1

Semana Sartorius 2017 República Dominicana

Microbiología

Enrique Alvarez

Page 2

Clasificación de los Microorganismos

3 Membrana, beneficios.

Identificación de los Microorganismos

Legislaciones Regulatorias

1

2

Preguntas

5 Referentes del Competidor

Contenido

1

4

4

Microorganisms

Viruses

Fungi

Bacteria

Molds Yeasts

Microorganismos

Organismos microscópicos unicelulares

Algas más de 100 micras

Protozoarios de 50 a 100 micras

Hongos de 1 a 40 micras

Actinomycetos de 0.8 a 10 micras

Bacterias de 0.45 a 1.0 micras

Rickettsias de 0.45 a 0.8 micras

Virus menos de una micra.

una micra = 1/1000 mm

Bacterias Verdaderas

Es el más amplio grupo de microrganismos del tipo vegetal, comprende las bacterias más numerosas y mejor conocidas.

Se clasifican por su forma:

Cocos

Bacilos

Espirilos

Tinción de Gram

Un frotis microbiano se somete a diferentes colorantes:

Cristal violeta

Solución de Yodo

Alcohol-Acido

Safranina

Bacterias Gram (+) Azules

Bacterias Gram (-) Rojas

Tinción de Gram

Soluciones aplicadas Grampositivas Gramnegativas

Cristal violeta Las bacterias se tiñen

en violeta

Las bacterias se tiñen

en violeta

Solución yodo

yodurada (lugol)

Complejo CV-I dentro

de la bacteria

Complejo CV-I dentro

de la bacteria

Alcohol Deshidratación de la

pared celular de la

bacteria

Extracción de lípidos,

aumenta la porosidad

Safranina Las bacterias

permanecen violetas

Las bacterias se tiñen

de rojo

Gérmenes tipo Pleuroneumonía

Mycoplasma, parásito filtrable, multiforme, sin paredes rígidas.

Ligeramente mayor en tamaño que los virus.

Son las más pequeñas células conocidas con metabolismo.

Autónomas.

Virus

Único parásito intracelular.

Ultramicroscópicos.

Constan de un centro de ácido nucleico DNA ó RNA dentro de una cubierta proteica.

Parásitos estrictos.

Microorganisms Size Reproduction

VIRUSES Ø 0.01 - 0.5 µm in host cellsFUNGI

• Molds Ø 3.0 - 5.0 µm Spore formation• Yeasts Ø 3.0 - 12.0 µm Budding

BACTERIA Ø 0.1 - 1.0 µm Fissionlength 0.4 - 5.0 µm

YeastVirus

1 µm

Bacteria

Células de MicroorganismosPROCARIOTICOS

Núcleo que no tiene membrana nuclear

Células primitivas.

Bacterias

Algas Azul Verde.

EUCARIOTICOS

Núcleo definido con membrana nuclear

Células verdaderas

Protozoarios

Hongos

Grupos de Micoorganismos

Saprófitos: Vida libre, se alimentan de materia no viva, el resultado de su crecimiento es la putrefacción o descomposición de la materia orgánica.

Parásitos: Viven dentro de otros organismos (plantas o animales) su alimentación se deriva más o menos directamente de la materia viva.

Patógenos

No Patógenos

Desarrollo de los Microorganismos.

En función de :

Parámetros fisicoquímicos del medio.

pH

Actividad de agua

Potencial de oxido-reducción

Concentración de sales ( presión osmótica)

Propio potencial genético.

Oxígeno del aire

Temperatura

Humedad relativa.

Moisture

Aeration

Nutrients

Temperature

Inhibitors

pH

Condiciones de Crecimiento

pH Bacterias: Pueden desarrollarse entre pH4.5 y 9.0

óptimo entre 6.5 y 7.5

Bacterias lácticas pH inferior a 3.5

Levaduras:Pueden desarrollarse entre pH 2.0 y 9.0 óptimo entre 4 y 6

Mohos:Pueden desarrollase entre pH 2.0 y 11.0

Actividad de agua

El agua es utilizada para el crecimiento de los microorganismos de dos formas:

Como solvente de nutrientes, lo que permite su transporte y disponibilidad en el citoplasma.

Como agente químico que forma parte de las reacciones hidrolíticas necesarias para la síntesis microbiana y para las reacciones energéticas.

Potencial redox y Oxígeno

Los microorganismos se clasifican en función de sus exigencias de oxígeno y/o en la toxicidad del mismo.

Aerobios estrictos.

Aerobios facultativos.

Anaerobios estrictos.

Microaerófilos.

Temperatura

La mayor parte de los microorganismos proliferan a temperaturas medias superiores o iguales a 20 ° C, pero existen algunos que son capaces de crecer mientras las temperaturas estén comprendidas entre –18 y 90 ° C

Psicrótrofos y psicrófilos: desarrollan a 0 ° C

Mesófilos: entre 20 y 45 ° C y óptimo 37 ° C

Termófilos: entre 45 y 65 ° C y óptimo 55° C

100

80

60

40

20

0

thermophilic

mesophilic

psychrophilic

Vegetativeform

Bacterialspore

Temperature

Presión Osmótica

Osmosis es la difusión de productos a través de una membrana semipermeable que separa dos soluciones de diferente concentración.

Plasmólisis: Deshidratación de las células

Plasmóptisis ó turgescencia: La célula revienta por gran cantidad de agua dentro.

Extracts

Minerals

Nutrient medium

Peptones

Casein

Soy

MeatYeast

Malt

Water

Sugar

Selectivity of nutrient media

Endo Wort

pH 7,4 4,8

Peptones Meat peptone Casein peptone

Meat peptone

Soymeal peptone

Sugars Lactose Maltose

Dextrin

Extracts - Malt extract

Inhibitors Sulfite -

Fuchsin

Incubation 36°C, 24 h 25°C, 2-3 days

fineurg !

E.coli +

coliforms

Yeasts +

Molds

Microorganismos Indicadores

Reflejan la calidad microbiológica:

Deben estar presentes y deben ser detectables fácilmente.

Su multiplicación y número tienen relación directa negativa con la calidad de fármacos, Alimentos y bebidas.

Deben poderse diferenciar claramente de otros microorganismos.

Se deben poder contar en corto tiempo.

Su crecimiento debe ser independiente de otros componentes de la flora del alimento.

ColiformesEnterobacterias

Escherichia

Salmonella

Shigella

Proteus

Enterococos Streptococcus

OtrasPseudomonas

Lactobacillus

Clostridium

LevadurasCandida

Fuentes de Contaminación

Microbiana

AGUA

AIRE

PRODUCTOEQUIPO

MATERIAS PRIMAS

Trabajadores

y Empleados

Edificios e Instalaciones

Plagas

La Directiva Europea sobre Agua Potable 98/83 / EC

Parámetros microbiológicos para el agua embotellada

Escherichia coli 0 / 250 ml

Enterococci 0 / 250 ml

Pseudomonas aeruginosa 0 / 250 ml

Coliform bacteria 0 / 250 ml

Colony count at 22 °C 100 / ml

Colony count at 36 °C 20 / ml

30 September 2010 Page 2

Todas las pruebas microbiológicas deben realizarse según las normas ISO

Escherichia coli/ coliforms ISO 9308-1 (2014)Enterococci ISO 7899-2 (2000)Pseudomonas aeruginosa DIN EN ISO 16266 (2008)Clostridium perfringens TrinkwV 2001 and ISO 6461-2.2Total Count DIN EN ISO 6222 (1999)Membrane filters ISO 7704 (1985)General methods ISO 8199 (2008)

ISO = The International Organization for Standardization.DIN = Draft International Standards.

Muestreo Bolsa Whirl-Pak®

1

2

—Pre-esterilizada

—Deshechable

—Reduce el tiempo de preparación y la esterilización de recipientes de vidrio

—Disponible con un comprimido de tiosulfato de sodio para neutralizar el cloro

Calidad de la Membrana

Cumple los requerimientos de los Métodos Estándar para la Prueba de Agua y Aguas residuales

Recuperación de bacterias existentes en el agua Coliformes (totales y fecales)

Bacterias totales

Reproducibilidad de lote a lote

Debe retener las bacterias típicas 100% de retencíon de 104 Serratia marcesens

No debe liberar extraíbles bactericidas o bacteriostáticos Inorgánicos -- Na, Ca, Zn, Ag, Pb, Hg, Cu, Cr, P, NH3

Orgánicos -- carbono orgánico total

No debe alterar el medio utilizado para ayudar al crecimiento pH del extracto del filtro

acidez total

Debe estar certificada por el proveedor

MEMBRANA

Membrana de Filtración

Filtre la muestra a través de una membrana de 0.45 o 0.8um

Transfiera la membrana a una caja Petri (con caldo o agar)

Enjuague con 20-25ml de solución amortiguadora estéril

Equipo y consumibles de Microbiología

Dispensador de Membrana Nuevo modelo

Pall

Sartorius 2003 Sartorius 2017

Manifold vs Combisart

“Estándar”

Único embudo acero inoxidable

Electropulido “impide biofilm”

Resisiste esterilización calor seco y

húmedo

• “Convertible”Versatilidad de embudos: Polipropileno Acero inoxidable electropulido Biosart 100 Vidrio 30 ml Vidrio 250 ml

Uso de Microsart en Convisart

Sartorius

Nutrient Pad Sets

Optimiza el flujo de trabajo en el laboratorio

Provee resultados confiables

Esencial para el aseguramiento de calidad

Nutrient Pad Sets

Contenido • Nutrient Pad Sets (NPS) • Aplicaciones en Control Microbiológico de Bebidas: Suaves, Carbonatadas, Agua • Ventajas del producto • NPS vs Competidor

Nutrient Pad Sets

Descripción del producto • Placas de agar deshidratado para Cuenta Límite de Microorganismos detallada en USP Capítulo 61 y EP capítulo 2.6.12 • Empaque aluminizado con ambiente controlado evita deterioro de producto por luz y/ oxígeno Ventajas: Evita la refrigeración previa al uso del medio Fecha de caducidad de hasta 24 meses en condiciones de temperatura ambiente Vigencia superior a placas de agar cuyo tiempo está en el rango de 3 y hasta 9 meses como máximo Abate pérdidas de medios por estar próximos a caducar

Nutrient Pad Sets

Aplicaciones en la Industria de las bebidas

Filtración y Microbiología

Membranas Nitrocelulosa Cuadrícula para análisis

Nutrient Pad Sets

Filtración de:

• Materias primas

• Muestras en interfases de proceso

• Producto terminado

• Muestras de retención

Microsart e Motion Membrane Filters

Manifold

Jeringa Dosificadora

Microsart e Motion Membrane Dispenser

Microsart funnel 100

Presentaciones disponibles• Embudos y base de polipropileno estériles en 5 bolsas selladas• Esterilización mediante óxido de etileno• Complementario con diferentes tipos de membranas tamano de poro y colores• Contiene 60 piezas

Embudo de 100 ml estéril

Ajuste embudo en base

Ranura para muesca 16 A07– 10 --N

Microsart @ filter 100

Presentaciones disponiblesEmbudos y base de polipropileno estériles mediante óxido de etileno en bolsas selladas Integradas distintos tipos de membranas tamano de poro y colores Contiene 60 piezas

Embudo de 100 ml estéril

Membrana

Ajuste embudo en base

Base desechable

Ranura para muesca 16 D01 10—06--BL

Microsart @ filter y Microsart funnel

Ventajas

Ahorra espacio en campana de flujo

Compatible con dispensador 16A08

Menor costo

16 A08

16 A07 10 N

16 A07 10 N

16 D01 10—06--BL

Microsart @ filter 100

Caracteristicas Microsart @ filter

Geometría innovadora ↓ Retencion de líquidos Ajuste perfecto y de fácil remoción

Junta asegura adecuada posición

Fácil remoción y transferencia de membrana soporte adecuado

fácil retiro del embudofácil transferencia al NPS

10 January 2017 Page 7

¿Qué se prueba?• Agua utilizada en la producción• (Agua purificada, agua para inyección)• Desinfectantes• Bioburden• Materias primas

A qué microorganismos se dirigen?

• Cuenta Viable Total (TVC)• Levaduras y Hongo (TYMC)• Microorganismos especificados• Organismos de potabilidad del agua

Aplicaciones en Farma

10 January 2017 Page 27

Filter Material Comparison

Membrane Material

Suitablefor

Aqueoussolutions

Suitable foralcoholicsolutions(Disinfectants)

Adsorption Chemical Resistance

(pH)

BacterialGrowth

Cellulose Mixed Ester

XXX - XXX X XXX

Cellulose Acetate XXX XXX X XXX X

PESU XXX X XX XXX XXX

PVDF XXX XXX X XXX X

Nylon XXX XXX XXX ---

1.Soluciones acuosas ~ 95% de las aplicacionesEl éster mixto de celulosa (CN) es más adecuado para la enumeración microbiana y estándar en la industriaSoluciones no acuosas, soluciones alcohólicas como desinfectantes ~ 5% del mercadoCA y PVDF son opciones para Cellulose Mixed Esters

Nutrient Pad Sets

Acorde a legislaciones vigentes Control Microbiológico de productos No estériles

Clave Producto Nombre Propósito

14053 –47----N Endo E.Coli y coliformes

14080 –47----N Schaufus Pottinger Hongos y levaduras

14084–47----N R2A Cuenta total en agua

14062–47----N Suero naranja Bacterias acidófilas

EP USP

2.6.12 Cuenta microbiana 61 Cuenta microbiana

2.6.13 Prueba específica paramicroorganismos

62 Prueba específica paramicroorganismos

Microsart @filter 100

Microsart@ filter OTROS

Mayor área de filtración ↓ 30% área de filtración

Embudos en empaque de 100 piezas Microfil S Embudos en empaque individual

Membrana fácil de remover /remplazar Membrana difícil de remover /remplazar

Microsart @filter fácil visión y manipulación de membranas = Solución fácil y rápida Asegura resultados confiables Seguridad en manejo de muestras

Alternativas de monitoreo

Efectividad de las soluciones Escenario I (continuación)

1. Cliente emplea embudos, membrana de filtración y pinzas

2ª Opción

Beneficios:Ahorra tiempo, horas hombre, provee resultados confiables, ergonomía

Alternativas de monitoreo

Efectividad de las soluciones Escenario I (continuación)

1. Cliente emplea embudos, membrana de filtración y pinzas

3ª Opción

Beneficios:Ahorra tiempo, horas hombre, provee resultados confiables, ergonomía

16414Biosart 100 Adapter (silicone)onto - Sartorius stainless steel base e.g. 16840 or 16841

16424Biosart 100 Adapter (PP, with silicone o-ring)onto- Sartorius stainless steel base1ZU---0002 Microsart

16415Biosart 100 Adapter (PP, with 50 mm Ø)onto - Millipore Microfil

16416Biosart 100 Adapter (PP, with 59 mm Ø )onto - Millipore Milliflex - Whatman AS230 (MBSII)

Biosart 100 Adapter

02. Juli 2014 Seite 1

3 different packaging types are available:

ACK: 48 pzas, estéril empacado individualmente en 1 caja

K : Cada 12 monitores se empacan estéril en una bandeja, 1 caja tiene 4 de estas bandejas.4 bandejas (= 48 monitores)

V--K: 48 Monitores se empacan en 1 caja de cartón, la caja de cartón es sellada con una lámina delgada

Biosart 100 Monitors:

INCUBACIONExaminación inmediata

después del período de

incubación.

Cuenteo de colonias y tomar

nota de los resultados

ExaminarSe denomina unidad formadora de colonia

(UFC) a una célula viva y aislada que se

encuentra en un substrato sólido y en

condiciones ambientales adecuadas y produce

una colonia en un breve lapso de tiempo.

Una UFC también puede corresponder a más de

una célula cuando éstas forman parte de

grupos unidos fuertemente ya que cada grupo

formaría una colonia.

No Se Observa Crecimiento

Muestra con pH extremo

Almacenamiento inadecuado del medio

Manejo inadecuado de la muestra

Medio caducado

Volumen insuficiente del medio

Evaporación del medio durante la incubación

Tiempo insuficiente de incubación

Enjuagar

Refrigerar

Proteger del exceso de calor

Verificar fecha de caducidad

Verificar volúmen = 2 ml

Usar caja petri cerrada herméticamente

Verificar que el tiempo y la temperatura sean los requeridos para el organismo analizado

Razón Solución

10 January 2017 Page 34

Thank you very much for your

attention!