nanocristales, la mezcla de la reacción fue enfriada hasta temperatura

ambiente, y un volumen equivalente de una mezcla de cloroformo/metanol 1 : vol:vol) así

como 10 equivalentes de etanol fueron añadidos; posteriormente se centrifugó a 14000 rpm,

colocando la solución en cinco vieles se colocó uno extra con agua para com pensar al

mom ento de centrifugar). Una vez centrifugadas las nanopartículas, se decantó la solución. Se

agregaron 2 m1 de etanol por viel; se trataron en el limpiador ultrasónico para disolver las

partículas en el etanol

y

se volvió a centrifugar. Este proceso se realizó por tres ocasiones, de

manera que se fueron limpiando las muestras. El precipitado resultante fácilmente podría estar

disperso en diferentes disolventes orgánicos, incluido el hexano, tolueno o cloroformo. Figura

6.8.

Figura 6 8

Nanopartículas después del proceso de centrifugado


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INS TITUTO OLITÉC NIC OACIONAL

Unidad Profesional Interdiscipl inaria en Ingeniería y Tecnologías Avanzadas

upiit


6.3 Biofuncion alización de nanop artículas semicond uctoras InP, 111-V)

Después de realizar la lectura detallada de artículos sobre biofuncionalización y

bioconjugación de quantum dots para realizar marcadores biológicos, se compararon las

ventajas

y

desventajas del uso de anticuerpos

y

de aptámeros. Optamos por plantear el

siguiente procedim iento para biofuncionalizar las nanopartículas semicondu ctoras:

Las sondas de nanopartículas de InP fueron sintetizadas por la derivación de 5ml de

solución de etanol de nanopartículas semiconductoras de InP con 2.5 OD de alcanotiol-

oligonucleótido (la concentración final del oligonucleótido es 3.6pM, disuelto en agua), la

mezcla heterogénea se pone a reflujo durante 15 minutos, posteriormente se deja en reposo y

una vez que las fases sean separables y se retiran las moléculas hirofílicas (Nanopartículas

InP-aptámeros). Después de reposar durante 16 horas, la solución es puesta a 0.1 M d e NaC1,

buffer d e 1OmM de fosfato (pH=7)

y

se deja reposar durante 40 h, seguida de centrifugación

por lo menos unos

25

minutos a 14000 revoluciones por minuto para remover el exceso de

reactivos. Despu és de retirar el supernatante, el precipitado rojo aceitoso es lavado con 5 m1 d e

una so lución d e stock de 0.1 M d e NaCl

y

10 mmol buffer fosfato se ce ntrih ga

y

se decanta; se

le agrega 5 m1 de una solución d e 0.3 M de NaCl

y

10 mmol d e buffer fosfato (pH=7), 0.01

solución ácida.


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INSTITUTO OLITÉCNICO CION L

A


pllt


R E S U L T D O S


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upllta


Resultados

7.1 Nanopartículas coloidales de oro.

Los espectro de absorción en la región UV-Vis de la soluciones de sal metálica de

HAuCI4 en H 2 0 es presentada en la Figura

7.1.

La presencia de los iones de oro es revelada

por el pico de alrededor 216 nm. Con la adición del sistema reductor citrato de sodio, el pico

de absorción a 216 nrn decrece y desaparece como consecuencia de la reducción d e los iones

de oro a átomos metálicos. En este periodo, en general la solución se vuelve transparente y

después se torna azulado-violeta-rojo intenso debido a la formación de partículas de oro de

escala nanométrica. El espectro obtenido al final del proceso de crecimiento presenta una

banda característica alrededor de

520

nm dependiendo de la razón

[CS]

[HAuC14]

correspo ndiente a la resonan cia del plasmon superficial RP S) resultado de la oscilación

colectiva de los electrones de conducción del oro en las nanopartículas.

[Citrato] [HAuCI,] 0 25

1 0

Iones de oro

2 16 nm)

Longitud de onda nm)

Figura

7.1

Espectro de absorción en la región UV Vis de la solución de oro con una razón molar

[ SII [HAuCI ]

0.25


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INSTITUTO PO LIT ÉC NI CO ACIONAL

A

Unidad Profesional lnterdiscipl inaria e n Ingeniería y Tecnologías Avanzadas

,,iíta


La Figura 7.2 muestra los espec tros de absorción visible de las dispersiones coloidales

de nanopartículas de Au obtenidas a diferentes razones molares de [CS] [HAuC14]. Para

todos los valores de razones de concentración, se observo un solo má ximo de ab sorción. Estas

características, confirma la formación de partículas esféricas de oro de escala nanométrica.

[Citrato] [HAuC14]= 0.5

PS 530 nm

[Citrato] [HAuCIJ

= 0 75

0.50

/ PS 525 nm

i

V

m

.

-

0.25

P

2

-0

d

300 400 500 600 700 800




Longitud de onda

nrn)

[Citrato] / [HAuC14]= 1 0 [Citrato] [HAuCI4]

=

1.3

0.50

RPS 523 nin

/

m

-

0.25

P

3

<

0.50

m

V

m

U

S

4 0.25

3

<

300 400 500 600 700 S00 300 400 500 600 700 800

Longitud de onda m )

Longitud de onda m )

[Citrato] [HAuCI,] = 1.7

[Citrato] / [HAuCI,]

= 2 0

0.50 0.50

/

P S 5 1 8 n 1 n

r

V

m

U

m

.

U

4 0.25

0.25

V

d

D

<

0.00

RPS 524

nm

/

?


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INST

Síntesis de Nanopartículas Semiconductoras Para Su Biofuncionalización

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