IntroducciónRelación del crecimiento de la población mundial incremento de bioespecímenes

Rápido incremento del acceso a tecnologías de “próxima generación”

Tejido congelado

Ventajas y desventajas del uso de tejidos congelados a bajas temperaturas y FFPE

Tejido congelado FFPE

Histología Inferior Superior

DNA y RNA Mayor peso molecular y sin enlaces entrecruzados

Menor peso molecular y con enlaces entrecruzados

Proteínas Proteínas bien conservadas, incluyendo actividad enzimática

Proteínas con enlaces entrecruzados, actividad enzimática inexistente

Organismos infecciosos Podrían permanecer viables -

Costos Más costosos Menos costoso

Manipulación con nitrógeno líquido

Graves riesgos Menos riesgo

Materiales y métodosBúsqueda bibliográfica Biobancos

Biorepositorios

Bioespecímenes

Congelación (congelado)

Tejido

Sangre

Obtención

Contenedor

Control de calidad

Aseguramiento de la calidad

¿Cuán rápido debemos congelar los bioespecímenes?

¿Es el freezer de -80° C realmente adecuado para estabilizar un bioespecímen o es el almacenamiento a -150° C superior?

¿Cuánto afectan a las muestras biológicas los ciclos de congelamiento/descongelamiento?

¿Cuáles son las bases de los procedimientos de control de calidad comúnmente en uso?

Consideraciones en la obtención de tejido y muestras de sangre

Generación de manuales de buenas prácticas por instituciones internacionales: Society for Biological and Environmental Repositories (ISBER), National Cancer Institute (NCI) y otros

POEs de colección y almacenamiento de tejido humano fijado y no fijado están en continúo desarrollo

Obtención de tejido

Intervenciones quirúrgicas

Autopsias

Procesos pre-mortem pueden tener impactos negativos en la integridad de la muestra

Duración de la cirugía

Isquemia tibia: es medida como la cantidad de tiempo que el tejido está a temperatura ambiente después de ser resecado desde el cuerpo humano hasta ser estabilizado

La isquemia caliente no es anotada durante la cirugía debido al ambiente ocupado que se genera en la habitación debido a la preocupación del cuidado del paciente

Biopsia y técnico

Evaluación del tejido a temperatura ambiente

Mantener tejido en hielo mientras tanto

Isquemia fría

Obtención de tejidoRNA

Existen estudios que han demostrado la no degradación del RNA en algunos tejidos por varias horas y otros que han demostrado la degradación desde la resección hasta el congelamiento

Proteínas

Fosforilación de proteínas y proteólisis post mortem en muestras de corazón congelación rápida

Variabilidad en la preservación de acuerdo al tipo de tejido

Obtención de sangre• Es uno de los bioespecímenes más comúnes usado en clínica e

investigación traslacional

Sangre completa

Plasma

Suero

Leucocitos

Eritrocitos

Suero: se necesita un tubo que contenga un acelerador de la coagulación, como sílica o trombina

Sangre anticoagulada para obtención de plasma, buffy coat y RBCs

Colección en tubos que contengan EDTA

• La sangre se puede almacenar completa o en sus componentes

Obtención de sangre

Suero y plasma estudios e analitos, como proteínas, lípidos y pequeñas moléculas y como fuente de obtención de ácidos nucleicos libres de células

Concentrados celulares citometría de flujo, cultivos, o como fuente de ácidos nucleicos

Células vivas son estables por 48 horas, pero deben ser cultivadas o criopreservadas a -150° C para mantener su viabilidad

• Transcurrido tiempo entre la colección y el procesamiento, con las muestras mantenidas a temperatura ambiente o incluso a 4° C (por más de 24 horas) puede resultar en alteración de algunas proteínas

Obtención de sangre

Se requiere una separación inmediata de plasma y células… Un lapso de tiempo de 24 horas es aceptable, con un almacenamiento transitorio a 4° C

Temperaturas óptimas de almacenamiento para bioespecímenes congelados

Almacenamiento de tejido

Almacenamiento a -20° C fue comúnmente usado en el pasado

Temperaturas ultra bajas han llegado a covertirse en el estándar para el almacenamiento a largo plazo (-80° C a -150° C)

Se sugiere el almacenamiento bajo los -137° C, ya que esta temperatura es la de transición vítrea del agua, la cual deja inerte los procesos bioquímicos que podrían dañar el contenido intracelular

Nitrógeno líquido: fase de vapor y fase líquida

Almacenamiento de tejido• Almacenamiento de hígado humano a -25° C vs. -80° C y -150° C (por

7 años)• Reducción de integridad de RNA en bioespecímenes almacenados a -

70° C y -80° C por 5 años o más• DNA permanece sin cambios por almacenamiento por largo tiempo a

-80° C• Proteoma permanece sin cambios a -70° C o más bajo• Bioespecímenes deben ser almacenados al menos a -80° C

Almacenamiento de sangreLa temperatura y el periodo de tiempo de almacenaje depende de el analito, marcador, o molécula de interés.

Se ha demostrado que el DNA puede ser extraído con un rendimiento aceptable y de buena calidad desde muestra de sangre almacenadas a TA, 4° C y -20° C por máximo de 1 mes posteriormente a eso, la tasa de destrucción de eritrocitos y leucocitos es más alta

DNA a es estable por semanas a 4° C, por meses a -20° C y por años a -80° C, el RNA se degrada más rápido a temperaturas más altas que -80° C.

MicroRNA es mantenido por años en muestras de plasma almacenado a -80° C

Efecto de la congelación/descongelación en la calidad del bioespecímenEfectos de la congelación/descongelación en tejido congelado

RNA

Estudios en tumor ovárico y cerebral humano no mostraron alteraciones en la calidad del RNA, perfiles de expresión génica o expresión proteica (desde 3 a 6 ciclos)En otros estudios bastó con 2 ciclos para reducir la calidad del RNALas diferencias pueden estar en el tipo de tejido y las condiciones de descongelamiento

Efectos de congelación/descongelación de muestras de sangre

En un estudio, solo un ciclo de descongelación bastó para disminuir en un 25% la calidad del DNA, pero no disminuyó la concentración de mRNA en suero y plasma

Kopreski y cols. observaron que al tercer ciclo de descongelamiento de suero, se promovía rápidamente la degradación del mRNA con amplificación indetectable, algo similar ocurrió con el proteoma

Control de calidad y herramientas de control de calidadControl de calidad histológica

En el pasado se realizaba el cálculo del porcentaje que ocupaba el tumor en el área total del tejido Engañoso

Una alta densidad de células tumorales en una pequeña área tumoral puede producir un alto y adecuado porcentaje de DNA

Gran área de tejido de células tumorales dispersas, producirán un bajo porcentaje de DNA tumoral

Razón de núcleos tumorales frente a

totalidad de núcleos

70%

Control de calidad histológicaCuando las muestras no reúnen los criterios, las áreas no neoplásicas pueden ser removidas con la finalidad de enriquecer el tejido tumoral

80% de núcleos tumorales para glioblastoma multiforme y 60-70% para otros cánceres

Exclusión de los casos con más de 20-50% de necrosis

Evaluación de la calidad del DNAEvaluación del rendimiento y pureza de DNA extraído de células y tejidos

Determinación de la densidad óptica, por lectura en espectrofotómetro, 260 y 280 nm

Razón 260/280 óptima = 1.8

Evaluación de la integridad del DNA por electroforesis en un gel de agarosa del 1-1.5% p/v

Evaluación de utilidad del DNA por reacción en cadena de la polimerasa

Evaluación de la calidad del RNA• RNA es importante para la evaluación de la expresión génica pero las

Rnasas pueden degradar rápidamente el RNA

Evaluaciones a distintas longitudes de onda

Longitud de onda Información 240 nm Absorción del background y posibles

contaminantes como EDTA

260 nm Contenido de ácido nucleico

280 nm Contenido de proteínas

320 nm Absorción de background y compuestos orgánicos como fenol, azúcares y alcohol

Razones

260/280 Un valor de 1.8 o más se considera aceptable con respecto a pureza

260/240 Indicadores de otros contaminantes

260/320

Evaluación de la calidad del RNAEvaluación de integridad

Lo tradicional es la evaluación de la razón del RNA ribosomal 28S y 18S

Banda de 28S es aproximadamente dos veces más intensa que la de 18S

Razón de 28S/18S = 2 o más

Número de integridad del RNA (RIN): cálculo a través de un software de las trazas electroforéticas de un electroferograma. Scores van desde 1 a 10.

Valores de RIN Aplicaciones

Superior a 8.05 Análisis por microarray

Preferiblemente 8.0 qRT-PCR

Evaluación de la calidad proteica• El estudio de las proteínas nos entrega información útil para el estudio de

vías patológicas o biomarcadores relacionadas a una enfermedad particular

Etapa pre-analítica

Evaluación histológica al momento de la obtención de los bioespecímenes

Evaluación con ensayos colorimétricos: BCA, Lowry o Bradford

Evaluaciones dependiendo del número de clientes

Tinciones inmunohistoquímicas para evaluación de antígenos

Evaluación de la calidad proteica• Integridad del proteona geles SDS-PAGE teñidos con Coomassie

Blue• Realización de Western blot para evaluación de proteínas, incluyendo

las fosforiladas.

Hincapié en el rol del patólogo o citopatólogo en la evaluación de bioespecímenes para el Biobanco

Costos de infraestructura incluyendo backup de emergencias y una adecuada refrigeración de la habitación.

Un freezer de -80° C puede almacenar más bioespecíemenes que su contraparte de -150° C