ESCUELA DE RECURSOS NATURALES

INGENIERIA EN ACUICULTURA

Evaluación de la Existencia de Diferencias Significativas en el

Crecimiento de las Microalgas Isochrysis galbana y Nannochlorys sp.

Con Cambios en el Fotoperíodo

Nombre Katherine Cerna Boassi

Docente: Tatiana Zúñiga

Sigla: STL8301

2011

1 INTRODUCCIÓN

Son llamadas microalgas a una gran cantidad de especies que constituyen el

fitoplancton que abarca desde organismos autótrofos hasta microflagelados y microciliados

auxótrofos.

Su posición taxonómica ha sido de gran polémica entre botánicos y zoólogos, como

ejemplo se puede mencionar el grupo de los dinoflagelados, conocidos por unos como

microalgas y por otros como protozoarios.

Las microalgas aportan un alto contenido nutricional para peces, crustáceos y

moluscos, además de ofrecer facilidades de manejo en sistemas de cultivo tanto en laboratorio

como en producción a gran escala con fines comerciales. (FAO)

La producción de microalgas en laboratorio genera costos para la empresa, como es

la energía eléctrica que es necesaria para suministrarles la luz necesaria para el crecimiento.

Si es posible la reducción en los costos sabiendo que necesidades específicas de

tiempo de luz necesita efectivamente las microalgas para su crecimiento se estaría abaratando

costos de las empresas.

Es por esto que el seminario de titulo se abocó a Evaluar si existe diferencias

significativas de crecimiento en las especies de microalgas Isochrysis galbana y

Nannochlorys sp. con cambios en el fotoperíodo. Por lo que se realizará el cultivo de

microalgas creando un sistema para manejar el fotodiodo de 12 horas y 24 horas continua de

luz y un posterior un análisis estadístico de los resultados del conteo que dio el crecimiento de

estas dos microalgas por un tiempo de una semana.

2

2 OBJETIVO

Evaluar si existe diferencias significativas de crecimiento en las especies de

microalgas Isochrysis galbana y Nannochlorys sp. con cambios en el fotoperíodo.

2.1 Objetivos específicos

Describir el cultivo de microalgas

Cultivar microalgas Isochrysis galbana y Nannochlorys sp.

Determinar crecimiento de las microalgas Isochrysis galbana y Nannochlorys sp con

manejo de fotoperíodo

Comparar crecimiento de las microalgas Isochrysis galbana y Nannochlorys sp. con

manejo de fotoperíodo

3 ANTECEDENTES GENERALES

3

3.1 Microalgas

Dentro del conjunto de organismos que forman el zooplancton se distinguen el

fitoplancton y los rotíferos. El fitoplancton está formado por algas minúsculas marinas que se

encuentran suspendidas en la columna de agua. Las microalgas forman la base de la cadena

trófica de los lechos marinos (Fig. 1). Para asegurar cantidades suficientes de fitoplancton para

poder nutrir cualquier otro cultivo es necesario ser capaces de ofrecerles las condiciones de

mantenimiento que requieren. (http://www.aquanovel.com/cultivos_fitoplancton.htm)

Fig. 1, Pirámide de la cadena Trófica marina

Fuente: http://wenarenandaf-ecosistemadelmar.blogspot.com/2010_11_01_archive.html

3.1.1 Parámetros de cultivo

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Los parámetros de cultivos para la productividad microalgal son: Luz, temperatura,

fuente de carbono, nutrientes, ph, evaporación, lluvia, contaminación, salinidad, agitación,

inóculo.

La Luz constituye un factor fundamental en todo cultivo de microalgas, tanto por si

misma como por sus interrelaciones con otros parámetros. La radiación utilizable

fotosintéticamente (PAR) cae dentro del rango de espectro visible (400- 700nm). Representa la

fuente de energía para la fotosíntesis, y tanto la intensidad luminosa como la longitud de onda y

el fotoperíodo (que marca el mecanismo para muchos ritmos circadianos) afectan al

crecimiento y metabolismo microalgal (Lips y Avissar, 1986).

La Intensidad de luz se necesita para que se realice la fotosíntesis. La tasa de fotosíntesis

aumenta con la intensidad luminosa siguiendo una cinética de Michaelis-Menten; donde se

alcanza un nivel de saturación a intensidades variables en función de la especie, después del

cual la intensidad se hace limitante, provoca la disminución de la tasa fotosintética y, por tanto,

del crecimiento.

También la fotoinhibición en un cultivo se puede dar cuando las intensidades de luz son

muy elevadas con frecuencia son inhibitorias para el crecimiento microalgal.

El termino fotoperíodo en biología dice sobre la duración o tiempo relativo de los

períodos de luz y oscuridad diarios a que están sometidos los organismos. En botánica se dice

de la unidad de alternancia de iluminación-oscuridad, específica para cada planta, cuya

repetición orgánica determina la floración de la misma.

El Fotoperíodo en condiciones normales las microalgas están sometidas a periodos de

luz/oscuridad y esta alternancia generalmente se utiliza también en su cultivo.

Muchos aspectos de la fisiología microalgas fluctúan en un ciclo de 24 horas(diario).

Esta periocidad se observó en (Sournia, 1974) :

División celular: en muchas especies la mayoría de las células se dividen en un

momento determinado del día o de la noche, lo que favorece su sincronización; al

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parecer la división nocturna ocurre en muchas especies, especialmente la que se

estudian en cultivo.

Capacidad fotosintética: con frecuencia se observa las tasas máximas de

fotosíntesis se producen en la mañana y las mínimas en el anochecer.

Absorción de nutrientes: las tasas de absorción de N y P son mayores durante el

día que durante la noche, lo que refleja la influencia de la luz sobre la absorción.

Bioluminiscencia: generalmente se detecta un pico nocturno de bioluminiscencia

en las especies que las poseen (dinoflagelados).

Estos ritmos cicardianos diarios persisten bajo condiciones ambientales constantes.

Se han realizado experimentos en laboratorios utilizando luz continua, pero los resultados

demuestran que son necesarios periodos de oscuridad para conseguir resultados óptimos,

aunque hay discrepancia de datos a este respecto. Ya que se dice que las microalgas se pueden

adaptar a bajas densidades de luz y tienen mas eficiencia en la absorción de energía lumínica

Experiencias con I. galbana en luz continua y en periodos luz-oscuridad, proporcionando

la misma cantidad de luz por día (cantidad de luz=intensidad x tiempo), muestran que si bien

para una temperatura dada el crecimiento es proporcional a la cantidad de luz recibida, se

obtienen mayores tasas de crecimiento en el régimen de Luz-oscuridad (Toro, 1989).

En cuanto a la Longitud de onda que es la calidad de luz se que tiene efectos marcados

sobre el crecimiento y varios procesos metabólicos y pueden afectar también la composición

bioquímica.

Las Fuentes luz pueden ser artificial y natural. La luz natural tiene la ventaja de no

suponer un gasto energético, pero tiene los inconvenientes de que no se puede controlar ni el

fotoperíodo ni la intensidad, asimismo, se producen importantes variaciones diarias,

estacionales, en función del tiempo atmosférico. Por el contrario, la luz artificial puede

controlarse pero supone un gran gasto energético, u por tanto un elevado coste.

6

La fuente de luz artificial tiene espectros de emisión que no son necesariamente idénticos

a la luz natural del sol y la calidad de la luz puede afectar al crecimiento, metabolismo,

reproducción y morfología.

Las lámparas de fluorescentes tubulares son la fuente de luz preferida la iluminación de

cultivos interiores. Estas dan menos calor que otros tipos de luz artificial y son igualmente

eficientes en promover tasas de división y crecimiento máximos.

3.2 Fotosíntesis

Las microalgas son responsables de más del 50% de la fotosíntesis del planeta, y

además convierten el CO2 en biomasa verde (Fig. 2), ya que lo incorporan a su propio

organismo. Las microalgas captan la energía solar y la acumulan en sus grasas gracias a la

fotosíntesis, absorbiendo dióxido de carbono y desprendiendo oxígeno.( M. Teresa Bermúdez,

http://www.andaluciainvestiga.com/espanol/noticias/4/microalgas_2924.asp)

Fig. 2, Esquema del almacenamiento de energía en un microalga.

Fuente: http://www.sitiosolar.com/biocombustibles%20de%20microalgas.htm

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3.2.1 Fase luminosa

La fase luminosa, fase clara, fase fotoquímica o reacción de Hill es la primera etapa

de la fotosíntesis, que convierte la energía solar en energía química. La luz es absorbida por

complejos formados por clorofilas y proteínas. Estos complejos clorofila-proteína se agrupan

en unidades llamadas fotosistemas, que se ubican en los tilacoides (membranas internas) de los

cloroplastos. Se denomina fase luminosa o clara, ya que al utilizar la energía lumínica, sólo

puede llevarse a cabo en condiciones de alta luminosidad, ya sea natural o artificial. (

http://es.wikipedia.org/wiki/Fase_luminosa)

8

3.3 Antecedentes de la especie

3.3.1 Nannochlorys sp.

Nannochlorys sp. (Naumman ) (Tabla I) es un alga verde que no posee movilidad ya

que no contiene flagelos, tiene un reducido tamaño, es una célula de forma esférica, tiene un

diámetro de 1,5-2,5µ (Fig, 3), Es una especie unicelular que acumula lípidos y ácidos grasos

polinsaturados (Hoff F.,1999).

Tabla I, Taxonomía Nannochlorys

Fuente: http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=6987

Fig. 3, Nannochlorys.

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3.3.2 Isochrysis galbana

Isochrysis galbana (Parke) (Tabla II) Variedad Tahití es una célula de 4 a 8 m de

tamaño, con dos flagelos móviles situados cerca del final de la célula (Fig 4). Es un flagelo de

color amarillo, que habita en climas templados, su crecimiento óptimo se encuentra a una

temperatura que varia de 16ºC a 20ºC , a una salinidad de 25 o / oo y una iluminación de 4.000

lux. Debido a su tamaño y a que es un flagelado desnudo, es fácilmente digestible por los

consumidores. Se reproducen por simple división y usualmente son empleados como alimento

para rotíferos, almejas, ostras y larvas de camarón.

Isochrysis galbana es rico en ácidos grasos poliinsaturados, que son de alto valor

nutritivo para los las larvas de peces marinos y estadios juveniles de moluscos, se sabe de la

experiencia de crecimiento de esta microalga para la alimentación de larvas de ostras fue un

gran éxito para la alimentación de esta. (http:// www.bashanfoundation.org

/drora/droraoptimalgrowth.pdf)

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Tabla II, Taxonomía de Isochrysis galbana

Fuente: http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=77552

Fig. 4, T iso Isochrysis galbana Variedad Tahití

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3.4 Técnica de cultivo de microalgas

La secuencia de cultivo es bastante simple, y en general, es común para todos los

cultivos de microalgas que se realicen en ambiente controlado. Se inicia con la obtención de la

o las cepas que sean de interés para el hatchery, a través de un tubo de stock, del cual se

realizan varias diluciones con el fin de tener réplicas de las cepas.

Para iniciar el cultivo se selecciona aquel tubo que tenga la mayor concentración, la

cual normalmente se ve a través de la coloración que ésta tenga. De aquí se obtiene el inóculo

para comenzar el cultivo intermedio desde 150 ml, para continuar hasta aproximadamente

2.000 ml. Una vez alcanzada esta etapa, se pasa al cultivo masivo, el cual dependiendo del área

que se tenga, se puede realizar en estanques de fibra de vidrio de aproximadamente 200 litros o

mangas plásticas con volúmenes variables hasta los 25 litros aproximadamente.

3.4.1 Medios de cultivos

Entregar una correcta nutrición a las Microalgas es una de las tareas más

importantes en el cultivo de estos organismos. Las Microalgas son alimentadas mediante los

medios de cultivo, que son recetas formuladas para grupos de especies con características en

común. Cada medio de cultivo varía en sus concentraciones y tipos de nutrientes, existiendo

algunos que son utilizados sobre agua destilada, agua dulce y agua de mar. Para conocer cómo

nutrir a las Microalgas, es importante conocer su composición química para así poder

identificar qué elementos son los necesarios para generar biomasa algal. Los principales

nutrientes en las Microalgas son el Carbono, Nitrógeno y Fosfato.

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3.4.1.1 Medios para Microalgas marinas

El agua de mar es de por sí un medio propicio para el crecimiento de algas. Este

medio marino generalmente es fortalecido cuando se le añaden nutrientes como el nitrógeno, el

fósforo, el hierro y otros. Muchos medios enriquecidos y sintéticos han sido desarrollados para

el cultivo de algas microscópicas planctónicas y algunas especies bénticas han crecido

exitosamente con estos medios. Las dificultades encontradas en el desarrollo de los cultivos

algales están a menudo relacionadas con los problemas de aislamiento, manipulación,

incubación y situación fisiológica del organismo. Un solo medio debe servir para la mayoría de

las necesidades del cultivador. Este es el caso del medio R. Guillard f/2 en el cual un gran

número de especies algales crecen sin dificultad. Un medio sintético puede ser usado igual que

uno enriquecido, pero cualquiera que éste sea, el medio deberá ser tan simple como sea posible

en su composición y preparación. (Stein,1994)

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3.5 Modelo Matemático

3.5.1 Modelo experimental: Modelo bifactorial de efectos fijos con varias muestras por

grupo: (Montgomery, 2002)

El diseño de un experimento tiene como objetivo proporcionar estimadores de los

efectos de los tratamientos o diferencias entre sus efectos, por medio del uso de unidades

experimentales que presenten un comportamiento equivalente frente a un mismo tratamiento,

de modo que las diferencias detectadas en las respuestas sean preferentemente, consecuencia de

los diferentes efectos de los tratamientos y no de las diferencias entre las unidades

(Montgomery, 2002).

Sin embargo, es necesario estimar la variabilidad del material en experimentación, por

medio de una estimación del error experimental, para lo cual cada experimento debe ser

replicado un número suficiente de veces. De esta forma los grados de libertad disponibles para

ese efecto, permiten separar los diferentes componentes de la varianza asociados al

experimento, es decir estimar los distintos componentes del error experimental.

En particular se debe verificar la posibilidad de efectos combinados de dos o más

factores, interviniendo sobre una misma unidad experimental. Este problema se asocia a la idea

de independencia entre los efectos de los tratamientos. Idealmente, sería deseable que el efecto

de la aplicación de un tratamiento A, fuera independiente del efecto de la aplicación de otro

tratamiento B, suponiendo que en principio sólo se está interesado en estimar los efectos puros

de ambos factores, pero como no es posible asegurar tal independencia, se necesita diseñar un

esquema de aleatorización y análisis que permita verificar la existencia de tales interacciones.

A este respecto, los experimentos factoriales, constituyen una forma de definir los tratamientos

de un experimento de modo que sea posible estimar el efecto de dichas interacciones. En un

experimento factorial, los tratamientos consisten en combinaciones de dos o más factores cada

uno en dos o más niveles. Las combinaciones son tales que cada nivel de todos los factores

ocurre junto con cada nivel de todos los otros factores. El número de tratamientos es el

producto del número de niveles de todos los factores.

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Este tipo de generación de tratamientos, que puede estar asociado con cualquier tipo de

aleatorización (o diseño experimental), tiene las ventajas que en él, todos los efectos simples

del factor son iguales al efecto principal. Existen replicaciones escondidas, de modo que cada

efecto principal es estimado con la misma precisión como si el ensayo entero hubiera sido

desarrollado para un solo factor y finalmente, quizás lo más importante, cuando hay

interacciones entre los factores participantes del experimento, los experimentos factoriales

proporcionan un conjunto sistemático de combinaciones de factores para estimar todas las

interacciones, cada una con igual precisión.

Para efectos de este estudio, se consideran diseños completamente aleatorios, con dos

factores y que se llamarán, para efectos de identificación A y B, cuyo modelo es:

donde:

Y ijk = corresponde a la respuesta, densidad (número de células/ml.)

m = es la media general del modelo

a i = es el efecto del i-ésimo nivel del factor A, el que tiene i=1,...,a niveles

b j = es el efecto del j-ésimo nivel del factor B, el que tiene j=1,...,b niveles

(abij ) = es el efecto agregado (interacción) de los factores A y B a sus niveles i y j,

respectivamente.

e ijk = error experimental

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Y ijk = m + a i + b j + (abij) + e ijk

4 MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 Lugar y tiempo de trabajo

La experiencia se desarrolla en el laboratorio de DUOCUC en un tiempo de 2 meses,

desde mayo hasta junio.

4.2 Sistema de fotoperíodo

Para reproducir dos sistemas de fotoperíodo que será de 12 y 24 horas, se diseña y

construye una caja de madera de 30 alto x 40 ancho x 50 cm largo (fig 5 y 6), separadas en dos

secciones de 25 cm. Provistas de un tubo Fluorescente de 8 watts en cada sección conectados a

un Timer o reloj formando un circuito (Fig.7) que esta programado para realizar el fotoperíodo

en la sección 1 de 12 horas realizando la fase luminosa desde las 21 - 9 horas y en la sección 2

realizando la fase luminosa las 24 horas del día.

Fig.5 , Diseño y medidas del sistema de fotoperíodo.

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Fig. 6, Caja terminada con instalación de iluminación tubos fluorescentes 8 Watts.

FIg. 7, Circuito del sistema

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4.3 Obtención de las cepas de microalgas

Las 2 cepas fueron suministradas del Stock que posee el laboratorio DUOCUC que

son las siguientes:

Isochrysis galbana

Nannochlorys sp.

4.3.1 Medio de cultivo para microalgas

Se emplea el medio de cultivo de Guillar “f/2” (Fig. 8 y Tabla III), las cantidades de

las preparaciones son las siguientes :

Para un litro:

1 ml. Nitrato

1 ml. Fostato

1 ml. Traza

0.5 ml. Vitamina

2 ml. Triz

Fig. 8 , Preparados de nutrientes.

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Tabla III , Medio de Cultivo F/2 de Guillard

Cantidades para la preparación de nutrientes.

Fuente: Manual cultivo de bivalvos en criadero (FAO)

4.3.2 Desinfección y esterilización en el cultivo de microalgas

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La Desinfección es muy necesaria para evitar contaminaciones externas sólo en las

manos como en el mesón.

Para la preparación del material se debe realizar un lavado previo, con un detergente

no abrasivo, y secado en la estufa por período de 45 minutos aproximadamente. Una vez frío el

material se procede a envolver el material a utilizar con papel “reciclado” del laboratorio, se

debe dejar siempre la cara escrita hacia fuera del material de vidrio.

La esterilización, para material de vidrio en la estufa a 180° por 1 hora. Por medio de

calor seco. Es muy importante destacar que el retiro de los materiales se debe hacer con

guantes de seguridad para evitar posibles quemaduras

El agua que es reservada en el estanque de acopio es tratada para su remoción de

microorganismos con el esterilizador UV por un período de 56 hrs. continuas, luego de ese

período es posible ocupar el agua para cultivo de las microalgas.

Posteriormente se hace factible contener el agua en un matraz de aproximadamente 2

lts. Cubierto con un algodón hidrófobo y papel reciclado en la boquilla.

El agua es autoclavada equipo que esteriliza por medio de calor húmedo, equivalente

al proceso de una olla a presión. Por un período de 15 minutos a 121°C o 1.2 atm.

4.4 Cultivo de microalgas

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La experiencia se inicia con la obtención de cepas entregadas por el laboratorio, se

prepara el material de vidrio que son dos matraces de 250 ml., se autoclave agua de mar luego

con la preparación del medio que se uso F/2. se prepara un stock de microalgas (Fig. 9).

Se realizó un litro de solución y se preparó dos matraces de 250 ml cada uno, se le

adiciona 4 ml. de tubos de ensayo inicial que contaba el laboratorio de Duoc Uc.

Fig. 9, Stock de cada microalga Isochrysis y Nannochlorys

después de 2 semanas de crecimiento.

Se replica a tubos de ensayo 4 ml. de cada stock de microalgas y se rellena con 6 ml.

de agua preparada con el medio F2.

Durante una semana se dejan las microalgas creciendo en el sistema de fotoperíodo

agitando diariamente las muestras (Fig. 10) .

Fig. 10, Sistema con dos secciones diferentes de fotoperíodo

4.5 Recuento de microalgas

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Para el recuento de microalgas se utiliza la Cámara de Neubauer (Fig. 11) es un

herramienta utilizada en medicina y biología para realizar el recuento de células en un medio

líquido, que puede ser un cultivo celular, sangre, etc.

Fig. 11, Cámara de Neubauer

Esta cámara de contaje está adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste

de fases. Se trata de un portaobjetos que tiene dos zonas ligeramente deprimidas y que en el

fondo de las cuales se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula de dimensiones

conocidas. Se cubre la cámara con un cubrecámaras que se adhiere por simple tensión

superficial.

La fórmula de valoración del número de células (válida universalmente) es la

siguiente: Partículas por μl=(partículas contadas)/(superficie contada (mm²)∙profundidad de la

cámara(mm)∙ dilución)

4.5.1 Protocolo para conteo de microalgas

1. Mantener el lugar de trabajo limpio y ordenado, previamente desinfectado con alcohol

lugar de trabajo.

2. Sacar una muestra con la pipeta y depositar en la cámara Neubauer, colocando sobre

esta un cubre objeto (Fig. 12)

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3. Se lleva al microscopio con un aumento de 10x, ubicando primero la cámara en imagen

general, luego se aumenta a 40x comenzando la ubicación del primer cuadrante de

conteo que según figura 2 están demarcados por la letra L

Fig.12, Cuadricula de la cámara neubauer

4. Una vez ubicados los cuadrantes de conteo, se procede a contar todas las microalgas

visibles, obteniendo cinco lecturas con las cuales se calculara un promedio (Q).

5. Una vez realizados estos pasos (Fig. 13), se utilizara la siguiente formula para calcular

la densidad celular (Células/ml)

Donde:

D: densidad celular (Cel/ml)

Q: promedio de células

¼: numero de divisiones del cuadrado central

106: factor de disolución

23

Fig. 13, Pasos para el conteo de microalgas

24

4.6 Análisis Estadístico de los datos

4.6.1 Diseño experimental

Explicar si hay diferencia significativa en crecimiento celular de las microalgas

Nannochlorys s sp. y Isochrysis Galbana, manteniendo fotoperíodo (12 horas) y 24 horas

continuas respectivamente, considerando los factores A y B que son los siguientes:

Factor A: Tipo de Microalga

Este factor cuenta entonces con dos niveles:

a1, Microalga Nannochlorys sp.

a2, Microalga Isochrysis.

Factor B: Fase Lumínica

Este factor cuenta entonces con dos niveles:

b1, Fotoperíodo 12 horas

b2, Fotoperíodo 24 horas contínuas

Por lo tanto el modelo propuesto se esquematiza como:

Tabla IV. Modelo bifactorial de efectos fijos con varias muestras por grupo:

(Montgomery, 2002)

Nivel b1 b2a1 Y111 Y121

. .

. .Factor A Y11k Y12k

a2 Y211 Y221. .. .

Y21k Y22k

FactorB

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Y ijk = corresponde a la respuesta Tabla V, densidad (número de células/ml.)

Tabla V : Desglose de la respuesta

i = es el efecto del i-ésimo nivel del factor A i = (1,2)

j = es el efecto del j-ésimo nivel del factor B j = (1,2,3)

k = numero del dato dentro del grupo k = (1....12)

4.6.2 Supuestos y límites del diseño de experimento

Las inferencias estadísticas sobre los parámetros del modelo, son válidas bajo ciertos

supuestos, que son los siguientes:

4.6.2.1 Normalidad:

En general la distribución de frecuencia de los errores debería tener la siguiente

forma: simétrica y acampanada campana de Gauss (Neuling, 1988), haciendo un histograma de

residuales, si se satisface el supuesto N(0,2) para los errores, una grafica de residuales

deberá aparecer como una muestra de distribución normal con centro en cero (Montgomery,

2002).

Por lo tanto se hará la comprobación de normalidad gráficamente para lo cual se

analiza la frecuencia acumulada (%) vs residuales y se ve si se ajustan a una regresión lineal,

más un histograma de frecuencia relativa (n°) v/s densidad (número de células/ml.) para ver si

los datos se ajustan a la forma simétrica (Campana de Gauss). Esto se comprobará mediante la

Prueba de Lilliefors con un umbral de significación =0,02 si es que se puede rechazar o no la

hipótesis nula según la cual la muestra sigue una ley normal.

26

4.6.2.2 Aleatoriedad de las muestras:

Se aplica para comprobar si la multiplicación celular por tipo de microalga se

comporta en forma aleatoria en cada una de las fases lumínicas analizadas, para esto se aplicará

la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis.

Cabe señalar que la distribución F de la teoría normal es una buena aproximación de

la distribución de aleatorización exacta (Montgomery, 2002), esto quiere decir que valores

grandes de F indica que los datos no son consistentes con la hipótesis Ho: µ1 = µ2 o sea, las

medias muestreales generan diferencia de multiplicidad celular entre microalgas.

4.6.3 Planificación diseño de experimento

Teniendo el dato de los recuentos de microalgas a través de la Cámara de Neubauer, se

calcula el promedio de células Q, a través de este se calcula la densidad celular por tubo de

ensayo “d”, por tipo de Microalga y fase lumínica analizada.

Posteriormente los datos recopilados son ordenados, seleccionados y tabulados según

los dos tipos de Microalga (Iso-Nano) y fase lumínica (12-24 horas contínuas). Esta

información es procesada por el programa estadístico XLSTAT-PRO 2010, el cual desarrolla

los test estadísticos.

En la parte de análisis de datos de Microsoft Excel se procede a utilizar la función de

análisis de varianza con varias muestras por grupo, el cual da el resultado de la tabla ANDEVA

II. También se procede a analizar la diferencia de multiplicación celular entre los dos tipos de

microalgas gráfico de células/ml vs fotoperiodo (12-24 horas contínuas), Todo esto para saber

cuál es la tendencia % de multiplicidad celular en las fases lumínicas analizadas, saber si es

necesario tener en cultivo 12 o 24 horas contínuas ambos tipos de microalgas.

27

4.6.4 Numero de réplicas para el diseño propuesto

Este número está definido por el diseño experimental. En la práctica tratándose de

experimentos multifactoriales, lo que realmente interesa es el número de grados de libertad

destinados a estimar el error experimental, mostrado en la siguiente tabla de análisis de

varianza.

Tabla VI: Gratos de libertad

Fuente

Grados de

libertad

Suma de

cuadrados

Cuadrados

medios Test-F Valor-p

Modelo          

Error (r-1)(ab-1)        

Total rab-1        

A partir de este modelo es posible separar los grados de libertad del modelo de acuerdo a la

siguiente tabla VII

Tabla VII: grados de libertad

Fuente

Grados de

libertad

Suma de

cuadrados

Cuadrados

medios F Pr>F

A a-1        

B b-1        

A*B (a-1)(b-1)        

La tabla anterior permitirá establecer la significancia de las interacciones de primer y

segundo orden, como también de los efectos principales, utilizándose como valor crítico un

nivel no superior a 0,02. Los grados de libertad del error se obtienen como función del número

de niveles de los factores del modelo.

Ya que el modelo posee dos factores (2x2) niveles cada uno con 2 réplicas cantidad de

grupos anidados entre tratamientos, el total de grados de libertad para estimar el error es (2-1)

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(2x2-1) = 5. Esto equivale a una muestra de tamaño n=5 calculada en un enfoque regular, los

que en términos generales son suficientes para este efecto.

La cantidad final de muestras por modelo bifactorial serian n=16, (4 grupos anidados

por 4 unidades experimentales (tubos de ensayo) por matriz, Para poder tener el mínimo

muestreal se contará con una réplica matricial de 2, con esto en total se tendría n=32 ≥30, que

es el mínimo muestreal para poder inferir estadísticamente el diseño experimental propuesto.

4.6.5 Numero de datos a considerar en el diseño experimental

Cada tubo de ensayo corresponde a una unidad experimental en la que se han colocado

ambos tipos de microalgas La cantidad de tubos de ensayo son calculadas mediante el producto

del numero de niveles de los factores que da la cantidad de muestras mínimas por grupo (a*b =

2*2 = 4), por lo tanto se tendrán 4 tubos el tipo a1 (Microalga Nannochlorys sp.) y 4 del tipo

a2 (Microalga Isochrysis Galbana.), entre las respectivas fases lumínicas b1 (Fotoperíodo 12

horas) y b2 (24 horas continuas).

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4.7 Métodos estadísticos empleados

Para el análisis del diseño de experimento propuesto se analiza que cada muestra

cumpla la condición de normalidad, aleatoriedad y homogeneidad de varianzas para ello se

tendrá los siguientes métodos de cálculo a emplear.

4.7.1 Análisis de normalidad (Análisis de Residuales & Prueba de Lilliefors)

Gráficamente se analiza la frecuencia acumulada (%) v/s residuales si se ajustan a una

regresión lineal, mas un histograma de frecuencia relativa (n°) v/s densidad (número de

células/ml.) para ver la forma simétrica (Campana de Gauss), si se satisface el supuesto

N(0,2), esto quiere decir que la muestra se ajusta a una distribución normal con centro en

cero, con una respectiva varianza.

Para la comprobación formal de la normalidad se hará la Prueba de Lilliefors, este test

detecta si las muestras, sigue o no una distribución normal. El supuesto básico es que la

muestra debe ser aleatoria.

Las hipótesis para este test son las siguientes:

H0: Datos células/ml se ajustan a una distribución normal.

H1: Datos células/ml no se ajustan a una distribución normal.

4.7.2 Aleatoriedad (Prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis)

30

Esta consiste en probar la hipótesis nula de que los tratamientos son idénticos contra la

hipótesis alternativa de que algunos de los tratamientos generan observaciones que son

mayores que otras. Este procedimiento esta diseñado para ser sensible al probar las diferencias

en las medias muestreales en comparación de los tipos de microalgas a1 (Microalga

Nannochlorys sp.) y del tipo a2 (Microalga Isochrysis.), entre las respectivas fases lumínicas b1

(Fotoperíodo 12 horas) y b2 (24 horas contínuas).

Las hipótesis para este test son:

H0: Los tipos de microalgas a1 (Microalga Nannochlorys sp.) y del tipo a2 (Microalga

Isochrysis.), entre las respectivas fases lumínicas b1 (Fotoperíodo 12 horas) y b2 (Fotoperíodo

24 horas contínuas), generan multiplicación celular iguales.

H1: Los tipos de microalgas a1 (Microalga Nannochlorys sp.) y del tipo a2 (Microalga

Isochrysis.), entre las respectivas fases lumínicas b1 (Fotoperíodo 12 horas) y b2 (Fotoperíodo

24 horas contínuas), generan multiplicación celular distintas.

H0: Los tipos de fases lumínicas b1 (Fotoperíodo 12 horas) y b2 (Fotoperíodo 24 horas

contínuas) entre los distintos tipos de microalgas, a1 (Microalga Nannochlorys sp.) y del tipo

a2 (Microalga Isochrysis.), generan multiplicación celular iguales.

H1: Los tipos de fases lumínicas b1 (Fotoperíodo 12 horas) y b2 (Fotoperíodo 24 horas

contínuas) entre los distintos tipos de microalgas, a1 (Microalga Nannochlorys sp.) y del tipo

a2 (Microalga Isochrysis.), generan multiplicación celular distintas.

El cálculo de este test lo hará el software estadístico XLSTAT-PRO-2011

31

4.7.3 Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo & (Prueba de

Bartlett)

El análisis multifactorial de la varianza se presenta cuando dos o más factores

(variables independientes) afectan a la variable de respuesta (variable dependiente). Para cada

factor tendremos varios niveles, que dividen la población total en grupos de tratamiento.

Un concepto importante a tener en cuenta en el modelo multifactorial de la varianza

es el análisis de la interacción entre las variables (factores). Se dice que hay interacción cuando

una variable independiente A afecta a la variable dependiente de manera distinta según los

diferentes niveles de otra variable independiente B. En síntesis se trata, por tanto, de analizar si

las variables independientes (factores) producen efectos distintos en función de los niveles de

las otras variables independientes.

Por lo tanto el diseño experimental propuesto sigue el siguiente modelo factorial de

efectos fijos:

donde:

Y ijk = corresponde a la respuesta, densidad (número de células/ml.)

m = es la media general del modelo

ai = es el efecto del i-ésimo nivel del factor A, el que tiene i=1,...,a niveles

bj = es el efecto del j-ésimo nivel del factor B, el que tiene j=1,...,b niveles

(abij ) = es el efecto agregado (interacción) de los factores A y B a sus niveles i y j,

respectivamente.

e ijk = error experimental

32

Y ijk = m + a i + b j + (abij) + e ijk

Los términos ai y bj representan los efectos de los factores A (tipos de microalgas) y B

(faces lunínicas) que son los efectos principales, y son constantes sujetas a las restricciones:

Los términos ABij representa el efecto de interacción entre los factores A y B, y son

constantes sujetas a las restricciones:

El error experimental (eijk), corresponde a una variable aleatoria normal de media cero

y varianza (2) constante para cada k, las variables (eijk) han de ser independientes.

Por lo tanto los datos quedan representados como lo muestra la siguiente Tabla VIII.

Tabla VIII. Análisis de varianza diseño factorial, grupo de datos.

Nivel b1 b2a1 Y111 Y121

. .

. .Factor A Y11k Y12k

a2 Y211 Y221. .. .

Y21k Y22k

FactorB

5 RESULTADOS

33

i = 1.....tj = 1.....rk= 1....n

5.1 Conteo de microalgas (Anexo 1 y 2)

5.2 Resultados del Análisis de normalidad (Análisis de Residuales & Prueba de

Lilliefors)

En el cálculo de la normalidad, mediante el uso de análisis de residuales para el cultivo

de las Microalgas Isochrysis y Nannochlorys sp. mediante las fases lumínicas de 12 y 24 horas

contínuas, se pudo constatar que los datos de densidad cel/ml por tubo de ensayo, como lo

muestra el modelo bifactorial (Anexo), si satisface el supuesto N(0,2), esto quiere decir que

la muestra se ajusta a una distribución normal con centro en cero, con una respectiva varianza.

En el análisis gráfico de frecuencia acumulada (%) v/s residuales se puede constatar que

los datos para la Microalga Iso (Fig. 14). se ajustan a una regresión lineal muestra (n = 8) que

en total ocuparon 5 muestras de densidad de células, por prueba analizada.

En la matriz del modelo bifactorial, se puede apreciar que los residuales se ajustan a una

regresión lineal con un R2 = 0,85, con una pendiente b0 = 5,11.

En el análisis gráfico de frecuencia acumulada (%) v/s residuales para la Microalga

Nanno (Fig. 15), se puede constatar que también se ajustan a una regresión lineal muestra (n =

8) que en total ocuparon 5 muestras de densidad de células, por prueba analizada.

En la matriz del modelo bifactorial, se puede apreciar que los residuales se ajustan a una

regresión lineal con un R2 = 0,91 con una pendiente b0 = 6,49.

Esto quiere indicar que los datos de ambas microalgas son consistentes al tipo de

distribución normal, y que la variabilidad de los datos respecto a la media es normal, para la

totalidad de los datos en la muestra analizada.

34

Fig. 14. Análisis frecuencia acumulada (%) v/s residuales cultivo Microalgas Isochrysis

Figura 15. Análisis frecuencia acumulada (%) v/s residuales cultivo

Microalga Nannochlorys sp.

35

A su vez el histograma de frecuencia relativa (n°) v/s densidad (número de

células/ml.) (Fig. 16 y 17), muestran la forma acampanada de la distribución normal de las

respectivas frecuencias relativas, por ende los datos muestran visualmente que se ajustan a

una distribución Normal. Cabe destacar que el ajuste para los datos de distribución de

frecuencia relativa para la Microalga Nanno, (Fig. 15), muestra una distribución normal-

bimodal, para los intervalos de 410-420 y 440-450 (cel./ml), respectivamente en los

extremos de la distribución, eso no quita que no se pueda inferir sobre la respuesta global de

la matriz del modelo.

Figura 16. Histograma de frecuencia relativa (%) v/s densidad (número de células/ml.)

Microalga Iso.

36

Figura 17. Histograma de frecuencia relativa (%) v/s densidad (número de células/ml.)

Microalga Nanno.

En lo que respecta a la prueba estadística de normalidad (Prueba de Lilliefors) se tiene

que las hipótesis para este test son las siguientes:

H0: Datos células/ml se ajustan a una distribución normal.

H1: Datos células/ml no se ajustan a una distribución normal.

En el cual se rechaza H0: cuando P-value es inferior al umbral =0,02. A través de la

resolución del programa estadístico XLSTAT-2011 (Tabla IX) para los datos de la

Microalga Iso, se puede apreciar que p-value es del orden del 0,269 que es > al umbal

=0,02, por lo tanto cae en la zona de aceptación de H0, esto quiere decir que

estadísticamente la muestra analizada se considera que sigue una distribución normal.

37

Tabla IX . Resolución Prueba de Lilliefors, programa XLSTAT-2011

Microalga Iso

Para los datos de la Microalga Nanno (Tabla X), se puede apreciar que p-value es del

orden del 0,410 que es > al umbal =0,02, por lo tanto cae en la zona de aceptación de H0,

esto quiere decir que estadísticamente la muestra analizada se considera que sigue una

distribución normal.

Tabla X. Resolución Prueba de Lilliefors, programa XLSTAT-2011

Microalga Nanno

38

5.3 Resultados Aleatoriedad (Prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis)

En la verificación de que la multiplicidad celular por el tipo de microalga se comporta

en forma aleatoria en cada una de la fases lumínicas, se obtienen los resultados para cada una

de las matrices en forma independiente, o sea tanto para el factor A Tipo de Microalga con a1

(Microalga Nannochlorys sp..), como para el factor a2 (Microalga Isochrysis.) y entre las

distintas fases lumínicas factor B (12 y 24 horas contínuas).

En la primera prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, se tiene las siguientes

hipótesis:

H0: Los tipos de microalgas a1 (Microalga Nannochlorys sp..) y del tipo a2 (Microalga

Isochrysis.), entre las respectivas fases lumínicas b1 (Fotoperíodo 12 horas) y b2 (Fotoperíodo

24 horas contínuas), generan multiplicación celular iguales.

H1: Los tipos de microalgas a1 (Microalga Nannochlorys sp..) y del tipo a2 (Microalga

Isochrysis.), entre las respectivas fases lumínicas b1 (Fotoperíodo 12 horas) y b2 (Fotoperíodo

24 horas contínuas), generan multiplicación celular distintas.

El resultado para la primera matriz (Tabla XI), muestra el Factor A tipos de microalgas

con sus respectivos niveles tipo a1,a2 (Iso. Y Nanno) analizado entre las distintas fases

lumínicas b1, b2 (12 y 24 horas contínuas), en el cual se calcula mediante el programa

XLSTAT-2011, si existe diferencia significativa en la multiplicidad celular entre los dos tipos

de microalgas analizando los distintos grupos o muestras independientes K, generada por un

total (n = 16 datos definidos por el diseño de experimento).

Se acepta H0 y se rechaza H1, ya que el p-value bilateral 0,958 > alpha 0,05 dicho de

otra manera se rechaza H0 cuando el K (valor observado) es > a K (crítico) que en este caso no

se cumple ya que 0,003 < 3,841. Esto quiere decir que no existe diferencia significativa en la

multiplicidad celular entre las dos especies de microalgas analizadas (Nannochlorys sp.. y

Isochrysis).

39

Tabla XI. Resolución Prueba de Kruskal-Wallis, Factor A (Tipos de Microalga)

programa XLSTAT-2011

40

En la segunda prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, se tiene las siguientes

hipótesis:

H0: Los tipos de fases lumínicas b1 (Fotoperíodo 12 horas) y b2 (Fotoperíodo 24 horas

contínuas) entre los distintos tipos de microalgas, a1 (Microalga Nannochlorys sp.) y del tipo

a2 (Microalga Isochrysis.), generan multiplicación celular iguales.

H1: Los tipos de fases lumínicas b1 (Fotoperíodo 12 horas) y b2 (Fotoperíodo 24 horas

contínuas) entre los distintos tipos de microalgas, a1 (Microalga Nannochlorys sp..) y del tipo

a2 (Microalga Isochrysis.), generan multiplicación celular distintas.

El resultado para la segunda matriz (Tabla XII), muestra el Factor B Fases lumínicas

con sus respectivos niveles b1, b2 (12 y 24 horas contínuas) analizado entre los distintos tipos

de microalgas a1, a2 (Iso. Y Nanno), en el cual se calcula mediante el programa XLSTAT-

2011, si existe diferencia significativa en la multiplicidad celular entre los dos tipos de fases

lumínicas analizando los distintos grupos o muestras independientes K, generada por un total

(n = 16 datos definidos por el diseño de experimento).

Se rechaza H0 y se acepta H1, ya que el p-value bilateral 0,001 < alpha 0,05 dicho de

otra manera se acepta H0 cuando el K (valor observado) es > a K (crítico) que en este caso se

cumple ya que 10,615 > 3,841. Esto quiere decir que existe diferencia significativa en la

multiplicidad celular entre los dos distintos tipos de Fases Lumínicas (12 y 24 horas

contínuas).

Tabla XII. Resolución Prueba de Kruskal-Wallis, Factor B (Tipos de Fases Lumínicas)

programa XLSTAT-2011

Cabe destacar que el proceso aleatorio no sólo protege contra el sesgo sistemático,

sino que tiende a neutralizar los efectos de todos aquellos factores externos que no se

encuentran bajo el control del investigador (J.Araya, 2007), esto implica que las

condiciones bajo las cuales se desarrollo el experimento es observada la respuesta en este

caso la diferencia de multiplicidad entre las microalgas entre las distintas fases lumínicas,

son las mismas durante todo el experimento.

5.4 Resultados Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo &

(Prueba de Bartlett)

En la prueba de Bartlett (Tabla XIII) se rechaza la hipótesis nula (H0) cuando 20

(obs.) > 2α,b-1 (cri.) prueba unilateral a la derecha, con un nivel = 0,05 que en este caso da

que 0,495 < 3,841, por lo tanto se acepta la hipótesis nula Ho de igualdad de varianza para los

distintos grupos de datos analizados (K), esto quiere decir que el tipo de microalga Nanno a1,

no genera una diferencia significativa en la multiplicidad celular entre los distintos tipos de

42

fases lumínicas (12 y 24 horas contínuas), ya que a 12 horas con fotoperiodo de las 21:00 PM

a las 09:00 AM, durante una semana se tiene el 95% del crecimiento, en comparación de tener

en cultivo 24 horas contínuas en la misma semana que solo crecería un 5% más.

Tabla XIII . Resolución Prueba de Bartlett, Microalga Nanno. (a1)

programa XLSTAT-2011

En la prueba de Bartlett (Tabla XIV) se rechaza la hipótesis nula (H0) cuando 20

(obs.) > 2α,b-1 (cri.) prueba unilateral a la derecha, con un nivel = 0,05 que en este caso da

que 1,019 < 3,841, por lo tanto se acepta la hipótesis nula Ho de igualdad de varianza para

los distintos grupos de datos analizados (K), esto quiere decir que el tipo de microalga Iso

a2, no genera una diferencia significativa en la multiplicidad celular entre los distintos

tipos de fases lumínicas (12 y 24 horas contínuas), ya que a 12 horas con fotoperiodo de las

21:00 PM a las 09:00 AM, durante una semana se tiene el 96% del crecimiento, en

comparación de tener en cultivo 24 horas contínuas en la misma semana que solo crecería

un 4% más.

Tabla XIV . Resolución Prueba de Bartlett, Microalga Iso. (a2)

programa XLSTAT-2011

43

6 DISCUSIÓN

De acuerdo a la experiencia realizada a dos tipos de microalgas (Nannochlorys sp. y

Isochrysis galbana) con distintas fases luminosas no existe diferencia significativa en la

multiplicidad celular, no lo mismo pasa entre los dos distintos tipos de Fases Lumínicas (12 y

24 horas continuas) que si existe una diferencia.

44

La microalga Iso no genera una diferencia significativa en la multiplicidad celular entre

los distintos tipos de fases lumínicas (12 y 24 horas continuas), ya que a 12 horas con

fotoperiodo de las 21:00 PM a las 09:00 AM, durante una semana se tiene el 96% del

crecimiento, en comparación de tener en cultivo 24 horas continuas en la misma semana que

solo crecería un 4% más.

La microalga Nanno , no genera una diferencia significativa en la multiplicidad celular

entre los distintos tipos de fases lumínicas (12 y 24 horas continuas), ya que a 12 horas con

fotoperíodo de las 21:00 PM a las 09:00 AM, durante una semana se tiene el 95% del

crecimiento, en comparación de tener en cultivo 24 horas continuas en la misma semana que

solo crecería un 5% más.

7 CONCLUSIÓN

Se puede concluir que las microalgas pueden crecer con fotoperíodo sin incurrir en

gastos mayores energéticos para obtener máximos óptimos en lo que tiene que ver con la luz,

porque puede pasar que por otras cosas las microalgas puedan no crecer, por se le tiene que

brindas las condiciones adecuadas para su crecimiento como sus nutrientes apropiados, evitar

la contaminación de los cultivos y una agitación diaria predice un buen stock de microalgas.

45

8 BIBLIOGRAFÍA

Araya, J. 2007. Determinación del Tipo de Trampa y Tiempo de Reposo Diurno para la

Captura de Anguila Babosa (Eptatretus polytrema), en la Región de Valparaíso. Tesis de

Ingeniería Pesquera, Escuela de Ciencias del Mar (ECM), Pontificia Universidad Católica de

Valparaíso (PUCV), 75 pp.

46

Derner, R. 1996. Cultivo de microalgas. Curso internacional de postlarvas de camarón

marino. Laboratorio de camarones marinos U.F.S.C, Florianópolis, Brasil.

Montgomery, D. 2002. Diseño y análisis de experimentos. Iberoamericana S.A. Washington,

589 pp.

Pérez, G. 2002. Estadística a través de Excel. Universidad Complutense de Madrid (UCM).

Univ. Complutense, Madrid, 314 pp.

Abalde, Cid, Fidalgo, Torres, Herr. 1996. Microalgas cultivo y aplicaciones

Páginas de Internet:

1 Cultivos de fitoplancton:

Nannochlorys sp.. y Chlorella sp.

Técnicas y equipos acuariófilos

http://www.aquanovel.com/cultivos_fitoplancton.htm

2 medios de cultivos:

https://www.ucursos.cl/faciqyf/2010/1/FCQF628/1/material_alumnos/previsualizar?

id_material=5258

3 Taxonomias de microalgas; http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=6987 ;

4 http://www.bashanfoundation.org/drora/droraoptimalgrowth.pdf ; Optimal Growth

Conditions for lsochrysis galbana Opt

5 http://blogs.mdp.utn.edu.ar/mpersico/files/2010/04/Manual-medios-cultivo.pdfimal

Growth Conditions for lsochrysis galbana

9 ANEXOS

TABLA DE DATOS 1

47

TABLA DE DATOS 2

48