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SELECCIÓN DE EXTRACTOS FÚNGICOS EXTRACELULARES (EFE)

CON POTENCIAL PARA EL CONTROL DE Botrytis cinerea EN TOMATE (Lycopersicon esculentum Mill.)

DIANA CATALINA POVEDA PARRA

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial

Para optar al título de

MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Bogotá, D. C. 2006

SELECCIÓN DE EXTRACTOS FÚNGICOS EXTRACELULARES (EFE)

CON POTENCIAL PARA EL CONTROL DE Botrytis cinerea EN TOMATE (Lycopersicon esculentum Mill.)


TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial

Para optar al título de

MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL

Director: ALBA MARINA COTES PRADO Ph. D.

Codirector: ANDRÉS DÍAZ GARCÍA I.Q.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Bogotá, D. C. 2006

NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

SELECCIÓN DE EXTRACTOS FÚNGICOS EXTRACELULARES (EFE) CON POTENCIAL PARA EL CONTROL DE Botrytis cinerea EN TOMATE

(Lycopersicon esculentum Mill.)


APROBADO

_____________________________________ __________________________________ ALBA MARINA COTES PRADO Ph. D. ANDRÉS DÍAZ GARCÍA I.Q. Director Codirector

______________________________________ __________________________________ MARIA CARIDAD DE GARCÍA MsC. MARÍA MERCEDES MARTÍNEZ Jurado Jurado

SELECCIÓN DE EXTRACTOS FÚNGICOS EXTRACELULARES (EFE) CON POTENCIAL PARA EL CONTROL DE Botrytis cinerea EN TOMATE

(Lycopersicon esculentum Mill.)


APROBADO

_______________________________________ _______________________________

ANGELA UMAÑA MUÑOZ M.Phil. LUIS DAVID GÓMEZ M. Decana Académica Director Carrera

A Dios mi Director Principal porque me dio la visión y fortaleza necesarias cada día, Él y mi familia con su amor, apoyo y guía sabia me han enseñado que la perseverancia, la

valentía, el no mirar atrás y el esfuerzo son baluartes de una vida en vía a la excelencia.

vi

AGRADECIMIENTOS

La autora manifiesta su gratitud a:

Dra. Alba Marina Cotes, por su enseñanza y por la oportunidad de formar el hábito

investigativo.

Andrés Díaz, por su enfoque y discusiones acertadas.

Carlos Andrés Moreno, por su asesoría.

Los estudiantes, profesionales y auxiliares del Laboratorio de Control biológico, por

su ayuda y colaboración.

Corpoica C.I. Tibaitatá por mostrarme posibilidades en un área que necesita ser

explorada, la investigación en la agricultura.

Mis Padres por su confianza y consejo sabio, a Moni mi hermana por su ayuda.

A todos aquellos que me acompañaron en esta carrera y me comunicaron sus

conocimientos y trabajos para la construcción de éste, su apoyo ha sido clave a lo

largo de esta etapa de mi vida.

vii

TABLA DE CONTENIDOS Página ÍNDICE DE TABLAS XI ÍNDICE DE FIGURAS XII RESUMEN ABSTRACT 2

INTRODUCCIÓN 3

1. MARCO TEÓRICO 5 1.1 LOS MICROORGANISMOS COMO FUENTE DE METABOLITOS DE INTERÉS 5

Biodiversidad Microbiana 5

Bioprospección: Proceso esencial en la investigación biotecnológica 7

Metabolitos Fúngicos en Medicina 9

Antibióticos 9

Anticancerígenos, Antidiabéticos e Inmunosupresores 12

Metabolitos Fúngicos en Alimentación e Industria 13

Metabolitos Fúngicos en Fitoprotección 14

Antibióticos 15

Enzimas 18

Volátiles 19

1.1.2 Metodologías empleadas para la bioprospección de metabolitos con

interés en fitoprotección 20

Bioprospección in vitro 20

Bioprospección in vivo e in planta 22

1.1.2.1Metabolismo secundario: Biosíntesis de productos naturales con

interés en fitoprotección 23

viii

1.2 IMPORTANCIA DEL TOMATE (Lycopersicon esculentum Mill.) 25

1.2.1 Principales patologías del Tomate 25

1.3 MOHO GRIS: Botrytis cinerea 26

1.3.1 Generalidades del Agente Etiológico del Moho Gris. 26

1.3.2 Características Microscópicas y Macroscópicas de Botrytis cinerea. 27

1.3.3 Epidemiología y Ciclo de Vida del Fitopatógeno B. cinerea 28

Diseminación del Patógeno 28

Ciclo de Infección de Botrytis cinerea 29

1.4 CONTROL DEL MOHO GRIS (Botrytis cinerea) 31

1.4.1 Control Químico 31

1.4.2 Metabolitos fúngicos reportados para el control de B. cinerea 33

1.4.3 Características de los metabolitos fúngicos utilizados para fitoprotección 33

2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 35

2.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA. 35

2.2 JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN. 35

3. OBJETIVOS 37

3.1 OBJETIVO GENERAL. 37

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS. 37

4. MATERIALES Y MÉTODOS 38 4.1 PRODUCCIÓN DE LOS EXTRACTOS FÚNGICOS EXTRACELULARES (EFE) 38

4.1.1 MICROORGANISMOS Y MEDIOS DE CULTIVO 38

Cepas nativas de hongos filamentosos 38

Colección de trabajo de los Hongos 38

Obtención de los Extractos Microbianos 39

Producción de los Extractos 39

ix

4.2 ENSAYOS in vitro. 40 4.2.1 Suspensión de conidios de Botrytis cinerea. 40

4.2.2 Lectura de las Placas 41

4.2.2.1 Curva de Calibración para Botrytis cinerea 42

4.2.2.2 Actividad Antifúngica de los Extractos (EFE) 42

4.2.3 Análisis Estadístico 43

4.3 ENSAYOS in planta. 44

4.3.1 Selección del Bioensayo 44

4.3.2 Evaluación de los Extractos Fúngicos Extracelulares (EFE) seleccionados 45

4.3.2.1 Material Vegetal 45

Inoculación en Foliolos de Tomate. 45

4.3.3 Análisis Estadístico 46

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 48 5.1 MICROORGANISMOS Y MEDIOS DE CULTIVO 48

5.1.1 Cepas nativas de hongos filamentosos 48

5.1.2 Producción de los Extractos Fúngicos Extracelulares (EFE) 53

5.2 ENSAYOS in vitro 59

5.2.1 Efecto de los extractos fúngicos (EFE) sobre la inhibición de la

germinación de B. cinerea 59

5.2.2 Cuantificación de la densidad óptica en relación con el efecto de los

extractos fúngicos (EFE) sobre la inhibición de la germinación de B. cinerea 74

5.3 ENSAYOS in planta 85

5.3.1 Selección del Bioensayo 85

5.3.2 Evaluación de la actividad antifúngica de los extractos en ensayos

in planta. 86

6. CONCLUSIONES 94

x

7. RECOMENDACIONES 95 8. REFERENCIAS 96

9. ANEXOS 109

xi

ÍNDICE DE TABLAS Página

Tabla 1. Taxonomía de Botrytis cinerea 28

Tabla 2. Morfoespecies recuperadas de los tubos de agar 48

Tabla 3. Morfoespecies recuperadas de los viales en aceite 51

Tabla 4. Características de los EFE provenientes de las morfoespecies

suelo 1 56


suelo 2 57


suelo 3 58

Tabla 7. Efectos potenciales de los extractos con actividad antifúngica

sobre la germinación de B. cinerea 68

Tabla 8. Características de los EFE pertenecientes al grupo de inhibición

alta de la germinación de B. cinerea y sus correspondientes

extractos producidos en el otro medio de cultivo 69

Tabla 9. Delta de diferencias de la densidad óptica para cuatro longitudes

de onda 74

Tabla 10. Valores de densidad óptica para diferentes concentraciones

de B. cinerea 75

Tabla 11. EFE producidos en el medio Czapeck-Dox, empleados para la

calibración 78

Tabla 12. EFE producidos en el medio YMG, empleados para la

calibración 80

Tabla 13. Relación entre el porcentaje de inhibición de la germinación de

B. cinerea y la densidad óptica, obtenido con los extractos

49 y 56 82

Tabla 14. Porcentajes de severidad y eficacia para los tratamientos EFE

56 y 158 después de 19 días de inoculación de B. cinerea 92

xii

ÍNDICE DE FIGURAS

Página Figura 1. Estructura del metabolito paclitaxel 12

Figura 2. Estructura del antidiabético L-783,281 13 Figura 3. Estructura de la gliotoxina 15

Figura 4. Estructura de la glisoprenina C, neobulgarona D y scytalol D 17

Figura 5. Fotografías macroscópicas de diferentes morfoespecies de los

suelos 1, 2 y 3 49

Figura 6. Fotografías macroscópicas de diferentes morfoespecies de los

suelos 1, 2 y 3 50

Figura 7. Fotografías microscópicas de diferentes morfoespecies 52

Figura 8. Fotografías de algunos de los extractos producidos 53

Figura 9. Agrupamiento del efecto inhibitorio de los EFE producidos en

el medio Czapeck-Dox 59


el medio YMG 60

Figura 11. Tubos germinales cortos de B. cinerea en presencia de algunos

EFE 63

Figura 12. Concentración del contenido citoplasmático de conidios de

B. cinerea en presencia de algunos EFE 64

Figura 13. Tubos germinales secundarios y terciarios de B. cinerea en

presencia de algunos EFE 64


Czapeck-Dox pertenecientes a los grupos de inhibición media

y alta 66


YMG pertenecientes a los grupos de inhibición media y alta 67

Figura 16. Fotografías de los extractos del grupo de inhibición alta 69

Figura 17. Fotografías del efecto de los EFE del grupo de inhibición alta

sobre la germinación de B. cinerea 71

xiii

Figura 18. Morfoespecies productoras de los extractos del grupo de

inhibición alta 72

Figura 19. Curva de calibración para B. cinerea, concentración vs.

densidad óptica 75

Figura 20. Disposición espacial de los tratamientos evaluados en una placa

de microtitulación de 96 pozos 76

Figura 21. Modelo de calibración lineal entre la densidad óptica y el porcentaje

de germinación para los EFE producidos en Czapeckl-Dox 79

Figura 22. Modelo de calibración lineal entre la densidad óptica y el

porcentaje de germinación para los EFE producidos en YMG 79

Figura 23. Incidencia B. cinerea en el modelo de foliolos de tomate 85

Figura 24. Incidencia B. cinerea en el modelo de tallos de tomate 86

Figura 25. Fitotoxicidad sobre foliolos de tomate en presencia del EFE 49 87

Figura 26. Fitotoxicidad sobre foliolos de tomate en presencia del EFE 66 87

Figura 27. Progreso moho gris sobre foliolos de tomate 88

Figura 28. Curva de progreso incidencia moho gris sobre foliolos tomate 88

Figura 29. Porcentaje de incidencia del moho gris en el día 19 89

Figura 30. Fotografías del área foliar con moho gris en presencia de los

tratamientos evaluados 90

Figura 31. Progreso severidad moho gris sobre foliolos expresado en

UABC 90

Figura 32. Porcentaje de severidad del moho gris en el día 19 91

Figura 33. Beauveria sp. cepa 223 productora del EFE 56 93

RESUMEN

Los hongos filamentosos presentes en zonas tropicales como el Amazonas, proveen

fuentes potenciales de compuestos con actividad para inhibir la germinación de

hongos fitopatógenos durante su ciclo de infección. Este tipo de alternativas

permitirá el control de brotes epidemiológicos como el producido por el moho gris B.

cinerea, durante la pre y postcosecha en cultivos de importancia agrícola, como el

tomate. Por otra parte, en la actualidad se han desarrollado técnicas de

bioprospección de alta eficiencia en el formato de placas de microtitulación de

96-pozos para evaluar el efecto de extractos crudos o moléculas puras sobre la

fisiología, morfología o actividad de microorganismos de importancia clínica,

agrícola e industrial. Dicho efecto puede ser cuantificado relacionando la

observación directa por microscopia del fenómeno con la densidad óptica obtenida

en un lector de ELISA. Por tanto, el objetivo de este trabajo fue seleccionar

extractos fúngicos extracelulares (EFE) que inhibieran la germinación de B. cinerea

in vitro e in vivo mediante el empleo de una técnica de microtitulación. Se emplearon

cepas de hongos filamentosos aisladas previamente del Amazonas para la

producción de extractos fúngicos extracelulares (EFE) en dos medios de cultivo,

Czapeck-Dox y YMG. Los EFE fueron evaluados en placas de microtitulación de 96-

pozos para cuantificar la inhibición de la germinación de 5 x 105 conidios.ml-1 de

B. cinerea, relacionando la germinación del hongo observada mediante microscopia

óptica con la densidad óptica a 405 nm. En total, 22 extractos (15 producidos en el

medio YMG y 7 en Czapeck-Dox), lograron inhibir la germinación de B. cinerea en

más del 60% en comparación con el testigo patógeno. De estos, cuatro EFE

codificados como 49, 56, 66 y 158, producidos por las morfoespecies 44 (Penicillium

sp.), 223 (Beauveria sp.), 110 (Aspergillus sp.) y 150 (Phialophora sp.)

respectivamente, en los medios YMG y CD, presentaron inhibiciones de la

germinación de B. cinerea entre el 85% y 90%. De los cuatro extractos

seleccionados in vitro, dos de ellos presentaron actividad fitotóxica en las hojas de

tomate y el extracto 56 presentó la mayor actividad sobre foliolos de tomate

reduciendo la severidad del moho gris en un 74%, después de 19 días.

2

ABSTRACT

Filamentous fungi from tropical ecosystems as the Amazonas, possess potential

sources of compounds with activity to inhibit germination of fungal phytopathogens

during their infection cycle. These alternatives allow to control epidemic outbreaks

produced by the gray mould B. cinerea, during pre- and postharvest of importance

agricultural cultives as the Tomato. Nonetheless, currently high-troughput

bioprospection techniques have been developed based on the 96-well microtitre

plate format to evaluate the effect of crude extracts, or pure molecules over the

physiology, morphology or activity of clinical, industrial and agricultural

microorganisms. Such effect may be scored considering the direct observation by

optical microscopy with optical density obtained in ELISA´s microplate reader.

Therefore, the objective of this investigation was to select extracellular fungal

extracts (EFE) that inhibited B. cinerea germination in vitro and in vivo through the

microtitration technique. Strains of filamentous fungi isolated previously from the

Amazonas, were used and grown for the production of the extracellular fungal

extracts (EFE) in the Czapeck-Dox and YMG media. EFE were tested on the 96-well

microtitre plates to estimate inhibition of germination from B. cinerea 5 x 105

conidia.ml-1 which was related between optical microscopy with optical density at

405nm. Twenty two extracts (15 produced on YMG medium and 7 on Czapeck-Dox

medium), inhibited conidial germination of B. cinerea up to 60% as compared to the

pathogen. From of these ones, four EFE codified as 49, 56, 66 and 158, produced by

the morphospecies 44 of Penicillium sp., 223 of Beauveria sp., 110 of Aspergillus sp.

and 150 of Phialophora sp., respectively, on YMG and CD media, showed

germination inhibition of B. cinerea ranged between 85% and 90% after 16 h. From

these four extracts selected against B. cinerea two of them showed phytotoxic

activity over tomato leaves, and was only the EFE 56 that showed the highest

activity in vivo upon tomato leaves reducing severity of gray mould at 74 % after 19

days.

3

INTRODUCCIÓN

Los hongos filamentosos representan gran parte de la diversidad macro y

microscópica universal, con aproximadamente más de 250.000 especies, y más de

3.000 productos derivados de su metabolismo, identificados hasta la fecha. De

algunas de estas cepas y metabolitos, no se conocen todas sus propiedades y

actividades específicas, reflejando aún un amplio campo de interés para su

exploración e investigación. Esto es especialmente relevante en aquellos

microorganismos aislados de zonas megadiversas de nuestro país como el

Amazonas, donde la microbiota fúngica y productos derivados todavía no han sido

explorados ni explotados.

Adicionalmente, dentro del reservorio de productos naturales, existen varios

metabolitos fúngicos que han demostrado su utilidad en fitoprotección de cultivos,

debido tanto a sus efectos directos sobre los fitopatógenos, como a los efectos

indirectos sobre la planta. Esto es debido a que, estos pueden inhibir el desarrollo

de estructuras de infección y de penetración del patógeno, o actuar como inductores

de respuestas de defensa en el huésped, protegiendo en ambos casos a la planta

de los efectos deletéreos de los hongos fitopatógenos.

Las disminuciones en el rendimiento en muchos casos, también son una

consecuencia del desarrollo de resistencia por parte de los patógenos a los agentes

químicos de control tradicionalmente empleados, reduciéndose el efecto de los

agroquímicos y por ende ocasionando la persistencia de estas cepas dentro de los

cultivos. Como resultado de lo anterior se han presentado numerosos brotes

epidemiológicos de impacto económico, como los reportados para el moho gris una

enfermedad ocasionada por Botrytis cinerea, un patógeno de alto riesgo en lo

concerniente al manejo de resistencia, por su capacidad para adaptarse con

facilidad y rapidez a las condiciones del huésped y del medio.

4

Botrytis cinerea es un hongo necrótrofo y polífago que causa serios daños y

pérdidas en un amplio rango de cultivos de frutales, vegetales y ornamentales en

todo el mundo, genera pérdidas significativas ya que puede infectar y destruir hojas,

tallos, flores y frutos, durante la producción y el almacenamiento. Desencadena un

impacto negativo con repercusiones económicas, tanto por su distribución,

versatilidad como por sus características únicas de patogenicidad dentro del ciclo de

infección, porque es capaz de desarrollar estructuras de penetración especializadas,

así como una matriz extracelular cuya función es la adhesión en la superficie de la

planta, que junto con un amplio espectro de enzimas potencian su ingreso y acción

en el huésped, desencadenando efectos letales para los cultivos. El tomate

(Lycopersicon esculentum Mill.) se ve afectado por varios problemas fitosanitarios

dentro de los que también se encuentra la enfermedad del moho gris causada por

B. cinerea.

Tradicionalmente, el control de B. cinerea se ha realizado a través de aspersiones

químicas, se estima que el mercado de productos anti-Botrytis en los últimos años,

ha alcanzado alrededor de los US $ 15-25 millones. Sin embargo, existe el riesgo de

la aparición y el establecimiento de cepas resistentes de Botrytis sp. a dichos

químicos; creándose la necesidad de buscar otro tipo de estrategias de control del

moho gris, tales como los metabolitos fúngicos que representan una alternativa

natural. Estos beneficios potenciales pueden ser descubiertos mediante procesos de

bioprospección de algunas cepas de hongos filamentosos y de los metabolitos

producidos por estos.

5

1. MARCO TEÓRICO

1.1 LOS MICROORGANISMOS COMO FUENTE DE METABOLITOS DE

INTERÉS. Biodiversidad Microbiana.

Los microorganismos son una gran fuente de recursos biotecnológicos porque tanto

bacterias como hongos poseen una maquinaría enzimática y una composición

genética y fisiológica diversa, haciéndolos atractivos para la investigación, mediante

programas de búsqueda y exploración. Procesos que han permitido descubrir un

amplio número de especies, distribuidas en la mayoría de ecosistemas terrestres y

acuáticos, así como un potencial de compuestos microbianos. Hawksworth y

Rossman (1987) estiman, que existen al menos 1,5 millones de hongos en nuestro

planeta, donde para ese año, el 10% de la microbiota (100.000 especies) estaba

descrita. Pero, según datos de Selitrennikoff, en 2001, el número ha incrementado a

250,000 especies identificadas, un 25% de la población, lo que significa que aún

queda un 75% de nuevos géneros y biotipos por caracterizar. Sin contar con que, el

número de especies continúa creciendo, especialmente con el hallazgo de los

hongos endofíticos, con aproximadamente 1 millón de especies (Dreyfuss y

Chapela, 1994 citado por Strobel y Daisy, 2003), reflejando la diversidad de este

grupo de organismos asombrosos y extremadamente versátiles, porque además del

incremento en su número, se presume que con cada nueva especie se pueden

encontrar nuevos productos naturales y biomoléculas asociadas (Strobel y Daisy,

2003), de las cuales también es necesaria su identificación.

Demain (1999) reporta que existen 100,000 productos naturales, donde alrededor

del 50% corresponde a los producidos por microorganismos. De este porcentaje,

existen 12,000 antibióticos conocidos, donde el 22% pertenece a los derivados de

6

los hongos filamentosos, significando aproximadamente 2,640 sustancias con

propiedades antimicrobianas. El 78% restante, se divide entre los producidos por

bacterias filamentosas (66%) y no filamentosas (12%), confirmando al grupo de los

actinomycetes, especialmente al género Streptomyces, como la principal fuente de

antibióticos a nivel mundial (Strobel y Daisy, 2003).

El número de antibióticos derivados de fuentes fúngicas, pertenece a los más de

3,000 metabolitos producidos por esta microbiota (IBWF, 2005), con diferencias

tanto en sus estructuras químicas y moleculares, como las funciones que realizan,

las cuales no siempre son conocidas (Calvo et al., 2002).

Como se mencionó anteriormente, muchos de los metabolitos descritos se derivan,

de bacterias y hongos filamentosos que son habitantes del suelo (Fravel, 1988).

Encontrándose una marcada influencia del ecosistema, de donde se aísla el

microorganismo, sobre la tasa de producción de sustancias fúngicas, porque en su

microhábitat, el microorganismo desarrolla interacciones benéficas o negativas

(Atlas y Bartha, 2002) que posiblemente pueden resultar en un efecto inductor o

supresor, de la producción de sustancias antibióticas (Fravel, 1988). Investigaciones

realizadas por el IBWF (2005) basadas en el supuesto que los hongos nunca viven

solos, y por tanto se ven influenciados por las relaciones con otros organismos,

demuestran que existe una mutua inducción entre hongos, para la producción de

metabolitos secundarios, especialmente entre hongos que presentan el mismo

hábitat, porque cepas de Penicillium sp. inducen la producción de strobilurina en

Oudemansiella mucida, que a su vez incrementa la síntesis de crisogina en P.

notatum, en comparación a la inoculación de la misma cepa en un medio de cultivo

diseñado para su fermentación. Evidenciándose una diferencia de rendimiento para

aquellas cepas que se cultivan en medios de producción frente a las mismas pero

en condiciones naturales. Este fenómeno también se ha observado para algunos

basidiomycetes, que produjeron compuestos bioactivos, cuando se cultivaron en

medios enriquecidos, bajo condiciones de laboratorio, pero donde el porcentaje de

cepas productoras (50%) no fue comparable a los obtenidos al propiciar el

crecimiento en el sustrato natural (12 de 17 cepas, 70%), debido a que también se

7

producen antibióticos para suprimir el crecimiento de hongos que compiten por

sustrato o espacio (IBWF, 2005).

Este tipo de diferencias observadas al cultivar un microorganismo a escala de

laboratorio frente a las condiciones nativas, comprueba la influencia de los factores

abióticos y bióticos en la gran biodiversidad microbiana, que se ha desarrollado

como respuesta a las características que le proporciona el medio ambiente,

conllevando a la expresión y desarrollo de un sinnúmero de estrategias para poder

conservar su hábitat y nicho, dentro de un determinado ecosistema (Atlas y Bartha,

2002; Fravel, 1988; IBWF, 2005). Motivo por el cual se observan microorganismos

(bacterias y hongos) que pueden vivir en condiciones adversas o extremas, bien sea

de temperatura (-12°C a >110°C), radiación (ionizante, UV, luz visible), presión

(atmosférica, hidrostática, osmótica), salinidad, actividad de agua (0,60-1,00), pH (0,

ácidos y 13, básicos) y potencial redox, entre otros (Atlas y Bartha, 2002).

Todas estas características, también revelan el potencial biotecnológico de la

microbiota en general, porque todos los factores moleculares, enzimáticos,

metabólicos y estructurales, que le confieren resistencia y que suceden en

respuesta al escenario, son deseables para su aprovechamiento en diversos

procesos de interés industrial y económico, por la producción de pigmentos,

enzimas, polímeros, lípidos, ácidos, sales y demás derivados del reservorio

metabólico y bioquímico de los microorganismos.

Bioprospección: Proceso esencial en la investigación biotecnológica. El conocimiento de la biodiversidad y del potencial de un microorganismo, se define

a través del estudio de sus propiedades fisiológicas, metabólicas y bioquímicas así

como de los diferentes metabolitos sintetizados, lo cual se logra mediante la

realización de pruebas exploratorias para encontrar dentro de grandes poblaciones

(Guarro et al., 1999), aquellos organismos que posean las características

seleccionadas, proceso que se conoce como bioprospección.

8

La bioprospección da a la investigación una línea de tendencia, que puede resultar

en el desarrollo de nuevos productos naturales, de bioplaguicidas, o bien de

fungicidas, dependiendo del caso. Esquema de producción, que según el

Laboratorio de Control Biológico de Corpoica (C.I. Tibaitatá), comprende procesos

biológicos, tecnológicos y legales.

En los procesos biológicos, se concentran las exploraciones primarias, con las

etapas de aislamiento, selección y caracterización de microorganismos o de los

productos de síntesis, perfilando el potencial existente y haciendo de esta fase de la

investigación, el fundamento dentro de la consecución de nuevos productos. Porque

después de descubrir y seleccionar factores de interés, se continúa con los

siguientes procesos tecnológicos para el registro, comercialización y demás etapas

legales del producto.

La bioprospección de metabolitos secundarios de origen microbiano, ha permitido

identificar nuevas moléculas biológicamente activas. Esta práctica ha sido frecuente,

desde el siglo XVIII y el pasado, mediante la exploración de extractos de

fermentación microbiana con actividad antibiótica (Higgs et al., 2001). Desde, las

investigaciones realizadas por científicos visionarios como A. Fleming y S.

Waksman, resultado en el conocimiento de la mayoría de la microbiota actualmente

identificada y en el descubrimiento de algunos metabolitos, que ingresaron en la era

de los antibióticos, con la penicilina (1929) y la estreptomicina (1943), derivada de

Penicillium sp. (Atlas y Bartha, 2002; IBWF, 2005) y Streptomyces sp.

respectivamente, como los primeros metabolitos secundarios utilizados como

medicamentos con aplicaciones clínicas.

Además de las aplicaciones en salud humana, de los metabolitos secundarios

derivados de fuentes microbianas, se ha descubierto el gran potencial, de los

hongos filamentosos y de sus diferentes compuestos de biosíntesis, en diferentes

arenas. Encontrándose que esta microbiota comprende una colección de

microorganismos industrialmente muy importantes, por ser una rica fuente de

metabolitos secundarios (Calvo et al., 2002; Nieminen et al., 2002; Singh et al.,

2000; Thines et al., 2004) y de su prospección resultan grandes posibilidades de

encontrar nuevos compuestos potencialmente significativos para el tratamiento de

9

nuevas enfermedades en humanos, plantas y animales (Strobel y Daisy, 2003),

entre otras implicaciones futuras.

Metabolitos Fúngicos en Medicina. Antibióticos. Al explorar un amplio rango de hongos filamentosos, se han encontrado compuestos

orgánicos de bajo peso molecular, que a bajas concentraciones son deletéreos tanto

para el crecimiento como para el desarrollo de actividades metabólicas de otros

microorganismos (Fravel, 1988), los cuales se conocen como agentes

antimicrobianos o antibióticos, que pueden ser utilizados en medicina y salud

humana frente al creciente aumento de nuevas enfermedades microbianas así como

de cepas resistentes a los medicamentos, expresado por una amplia variedad de

bacterias y hongos patógenos.

Encontrándose compuestos con estructuras y modos de acción diversos, como lo

reportado por Singh y colaboradores (2000), durante la selección de extractos de

fermentación fúngica, donde encontraron un nuevo diterpenoide, el

guanacastapeno, con actividad bactericida frente a S. aureus y E. faecium,

resistentes a los fármacos, meticilina y vancomicina, tradicionalmente empleados

para su control. En ese mismo año, Nose y col., aislaron dos nuevos antifúngicos

PF1163A y B, de un caldo de fermentación de Penicillium sp., que mostraron una

potente actividad inhibitoria del crecimiento de Candida albicans, al interferir en la

biosíntesis de ergosterol. Estos resultados son interesantes, porque se podrían

utilizar este tipo de compuestos, para reemplazar los azoles y polienos que

presentan deficiencias en el tratamiento de varias micosis e infecciones sistémicas,

ocasionadas por hongos y levaduras oportunistas, en pacientes inmunodeprimidos;

infectados por el VIH o que han recibido quimioterapia.

Igualmente, el hongo filamentoso Acanthostigmella sp. aislado del jardín botánico de

Nueva York, USA, puede ser utilizado en terapias con estos mismos pacientes,

porque produce tres flavonas con propiedades antifúngicas, especialmente la de CJ-

19,784 (3´-bromo2´,5-dihidroxi-3,7,8-trimetoxiflavona) que inhibe el crecimiento de

10

los hongos C. albicans, C. neoformans y A. fumigatus (Watanabe et al., 2001),

patógenos de alto riesgo. Clavariopsis aquatica, un hongo hiphomycete, también

sintetiza compuestos deletéreos, para A. fumigatus y otras especies como A. niger

y C. albicans, conocidos como clavariopsinas A y B, depsipéptidos de carácter

cíclico, encontrados por Kaida y colaboradores (2001).

Otro compuesto que también podría ser empleado, es un nuevo antibiótico CJ-

17,665, derivado de Aspergllus ochraceus (Sugie et al., 2001) que inhibe cepas

bacterianas resistentes, como las mencionadas inicialmente, causantes de serios

problemas de salud pública. Chu y colaboradores en el 2003, también encontraron

dentro de cientos de extractos, dos antibióticos (Sch -484129 y -484130) de

naturaleza glicolipídica y acción frente a cepas de Saccharomyces como de

Aspergillus.

La mayoría de estos nuevos metabolitos tienen estructuras complejas con

propiedades únicas, como queenslandon, una micotoxina de la familia de las

zearalenonas (fórmula C20H26O8, estructura aromática, grupo ceto y éster carbonil,

E-configuración), encontrada dentro del grupo de las naftoquinonas, al que también

pertenece un complejo de tres altersolanoles (A, B, C), todos derivados de

Chrysosporium queenslandicum, un hongo patógeno aislado de una muestra de

suelo colectada en Egipto (Hoshino et al., 2002). Queenslandon, tiene además de

su función lactona, un fuerte espectro de actividad biológica contra bacterias y

hongos patógenos, como M. luteus, B. subtilis, A. alternata, P. chrysogenum, A.

nidulans y P. variotii, entre otros (Hoshino et al., 2002).

FR901469 es otro nuevo antimicrobiano (Fujie et al., 2000) que también presenta

una estructura y función de interés, porque es uno de los 40 miembros de las

lipopeptidolactonas macrocíclicas, con 12 aminoácidos y motilidad 3-

hidroxipalmitolil, que interfiere con las enzimas encargadas de la síntesis de 1,3-β-

glucanos, los cuales son componentes esenciales de la pared celular de hongos

patógenos de importancia clínica, como C. albicans y Aspergillus sp.. Este espectro

de actividad es ideal, porque no existen enzimas similares en las células de los

mamíferos (Fujie et al., 2000), que puedan ser inhibidas durante los tratamientos

terapéuticos con este tipo de metabolitos. Otro agente inhibidor, que también es

11

selectivo y específico dentro de vías metabólicas de los hongos patógenos, es la

Khafrefungina, aislada de un micelio estéril perteneciente a un hongo endofítico.

Porque la Khafrefungina, inhibe la síntesis de esfingolípidos en etapas claves para

su consecución (Mandala et al., 1997).

Hasta el momento, se han relacionado algunos de los antibióticos con espectro de

actividad prospectiva frente a bacterias y hongos patógenos, pero existen dos

inhibidores de proteasa, los ácidos citónicos A y B, aislados de la fermentación en

estado sólido de hongo endofítico Cytonaema sp. que presentan un modo de acción

llamativo, por la inhibición del citomegalovirus humano (Strobel y Daisy, 2003).

De todos los compuestos mencionados, se hace necesario no solo evaluar su

actividad biológica sino la citotóxica o genotóxica (Nieminen et al., 2002; Watanabe

et al., 2001) debido a que, muchos de estos productos se emplearán como fármacos

para humanos. Es así como algunos de ellos están en fase exploratoria, en

laboratorio, para conocer su posible toxicidad (Hoshino et al., 2002), mientras que

otros se encuentran en las últimas etapas dentro del desarrollo de nuevos

productos, como el caso de los lipopéptidos FK 463 y WF 11899A, derivados cepas

de hongos filamentosos que fueron clasificadas dentro de dos grupos, los

Coleomycetes e Hiphomycetes (Hino et al., 2001). Cabe resaltar que, muchas de las

cepas productoras de metabolitos secundarios, con potencial prospectivo

encontradas en procesos de selección, no han sido clasificadas porque se

desconoce su género y especie.

Los antibióticos de la clase de los β-lactámicos, ya han sido comercializados y son

un ejemplo destacado para la biotecnología, por su producción industrial por

fermentación, desde hace 50 años, y porque actualmente estos antibióticos,

particularmente penicilinas y cefalosporinas representan en el mundo productos de

importancia biotecnológica con ventas mundiales de alrededor de US$ 15 billones,

aproximadamente el 65% del mercado total de antibióticos en el mundo (Elander,

2003). Muchos de estos antibióticos han sido modificados químicamente mediante

un proceso conocido como semisíntesis, desde 1974 (Demain, 1981).

Europa permanece como el área manufacturera dominante para penicilinas y

cefalosporinas. Sin embargo, debido a un creciente trabajo, costos de energía y de

12

materias primas, la mayor parte de industrias se están moviendo hacia el este, con

China, Corea e India como los países más favorecidos (Elander, 2003).

Además de los antibióticos, existen otro tipo de metabolitos fúngicos con actividad

prospectiva en medicina, pero con otros modos de acción diferentes, como los

mencionados a continuación.

Anticancerígenos, Antidiabéticos e Inmunosupresores.

De la revisión realizada por Strobel y Daisy (2003), se puede inferir que muchos de

los metabolitos fúngicos descubiertos son de interés para su aplicación en humanos,

especialmente algunos aislados de hongos endofíticos, porque se han encontrado,

entre otros, compuestos anticancerígenos, como el Paclitaxel (Figura 1) y algunos

de sus derivados, que representan el principal grupo de fármacos de este tipo,

producidos por estos microorganismos, llegando a ventas de billones de dólares a

nivel mundial.

Figura 1. Paclitaxel (Strobel y Daisy, 2003)

Paclitaxel, ha sido aislado de varios hongos endofíticos alrededor del mundo, p. Ej.

T. andreanae y nuevas especies como Seimatoantlerium tepuiense, en Venezuela

(Strobel et al., 1999; Strobel y Daisy, 2003).

Además de los beneficios mencionados, este compuesto ha sido empleado para

tratar otras enfermedades en tejidos humanos y también presenta actividad frente a

oomycetes fitopatógenos (Strobel y Daisy 2003).

13

Lee y colaboradores 1996, citado por Strobel y Daisy (2003), aislaron de una cepa

de Pestalotiopsis microspora, el ácido toreyanico una quinona dímerica citotóxica y

selectiva, empleada también como agente anticancerígeno.

En 1999, Zhang y col. encontraron, de una muestra de hongos nativos de selvas del

África (Kinshasa, República democrática del Congo), un metabolito

L-783,281(Figura 2) de Pseudomassaria sp., que actúa de manera similar a la

insulina y por ende, puede utilizarse en nuevas terapias para la diabetes, ya que a

diferencia de la insulina, este compuesto puede ser administrado oralmente porque

no es destruido en el tracto digestivo y además, ha demostrado una reducción de

los niveles de glucosa en la sangre, en ensayos realizados en ratones.

Otro descubrimiento sobresaliente para la medicina, ha sido la ciclosporina, aislada

de Tolypocladium inflatum (Borel y Kis, 1991, citado por Strobel y Daisy, 2003), así

como otros metabolitos fúngicos con modo de acción parecido (IBWF, 2005; Strobel

y Daisy, 2003), que actúan de forma similar a los inmunosupresivos empleados en

la actualidad en pacientes que han sido transplantados, para prevenir el rechazo a

los injertos. Lo cual, abre un amplio espectro, para el desarrollo de nuevos

fármacos, dentro de los que también se pueden contar algunos metabolitos que

presentan, actividad antitumoral (Strobel y Daisy, 2003), acción frente a la

hipercolesterolemia (IBWF, 2005), entre otros.

Figura 2. Estructura del antidiabético L-783,281 aislado de Pseudomassaria sp.

(Zhang et al., 1999. Science)

Metabolitos Fúngicos en Alimentación e Industria.

Los hongos filamentosos también han sido empleados para la elaboración de una

amplia variedad enzimas industriales (Pazouki et al., 2000), como proteasas, lipasas

14

y celulasas, entre otras, que aceleran diversos procesos industriales. Utilizándose

para la degradación de materiales (p. ej. papel, residuos vegetales, grasas),

obteniéndose productos y subproductos de interés. Beneficios que se derivan de la

versatilidad de los microorganismos para aprovechar los materiales y recursos

existentes en el ambiente.

Descubriéndose, un sinnúmero de enzimas de fuentes fúngicas; amilasas

encontradas en varios cultivos de Aspergillus sp. como la α-amilasa de A. oryzae

(Pedersen y Nielsen, 2000); pectinasas (Endo- y Exo- Poligalacturonasas PG) en A.

awamori (Blandino et al., 2002); Celulasas (β- glucosidasas, β−1-4 glucanasas)

producidas por varias cepas de Aspergillus, Phoma, Fusarium y Trichoderma (Atlas

y Bartha, 2002), proteasas y lipasas.

La mayoría de estos metabolitos fúngicos son empleados en la industria de

alimentos para la fabricación de bebidas alcohólicas, edulcorantes, jugos, quesos

madurados y en la producción detergentes, enzimas, entre otros.

Además, de las enzimas fúngicas, el ácido cítrico derivado de la fermentación de

Aspergillus niger (Demain, 1981), ha demostrado ser uno de los metabolitos más

importantes en varios alimentos, por su carácter acidulante y conservante.

Metabolitos Fúngicos en Fitoprotección. Muchos de los metabolitos fúngicos utilizados como agentes de biocontrol de

microorganismos fitopatógenos, presentan diferentes modos de acción específicos o

no específicos, y comprenden tanto agentes líticos, enzimas, compuestos volátiles y

otras sustancias tóxicas, siendo considerados como mecanismos de antibiosis,

según Fravel (1988). A continuación, se enumeran algunos de los metabolitos

fúngicos utilizados en fitoprotección, que han sido agrupados dentro de estos

fenómenos de antagonismo como antibióticos, sustancias volátiles y enzimas.

15

Antibióticos Desde los años 50´s, existen varios reportes (Fravel, 1988) que mencionan la

producción de metabolitos fúngicos para el control de ciertas enfermedades

ocasionadas por fitopatógenos. Como la gliotoxina (Figura 3) (Wright, 1956 citado

por Fravel, 1988) producida por Trichoderma viride (G. virens), para el control de

Pythium, patógeno que induce volcamiento en plantas.

En 1962, Barnett y col. (referido por Fravel, 1988) citan la producción in vitro de un

antibiótico que explica el antagonismo de G. roseum, frente a varios hongos,

relacionándolo como uno de los posibles mecanismos responsables, además del

hiperparasitimo. Otra correlación, pero entre la actividad in vitro y en invernadero,

fue realizada para la quetomina producida por Chaetomium globosum, viéndose una

inhibición del patógeno Venturia inequalis, en ambos modelos de estudio (Cullen y

Andrews, 1984 citado por Fravel, 1988).

Fravel (1988), considera algunas investigaciones realizadas durante la década de

los 80´s, donde se mencionan varios estudios que relacionan el empleo de

diferentes extractos de fermentación fúngica con la inhibición de algunos

fitopatógenos. En 1982 (Papavizas et al.), el extracto del medio de cultivo de

Trichoderma harzianum resultó en una inhibición de la pudrición blanca ocasionada

por S. cepivorum. En 1986, Ricard y Bollen, encontraron una sustancia producida

por Scytalidium sp. que inhibía a Poria carbonica. El año siguiente, Fravel et al.,

aislaron un metabolito del medio de cultivo de Talaromyces flavus, que destruía los

esclerocios de V. dahliae.

Figura 3. Estructura de la Gliotoxina

Wilson y Wisniewski (1994), también exponen una revisión de diversas

investigaciones, de donde se aislaron algunos metabolitos bioactivos de cultivos

16

líquidos, principalmente de especies de Trichoderma sp., varios compuestos de

estructura 6-pentil-α-pirona, siendo de este grupo, el 6-amil- α-pirona el más común

y potente in vitro e in vivo. Otras especies como T. lignorum y T. viride producen

trichodermina, que inhibe no solo a hongos filamentosos sino también a Candida

albicans.

Otros metabolitos fúngicos derivados de este género, son las koninginas, aisladas

de T. Koningi que produce Koningina A, y de T. harizianum que sintetiza tanto la

Koninginas A y B, así como dos nuevas estructuras butenolidas, estas últimas con

actividad frente a Gaeumannomyces graminis, un patógeno de cereales (Wilson y

Wisniewski, 1994).

Para favorecer el ingreso a la planta, después de la germinación del conidio,

muchos fitopatógenos desarrollan una estructura conocida como apresorio, la cual

también se ha visto afectada por numerosos metabolitos orgánicos, con diferentes

estructuras químicas y modos de acción, dentro de las que se cuentan 4

glisopreninas de carácter lipofílico (Figura 4A) de cultivos de Clonostachys rosea, 6

dímeros derivados de la antraquinona, las Neobulgaronas A-F, con mayor actividad

de la Neobulgarona D (Figura 4B), purificadas del micelio de Neobulgaria pura

(asomycete) (Eilbert et al., 2000). Así como, varios ácidos grasos de longitud de

cadena de 16,18 ó 20 átomos de C, hallados en extractos de micelio de hongos,

viéndose según Eilbert y colaboradores (1999; citado por Thines et al., 2004) una

mejor actividad inhibitoria frente a M. grisea, para aquellos que presentaban

configuración –cis en su instauración, como el ácido palmitoléico, el octadecenico y

el petroselínico (C18, cis-6) principalmente.

Otros compuestos con la misma afinidad por el sitio de acción son Scytalol D (Figura

4C), producido por el hongo anamórfico Scytalidium sp. (Thines et al. 1998) y una

cerulenina obtenida de un aislamiento originalmente llamado Cephalosporium

caerulens (Matsumae et al. 1963 y Sano et al. 1967 en Thines et al. 2004).

17

Figura 4. (A) Glisoprenina C, la más activa de las 4 glisopreninas de C. rosea,

(B) Neobulgarona D, (C) Scytalol D (Thines et al., 2004).

Algunos metabolitos también han sido aislados de hongos basidiomycetes, puesto

que según el IBWF (2005) la mitad de ellos producen antibióticos, como los

encontrados en el extracto de Resupinatos leightonii, dos sesquiterpenos, el 4-

germacradieno-2,6,12-triol y 1,6-farnesadieno-3,10,11-triol, asimismo inhibidores de

M. grisea (Eilbert et al., 2000; Thines et al., 2004).

Strobilurina A, ha sido un ejemplo destacado de metabolitos empleados como

moléculas modelo para el desarrollo de nuevos productos originalmente aislados de

fuentes fúngicas, en este caso de basidiomycetes. Porque según el IBWF (instituto

de investigación en Biotecnología y Drogas) junto con la Universidad de

Kaiserslautern (2005), de Alemania, esta es la clase más importante de fungicidas

utilizados en agricultura, descubiertas por Anke y colaboradores en 1977 de cultivos

líquidos de Strobilurus tenacellus un basidiomycete que crece en los conos de los

pinos.

En 1986 se produjeron los primeros derivados sintéticos que tenían estabilidad

frente a la radiación UV, porque aplicaciones del compuesto natural en campo

demostraron una relativa volatilidad e inestabilidad fotoquímica (Gullino et al. 2000),

además que existían dificultades para producir el compuesto a gran escala. De la

optimización química han resultado varios análogos, especialmente kresoxin-metil,

desarrollada por BASF y comercializada como Stroby®, Brio®, Discus® y Juwel®.

A

C

B

18

Las strobilurinas en el presente, están dentro de los fungicidas más vendidos

alrededor del mundo, siendo usados como protectantes de plantas frente a los más

importantes hongos fitopatógenos. Porque análogos químicos como kresoxin-metil,

azoxystrobina, metominostrobina y trifloxystrobina, tienen un amplio espectro de

actividad ya que, son inhibidores de la respiración fúngica controlando ascomycetes

y basidiomycetes, mildeos (polvoso y velloso) y royas (Gullino et al., 2000),

presentes en hojas, tallos, frutos y espigas principalmente de cebada, trigo, arroz.

Además de su uso para cultivos de cereales, estos fungicidas se emplean para en

otros cultivos para el control de Alternaria, Rhizoctonia solani, Pythium spp.,

Venturia, Botrytis cinerea y Sclerotinia, entre otras enfermedades (Gullino et al.,

2000).

Estos fungicidas del tipo strobilurina son un ejemplo del éxito en la aplicación

comercial de un producto a base de hongos ó de sus metabolitos, evidenciando que

las sustancias naturales pueden ser una importante fuente de agentes antifúngos,

que luego pueden ser desarrollados como productos o bien como moléculas modelo

para la síntesis de nuevos fungicidas selectivos (Gullino et al., 2000; Thines et al.,

2004). Este último autor, además menciona su importancia para el ambiente, porque

se asume que los compuestos naturales, siendo parte del ecosistema, pueden ser

biodegradables, compatibles y menos tóxicos.

Enzimas Las enzimas son otro tipo de metabolitos fúngicos que median el antagonismo

ejercido por agentes de biocontrol, lo que significa su uso potencial sobre

poblaciones de fitopatógenos y de insectos plaga. Debido a que, las enzimas

pueden degradar las paredes celulares y otros compuestos estructurales, o bien

actuar frente a algunos eventos relacionados con la patogénesis de organismo.

Fravel (1988) menciona dos investigaciones realizadas en 1982 y 1987, por Marois

y colaboradores y Lewis y Papavizas respectivamente, donde encontraron

compuestos que tenían una acción enzimática en fitopatógenos como Sclerotinia y

R. solani, derivados de Talaromyces flavus, Gliocladium virens y especies de

Trichoderma sp. Cabe resaltar, que la mayoría de enzimas de importancia

19

agroecológica, son las que producen varias especies de este género, como las

chitinasas y B-1,3-glucanasas reportadas por Elad y Kapat (1999) para Trichoderma

harzianum cepa T39.

Además de estas enzimas, De la Cruz y Llobell (1999) y Ait-Lahsen y colaboradores

(2001) indican la producción de B-1,6-glucanasas y proteasas corroborando la

producción de una gran variedad de estos metabolitos que lisan la pared celular, de

micelios y conidios en hongos fitopatógenos, por diferentes aislamientos de

Trichoderma.

Volátiles Como se mencionó anteriormente, T. harzianum es una fuente de antifúngicos con

diferentes modos de acción, como los metabolitos volátiles reportados por Claydon

et al. (1987, citado por Fravel, 1988) identificados como alquilpironas con acción

fungicida y mayoritariamente fungistática sobre patógenos como R. solani.

Otro microorganismo que produce sustancias volátiles protectoras, es Boletus

varigatus (Krupa y Nyland; 1972 por Fravel, 1988) dentro de las que se incluyen

alcoholes como etanol e isobutanol y ácido isobutírico.

Por lo general los principales compuestos volátiles, pertenecen al grupo de los

alcoholes y de los ácidos, como los compuestos reportados para el hongo endofítico

Muscodor albus, denominado “biofumigante” según Mercier y Jiménez en el 2004,

porque este micelio estéril aislado de una árbol de canela (Cinnnamomum

zeylanicum) en Centro América (Strobel et al., 2001) produce 28 compuestos que

inhiben y destruyen varias especies de hongos, oomycetes y bacterias (Mercier y

Jiménez, 2004).

Este tipo de metabolitos principalmente 2-metil-1-butanol y el ácido isobutírico,

pueden ser empleados para controlar algunas de la enfermedades que se presentan

en postcosecha durante el almacenamiento de los frutos, ocasionadas por Botrytis,

Colletotrichum, Geotrichum, Monilinia, Penicillium y Rhizopus, ya que no se requiere

el contacto del hongo con el fruto o el fitopatógenos para ver un efecto inhibitorio,

fungicida o fungistático de los volátiles (Mercier y jiménez, 2004).

20

1.1.2 Metodologías empleadas para la bioprospección de metabolitos con interés en fitoprotección. Para definir el perfil de un metabolito fúngico, es decir su modo de acción y

aplicabilidad, se hace necesario evaluar su actividad biológica en protocolos que

permitan cuantificar la sensibilidad del fitopatógeno respecto de los compuestos

antifúngicos, lo cual se puede lograr mediante ensayos in vitro e in vivo, en los que

se enfrenta el compuesto con el patógeno.

Bioprospección in vitro. Bauer y colaboradores (1966, citado por Hadacek y Greger, 2000) implementaron la

metodología in vitro, para la evaluación de la actividad antagónica de los metabolitos

frente a los hongos filamentosos, mediante protocolos de difusión del producto en

cajas de petri que contienen un medio de cultivo (p.ej. Agar Papa Dextrosa –PDA-,

Extracto de Malta), que queda mezclado con el compuesto en una proporción

definida. Para luego, colocar un disco (5-10 mm de diámetro) con desarrollo del

hongo fitopatógeno en el centro de la caja sobre la superficie del medio y evaluar la

inhibición del crecimiento radial respecto del control (Daoubi et al., 2004; Folman et

al., 2004). Una variación de esta metodología, es disponer una suspensión de

esporas (10-20µl) en el centro de la caja (Hadacek y Greger, 2000), o bien, colocar

la suspensión (0.5-1ml) distribuida sobre la superficie del medio de cultivo, donde se

colocan discos de papel filtro (3-5 mm de diámetro) impregnados con el metabolito,

para medir el halo de inhibición producido (zonas libres de micelio), después del

tiempo de incubación, tomando como parámetros de aceptación los valores dentro

del rango de 10-20 mm (Dardari et al., 2004; Hadacek y Greger, 2000; Santamarina

et al., 2002; Zhang et al., 2001).

Para evaluar estos compuestos difusibles, también se pueden colocar discos con

crecimiento del hongo (7mm) enfrentados con discos (5mm) inoculados con el

metabolito, conservando una distancia entre ellos de 2,0-2,5 cm, dentro de cajas de

petri con medio de cultivo (Chaurasia et al., 2005), para estimar igualmente el

crecimiento radial.

21

Además de estos ensayos de difusión en medio sólido, desde mediados de los 90´s

se desarrollaron protocolos de dilución (microdilución) en medio líquido, en placas

tipo ELISA de 96-pozos, protocolo ampliamente adoptado por autores como

Alemany, 2001; Dardari et al., 2004; Hadacek y Greger, 2000; Hjeljord et al., 2001;

López-García et al., 2002; Meepagala et al., 2003; Pohanka et al., 2004; Salah et al.,

2003; Slawecki et al., 2002; Thines et al., 2004; Wilson et al., 1997; Wedge et al.,

2000 y Zhang et al., 2001, entre otros, para evaluar la susceptibilidad de los

fitopatógenos, a este tipo de compuestos antifúngicos. El formato de placas de

microtitulación es un bioensayo cuantitavo (Roberts y Boyce, 1972 citado por

Hadacek y Greger, 2000) que permite evaluar el modo de acción, al valorar la

inhibición de la adhesión y germinación del conidio, mediante observación directa

por microscopia (Alemany, 2001; Hadacek y Greger, 2000; Hjeljord et al., 2001;

Slawecki et al., 2002), así como la interferencia en el crecimiento del hongo, por

determinación de la absorbancia (Wilson et al., 1997).

Junto con las metodologías mencionadas, existen otros protocolos que buscan

evaluar únicamente una variable, como la inhibición de la germinación, al disponer

en láminas de vidrio un volumen (µl) del compuesto y de la suspensión de esporas

del hongo, como lo realizado por Silva y colaboradores (2002) y por Walker y

colaboradores (2001), para evaluar extractos vegetales de Caryocar brasiliense

Camb. y metabolitos de Pseudomonas antimicrobica frente a Botrytis cinerea,

respectivamente.

Otro efecto in vitro que también puede ser cuantificado, es el carácter volátil de los

metabolitos, una variable que ha sido estimada para extractos vegetales y aceites

esenciales en microplacas, al sellar cada pozo con láminas de cera dental para

prevenir la contaminación cruzada (Wilson et al., 1997). Esta variable también

puede ser evaluada en cajas de petri, creando dos áreas con medio de cultivo al

retirar una tira de agar, del centro de la caja, con el fin de inocular a un lado del plato

un microorganismo productor de volátiles (p. Ej. M. albus) y en el otro lado, 7-10

días después, un disco de agar con el hongo fitopatógeno, para ver el efecto sobre

su crecimiento y desarrollo (Mercier y Jiménez, 2004; Strobel et al., 2001).

22

De todos los ensayos de antagonismo, se puede inferir que la metodología en

microplacas ofrece por una parte, un potencial para una alta eficiencia en el análisis

de 10,000 o más compuestos por semana ya que, se reduce la cantidad de

metabolito y de inóculo necesarias y por otro lado, permite una observación directa

para detectar anomalías morfológicas (Hadacek y Greger, 2000), como inhibición en

la germinación y daño de las hifas, entre otros.

Bioprospección in vivo (in planta). En los ensayos in vivo principalmente se busca ver el desarrollo de los signos y

síntomas del fitopatógeno estimado como incidencia y severidad de la enfermedad,

evaluando también la inhibición de la germinación o del crecimiento del patógeno,

expresado como la supresión de la enfermedad en la planta.

Conduciendo en muchas ocasiones, a que los parámetros evaluados in vitro puedan

ser o no correlacionados con el biocontrol in vivo, en condiciones similares a la

naturales (Fravel, 1988). Por ejemplo, este autor cita un ensayo realizado por

Richard y Bollen (1986), donde se vio la inhibición de un fitopatógeno frente a una

sustancia microbiana, tanto en ensayos in vitro en agar como in planta, sobre trozos

de madera.

Elad y Kapat, 1999; Fravel, 1988; O´Neill et al., 1997 y Mercier y Jiménez, 2004,

entre otros autores, reportan la aplicación de los extractos fúngicos, sobre hojas o

segmentos de éstas, en tallos, en frutos, o en suelo estéril y en combinación o no

del fitopatógeno para observar la supresión del microorganismo o de estructuras de

resistencia como esclerocios (Fravel, 1988), lo que resulta en la disminución de la

enfermedad. De Meyer y colaboradores (1998) indican que al emplear la totalidad

de la planta, también se puede observar la inhibición de los fitopatógenos, porque

dependiendo del sitio de inoculación se pueden inducir respuestas de defensa en el

huésped.

23

1.1.2.1 Metabolismo secundario: Biosíntesis de productos naturales con interés en fitoprotección.

Brakhage y colaboradores (2004), estudiaron algunos mecanismos que regulan la

biosíntesis de penicilina en hongos filamentosos, encontrando que la producción de

este metabolito secundario, no es esencial para la directa supervivencia del

organismo productor, indicando que los genes para la biosíntesis son controlados

por una red compleja de regulación; por el pH del ambiente, la fuente de carbono,

nitrógeno, aminoácidos, entre otros elementos, coincidiendo con Calvo y

colaboradores (2002), en que varios aspectos internos y externos, como factores

ambientales y genéticos pueden influenciar la producción de metabolitos

secundarios. Incluyendo en algunos casos, reacciones muy alejadas del

metabolismo energético (Doran, 1998), ya que muchos de estos compuestos no son

esenciales ni para el crecimiento ni como intermediarios del metabolismo básico del

microorganismo, entendiéndose que probablemente juegan algún otro rol en la vida

de los hongos (Turner 1971; Demain, 1981; Guarro et al., 1999).

Cabe resaltar que toda la producción de metabolitos, está enmarcada dentro del

comportamiento cinético del microorganismo, en este caso de los hongos

filamentosos, los cuales experimentan una tendencia diferente que se caracteriza

por tener una primera fase llamada trofofase o de crecimiento, en la cual se

sintetizan los metabolitos primarios y la idiofase donde se producen los metabolitos

secundarios (Demain, 1981; Poutou, 2002). En la trofofase o fase de crecimiento, se

le proporcionan condiciones apropiadas al hongo filamentoso para que crezca de

manera eficaz y es donde el microorganismo produce metabolitos relacionados con

su crecimiento. Para la fase siguiente, la Idiofase, se producen metabolitos

secundarios, esta producción puede no derivarse del sustrato primario de

crecimiento, sino a partir de un producto que él mismo formó, a partir de esa fuente

primaria (Demain, 1981; Poutou, 2002). Sirviendo el metabolismo primario, en las

vías biosintéticas de antibióticos, como un proveedor de precursores y cofactores

para el metabolismo secundario (Gunnarsson et al., 2004) con la consecuente

producción de antifúngicos.

24

En estudios con biorreactores realizados por Saha y colaboradores, 2004, se ha

demostrado que la producción de este tipo de metabolitos, también depende

fuertemente de la escala de operación, donde existe una relación definitiva entre la

concentración de oxígeno disuelto, pH del medio, empleo de glucosa, diferenciación

celular y producción. Ratificando que todas las condiciones del cultivo y de la

fermentación, soportan e influencian la síntesis de metabolitos secundarios (Higgs et

al., 2001).

La morfología fúngica, en algunas ocasiones, es otro parámetro clave dentro de la

producción industrial, porque puede variar durante el proceso de fermentación, ya

que también está influenciada por aspectos como la velocidad de agitación, la tasa

de crecimiento, el oxígeno disuelto, el número de esporas o conidias por litro de

medio de fermentación, aspectos de importancia que deben ser considerados

cuando se quieren altos rendimientos en el proceso (Pazouki et al., 2000).

Además de los diferentes parámetros y condiciones de fermentación, mencionados

anteriormente, cabe resaltar que al interior de las células es donde se evidencia el

impacto de este tipo de factores, lo que desemboca en la consecución del producto

de interés y en el desarrollo de vías metabólicas para tal fin. Una de las rutas

metabólicas de donde se derivan los metabolitos secundarios, es la vía del

shikimato o ácido shikímico (Demain, 1981), porque según Adachi y colaboradores

(2003), la producción y vía salvaje de shikimato, es favorable para la biosíntesis de

muchos antibióticos, herbicidas y aminoácidos aromáticos, porque en esta vía se

sintetiza el corismato, un precursor común de muchos metabolitos aromáticos, tanto

primarios como secundarios (Herrmann y Weaver, 1999; Stryer, 1995).

25

1.2 IMPORTANCIA DEL TOMATE (Lycopersicon esculentum Mill.). El Tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) es la principal hortaliza a nivel mundial,

se cultiva en cerca de casi 4,0 millones de hectáreas, con más de 100 millones de

toneladas promedio de producción (FAO 2005). Siendo países como China y

Estados Unidos de América, los principales productores con 30 y 12 millones de

toneladas, respectivamente.

En Colombia, según datos emitidos por la FAO (2005), el cultivo de tomate ocupa un

lugar representativo dentro de los productos básicos del país, en cuanto a

producción e importancia alimenticia. La producción promedio es de 382,438

toneladas, durante los últimos seis años (1999-2004), con una superficie cultivada

promedio para el mismo período de 16.200 hectáreas, siendo para él último año

(2004) de 15.000 Ha. En cuanto a rendimiento, los datos suministrados entre 1999-

2003 arrojan un valor medio de 23.502 kg/Ha (2,3 Ton/Ha). Variables que presentan

crecimientos para los últimos dos años. Pero, cuyos resultados son sustancialmente

inferiores, comparados con países como Brasil y Chile, primer y segundo productor

suramericano, que presentan datos de producción de 3,4 y 1,3 millones de

toneladas, frente a las 370,000 toneladas nacionales, lo que significa una diferencia

de 3 millones (Ton), respecto de Brasil y de 930,000 toneladas menos frente a Chile.

Estos datos son un reflejo de la brecha tecnológica existente, que traduce en una

menor productividad. Porque, aunque existe una baja diferencia de área cultivada p.

Ej., entre Colombia y Chile, con 15,000 y 20,000 Ha, este último país, triplica la

producción deduciéndose que realiza un mejor aprovechamiento de los recursos

junto con la introducción de programas de cultivo sostenible.

Cabe resaltar que el cultivo de esta hortaliza presenta una gran variedad de

enfermedades, que minan su producción, de las cuales Colombia no es una

excepción.

1.2.1 Principales Patologías del Tomate. Algunos de los principales problemas fitosanitarios que enfrenta el cultivo de tomate

son causados por; insectos como mosca blanca, minadores de hoja, Spodoptera sp;

26

nemátodos; virus, como el mosaico del tomate; bacteriosis, Pseudomonas syringae,

y hongos filamentosos, dentro de los que se consideran, al moho gris (Botrytis

cinerea), mildeo polvoso y velloso, moho blanco (S. sclerotiorum), Alternaria sp.,

Fusarium oxysporum f sp.lycopersici y Verticillium dahliae (Infoagro, 2004), como los

más representativos, por su incidencia sobre todas las partes de la planta lo cual,

conduce a la reducción en el rendimiento porque se limita el desarrollo de la planta,

entre otros efectos. Estas enfermedades, concuerdan con lo reportado Bareño

(citado por Moreno, 2003) quien relaciona la presencia en el país, de algunos de

estos problemas fitosanitarios del ambiente foliar, tanto en época seca como

húmeda. Para el primer período algunos son causados por la mosca blanca, el

pasador de fruto, el gusano cogollero y Oidium sp., y en tiempo húmedo son

Phytophthora infestans, Alternaria solani, Fulvia fulva, bacteriosis, mildeo velloso y

Botrytis cinerea los factores restrictivos.

Por estas y otras patologías microbianas que afectan al tomate, se ha creado la

necesidad de buscar e implementar nuevas alternativas de control que aumenten la

productividad del cultivo, además de minimizar el uso indiscriminado de productos

químicos (Infoagro, 2004) a los que se expone esta hortaliza, surgiendo nuevas

estrategias que pueden ser implementadas dentro de un Manejo Integrado de las

Plagas (MIP) que afectan al tomate. Diseñadas también, en respuesta a la

resistencia que adquieren algunos de los patógenos. El Laboratorio de Control

Biológico, de Corpoica C.I, Tibaitatá, ha encaminado algunos de sus proyectos de

investigación, en la búsqueda de alternativas de manejo, en pre y postcosecha del

tomate, derivadas de fuentes microbianas que disminuyan algunos problemas de

importancia hortícola, como los ocasionados por Botrytis cinerea un fitopatógeno

frecuente del ambiente de invernadero.

1.3. MOHO GRIS: Botrytis cinerea. 1.3.1 Generalidades del Agente Etiológico del Moho Gris. Botrytis cinerea es un hongo polífago que causa serios daños y pérdidas en un

amplio rango de cultivos (Meyer et al., 2001) en todo el mundo (Agrios, 1988),

27

atacando prácticamente plantas de todas las especies hortícolas, frutícolas y

florícolas (Kerssies, 1993; De la Isla, 1994; Malolepsza, 2004), durante la

producción y el almacenamiento (Malolepsza, 2004) en la pre- y poscosecha

(Morandi et al., 2000, 2001).

El moho gris causado por Botrytis cinerea es probablemente una de las

enfermedades de vegetales, ornamentales, frutales y cultivos de campo, más

comunes y ampliamente distribuidas a lo largo del mundo (Ben-Shalom et al., 2003;

Barka et al. 2002; Elad, 1996), generando un impacto negativo con repercusiones

económicas, tanto por su distribución como por la capacidad de infectar las hojas,

los tallos, las flores y los frutos (O´Neill et al., 1997). Ocasionando la enfermedad

conocida como Moho o podredumbre gris, que durante epidemias severas puede

destruir la totalidad del follaje (Elad et al., 1999), porque el patógeno ocasiona una

propagación de lesiones necróticas en hojas (Morandi et al., 2001).

B. cinerea se disemina por el aire, se comporta como saprófito mientras encuentra

las condiciones favorables para infectar el hospedero y convertirse en patógeno

(Avila, 1993). Esta habilidad de desarrollarse como saprófito es esencial pues le

permite incrementar su inóculo sin recursos de sostenimiento derivados de la

patogénesis de las células del huésped (Blakeman, 1993 citado por Moreno, 2003).

1.3.2 Características Microscópicas y Macroscópicas de Botrytis cinerea. Botrytis cinerea Pers ex Fr, es el hongo más importante de las especies de Botrytis

(Daoubi et al., 2004), siendo un hongo Deuteromycete (Hyphomycete) (Tabla1), es

el estado imperfecto de Botryotinia fuckeliana (su teleomorfo) (De Meyer et al.,

1998) (Ellis y Waller, 1974 citado por Kerssies, 1993).

Microscópicamente B. cinerea, presenta los extremos de las hifas ramificados, al

comienzo de su formación se ven hialinas, con el tiempo se tornan pardas o negras

(Piñeros et al., 1998). La célula terminal de cada ramificación tiene forma de ampolla

a partir de la cual se forma en un dentículo una conidia hialina, esférica o elipsoide y

ligeramente pigmentada. Poseen doble membrana (Jarvis, 1981; citado por Millán,

28

1996) y su tamaño es aproximadamente de 10 x 8.5 µm (Pezet y Pont, 1990; citado

por Tenberg, 2004).

Tabla1. Taxonomía de Botrytis cinerea

Botrytis cinerea División Mycota

Clase Hiphomycetos

Orden Moniliales

Familia Botrytidiaceae

Género Botrytis

Especie Botrytis cinerea

En cuanto al desarrollo macroscópico, el hongo presenta colonias de crecimiento

moderado de color blanco o gris dependiendo del medio empleado, éstas pueden

ser de tipo micelial o esclerocial. Las colonias de tipo micelial son de crecimiento

rápido, abundantes, algodonosas y de color pardo, mientras que las de tipo

esclerocial son de crecimiento lento, de micelio escaso, inicialmente de color blanco

y a medida que van envejeciendo se tornan gris pardo con abundantes esclerocios

de color negro distribuidos irregularmente en el medio (Avila, 1993; Millán, 1996).

1.3.3 Epidemiología y Ciclo de Vida del Fitopatógeno B. cinerea. Diseminación del Patógeno. El agente causal del Moho gris, puede esporular profusamente en tejidos necróticos

como hojas senescentes y partes de la flor, en el cultivo de invernadero. Los

conidios producidos en estos son el mayor inóculo para otros brotes, debido a que

se distribuyen por el aire dentro del ambiente de invernadero (Elad et al., 2004). La

temperatura óptima de infección se encuentra entre 10 y 20°C, pero la infección

puede ocurrir incluso por debajo de los 2°C y por arriba de los 25°C (Elad, 1996;

Elad et al., 1999).

29

Botrytis cinerea puede entrar en hojas senescentes como saprofito (Blakeman, 1980

citado por Kerssies, 1993) y puede producir un gran número de conidios en hojas

colonizadas (Jarvis, 1980 citado por Kerssies, 1993), las cuales son dispersadas por

corrientes de aire, gotas de agua o insectos.

Conidias, ascosporas, fragmentos de micelio y esclerocios son importantes para la

dispersión (Jarvis, 1980 citado por Kerssies, 1993), aunque solamente las conidias,

promotores de infección o primera fuente de inóculo (Doss, 1999), pueden propagar

la enfermedad en invernaderos.

La liberación de conidias ocurre principalmente por cambios rápidos de humedad

relativa (Winspear et al., 1970; Jarvis, 1980; Van Holsteijn, 1985 citado por Kerssies,

1993), debido a que el fitopatógeno necesita alta humedad relativa (Diánez et al.,

2002) para germinar, colonizar y esporular en los tejidos de las hojas muertas

(Blakeman, 1980 citado por Kerssies, 1993) y de las sanas.

Ciclo de Infección de Botrytis cinerea. La infección tiene lugar a través de heridas, de tejido muerto o en decaimiento y por

penetración directa (Kerssies, 1993; Agrios, 1988; Elad et al., 2004).

Mientras que comienza la penetración B. cinerea, por ser un necrótrofo, requiere

nutrientes exógenos en muchas circunstancias durante la germinación de sus

esporas y durante el crecimiento del micelio en la superficie de la planta, antes de la

infección (Elad, 1996; Elad et al., 1999) y colonización del tejido.

Los hongos patógenos han elaborado estrategias para tener acceso a los tejidos de

la planta (Dean, 1997), donde los eventos iniciales comprenden la adhesión del

conidio a la cutícula, la germinación y el crecimiento del tubo germinal sobre la

superficie de la planta, seguido del desarrollo y maduración del apresorio para la

penetración y posterior crecimiento y esporulación del fitopatógeno en el huésped

(Mendgen et al., 1996; Thines et al., 2004). Para la entrada de B. cinerea, parásito

facultativo de plantas, al hospedero, ocurre una interacción de los conidios con la

superficie de la planta, conocida como adhesión de los conidios y tubos germinales,

que ocurre en dos etapas diferentes. La primera etapa ocurre inmediatamente

después de la hidratación de la conidia y está caracterizada por fuerzas adhesivas

30

débiles que incluyen interacciones hidrofóbicas. La segunda etapa, retrasa la

adhesión, ocurre después que la conidia viable ha sido incubada por varias horas

bajo condiciones que promueven la germinación. En este tiempo o estado, los tubos

germinados se unen fuertemente tanto a sustratos hidrofóbicos e hidrofílicos (Doss

et al., 1995), a través de la secreción de una matriz extracelular (Doss et al., 1993;

1995 citado por Doss 1999).

En el ciclo de infección de B. cinerea, durante la etapa de introducción al huésped,

la hifa de penetración, acumula componentes del citoesqueleto en la punta de la

misma y secreta una variedad de enzimas degradadoras de modo muy regulado

para penetrar la cutícula de la pared celular de la planta (Mendgen et al., 1996).

Las principales enzimas que segrega B. cinerea, encargadas de la ruptura de las

barreras físicas, son: exo- y endo poligalacturonidasas (PG), pectin metil esterasa

(PME), pectin liasa (PL), quitinasa, β-1.3-glucanasa, cutinasa y celulasa (Doss,

1999; Elad y Kapat, 1999; Elad, 2000; Elad et al., 2004).

Además, de las enzimas reportadas, Doss (1999) ha realizado estudios que revelan

que B. cinerea, produce una matriz extracelular (ECM por sus siglas en inglés),

implicada en la adhesión de la conidia germinada, a la superficie de la planta.

Kamoen (1992, citado por Doss, 1999), ha sugerido posibles funciones de esta

matriz extracelular entre las que se cuentan, el tropismo por el sitio de infección,

evitar la desecación de los conidios germinados y proporcionar una matriz donde las

toxinas o enzimas fúngicas requeridas para el proceso de infección puedan estar

resguardadas.

Una vez que la espora ha germinado, sigue un período de crecimiento durante el

cual el tubo germinal se extiende sobre la superficie de la hoja, buscando un sitio

favorable para penetrar, proceso que está precedido por modificaciones de las hifas

(Dickinson et al., 1987). En el sitio apropiado, la elongación polar del tubo

germinativo cesa y la punta de la hifa se une a la superficie, hinchándose para

formar un apresorio, estructura única de infección organizada (Dickinson et al.,

1987; Dean, 1997).

El apresorio puede tener paredes melanizadas y desarrollar una alta presión de

turgencia para soportar el proceso de penetración (Mendgen et al., 1996), además

31

de aumentar el área de contacto y de fijación entre el hongo y la superficie del

hospedero (Dickinson et al., 1987) de tal modo que, la hifa infectiva tenga fuerza

para penetrar (De la Isla, 1994) a través, de las capas de cera, cutina, pectina y una

red de fibrillas de celulosa impregnadas de otros polímeros de pared, antes de

entrar en contacto con el protoplasma de la planta (Avila de Leal, 1993).

Después de la formación y maduración del apresorio, ocurre la penetración en el

tejido del huésped, se inicia la colonización y crecimiento in planta (Thines et al.,

2004), donde las células infectadas colapsan y se desintegran (Agrios, 1988).

Con esta pudrición y daño del tejido, la epidermis se agrieta y el hongo fructifica

abundantemente (Agrios, 1988), los conidióforos emergen sobre la superficie de la

planta y se observa esporulación (Thines et al., 2004).

Los tejidos pueden volverse arrugados y secos, apareciendo en algunos casos

esclerocios sobre la superficie o hundidos dentro del mismo (Agrios, 1988).

En este desarrollo del patógeno, se destruyen las células del hospedero tan

rápidamente que no pueda desencadenarse respuesta eficaz, lo que ocurre con los

patógenos necrotróficos (Dickinson et al., 1987).

1.4 CONTROL DEL MOHO GRIS (Botrytis cinerea).

1.4.1 Control Químico.

Tradicionalmente, el control de B. cinerea se ha realizado a través de aspersiones

químicas, con varias familias de fungicidas químicos, que han sido parcialmente

exitosas. Se estima que el mercado de productos anti-Botyrtis en los último años, se

encuentra alrededor de los US$ 15-25 millones (Elad et al., 2004). Pero, existe el

riesgo de la aparición y el establecimiento de cepas resistentes de Botrytis sp. a

esos químicos (Barka et al., 2002; Leroux, 2004; Rosslenbroich y Stuebler, 2000).

Los grupos químicos más utilizados, para el control de B. cinerea, tradicionalmente

han sido dicarboximidas, benzimidazoles y Diethofencarb (Rosslenbroich y Stuebler,

2000). Sin embargo, las estrategias para controlar el hongo con fungicidas clásicos

32

o comúnmente usados, puede producir efectos secundarios, como una notable

contaminación ambiental y el desarrollo de cepas del hongo multi-resistentes

(Daoubi et al., 2004; Leroux, 2004), siendo poco efectivos (Malolepsza, 2004).

Sólo el recurso de fungicidas químicos antes de la fase logarítmica de la epidemia

ha ofrecido un control satisfactorio de la enfermedad. Pero como resultado, las

cepas que son resistentes a varios fungicidas sistémicos se han desarrollado

rápidamente (Elad et al., 1999).

Desde la mitad de la década de los 90´s, nuevos compuestos con excelente

actividad frente a B. cinerea han sido comercializados (Daoubi et al., 2004),

productos botryticidas de tres diferentes grupos químicos y con diferentes modos de

acción a los usados habitualmente, tales como las Anilinopirimidinas, Fenilpirroles e

Hidroxianilidas (Rosslenbroich y Stuebler, 2000).

Las anilopirimidinas están representadas por tres compuestos principalmente;

pirimetanil, mepanipirim y ciprodinil, los cuales inhiben la elongación del tubo

germinal y el crecimiento inicial del micelio in vivo, así como la excreción de

hidrolasas asociadas a la patogénesis del hongo (Rosslenbroich y Stuebler, 2000).

El fludioxonil pertenece a la clase química de los fenilpirroles, derivados del

antibiótico pirrolnitrina, producido por varias especies de Pseudomonas (Gullino et

al., 2000), el fludioxonil inhibe la germinación, elongación y crecimiento del micelio

(Rosslenbroich y Stuebler, 2000) se ha observado resistencia cruzada hacia estas

dos clases químicas (Gullino et al., 2000). Por último, las Hidroxianilidas

(fenhexamida), a altas concentraciones inhiben la germinación porque interfiere con

dos sitios en la biosíntesis de ergosterol (Rosslenbroich y Stuebler, 2000).

Varios de botrycidas se encuentran disponibles en el mercado y se han clasificado

de acuerdo a su modo de acción en cinco categorías conocidas; 1) fungicidas que

afectan la respiración del hongo, 2) tóxicos anti-microtúbulos, 3) compuestos que

afectan la osmorregulación, 4) fungicidas cuya toxicidad es revertida por

aminoácidos, y 5) los inhibidores de la biosíntesis de esterol (Leroux, 2004).

33

1.4.2 Metabolitos fúngicos reportados para el control de B. cinerea.

Algunos de los metabolitos reportados para el control de Botrytis, se han derivado

de procesos de bioprospección de hongos filamentosos (Gullino et al., 2000; Thines

et al., 2004). Encontrándose algunos compuestos que pueden inhibir la germinación

de conidios, como las Tricozianinas A1 y B1 y la gliotoxina de especies de

Trichoderma (Di Pietro et al., 1993; Schirmböck et al., 1994 citados por Elad, 1996),

las eniatinas derivadas de Fusarium (Pohanka et al., 2004) y lipopéptidos como la

cryptocandina, aislada del hongo endofítico Cryptosporiopsis cf. quercina (Strobel et

al., 1999), entre otros metabolitos descubiertos.

También se han utilizado enzimas que interfieren con el desarrollo del patógeno

porque degradan componentes estructurales de la pared celular del hongo, como

las quitinasas, exo- y endoglucanasas y proteasas principalmente producidas por T.

harzianum (Ait-Lahsen et al., 2001; Elad y Kapat, 1999). Además de lisar polímeros

estructurales, Elad en el 2000, encontró una cisteín-proteasa derivada de T.

harzianum, que interfiere con el proceso de patogenicidad, ya que inhibe las exo- y

endopoligalacturonasas producidas por B. cinerea.

1.4.3 Características de los metabolitos fúngicos utilizados para fitoprotección. Un cada vez más riguroso requerimiento para los nuevos fungicidas es su

biodegradabilidad en situaciones naturales. Un segundo parámetro importante es la

selectividad del modo de acción. Idealmente, un fungicida debe prevenir o curar

infecciones causadas por hongos patógenos de plantas sin herir especies neutrales

o benignas, como hongos saprofíticos del suelo o microrrizas asociadas, y por

supuesto sin toxicidad frente a otros organismos (Thines et al., 2004). Estos efectos

diferentes del blanco, pueden ser reducidos por bioprospección o screening de

fungicidas que no inhiban el crecimiento hifal vegetativo pero que si interfieran

específicamente con eventos implicados en el desarrollo de la patogénesis, como

germinación de esporas, formación de estructuras de penetración o esporulación

(Thines et al., 2004).

34

Por tanto, si se aplican metabolitos que interfieran con las etapas de patogénesis,

en el ciclo de infección, antes del establecimiento y colonización de patógeno en el

interior del huésped, es menos probable que los hongos desarrollen resistencia

frente a estas sustancias, porque dichos compuestos controlan el hongo al inicio de

su ciclo de vida sin interferir con el crecimiento vegetativo, lo que sería una posible

ventaja de este tipo de compuestos anti-penetrantes. Una desventaja sería que

estos compuestos pueden ser solamente protectivos y no curativos, porque las

sustancias atacan las etapas o blancos de pre- y penetración (Thines et al., 2004).

Sea cual sea el tipo de metabolito fúngico elegido para su aplicación en

fitoprotección, se deben tener en cuenta, además de los parámetros mencionados

anteriormente, algunos factores cada vez más importantes en la selección y

desarrollo de fungicidas lo cuales son, baja toxicidad para humanos como para la

flora y fauna, mínimo impacto medioambiental, bajos residuos en alimentos y

compatibilidad con los programas de manejo integrado de plagas (MIP) (Knight et

al., 1997). Lo que haría del uso de microorganismos o en especial de sus

excreciones una alternativa atractiva sola o como un suplemento de los plaguicidas

para prevenir y manejar fitopatologías, sin el impacto negativo del control químico,

facilitando una agricultura sostenible (Wang et al., 1999).

35

2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 2.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA. En el sector agropecuario, el rendimiento y la productividad de un cultivo se ven

influenciados por muchos factores, entre ellos el correcto manejo de los hongos

fitopatógenos que lo afectan. Dentro de este grupo se encuentra el hongo Botrytis

cinerea, un patógeno de alto impacto, no solo por la enfermedad que desencadena

en una amplia gama de cultivos durante la pre- y postcosecha, sino porque la

mayoría de las veces, el moho gris (B. cinerea) ha sido controlado con productos

químicos, ocasionando además del deterioro ambiental, problemas de salud para

quienes aplican y consumen los productos tratados con ellos, junto con el desarrollo

de resistencia en el fitopatógeno, resultando en una pérdida de la rentabilidad de los

cultivos.

Esta situación plantea la necesidad de buscar otro tipo de estrategias de control del

moho gris, mediante programas de fitoprotección, en los que se empleen

metabolitos microbianos como una alternativa natural, derivada del amplio

reservorio de compuestos bioactivos producidos por los hongos filamentosos

nativos, que pueda ser aplicada de manera preventiva, conduciendo a un manejo

integrado del fitopatógeno Botrytis cinerea; esta alternativa es ambientalmente

amigable y puede generar mayores dividendos económicos para los agricultores.

2.2 JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN.

La biodiversidad encontrada dentro de la microbiota fúngica, ha resultado en el

descubrimiento de un gran número de productos bioactivos con aplicación en

diferentes campos. Para la fitoprotección de cultivos agrícolas, se han encontrado

metabolitos con potencial biocontrolador, que pueden inhibir el crecimiento o

36

interferir con eventos relacionados con la patogénesis de fitopatógenos como

Botrytis cinerea, contribuyendo así con la disminución de la resistencia a los

fungicidas químicos empleados comúnmente y minimizando los efectos negativos

de ambos factores (patógeno y productos químicos), sobre las cosechas.

Estos beneficios potenciales pueden ser descubiertos mediante procesos de

bioprospección de hongos filamentosos y de los metabolitos producidos por estos, al

explorar el amplio reservorio de microorganismos de diferentes zonas Colombianas,

planteándose el reto de estudiar los productos naturales derivados, para seleccionar

aquellos que sirven de base para el desarrollo de nuevos fungicidas, requeridos en

el campo agroindustrial.

En trabajos previos a nivel internacional se ha demostrado que las aplicaciones de

productos bioactivos que pueden ejercer un control de fitopatógenos, presentan

mecanismos de acción potencialmente selectivos, haciendo elegible su uso por su

especificidad contra patógenos de alto riesgo, como Botrytis cinerea, el agente

causal del moho gris en diferentes cultivos de importancia económica durante la

producción y el almacenamiento.

Todo lo anterior significa un avance dentro de la necesidad de implementar nuevas

estrategias de control de este patógeno a nivel nacional, ya que ha generado

grandes pérdidas debido a su fácil dispersión y rápida acción, además de la

resistencia que ha adquirido frente a varios productos actualmente disponibles. Por

tanto, el Laboratorio de Control Biológico de Corpoica ha iniciado investigaciones

enfocadas en el desarrollo de procesos de screening y producción de metabolitos

secundarios para ser incorporados en programas de manejo integrado de

fitopatologías de importancia económica

37

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL.

• Seleccionar extractos fúngicos extracelulares (EFE), por su potencial efecto

en el control de Botrytis cinerea.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.

• Estandarizar una técnica sencilla y eficiente para la evaluación preliminar de

extractos fúngicos extracelulares (EFE) con actividad sobre la germinación

del hongo Botrytis cinerea.

• Seleccionar extractos fúngicos extracelulares (EFE) por su habilidad para

inhibir la germinación de Botrytis cinerea in vitro.

• Evaluar in planta los extractos fúngicos seleccionados, por su efecto de

control directo de Botrytis cinerea.

38

4. MATERIALES Y MÉTODOS.

Para el desarrollo de los objetivos propuestos, el trabajo se llevó a cabo en las

instalaciones del Laboratorio de Control Biológico del Programa de Manejo

Integrado de Plagas, ubicado en el Centro de Investigaciones Tibaitatá de Corpoica

(Mosquera, Cundinamarca).

4.1 PRODUCCIÓN DE LOS EXTRACTOS FÚNGICOS EXTRACELULARES (EFE). 4.1.1 MICROORGANISMOS Y MEDIOS DE CULTIVO. Cepas nativas de hongos filamentosos.

Los microorganismos cuyos extractos se evaluaron en este trabajo corresponden a

cepas de hongos filamentosos, que fueron originalmente aisladas de muestras de

suelo de tres zonas ambientales homogéneas del noroccidente de Leticia,

Amazonas por Cabrera (2000). Dado que estas cepas se encontraban conservadas

tanto en tubos de agar Czapeck-Dox (CD) inclinado como en viales con aceite,

fueron reactivadas. A las primeras se les adicionó medio Saboureaud líquido

acidificado (pH 4.5) y se llevaron a incubación a 26°C +/- 2°C, en oscuridad y sin

agitación hasta observar crecimiento en el tubo. Posteriormente se sembraron en

agar Saboureaud (pH 4.5) y se llevó a incubación bajo las mismas condiciones.

Los hongos conservados en aceite, fueron inoculados en agar Saboureaud

acidificado (pH 4.5), después de descartar el aceite de los viales. Estas cajas se

llevaron a incubación con una temperatura de 26°C +/ 2°C, durante 5-7 días en

oscuridad, hasta observar el desarrollo de la colonia.

Colección de trabajo de los Hongos.

Después de reactivar las cepas y de verificar su viabilidad y pureza las cepas fueron

conservadas en tubos con agar inclinado y mediante crioconservación a -70°C.

39

Para las primeras, se prepararon tubos con agar inclinado Saboureaud acidificado

(pH 4.5) (dos por cepa) que se inocularon por estría, después del período de

incubación (25°C, por 5-7 días en oscuridad) se conservaron en refrigeración.

Para la crioconservación de los hongos, se siguieron los procedimientos operativos

estándar definidos por el Banco de germoplasma de microorganismos con interés

en control biológico que maneja Corpoica, para lo cual en tubos eppendorff se

adicionaron de 4 a 5 cuadros de agar (0.5 - 0.6 cm2 aproximadamente) previamente

crecidos con el microorganismo, luego se adicionó una solución criopreservante (1

ml) de glicerol al 10% p/v y peptona 0.1% p/v. Los tubos, 8 para cada cepa, se

rotularon y se colocaron en un ultracongelador a -70°C.

Obtención de los Extractos Microbianos.

Para cada uno de los hongos reactivados, se tomó un vial de la colección de trabajo

crioconservada previamente y se descongeló hasta alcanzar 37°C (procedimiento

operativo estándar; Banco de germoplasma de microorganismos con interés en

control biológico, Corpoica). Posteriormente, se tomó un cuadro de agar y se colocó

sobre la superficie de una caja con agar Saboureaud acidificado (pH 4.5). Las cajas

con cada una de las cepas se llevaron a incubación a una temperatura de 26°C +/-

2°C durante 8 días en oscuridad.

Una vez se verificó el desarrollo óptimo de los hongos filamentosos, se preparó el

inóculo para cada microorganismo en Tween 80 al 0.1% removiendo con ayuda de

un asa el hongo crecido en la caja de Petri. La concentración de conidios se

determinó mediante recuento en un hemocitómetro, con el fin de ajustar el inóculo a

una concentración de 1 x 106 propágulos/ ml (Elad y Kapat, 1999).

Para aquellas cepas que presentaron micelio estéril o que no exhibieron producción

de propágulos durante el período de incubación (8 días), se utilizaron discos de agar

(6 mm diámetro) previamente colonizados con el microorganismo.

Producción de los Extractos.

Los extractos fúngicos extracelulares (EFE) fueron producidos en dos medios de

cultivo líquido, Czapeck-Dox (CD) y YMG ajustados a pH 7.0 (Anexo 1) (Thines,

2005 comunicación personal) adicionados con Tween 80 al 0.1% y dispuestos en

Erlenmeyers de 125 ml con un volumen efectivo de trabajo (VET) de 25 ml, en los

40

que se adicionó un inóculo al 10% v/v, de las suspensiones (1 x 106 propágulos/ ml)

o 5 discos de agar de 6 mm de diámetro. Los Erlemeyers se llevaron a incubación a

una temperatura de 26°C +/- 2°C durante 7 días, en un agitador orbital a 160 r.p.m.

(Kaida et al., 2001).

El contenido de cada uno de los Erlenmeyers de la etapa anterior, se hizo pasar a

través de una muselina estéril, con el objetivo de retener la fracción celular obtenida

durante el tiempo de fermentación y así, recolectar la solución acuosa donde se

encuentran los productos extracelulares del metabolismo, además de remanentes

del medio de cultivo y células libres. La centrifugación de este filtrado se realizó a

10,000 r.p.m. durante 15 minutos a 8 °C, empleando una centrífuga Sorvall® Biofuge

stratos (serie No. 40340227, año de manufactura: 2003). Los extractos crudos

resultantes, se dispusieron en tubos eppendorff de 1,5 - 2 ml, debidamente

codificados como EFE (extracto fúngico extracelular), que se conservaron en un

ultracongelador a -70°C, para ser utilizados posteriormente en los ensayos in vitro e

in planta.

4.2 ENSAYOS in vitro. 4.2.1 Suspensión de conidios de Botrytis cinerea Para este ensayo la suspensión del hongo se preparó a partir de un subcultivo

proveniente de viales conservados de Botrytis cinerea cepa Bo004, realizado en

cajas de Petri con agar PDA (Anexo 1) incubadas a 26°C +/- 2°C en oscuridad

durante 10-14 días, con períodos de exposición a luz blanca para inducir

esporulación.

Después del tiempo de incubación, se hizo una suspensión del hongo en una

solución de agua estéril con Tween 80 0.1%, para ser aplicada (25 µl) sobre

segmentos de tallos de tomate, de diferentes edades, de 4 cm de longitud,

dispuestos sobre un cubo de icopor en condiciones de cámara húmeda (Moreno

2003), para reactivar la cepa. Luego de la infección y la esporulación en los tallos,

se hicieron pases del hongo, a cajas de Petri con PDA y se incubaron durante 10

días a 26°C +/- 2°C en oscuridad.

41

La suspensión de conidios de B. cinerea reactivado para este ensayo se preparó,

adicionando 20 ml de una solución de agua estéril y Extracto de Malta al 0.1% sobre

el hongo crecido en caja de Petri, empleando un asa se removió el hongo, y se filtró

a través de una tela de muselina estéril, para obtener los conidios. La suspensión se

ajustó a una concentración de 5x105 conidios/ml, por adición de Extracto de Malta al

0.1%.

De esta suspensión de B. cinerea se inocularon 100 µl en microplacas de 96 pozos

(Corning®, Corning Glass Works) con 100 µl de los extractos fúngicos extracelulares

(EFE) producidos en cada medio de cultivo (4.1.1), siguiendo el protocolo reportado

por varios autores que han trabajado con Botrytis cinerea o con otros hongos

filamentosos dispuestos para su evaluación en placas de microtitulación (Hadacek y

Greger, 2000; López-García et al., 2002; Slawecki et al., 2002; Thines et al., 2004,

Wilson et al., 1997).

4.2.2 Lectura de las Placas.

Los tratamientos incluidos correspondieron a los diferentes extractos fúngicos

extracelulares (EFE) en combinación con 5 x 105 conidios/ml de B. cinerea y los

siguientes controles: (a) suspensión de 5 x 105 conidios del patógeno en extracto

de malta 0.1% sin el extracto (control negativo), (b) extractos EFE más la solución

blanco sin la suspensión de B. cinerea y (c) solución blanco (extracto de malta al

0.1%), con cuatro repeticiones por tratamiento.

Las placas de microtitulación se llevaron a un agitador orbital para su incubación a

26°C +/- 1°C con agitación de 100 r.p.m, en oscuridad, durante 16 horas.

Para la lectura de absorbancia previamente se probaron cuatro diferentes longitudes

de onda (405 nm, 450nm, 492nm, 620 nm) en el lector de placas de ELISA ASYS®

Hitech Expert 96, con el fin de seleccionar aquella longitud que presentara mayor

sensibilidad, después de obtener el delta de diferencias de los datos de densidad

óptica. En este ensayo se empleó una suspensión de conidios de Botrytis cinerea

preparada como se mencionó anteriormente en el numeral 4.2.1.

42

4.2.2.1 Curva de Calibración para Botrytis cinerea. Con el fin de correlacionar las dos metodologías seleccionadas para la evaluación in

vitro (absorbancia y germinación), en primera instancia se realizó una curva de

calibración, que sirvió para relacionar la germinación de los conidios del patógeno

con valores de absorbancia a la longitud de onda seleccionada anteriormente (405

nm). Por tanto, se prepararon varias concentraciones de B. cinerea dentro del rango

de 1x105 hasta 1x106 conidios/ml, mediante diluciones con una solución de extracto

de malta al 0.1% hasta llegar a un volumen final de 200µl en cada pozo una placa

de microtitulación (Corning®, Corning Glass Works), con cuatro repeticiones para

cada una de las concentraciones. Como blanco, se empleó la solución de extracto

de malta al 0.1%. Posteriormente, las placas se llevaron a un lector de placas de

ELISA ASYS® Hitech Expert 96 para evaluar la densidad óptica en el tiempo cero

con una longitud de onda establecida.

4.2.2.2 Actividad Antifúngica de los Extractos (EFE).

De cada uno de los extractos fúngicos extracelulares (EFE) producidos (dos por

cepa) se evaluó una concentración de 50% v/v (Slawecki et al., 2002). La cual se

preparó en combinación con la suspensión de conidios de B. cinerea ajustada en

una solución de extracto de malta al 0.1%. Para disponer por cada pozo dentro de la

placa de 96 pozos (Corning®, Corning Glass Works) un volumen final de extracto y

conidios de 200 µl con cuatro repeticiones por extracto. Al tiempo cero se realizó la

lectura de densidad óptica (λ=405nm) en el lector de ELISA ASYS® Hitech Expert

96. Después de 16 horas en incubación y agitación de las microplacas, se realizaron

tanto las lecturas de absorbancia en el lector de ELISA ASYS® Hitech Expert 96

como las observaciones directas en microscopio con un objetivo de 40X para

cuantificar la inhibición de la germinación de conidios del hongo B. cinerea.

La metodología fue la siguiente; se seleccionó aleatoriamente un pozo por

tratamiento y se dispensó dentro del pozo 10 µl de azul de lactofenol, para aumentar

el contraste visual de las estructuras del hongo. Se tomaron 20 µl que se colocaron

sobre una lámina portaobjetos para capturar las imágenes de la germinación con

43

una cámara digital. Posteriormente, se eligieron campos al azar con mínimo 10

conidios por campo y se estimó a las 16 horas de incubación, el porcentaje de

germinación (sumando el No. de conidios germinados y dividiendo entre el No. total

de conidios germinados y no germinados), al promediar cada uno de los campos

seleccionados por tratamiento.

Para calcular el porcentaje de inhibición de la germinación de B. cinerea en cada

uno de los tratamientos (EFE) se empleó la fórmula:

% Inhibición (I) = (100 - %GEFE) – (100 - % GBo)

donde:

%GEFE = porcentaje de germinación de B. cinerea en presencia del EFE.

% GBo = porcentaje de germinación de B. cinerea en ausencia del EFE (Díaz,

2006).

4.2.3 Análisis Estadístico. Los extractos fúngicos extracelulares (EFE) dependiendo de los medios líquidos de

producción (Czapeck-Dox y YMG) de donde provenían, se agruparon de acuerdo al

porcentaje de inhibición (I) de la germinación, constituyendo 3 grupos de inhibición

(1: baja; 2: media; 3: alta) mediante el análisis de agrupamiento con el método de

vínculos unitarios nearest neighbor y la distancia métrica del cuadrado euclidiano

squared euclidean del programa STATGRAPHICS versión 4.2. Se seleccionó de

cada bloque de medio de producción, los extractos del grupo de inhibición alta que

fueron probados en los ensayos in planta.

Para la correlación de las dos metodologías, porcentaje de germinación de

B. cinerea y densidad óptica (λ=405nm), empleadas en la técnica in vitro, en

primera instancia se calculó el delta (∆) de densidad óptica a las hora 16 en cada

tratamiento EFE después de promediar las repeticiones (4) y corregir con los valores

de densidad óptica de los controles extracto EFE más solución blanco y suspensión

de B. cinerea en extracto de malta 0.1%, en el tiempo cero. Para comparar el

44

porcentaje de germinación de B. cinerea y delta de densidad óptica se retiraron los

extractos con DO superiores a 0.9 a la hora 0 y coeficientes de variación superiores

al 10% de la DO de la hora 0 respecto de la hora 16 para los controles de los

extractos sin el inóculo del patógeno. Se aplicó un modelo de calibración usando el

programa STATGRAPHICS 4.2.

4.3 ENSAYOS in planta. 4.3.1 Selección del Bioensayo.

Se seleccionó un bioensayo entre dos modos de aplicación por aspersión o

puntual, en dos modelos; segmentos de tallos y foliolos de tomate.

El material vegetal fue obtenido de un cultivo de tomate (Lycopersicon esculentum

Mill.) tipo milano híbrido Rocío®, ubicado en el C.I. Tibaitatá, se colectaron brotes

secundarios con longitud mayor a 20 cm. De estos tallos se eliminaron 10 cm del

ápice y el resto se cortó en secciones de 4 cm de longitud. Estos segmentos se

insertaron verticalmente en cubos de icopor (10 x 10 x 2 cm) con la parte más joven

hacia arriba. Cada cubo de icopor contenía 4 segmentos de tallo de diferente edad.

Cada cubo se colocó en un recipiente plástico (24 x 24 x 10 cm) con dos capas de

papel estéril humedecido en el fondo. De cada tratamiento se hicieron 3

repeticiones.

Para el modelo de foliolos se recolectaron hojas de 6-7 semanas (Meyer et al.,

2001), con tamaños similares, para minimizar variables por área de infección, para

todos los foliolos empleados primero se realizó un lavado de las hojas seguido de

una desinfección con Hipoclorito de sodio a 0.7%, con dos enjuagues en agua

estéril y secado en cabina de flujo laminar. Las hojas previamente desinfectadas se

colocaron sobre una malla plástica, dentro de cajas de plástico (24 x 24 x 10 cm)

selladas y con papel estéril humedecido en el fondo, para crear condiciones de

cámara húmeda (Meyer et al., 2001). Las cajas con 15 hojas por tratamiento con

tres repeticiones (Unidad experimental: 1 bandeja con 5 hojas), fueron mantenidas

en un cuarto climatizado a 19 +/- 1°C, de igual manera que para las cajas del

modelo de tallos.

45

La suspensión de B. cinerea se preparó como se describió en el numeral 4.2.1, en

una solución de agua estéril con Tween 80 al 0.1% y después de recuento en

hemocitómetro se ajustó la concentración a 1 x 105 conidios/ml de B. cinerea. En el

modelo de tallos, se aplicó para los dos tratamientos evaluados; aplicación puntual

(25µl) y por aspersión (500 ml con un atomizador de PVC de 30 cm3 de capacidad),

la suspensión a cada segmento de tallo recién cortado y ubicado en su recipiente,

en el sitio de corte, se evaluó un testigo con tallos no tratados. Para el modelo de

foliolos, sobre la superficie de las hojas de tomate, se hizo una aplicación de la

suspensión del patógeno por aspersión (1 ml con un atomizador de PVC de 30 cm3

de capacidad) o en el ápice de las hojas 25µl, se evaluó un testigo no tratado.

Se hicieron lecturas de los tratamientos día intermedio durante 15 días hasta

encontrar valores cercanos al 100% de incidencia (número de hojas o tallos

infectados por tratamiento).

4.3.2 Evaluación de los Extractos Fúngicos Extracelulares (EFE) seleccionados. 4.3.2.1 Material Vegetal. El material vegetal utilizado fue recolectado de un cultivo de tomate (L. esculentum)

tipo milano híbrido Rocío®, ubicado en el C.I. Tibaitatá de Corpoica, del que se

tomaron hojas de 6-7 semanas (Meyer et al., 2001), con tamaños similares, para

minimizar variables por área de infección.

Para todos los foliolos empleados, primero se realizó un lavado de las hojas,

seguido de una desinfección con Hipoclorito de sodio a 0.7%, con dos enjuagues en

agua estéril y secado en cabina de flujo laminar.

Inoculación en Foliolos de Tomate. Las cajas con 16 hojas por tratamiento con cuatro repeticiones (UE: 1 bandeja con

4 hojas), fueron mantenidas en un cuarto climatizado a 19 +/- 1°C, durante 10-15

días. Los tratamientos correspondieron a los EFE pertenecientes al grupo de

inhibición alta seleccionados mediante el agrupamiento (STATGRAPHICS 4.2) más

46

la suspensión del patógeno (Bo004), los extractos crudos sin el patógeno, un testigo

patógeno (Bo004) y un testigo no tratado (hojas sin inocular).

Las hojas previamente desinfectadas se colocaron sobre una malla plástica, dentro

de cajas de plástico (24 x 24 x 10 cm) selladas y con papel estéril humedecido en el

fondo, para crear condiciones de cámara húmeda (Meyer et al., 2001).

Sobre la superficie de la hoja de tomate, se hizo una aplicación por aspersión de los

extractos EFE y sobre el ápice de la hoja se inocularon 25µl de 1 x 105 conidios/ml

de B. cinerea, suspensión preparada como se describió en el numeral 4.2.1, en una

solución de agua estéril con Tween 80 al 0.1%. En el testigo patógeno se aplicó

Tween 80 al 0.1% por aspersión y el inóculo en el ápice, en los controles de

fitotoxicidad para los extractos seleccionados se aplicó en el ápice Tween 80 al

0.1%.

Durante 15-20 días se hicieron observaciones cada 48-72 horas, se cuantificó el

progreso en el desarrollo de la infección a lo largo de la estructura (desde el ápice),

expresado como incidencia (número de hojas infectadas por tratamiento) y

severidad (porcentaje de la hoja infectado). Para esta última variable se tomaron

fotos de las hojas con una cámara digital para calcular el área total e infectada con

ayuda de un programa de análisis de imágenes (ImageJ 1,33u).

4.3.3 Análisis Estadístico.

La incidencia de la enfermedad se determinó como el número de hojas con la

presencia del moho gris (B. cinerea) sobre el total de hojas. Se calculó el progreso

de la enfermedad estimado con el porcentaje de severidad al cuantificar el área

foliar cubierta por el fitopatógeno sobre la totalidad del área foliar con ayuda del

programa de análisis de imágenes (ImageJ 1,33u) durante el desarrollo del ensayo,

estos porcentajes de severidad fueron transformados a UABC (Unidades de área

Bajo la curva).

El porcentaje de eficacia en el último día de lectura (19 d) se estimó mediante la

ecuación (a-b/a) * 100 (Elad, 2000), donde;

a = índice de enfermedad (severidad) en el testigo patógeno

b = índice de enfermedad (severidad) en el tratamiento

47

Se aplicó un análisis de diferencia de medias de mediante la prueba de Fisher LSD

(α =0.95) STATGRAPHICS 4.2, para los datos de incidencia y severidad

recolectados durante el ensayo y en el último día de lectura.

48

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1 MICROORGANISMOS Y MEDIOS DE CULTIVO. 5.1.1 Cepas nativas de hongos filamentosos.

En total se recuperaron 86 morfoespecies de hongos filamentosos aisladas por

Cabrera del Amazonas (2000), que se encontraban conservadas en medio

Czapeck-Dox o en aceite, 36 accesiones del Suelo 1 (S1), 19 accesiones del Suelo

2 y 31 accesiones del Suelo 3 (S3) (Tablas 2 y 3), cada una con características

macroscópicas y microscópicas particulares (Figuras 5 y 6), con diferentes tipos de

crecimiento micelial; por ejemplo, se observaron hongos dematiáceos (Figuras 5a,

5b, 5c, 5d, 5e y 5f) otras cepas presentaron micelio aéreo abundante y con

esporulación pigmentada (Figuras 5g, 5h y 5i), micelio algodonoso (Figuras 5j, 5k y

5l) y pulverulento (Figuras 6a, 6b, 6c, 6d), entre otras características. Igualmente se

observaron cepas con producción de pigmentos difusibles en el medio de cultivo, de

distintos colores; rojo (Figuras 6e, 6f y 5k), amarillo (Figuras 6g y 5i) y café (Figura

6h).

Tabla 2. Morfoespecies recuperadas de los tubos de agar.

Los números representan morfoespecies diferentes.

Suelo 1 Código

Suelo 2 Código

Suelo 3 Código

17 28 67 74 169 197

110 144

2

15 18 23 28 36 44 46 115 125 157 223

49

Figura 5. Fotografías macroscópicas de las morfoespecies 226(a), 1(b), 134(c), 80(d),

149(e), 167(f), 62(g), 96(h), 113(i), 31(j), 152(k), 143(l) provenientes de los suelos 1, 2 y 3.

Fuente: El Autor.

aa bb cc

dd ee ff

gg hh ii

jj kk ll

50

Figura 6. Fotografías macroscópicas de las morfoespecies 112(a), 197(b), 212(c), 27(d),

150(e), 228(f), 217(g), 153(h), provenientes de los suelos 1, 2 y 3. Fuente: El Autor.

aa bb cc

dd ee ff

gg hh

51

Tabla 3. Morfoespecies recuperadas de los viales en aceite.

Los números representan morfoespecies diferentes.

Microscópicamente, se observaron conidióforos penicilados (Figuras 7a y 7b),

micelio septado (Figura 7c), coenocítico (Figuras 7d, 7e, 7f, y 7g), hifas hialinas

(Figura 7h), conidios agrupados (Figuras 7g y 7i), artroconidias (Figuras 7j) y

esporas (Figura 7k), entre otros.

Suelo 1 Código

Suelo 2 Código

Suelo 3 Código

1

12 29 31 40 57 62 83 91 93 96 100 112 127 134 139 150 160 163 166 172 188 198 205 212 213 217 226 228 243

4 5

46 47 62 74 76 90

124 129 134 152 153 154 156 175 185

10 27 30 52 62 64 80

113 143 149 150 167 169 179 182 197 210 211 212

52

Figura 7. Fotografías microscópicas 40X de las morfoespecies 17(a), 18(b), 2(c), 213(d),

205(e), 28(f), 36(g), 151(h), 112(i), 23(j), 62(k). Fuente: El Autor.

aa bb cc

dd ee ff

gg hh ii

jj kk

53

5.1.2 Producción de los Extractos Fúngicos Extracelulares (EFE).

En total se produjeron 172 extractos fúngicos, con diferentes características en

cuanto a la coloración y pH final (Figura 8 y Tablas 4, 5 y 6). Para su producción se

requirió ajustar el inóculo a una concentración estándar de 1 x 106 propágulos/ml

para todos los aislamientos, sin embargo se observó que este parámetro no pudo

ser conservado en todas las accesiones, pues aunque Cabrera (2000) reporta sólo

una accesión como micelio estéril (212), otras 37 cepas no produjeron propágulos,

por lo que se inocularon discos de agar (6 mm diámetro) con micelio del hongo.

En total un 41,27% de los EFE presentaron variaciones en la coloración con

respecto del color inicial, de estos 40 extractos fueron producidos en Czapeck-Dox y

31 en YMG. Los pigmentos fúngicos producidos estuvieron dentro de la gama del

negro (Figuras 8a y 8b), café (Figuras 8c y 8d) y rojo (Figuras 8e y 8f).

Figura 8. Algunos extractos producidos en Czapeck-Dox y YMG, pertenecientes a las

morfoespecies 1(a), 83(b), 213(c), 150(d), 139(e), 115(f). Fuente: El Autor.

aa bb cc

dd ee ff

54

Hubo 36 extractos que no presentaron variaciones en la coloración para ninguno de

los dos medios empleados (Tablas 4, 5 y 6), mientras que para 22 EFE hubo

variaciones en los dos medios de producción (Tablas 4, 5 y 6). Se observó una

mayor proporción de extractos pigmentados producidos en Czapeck-Dox con

respecto a YMG y, aunque no hubo una determinación cuantitativa, cualitativamente

se observó que el medio YMG incrementó la producción de biomasa y formación de

pellets con relación al medio CD (Figuras 8a, 8b, 8c, 8d, 8e y 8f).

Para 21 cepas, las morfoespecies 93, 127, 134, 150, 166, 169, 172, 243 (Tabla 4),

74, 124, 154 (Tabla 5), 15, 28, 36, 44, 167, 169, 182, 197, 210 y 223 (Tabla 6) se

observó el mismo valor de pH final, en los dos extractos producidos. Un 44,1% de la

totalidad de los extractos presentó pH final ácido, 35 EFE producidos en Czapeck-

Dox y 41 en YMG, con un rango entre 2.0 y 6.0 (Tablas 4, 5 y 6), mientras que el

25,58% del total de los EFE conservaron el pH inicial (pH 7.0), 23 en Czapeck-Dox y

21 en YMG (Tablas 4, 5 y 6). De otro lado, el rango de los valores de pH final básico

estuvo entre 7.5 y 10.0 presentado por el 30,23% del total de los extractos

producidos, 28 en Czapeck-Dox y 24 en YMG (Tablas 4, 5 y 6). Sólo 34 extractos

correspondientes a 17 cepas producidas tanto en Czapeck-Dox como en YMG

presentaron el mismo valor de pH y la coloración final (Tablas 4, 5 y 6).

De la totalidad de los EFE producidos en ambos medios, se presentó la producción

de un polímero extracelular color crema por la cepa 150 en el medio Czapeck-Dox,

correspondiente al EFE 126 (Figura 8f).

En algunos de los extractos presumiblemente se encuentran los metabolitos

secundarios con algún potencial antifúngico, ya que los extractos de una

fermentación invariablemente resultan en mezclas complejas de cientos de

compuestos (Borders, 1999). La producción de algunos de los compuestos con

potencial inhibitorio puede desarrollarse bajo condiciones limitantes de nutrientes,

como disminución de fuentes de C, N ó P fácilmente asimilables, esto conlleva a

que el microorganismo entre en un período de crecimiento lento con alteraciones

morfológicas y cambios en el metabolismo, lo que se conoce como metabolismo

secundario (Drew y Demain, 1977, citado por Schimmel et al., 1998; Turner, 1971),

55

éste según Zhang y colaboradores (2001) puede presentarse a partir del día 1 con

máximos niveles de concentración el día 3, pero según Schimmel y colaboradores

(1996) se presenta a partir del día 5. La producción de metabolitos fúngicos,

depende de las características de las moléculas y está influenciada por varios

parámetros; temperatura, pH, oxígeno disuelto, entre otros (Brakhage et al., 2004;

Calvo et al., 2002; Higgs et al., 2001; Saha et al., 2004). Esto indica que aunque los

microorganismos pueden producir sustancias de bajo peso molecular con efectos

antifúngicos, su obtención es particular para cada cepa o metabolito de interés

(Broberg et al., 2004).

56

Tabla 4. Características de los extractos fúngicos extracelulares (EFE) producidos en el medio Czapeck-Dox y YMG, durante 8 días, provenientes de las morfoespecies del Suelo 1.

Código Czapeck-Dox YMG de la cepa EFE*

pH final Color EFE* pH final Color

1 78 8,0 + amarillo 79 7,5 + marrón 12 164 7,0 + rosado 165 6,0 + marrón 17 84 4,5 - transparente 85 7,0 + amarillo 28 38 7,5 + amarillo 39 7,0 + negro 29 15 7,0 + amarillo 16 5,5 - amarillo 31 122 8,0 + rosado 123 7,0 + rojizo 40 94 7,5 + amarillo 95 7,0 - amarillo 57 120 4,5 + amarillo 121 7,0-8,0 + marrón 62 1 7,0 - transparente 2 7,5 - amarillo 67 96 7,0 - transparente 97 5,5 + amarillo 74 86 6,0 - transparente 87 7,0 - café 83 68 7,0 + marrón 69 5,5 + marrón 91 128 8,0 + amarillo 129 7,0 - amarillo 93 146 4,1-4,2 - transparente 147 4,5 - amarillo 96 98 7,0 - transparente 99 5,5 - amarillo

100 88 4,2 - transparente 89 7,0 - amarillo 112 70 4,5 - transparente 71 7,0 - amarillo 127 17 5,5 + amarillo 18 5,5 + crema 134 139 7,5 - transparente 140 7,5 - amarillo 139 108 7,5 + rosado 109 5,4 + rojo 150 126 8,0 + crema** 127 8,0 - amarillo 160 143 4,1-4,2 + amarillo 144 5,5 + amarillo 163 76 4,5 - transparente 77 8,0 - amarillo 166 137 7,0 - transparente 138 7,0 - amarillo 169 135 8,0 + amarillo 136 8,0-8,2 + transparente 172 172 7,0 + marrón 173 7,0 + negro 188 110 8,5 - transparente 111 4,5 - amarillo 197 64 5,5 - transparente 65 7,0 - amarillo 198 3 7,5 - transparente 4 7,0 - amarillo 205 74 7,5 - transparente 75 7,0 - amarillo 212 168 6,0 - transparente 169 7,0 + marrón 213 72 7,0 + amarillo 73 7,5 - café 217 28 5,0 + amarillo 29 5,5 - amarillo 226 36 7,0 - transparente 37 4,0 + negro 228 80 7,0 + rosado 81 6,0 + rojizo 243 145 4,5 + marrón 157 4,5 - amarillo

* Códigos de los extractos fúngicos extracelulares (EFE), en cada medio de producción. (+):

Variaciones respecto del color inicial del medio; (-): sin variaciones respecto del color inicial.

** Producción de un polímero extracelular.

57


Código Czapeck-Dox YMG de la cepa EFE* pH final Color EFE* pH final Color

4 32 9,5 - transparente 33 8,0 - amarillo 5 170 4,5 + amarillo 171 7,0 - amarillo

46 19 9,0 - transparente 20 7,0 + crema 47 100 9,0 - transparente 101 6,0 - amarillo 62 148 4,5 - transparente 149 5,5 - amarillo 74 90 7,0 - transparente 91 7,0 + marrón 76 102 4,5 - transparente 103 5,5 - amarillo 90 5 8,0 - transparente 6 6,0 - amarillo

110 66 4,5 - transparente 67 5,5 - amarillo 124 104 4,5 + amarillo 105 4,5 - amarillo 129 166 7,0 + rosado 167 4,5 - amarillo 134 141 7,5 - transparente 142 7,0 + café 144 92 8,5 + rojo 93 4,5 - amarillo 152 21 8,5 + rosado 22 6,0 - amarillo 153 178 7,0 + marrón 179 8,0 + marrón 154 7 8,0 - transparente 8 8,0 - caramelo 156 124 8,0 + negro 125 7,0 + negro 175 182 7,0 + rosado 183 6,0 - caramelo 185 180 4,0 - transparente 181 3,0 - amarillo

* Códigos de los extractos fúngicos extracelulares (EFE), en cada medio de producción.

(+): Variaciones respecto del color inicial del medio; (-): sin variaciones respecto del color

inicial.

58


Código Czapeck-Dox YMG de la cepa EFE* pH final Color EFE* pH final Color

2 9 7,5 - transparente 10 6,0 - amarillo 10 133 4,5 + amarillo 134 7,8-8,0 - amarillo 15 54 4,5 - transparente 55 4,5 - amarillo 18 52 4,5 + amarillo 53 5,5 - amarillo 23 57 2,0 - transparente 58 3,0 + transparente 27 11 6,0 - transparente 12 5,5 - amarillo 28 46 4,5 - transparente 47 4,5 - amarillo 30 112 7,5 - transparente 113 8,0 - café 36 40 4,5 + amarillo 41 4,5 + crema 44 48 4,5 + café 49 4,5 + café 46 13 7,0 + crema 14 5,5 + crema 52 151 7,0 - transparente 152 5,5 - amarillo 62 130 5,5 - transparente 150 7,5-7,6 - amarillo 64 131 7,0 - transparente 132 7,5-8,0 - amarillo 80 162 7,0 - transparente 163 8,0 + negro

113 116 6,5 + rojizo 117 7,0 + rojizo 115 24 8,5-9,0 + rojo 61 8,5 + rojizo 125 50 6,0 - transparente 51 4,5 - amarillo 143 114 8,0 + amarillo 115 7,0 + amarillo 149 118 4,0 + rosado 119 6,0 - amarillo 150 158 8,0 + negro 159 8,5 - café 157 153 4,5 - transparente 154 7,0 + amarillo 167 44 7,0 + negro 45 7,0 - amarillo 169 42 7,0 + café 43 7,0 + negro 179 62 8,0 - transparente 63 7,0 - amarillo 182 174 4,5 - transparente 175 4,5 - amarillo 197 106 4,5 - transparente 107 4,5 - amarillo 210 155 7,0 - transparente 156 7,0 - amarillo 211 26 7,0 + café 27 4,5 - amarillo 212 82 10,0 - transparente 83 7,0 - amarillo 223 23 4,5 - transparente 56 4,5 - amarillo

* Códigos de los extractos fúngicos extracelulares (EFE), en cada medio de producción.

(+): Variaciones respecto del color inicial del medio; (-): sin variaciones respecto del color

inicial.

59

5.2 ENSAYOS In Vitro.

5.2.1 Efecto de los extractos fúngicos (EFE) sobre la inhibición de la

germinación de B. cinerea. La evaluación de la inhibición de la germinación, mediante la observación directa

por microscopia demostró que existe un gran potencial de compuestos con actividad

antifúngica, dado que en presencia de 50 extractos se encontraron porcentajes de

germinación de B. cinerea cepa Bo004 menores o iguales al 50%, después de 16

horas de incubación. Se debe tener en cuenta la gran variabilidad del patógeno, ya

que presentó porcentajes de germinación que oscilaron entre el 59,30% y el

93,75%, por lo que fue necesario emplear un factor de corrección (ecuación

porcentaje de inhibición, numeral 4.2.2.2); los valores de inhibición de la

germinación obtenidos fueron analizados mediante el análisis estadístico de

agrupamiento con el programa STATGRAPHICS versión 4.2.

g , q

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

Figura 9. Agrupamiento del efecto inhibitorio de la germinación de B. cinerea producida por

los extractos EFE producidos en el medio Czapeck-Dox (CD) de acuerdo con el análisis de

Grupos homogéneos (Programa STATGRAPHICS versión 4.2). Grupos de Inhibición: 1(o)

baja; 2( ) media; 3(x) alta, (+) centroides.

% Inhibición de la germinación

% In

hibi

ción

de

la g

erm

inac

ión

60

En el medio Czapeck-Dox (CD), el agrupamiento (Figura 9) mostró que el mayor

número de extractos correspondiente a setenta y nueve se ubicó en el grupo (1) de

inhibición baja abarcando porcentajes de inhibición desde 0 hasta 60%, esto

también se observó para los EFE que provenían del medio YMG, puesto que en el

grupo (1) de inhibición baja también se ubicaron la mayoría de extractos (71). En el

grupo (2) de inhibición media, se encontraron porcentajes de inhibición de la

germinación de B. cinerea que van desde 66,4% hasta 74,8% y desde 59,5% hasta

75,6% para cinco extractos producidos en el medio CD (Figura 9) y trece extractos

producidos en YMG (Figura 10), respectivamente.

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

Figura 10. Agrupamiento del efecto inhibitorio de la germinación de B. cinerea producida por

los extractos EFE producidos en el medio YMG de acuerdo con el análisis de Grupos

homogéneos (Programa STATGRAPHICS versión 4.2). Grupos de Inhibición: 1(o) baja; 2( )

media; 3(x) alta, (+) centroides.

Para ambos medios (CD y YMG) el análisis estadístico discriminó en el grupo (3) de

inhibición alta (Figuras 9 y 10) dos extractos para cada medio de cultivo, con valores

de inhibición de 85,3% con el extracto EFE 158 correspondiente a la cepa 150

producida en el medio Czapeck-Dox, de 85,6% con el extracto EFE 56 producido

% Inhibición de la germinación

% In

hibi

ción

de

la g

erm

inac

ión

61

con la cepa 223 en el medio YMG, del 86,1% con el extracto 49 producido con la

cepa 44 en el medio YMG y de 90,4% con el extracto 66 correspondiente a la cepa

110 producida en Czapeck-Dox. Estos extractos fueron seleccionados para realizar

el ensayo in planta, por su alta actividad frente a B. cinerea Bo004. Se observaron

diferencias marcadas en el efecto de los extractos producidos por un mismo hongo

en diferente medio, si se tiene en cuenta que con las cepas 223 y 44 producidas en

Czapeck-Dox, los porcentajes de inhibición de la germinación fueron de 0% y 15,4%

respectivamente, mientras que para la cepa 110 producida en YMG éste fue de 0%

de inhibición de la germinación de B. cinerea.

En ambos medios se produjeron extractos con potencial para el control de

B. cinerea. Según Thines (2005) la producción de compuestos de este tipo ocurre

principalmente bajo condiciones limitantes de nutrientes (Thines, 2005; Turner,

1971), y depende en gran medida de las vías de síntesis de productos naturales ya

que los metabolitos secundarios no siempre tienen un único origen biosintético y su

producción se puede derivar de diversas rutas metabólicas asociadas con el

desarrollo del hongo, la formación de esporas, pigmentos u otras estructuras, dentro

de las que hay procesos anabólicos del metabolismo de ácidos, proteínas, lípidos,

entre otros compuestos, cuya síntesis es coordinada por un gen o por un grupo de

estos (Calvo et al., 2002; Keller y Hohn, 1997; Marzluf, 1997).

En trabajos previos se ha demostrado la producción de compuestos inhibitorios al

sembrar microorganismos en YMG: ya que Eilbert y colaboradores (2000), con una

cepa de Neobulgaria pura obtuvieron compuestos como la neobulgarona D que

logró inhibir la formación de apresorios del fitopatógeno Magnaporthe grisea cepa

P1. Por otra parte, todos los inhibidores y compuestos antifúngicos obtenidos en el

instituto de biotecnología e investigación en drogas de la Universidad de

Kaiserslautern, Alemania, (Institute of Biotechnology and Drug Research, IBWF),

han sido encontrados en medios estándar como Czapeck-Dox, YMG y PDA. Los

dos primeros medios proporcionan fuentes de C y N como Sacarosa y Nitrato en

Czapeck-Dox y Glucosa y Extracto de levadura en YMG, que al permitir un

desarrollo favorable del microorganismo propician las condiciones para que se

presente tanto el metabolismo primario como el secundario. Turner (1971), realizó

62

bioprospección con los medios Raulin-Thom y Czapeck-Dox que difieren en la

fuente de nitrógeno (amonio y nitrato, respectivamente), observando frecuentemente

la producción de sustancias con actividad biológica, en un medio, pero no en el otro,

o diferencias entre los compuestos producidos en cada uno.

El éxito y potencial del metabolito, y por ende del medio de producción empleado,

también está relacionado con el modo de acción o target de la sustancia

(Santamarina et al., 2002), por tanto la baja inhibición de la germinación obtenida en

presencia de los extractos del grupo de inhibición baja pudo estar relacionada con

que no se produjeron compuestos antifúngicos o que los metabolitos producidos no

tenían potencial sobre la germinación de B. cinerea.

Las cepas utilizadas en el presente trabajo provinieron del Amazonas (Cabrera,

2000), y demostraron un importante potencial en la producción de extractos

antifúngicos con actividad media y alta, lo cual podría estar relacionado con su

origen, si se tiene en cuenta el trabajo de Bills y colaboradores (2002) (citado por

Strobel y Daisy, 2003) quienes al comparar el número de productos bioactivos

naturales derivados de microorganismos endofíticos de regiones tropicales frente al

número de compuestos aislados de endofíticos de origen templado, encontraron que

los primeros proporcionaron más productos naturales activos.

Además de la inhibición de la germinación producida por los extractos evaluados, se

observaron otros efectos sobre los conidios y sobre las hifas de B. cinerea. Por

ejemplo, tubos germinales cortos con respecto al testigo patógeno al evaluar los

tratamientos con los extractos 88, 96, 104, 106, 114, 124, 145, 170 y 176 producidos

por las morfoespecies codificadas como 100, 67, 124, 197, 143, 156, 243, 5 y 48, en

el medio Czapeck-Dox y por los extractos 58, 103, 129, 136 y 159 producidos por

las morfoespecies codificadas como 23, 76, 91, 169 y 150 en el medio YMG (Figura

11). Estos extractos podrían ser de interés si se tiene en cuenta que existe un grupo

de botrycidas (p.ej. DMIs, hidroxianilidas), que no previenen la germinación de

conidios pero, a bajas concentraciones inhiben la elongación del tubo germinal y el

crecimiento del micelio, debido a que interfieren con la biosíntesis de esterol

(Rosslenbroich y Struebler; 2000; Leroux, 2004).

63

Figura 11. Tubos germinales cortos de los tratamientos con los extractos 88(a), 176(b)

producidas en Czapeck-Dox y 136(c) producida en YMG, correspondientes a las

morfoespecies 100, 48 y 169, en relación con el control (d). Fotografías microscópicas 40X.

Fuente: El Autor.

Adicionalmente, se ha observado en medios suplementados con estos fungicidas,

que los tubos germinales producidos aparecen abultados, distorsionados y el citosol

tiene una apariencia granular (Leroux et al., 1999, citado por Leroux, 2004). Este

último fenómeno se observó en los conidios que estuvieron en contacto con el EFE

82, obtenido con la morfoespecie 212 producida en el medio Czapeck-Dox, donde

se observó una concentración del contenido citoplasmático en relación con los

conidios del control B. cinerea (Figura 12). Probablemente el efecto de este extracto

también puede estar relacionado con su pH básico (pH 10.0) que pudo afectar el

equilibrio celular (Atlas y Bartha, 2002; Manteau et al., 2003), debido que B. cinerea

presenta un crecimiento óptimo a pH 7.0 y en el rango de pH de 4,5 a 6.0 produce

las enzimas relacionadas con la patogénesis del hongo (Manteau et al., 2003).

a b c

d

64

Figura 12. Efectos sobre los conidios y sobre las hifas de B. cinerea, ocasionado por el

extracto 82 (a) producido en Czapeck-Dox, en relación al control (b). Fotografías

microscópicas 40X. Fuente: El Autor.

Así mismo, se desarrollaron tubos germinales secundarios y terciarios de B. cinerea

con los extractos 40, 74 y 84 producidos por las morfoespecies 36, 205 y 17 en el

medio CD y con los extractos 55 y 167 producidos por las morfoespecies 15 y 129

en el medio YMG (Figura 13). Este fenómeno ha sido reportado en Botrytis al

Figura 13. Tubos germinales secundarios y terciarios de B. cinerea, producidos por los

extractos 167 (a) producido en el medio YMG, 84 (b) y 40 (c) producidos en Czapeck-Dox,

en relación con el control (d). Fotografías microscópicas 40X. Fuente: El Autor.

a b

a b c

d

65

evaluar el efecto del resveratrol, que es una fitoalexina que interfiere con la

funcionalidad de las proteínas de membrana, especialmente en la mitocondria,

conduciendo a una disminución inmediata en la toma de oxígeno, manifestado en

cambios citológicos como producción de tubos germinales secundarios o terciarios,

formación de tubos germinales curvos y granulación de los conidios, entre otros

(Holian y Walter, 2001; Pezet y Pont, 1995, citado por Chan, 2002).

En algunos trabajos (Elad y Kapat,1999; Brunner et al., 2005) se obtuvo un alto

porcentaje de germinación de B. cinerea (100%) lo cual contrasta con los datos

derivados de este trabajo en que se observó un comportamiento disímil en cuanto a

la germinación de los conidios del patógeno, ya que los porcentajes oscilaron entre

un 60 y 90% en promedio después de 16h, esta cifra es muy superior a la reportada

en otros trabajos, en los que se presentaron variaciones máximas del 10% en la

germinación de B. cinerea (entre el 72,0% y 82,2%) a las 24h de incubación (Buck,

2004). La variabilidad encontrada en el presente trabajo pudo estar influenciada

principalmente por dos factores que afectaron la cepa utilizada. En primera

instancia, se sabe que este fitopatógeno es un hongo especialmente variable porque

presenta conidios mutinucleados, observándose una tendencia a cambiar

constantemente durante generaciones sucesivas in vitro y en condiciones de campo

(Elad et al., 2004). La segunda fuente de variación pudo estar relacionada con la

variabilidad de la cepa utilizada para adherirse a las placas de poliestireno, ya que

según Filonow, 2001 citado por Dardari et al., 2004 y Slawecki et al., 2002 la

diferencia en los valores de germinación pudo deberse a un retraso en la adhesión,

explicado por las dos etapas que comprende este proceso (Doss et al., 1993; 1995

citado por Doss 1999). La primera etapa ocurre después de la hidratación del

conidio e involucra fuerzas hidrofóbicas (Doss et al., 1993, citado por Doss 1999), la

segunda ocurre después de un período de incubación bajo condiciones que

promuevan la germinación, permitiendo que los tubos germinales puedan unirse

tanto a sustratos hidrofóbicos como hidrofílicos (Doss et al., 1995), además también

se presenta la excreción de carbohidratos y proteínas, coincidiendo con la

germinación (Doss et al., 1995).

66

Para refinar la selección en los grupos de inhibición media y alta de la germinación,

se realizó nuevamente un análisis de agrupamiento con los porcentajes de inhibición

obtenidos en presencia de estos extractos. Como resultado, para el medio CD se

observó el mismo agrupamiento de inhibición media de los porcentajes de inhibición

de la germinación de B. cinerea, mientras que con el grupo 3 de inhibición alta se

constituyeron dos grupos, uno correspondiente al extracto 66 significativamente

mejor con un 90,4% de inhibición y otro al EFE 158 con un 85,3% de inhibición de la

germinación de B. cinerea (Figura 14).

66 71 76 81 86 9166

71

76

81

86

91

Figura 14. Análisis de agrupamiento del efecto inhibitorio (>60% I) de los extractos EFE

producidos en el medio Czapeck-Dox (CD) de acuerdo con el análisis de Grupos

Homogéneos (Programa STATGRAPHICS versión 4,2). Los tratamientos corresponden al

extracto 66 (o; 90.4% I;) y 158 (x; 85.3%I), ( ) indica los demás extractos del grupo 2 y (+)

los centroides.

Con el nuevo agrupamiento de los porcentajes de inhibición media y alta obtenidos

en presencia de los extractos producidos en YMG, el grupo 3 de inhibición alta se

conservó por la cercanía de los porcentajes de inhibición del 85,6% y 86,1%

obtenidos con los EFE 56 y 49, mientras que el grupo 2 de inhibición media se

subdividió en dos grupos, uno con porcentajes de inhibición entre el 59,5 y 61,9% y

otro con porcentajes entre el 64,6% y 75,6% (Figura 15).

% Inhibición de la Germinación

% In

hibi

ción

de

la G

erm

inac

ión

67

g , q

59 64 69 74 79 84 8959

64

69

74

79

84

89

Figura 15. Análisis de agrupamiento del efecto inhibitorio (>59% I) de los extractos EFE

producidos en el medio YMG de acuerdo con el análisis de Grupos homogéneos (Programa

STATGRAPHICS versión 4,2). Los tratamientos corresponden al extracto 49 (x; 86,1% I) y

56 (x; 85, 6% I), (o) extractos con 59,5 y 61,9% de inhibición, ( ) extractos con 64,6 y 75,6 %

de Inhibición y (+) los centroides.

Estos análisis de agrupamiento de los EFE de los grupos media y alta confirmaron

el hallazgo de cuatro extractos con potencial para la inhibición de la germinación de

B. cinerea dos con el medio Czapeck-Dox y dos con el medio YMG (Figuras 14 y

15), frente a los otros EFE que presentaron porcentajes de inhibición de la

germinación del fitopatógeno aceptables dentro del grupo (2) de inhibición media.

Para explicar la inhibición de la germinación presentada con estos extractos se

podría sugerir la presencia de metabolitos antifúngicos que pudieron tener varios

posibles efectos sobre el patógeno, como se menciona en la Tabla 7.

% In

hibi

ción

de

la G

erm

inac

ión

% Inhibición de la Germinación

68

Tabla 7. Efectos potenciales de los extractos con actividad antifúngica sobre la germinación de B. cinerea

Posible efecto antifúngico Autores

Supresión de la biosíntesis de

metionina

Jin et al., 2004; Rosslenbroich y

Stuebler, 2000; Leroux, 2004

Interferencia sobre la respiración

mitocondrial

Gullino et al., 2000; Sauter et al.,1995;

citado por Slawecki et al., 2002; Leroux,

2004 ; Thines et al., 2004

Inhibición de tiol-enzimas Corbett et al., 1984, citado por Leroux,

2004

Desacople de la fosforilación oxidativa Leroux, 1996, citado por Leroux, 2004

Interferencia con la osmorregulación Rosslenbroich y Stuebler, 2000

Interferencia de procesos celulares, por

producción de especies activas de

oxígeno (AOS)

Edlich y Lyr, 1992; citado por Leroux,

2004

Inhibición de la lisis del poro para el

desarrollo del tubo germinal

Wolf, 1982, citado por Thines et al.,

2004

Además de los posibles modos de acción atribuidos para los los extractos ubicados

dentro de los grupos de inhibición media y alta de la germinación de B. cinerea,

pueden existir otros nuevos dependiendo de las moléculas productoras del efecto

inhibitorio (Strobel y Daisy, 2003).

En relación con las características de los extractos ubicados en el grupo de

inhibición alta y producidos en ambos medios, dos extractos presentaron

variaciones en la coloración y pigmentación con respecto al color inicial (Figura 16,

Tabla 8), ya que pasaron de transparente y amarillo claro transparente para

Czapeck-Dox y YMG respectivamente, a un color dentro de la gama café y negro.

Esta coloración oscura podría deberse a la presencia de melaninas las cuales están

asociados al desarrollo de estructuras en el hongo (Calvo et al., 2002; Keller y Hohn,

69

1997), u otros compuestos antifúngicos. Sin embargo no se encontró una relación

entre la producción de pigmentos y la actividad antifúngica de los EFE, ya que

varios extractos pigmentados no mostraron habilidad para inhibir la germinación de

B. cinerea.

Figura 16. Características de los extractos del grupo 3 de inhibición alta, 49 (a), 56 (b), 158

(c) y 66 (d). Fuente: El Autor.

Tabla 8. Características de los EFE pertenecientes al grupo 3 de inhibición alta de la germinación de B. cinerea y sus correspondientes extractos producidos en el otro medio de cultivo.

Medio Czapeck-Dox Medio YMG Cepa

EFE

% Inhibición

pH final

Color EFE

% Inhibición

pH final

Color

110 66 90,4 4.5 - 67 0 5.5 -

44 48 15,4 4.5 café 49 86,1 4.5 café

150 158 85,3 8.0 negro 159 72,0 8.5 café

223 23 0 4.5 - 56 85,6 4.5 -

Tres de los cuatro extractos del grupo (3) de inhibición alta presentaron un pH ácido

(< 7.0), es así como los extractos 49, 56 y 66 producidos por las morfoespecies 44 y

a b c d

70

223 en el medio YMG y 110 en CD, respectivamente presentaron pH final de 4,5 y

sólo el extracto 158 producido por la morfoespecie 150 en CD presentó pH 8,0

(Tabla 8), esta misma tendencia se presentó al analizar todos los extractos

especialmente los producidos en YMG, esto se debió probablemente a que las

cepas tienden a acidificar el medio para propiciar el desarrollo óptimo de su

metabolismo, factor que puede estar relacionado con la identidad y metabolismo de

cada cepa, ya que según Cabrera (2000), los tres suelos de donde se aislaron los

hongos eran fuertemente ácidos. Cabe mencionar que no existen muchos reportes

que relacionen la producción de metabolitos antifúngicos con el pH y por tanto no se

puede generalizar el valor del pH con un metabolito en particular, dado que esto

depende de la naturaleza del compuesto y de la composición del medio de

producción, entre otras variables.

Sin embargo, se puede mencionar que Zhang y colaboradores (2001) observaron

que durante la producción de cladospolide (antifúngico frente a Pyricularia oryzae y

Mucor racemous) el pH disminuyó desde el día 3 y al tiempo final de incubación (día

6) el pH fue de 4.8. Turner (1971) menciona que el cambio de pH del medio durante

el curso de la fermentación, depende en parte de la fuente de nitrógeno y en

algunos casos, puede tener un efecto en el metabolismo secundario.

Manteau y colaboradores (2003) observaron que con rangos de pH entre 3,0 y 6,0,

hay desarrollo del fitopatógeno, a pH menor de 4,5 y mayor de 7,0 se puede afectar

la actividad enzimática y la supervivencia de las células de B. cinerea, mientras que

a pH 7,0 se presentó el mejor crecimiento de B. cinerea y a pH 2,0 su desarrollo fue

muy escaso (Manteau et al., 2003). Aunque existen estos reportes en relación con el

pH y la interferencia en el desarrollo de B. cinerea en la actividad inhibitoria como

para el caso de los extractos 49, 56 y 66 (Tabla 9), además del pH debe

considerarse la composición del extracto si se tiene en cuenta que extractos con el

mismo pH producidos por el mismo hongo en diferente medio no tuvieron el mismo

comportamiento en la inhibición de la germinación de B. cinerea (Tabla 9). Estas

diferencias pueden estar relacionadas en gran medida con las vías de síntesis de

productos naturales, que dependiendo del medio se direccionan hacia la producción

de componentes con o sin actividad frente a la inhibición de B. cinerea.

71

Adicionalmente, para algunos extractos la actividad antifúngica sobre la germinación

de los conidios de Botrytis, pudo estar relacionada con un posible sinergismo entre

las diferentes características químicas y físicas de los EFE (Romagnoli et al., 2005).

Además de altos porcentajes de inhibición, en presencia de los EFE 49, 56 y 66 los

conidios de B. cinerea presentaron concentración del contenido citoplasmático

(Figuras 17a, 17b y 17c) en relación con el control (Figura 17e) y con el EFE 158

algunos conidios presentaron pérdida del contenido citoplasmático (Figura 17d).

Figura 17. Efecto de los extractos fúngicos 49 (a), 56 (b), 66 (c) y 158 (d) sobre la inhibición

de la germinación de conidios de B. cinerea en relación con el control (e) después de 16

horas de incubación (26 +/- 2 °C). Fotografías microscópicas 40X. Fuente: El Autor.

a b

c d

e

72

En cuanto a las cepas productoras de los extractos, se estableció que la cepa 44

pertenece al género Penicillium sp. (Figura 18a), la cepa 223 al género

Beauveria sp. (Figura 18b), la cepa 110 al género Aspergillus sp. (Figura 18c) y la

cepa 150 al género Phialophora sp. (Figura 18d), respectivamente. Y fueron

originalmente aisladas de dos (S2 - S3) de los tres suelos muestreados por Cabrera

en el Amazonas (2000). Las cepas 110, 44 y 223 se encontraban conservadas en

tubos con agar, y la cepa 150 en aceite, antes de su utilización en este estudio.

Sin embargo, sólo esta última accesión, demostró actividad antifúngica media o alta

con los dos extractos EFE (158 y 159) producidos en los dos medios de cultivo

Czapeck-Dox y YMG, respectivamente.

Figura 18. Morfoespecies de (a)Penicillium sp., (b)Beauveria sp., (c)Aspergillus sp. y

(d)Phialophora sp., cepas productoras de los extractos 49, 56, 66 y 158, respectivamente,

del grupo de inhibición alta. Fuente: El Autor.

De acuerdo con la actividad metabólica reportada por Cabrera (2000), la cepa de

Penicillium sp., morfoespecie 44, se encontraba en la categoría 2 (intermedia) de

degradación de quitina, de interés por su posible actividad lítica sobre las paredes

de B. cinerea. Esta accesión también presenta el mismo nivel de degradación de

celulosa, sin embargo este parámetro no se relaciona con la inhibición de la

germinación de los conidios de B. cinerea. Adicionalmente, la cepa 110 presentaba

a b

c d

73

actividad débil (1) en la solubilización de fosfatos y las otras 2 morfoespecies, 150 y

223, no presentaron algún nivel de actividad metabólica frente a los procesos

catabólicos evaluados (Cabrera, 2000).

En varios estudios exploratorios se relacionan los géneros Aspergillus sp.(Sugie et

al, 2001; Calvo et al, 2002; Vicente et al., 2003), Penicillium sp. (Nose et al., 2000) y

Beauveria sp. (Pohanka et al., 2004), como fuentes de productos naturales con

potencial antifúngico y de metabolitos inhibitorios, sin embargo no se encontraron

reportes para los géneros Aspergillus sp., Penicillium sp., Beauveria sp. y

Phialophora sp. en relación con la inhibición de la germinación de conidios de

B. cinerea, esto incrementa el interés del hallazgo tanto de los extractos como de las

cepas productoras para el control de B. cinerea reportadas en este trabajo.

74

5.2.2 Cuantificación de la densidad óptica en relación con el efecto de los extractos fúngicos (EFE) sobre la inhibición de la germinación de B. cinerea.

Inicialmente se probaron 4 longitudes de onda (405, 450, 492 y 620 nm) en un lector

de placas de ELISA ASYS® Hitech Expert 96, encontrando que la longitud de onda

de 405 nm presentó el mayor delta de diferencias de densidad óptica (Tabla 9),

entre las dos concentraciones evaluadas (1 x 105 y 1 x 106 conidios.ml-1) de

B. cinerea.

Tabla 9. Delta de las diferencias de la densidad óptica, para cuatro longitudes

de onda.

405 nm 450 nm 492 nm 620 nm Longitud de onda

Delta (DO)*

0,300 0,262 0,236 0,194

*Los valores corresponden al promedio de cuatro repeticiones por concentración de

B. cinerea evaluada.

Al estimar la sensibilidad de la lectura de densidad óptica frente a diferentes

concentraciones de B. cinerea, dentro del rango de 3 x 105 a 1 x 106 conidios.ml-1,

se estableció que existe una relación directamente proporcional en el tiempo 0 entre

la densidad óptica y la germinación, donde: Densidad óptica (DO) = 0.1846 *

Log10 [ ] - 0.9915 con coeficiente de correlación de 0,9417 (Tabla 10, Figura 19).

Desde el tiempo 0, la técnica es sensible a las diferentes concentraciones de

conidios de B. cinerea, como Pelloux-Prayer (et al., 1998) encontró para la variable

de respuesta, fluorescencia frente a las concentraciones de conidios de B. cinerea.

75

Tabla 10. Valores de densidad óptica para diferentes concentraciones de

B. cinerea

Concentración B. cinerea

(conidios.ml-1)

Log 10 Concentración

∆Densidad Óptica

(∆ DO405nm) 3 x 105 5,477 0,028 4 x 105 5,602 0,043 5 x 105 5,699 0,044 6 x 105 5,778 0,069 7 x 105 5,845 0,091 8 x 105 5,903 0,107 9 x 105 5,954 0,110 1 x 106 6,000 0,114

Los valores corresponden al promedio de cuatro repeticiones por concentración de

B. cinerea, corregidos con el blanco (Extracto de malta 0.1%), para obtener el delta de

densidad óptica en el tiempo 0 a 405 nm en un lector de ELISA ASYS® Hitech Expert 96.

0,000

0,020

0,040

0,060

0,080

0,100

0,120

0,140

5,4 5,5 5,6 5,7 5,8 5,9 6 6,1

Log10 Concentración (Conidios/ml)

∆ D

O 40

5 nm

Figura 19. Curva de calibración para Botrytis cinerea, Concentración vs. Delta de densidad

óptica respecto del blanco (Extracto de malta 0.1%) en el tiempo 0 a 405nm en un lector de

ELISA ASYS® Hitech Expert 96. La ecuación de la recta obtenida fue y = 0,1846x - 0,9915,

R2= 94,17%.

76

Para comparar la inhibición de la germinación de B. cinerea con la densidad óptica,

se obtuvo el delta de densidad óptica (∆ DO) al promediar las cuatro repeticiones

por cada extracto EFE evaluado, y después de corregir con el promedio de los

blancos (Ecuación: ∆DO corregido para cada EFE a las 16h = (1DO EFE +

B. cinerea) – (2DO EFE 0h) – (3 DO B. cinerea – 4DO Extracto de Malta 0.1% 0h)

(Figura 20).

Figura 20. Disposición espacial de los tratamientos evaluados en una placa de

microtitulación de 96 pozos; 1EFE + B. cinerea: 2EFE 3B. cinerea: 4Extracto de Malta 0.1%.

De la totalidad de los datos, se retiraron 39 y 42 EFE producidos en CD y YMG

respectivamente, porque algunos presentaron densidades ópticas superiores a 0.9

(DO > 0.9) y para otros extractos el blanco (extracto EFE sin conidios de B. cinerea)

presentó coeficientes de variación superiores al 10% de la densidad óptica entre la

hora 0 respecto de la hora 16, independientemente del medio producción, también

fueron retirados de la correlación. En relación con el valor de DO el rango de

densidad óptica debe estar entre 0.1-0.9 para que la técnica presente sensibilidad y

los coeficientes de variación superiores al 10%, pueden interferir en la corrección de

los datos de la ecuación mencionada anteriormente.

Después de aplicar los criterios definidos en el numeral 4.2.3 se emplearon 47

extractos producidos en el medio Czapeck-Dox y 44 en YMG para determinar la

correlación. Después de aplicar un modelo estadístico de calibración, quedaron 28

2

1

3 4

77

extractos producidos en los medios CD (Tabla 11) y YMG (Tabla 12), indicando un

59,57 y 63,6% del total de los datos en cada medio, respectivamente; para los dos

casos el mejor ajuste se obtuvo con un modelo de calibración lineal

(STATGRAPHICS 4.2).

Para los 28 extractos EFE producidos en el medio CD (Tabla 11), con el modelo de

calibración para las dos variables analizadas, delta de densidad óptica (t 16h- 0h,

405 nm) y porcentaje de germinación de B. cinerea, existió una relación lineal

estadísticamente significativa (p< 0.01), con un 99% de confianza (STATGRAPHICS

4.2, Anexo 2). El modelo de asociación explicó en un 49,83% la variabilidad

experimental observada en el porcentaje de germinación de B. cinerea y una

relación moderadamente fuerte entre las variables, expresada por un coeficiente de

correlación de 0.70. La ecuación del modelo de asociación para los extractos en el

medio CD fue % Germinación = 28,1674 + 300,46* ∆ DO405nm 16 h (Figura 21).

Con los 28 extractos producidos en el medio YMG, también se presentó una

relación estadísticamente significativa (p<0.01) entre las variables porcentaje de

germinación de B. cinerea y el delta de densidad óptica (t 16h- 0h, 405 nm), con un

99% de confianza (STATGRAPHICS 4.2, Anexo 2). Con un modelo de asociación

lineal se explicó en un 49,17% la variabilidad observada experimentalmente en el

porcentaje de germinación de B. cinerea con una relación moderadamente fuerte

entre las variables, expresada con un coeficiente de correlación de 0.73. La

ecuación del modelo de asociación para los extractos del medio YMG fue

% Germinación = 30,5577 + 443,166* ∆ DO405nm 16 h (Figura 22).

78

Tabla 11. Extractos fúngicos extracelulares producidos en el medio

Czapeck-Dox, empleados para la correlación entre el porcentaje de germinación para B. cinerea y el delta de densidad óptica (405 nm).

Extracto EFE

% Germinación de B. cinerea1

% Inhibición de la Germinación de B. cinerea DO2 16 h 3∆ DO405nm

82 37,01 52,1 0,284 0,091 114 37,39 30,3 0,204 0,048 86 40 45,3 0,214 0,046 135 43,12 45,9 0,28 0,096 128 46,55 35,2 0,256 0,07 38 53,4 22,2 0,372 0,106 96 53,85 22,3 0,331 0,142 104 54,17 18,3 0,22 0,059 151 56,64 19,5 0,316 0,103 130 60,38 15,2 0,337 0,129 120 60,48 15,1 0,359 0,124 72 61,79 18,1 0,617 0,072 146 61,95 5,7 0,331 0,156 36 63,39 12,2 0,341 0,164 74 63,57 9,8 0,323 0,163 48 64,42 15,4 0,3 0,117 153 65,45 16,3 0,242 0,123 70 67,92 8,2 0,339 0,152 148 69,17 15,1 0,258 0,11 68 71,65 1,7 0,586 0,119 133 73,68 6,2 0,491 0,155 164 74,04 0 0,312 0,14 174 75,89 8,4 0,269 0,104 31 75 2,4 0,414 0,149 116 81,1 0 0,392 0,12 76 94,12 0 0,337 0,148 168 95 0 0,327 0,191 26 95 0 0,477 0,156

1 Germinación de B. cinerea presencia del extracto, 2 Densidad óptica en presencia del

extracto, 3 delta de la diferencia entre el tiempo 0 y 16h, después de corregir con los blancos.

79

0 0,04 0,08 0,12 0,16 0,237

47

57

67

77

87

97

Figura 21. Modelo de calibración lineal entre las variables delta de densidad óptica (405 nm)

y % de germinación de los extractos fúngicos producidos en el medio Czapeck-Dox, p<0.01.

(STATGRAPHICS, 4.2)

0 0,04 0,08 0,12 0,160

20

40

60

80

100

Figura 22. Modelo de calibración lineal entre las variables delta de densidad óptica (405 nm)

y % de germinación de los extractos fúngicos producidos en el medio YMG, p<0.01

(STATGRAPHICS, 4.2)

Delta de Densidad óptica (405 nm) después de 16 h

% d

e G

erm

inac

ión

de B

. cin

erea

Delta de Densidad óptica (405 nm) después de 16 h

% d

e G

erm

inac

ión

de B

. cin

erea

80

Tabla 12. Extractos fúngicos extracelulares producidos en el medio YMG,

empleados para la correlación entre el porcentaje de germinación para B. cinerea y el delta de densidad óptica (405 nm).

Extracto EFE

% Germinación de B. cinerea1

% Inhibición de la Germinación de B. cinerea DO2 16 h 3∆ DO405nm

8 0 75,6 0,286 0 159 3,64 72 0,359 0 56 7,14 85,6 0,314 0,028 37 30,69 59,7 0,591 0

167 50 35,3 0,283 0,047 147 52,42 14 0,419 0,066 27 58,06 26,2 0,419 0,1

157 62,39 15,9 0,675 0,064 149 71,61 0 0,422 0,14 175 71,96 0,5 0,271 0,035 30 75,7 13,4 0,315 0,099 47 78,07 3,7 0,29 0,105 83 78,38 0 0,567 0,043 87 78,64 11,8 0,391 0,103

127 80,53 8,5 0,456 0,15 165 80,65 3,7 0,631 0,135 93 81,13 0,6 0,27 0,027 4 81,52 7,5 0,409 0,073

95 83,33 0 0,437 0,111 117 83,48 0,8 0,427 0,152 107 84,4 0 0,268 0,152 51 86,21 2,8 0,359 0,122

123 87,16 0 0,443 0,05 119 95 0 0,262 0,1 150 95 0 0,578 0,092 81 95,83 0 0,807 0,138 41 97,14 0 0,346 0,112

1 Germinación de B. cinerea presencia del extracto, 2 Densidad óptica en presencia del

extracto, 3 delta de la diferencia entre el tiempo 0 y 16h, después de corregir con los blancos.

81

Cabe resaltar que el valor de la pendiente (443,166) de la ecuación del modelo de

asociación para los extractos producidos en YMG es mayor que la pendiente

(300,46) de la ecuación del modelo de asociación para los extractos producidos en

Czapeck Dox, esto indica que con los extractos producidos en el primer medio la

técnica es más sensible a las variaciones entre los datos de porcentaje de

germinación de B. cinerea y delta de densidad óptica a las 16h.

El modelo de calibración lineal con los extractos producidos en el medio YMG

(Figura 22), permitió inferir que se presentan dos grupos o categorías definidas una

con valores de porcentaje de germinación de B. cinerea de 0 a 40 % y deltas de

densidad óptica entre 0 y 0,04 y otro grupo con valores de porcentaje de

germinación de B. cinerea y deltas de densidad óptica superiores a 40 % y 0,04,

respectivamente (Figura 22), porque a partir de estos valores de germinación y de

densidad óptica los datos se dispersan, probablemente por el número de conidios

germinados e hifas con diferentes longitudes del tubo germinal. Por tanto, bajo las

condiciones del ensayo in vitro en microplacas desarrollado en este trabajo, se

puede considerar que un extracto fúngico extracelular producido en el medio YMG,

ubicado dentro del rango de delta de densidad óptica menor a 0.04 después de 16

horas de incubación con 5 x 105 conidios/ ml de B. cinerea a 26°C, puede tener

potencial para la inhibición de la germinación del fitopatógeno B. cinerea.

Los extractos fúngicos obtenidos con el medio YMG mostraron ser más

convenientes para su evaluación mediante turbidimetría, porque existen menos

variaciones en relación con el color de los mismos, mientras que la producción con

el medio Czapeck-Dox condujo a un mayor número de extractos pigmentados

respecto de YMG (Tablas 4, 5 y 6), incrementando la interferencia originada por el

color de los extractos en la densidad óptica y, por ende afectando la correlación de

los datos de porcentaje de germinación de B. cinerea y delta de densidad óptica

leída, después de 16h a una longitud de 405 nm. Además, el modelo de calibración

con los extractos producidos en CD no relaciona porcentajes de germinación

inferiores al 37% con deltas de densidad óptica (Figura 21). La mejor correlación se

presentó cuando se analizaron extractos dentro de la gama del amarillo,

principalmente producidos con el medio YMG.

82

Para los extractos codificados como EFE 49 y 56, producidos en el medio YMG,

pertenecientes al grupo 3 de inhibición alta (Figura 15), después de corregir con los

controles (extracto de malta 0.1%, extracto EFE sin conidios y testigo 1 x 105

conidios.ml-1 de B. cinerea en extracto de malta 0.1%) después de 16h de

incubación se observaron en el tiempo cero, valores de absorbancia (A405) inferiores

(Tabla 13) a los presentados en los pozos que contenían 5 x 105 conidios/ ml de B.

cinerea en combinación con el extracto de malta 0.1% únicamente.

Tabla 13. Relación entre el porcentaje de Inhibición de la germinación de B. cinerea y el delta de densidad óptica (405 nm), obtenido con los extractos

49 y 56, del grupo 3 de inhibición alta.

A405 Extracto EFE*

% Inhibición B. cinerea1 Extracto2

49 (1) 86,1 0,090 0,045

56 (2) 85,6 0,108 0,028

* Extractos producidos en el medio YMG por las morfoespecies 3-44 (1) y 3-223 (2). 1Promedio del valor de absorbancia (A405) para 5 x 105 conidios/ ml de B. cinerea en combinación con el extracto de malta 0.1% menos el valor en el tiempo cero para los mismos pozos. 2Promedio de 4 repeticiones de los valores de absorbancia (A405) después de 16 horas de incubación, corregidos con los controles y con el promedio de densidad óptica del testigo patógeno, en el tiempo inicial (hora 0) donde ∆ Densidad óptica (DO) en el Extracto = DO Blanco (Extracto de malta 0.1% más Extracto EFE) (0 h) – DO 1 x 105 conidios.ml-1 de en extracto de malta 0.1% (0 h).

Los bajos valores de densidad óptica para los extractos 49 y 56 (Tabla 13), se

relacionan con el porcentaje de inhibición de la germinación de B. cinerea, indicando

que a menores deltas de densidad óptica en comparación con el testigo patógeno,

mayores son los porcentajes de inhibición de la germinación del mismo.

Después de leer la densidad óptica (DO)(λ=405nm) en el tiempo inicial (t 0h), se

observó para el testigo patógeno diferencias entre los valores de densidad óptica,

razón por la que se hizo necesario determinar si existían diferencias en la

concentración inicial inoculada en cada uno de los pozos que llegaran a interferir

con la correlación de los datos en los dos medios de producción (CD y YMG);

83

después de transformar logarítmicamente los datos de concentración de B. cinerea

se encontró, un coeficiente de variación del 2,5% entre todas las repeticiones de los

bloques en el tiempo (>75 datos), indicando que en promedio se inoculó una

concentración de 4,5 x 105 conidios/ml (Log 10 : 5,657, desviación estándar (DS):

0.144, coeficiente de variación (CV): 2.5%) con un rango entre 3,0 x 105 y 7,7 x 105

conidios.ml-1 de B. cinerea y después de reemplazar en la ecuación de la curva de

calibración (Figura 19). En razón a estas variables, derivadas del empleo de hongos

filamentosos cuyo crecimiento no es tan fácil de cuantificar mediante turbidimetría

(Mischke, 1997) en comparación a microorganismos unicelulares (bacterias y

levaduras), no se encontraron reportes que correlacionen los parámetros evaluados

en este trabajo (% germinación y densidad óptica 405nm). Debe considerarse que la

germinación altera la medición de la densidad óptica sólo de forma limitada durante

las primeras 18h, ya que la mayoría de los cambios en la DO ocurren una vez los

conidios de B. cinerea han germinado y comenzado el crecimiento micelial para

experimentar la curva de crecimiento observada en los hongos filamentosos

(Wedge, 2005 comunicación). Por tanto, la densidad óptica correlaciona la fase de

crecimiento micelial, pero sólo hasta un tiempo óptimo cuando existe una sola capa

de micelio fúngico en el fondo de cada pozo, ya que a tiempos superiores las

lecturas que se generen pueden ser inexactas (Abril, 2005 comunicación).

Debido a lo anterior, en este trabajo no se encontró una relación clara entre el

porcentaje de germinación obtenido para el testigo patógeno, que osciló dentro del

rango de 60-90% de germinación en promedio, frente a los delta de densidad óptica

(405nm). No obstante, se evidenció una tendencia hacia el aumento del valor de

densidad óptica de B. cinerea después de 16 horas de incubación.

Además, al comparar la densidad óptica en el tiempo 0 para las lecturas del blanco

extracto de malta 0.1%, se observaron diferencias en los datos (>75) con un valor

promedio densidad óptica de 0.093, con un coeficiente de variación mayor al 15%

(coeficiente de variación (CV): 17,07; desviación estándar (DS): 0,016), estos

resultados de coeficiente de variación son muy altos para una solución de un

reactivo estándar y, probablemente también influyeron en la corrección del testigo

patógeno y por ende en los demás tratamientos (extractos EFE). De acuerdo con

84

Gehrt y colaboradores (1995), para propósitos de estandarización de este tipo de

técnicas turbidimétricas la concentración o tamaño del inóculo es considerado como

una variable crítica, que influye en la interpretación y correlación de los datos. Por lo

tanto, la concentración del inóculo para B. cinerea puede ser ajustada previamente

usando la curva de calibración obtenida, como se menciona en el documento M38-A

para la evaluación de antifúngicos frente a hongos filamentosos (NCCLS, 2002;

Salah et al., 2003).

Sin embargo, cuando se quiere usar la densidad óptica para medir crecimiento

fúngico, se observó mayor dispersión de los datos, lo cual concuerda con lo

obtenido por Paxton (1991) quien encontró un comportamiento disperso en el

crecimiento de muchos hongos filamentosos, lo que hace que la densidad de

conidios germinados no siempre sea uniforme en todas las suspensiones (Hadacek

y Greger, 2000), ya que aunque se presente germinación, no todos los tubos

germinales tienen el mismo tamaño; este fenómeno y el efecto de los extractos

puede interferir en la absorción de la longitud de onda emitida (Paxton, 1991; citado

por Hadacek y Greger, 2000). Además, al corregir los tratamientos EFE (extracto

EFE más 5 x 105 conidios/ml de B. cinerea en extracto de malta 0.1%) con el valor

de densidad óptica del extracto EFE control (sin conidios de B. cinerea) los datos

pueden indicar que no es el resultado de un factor aditivo por la diferencia de

colores y componentes del extracto crudo, haciendo que los deltas de densidad

óptica a las 16h no estén directamente relacionados entre sí, esto último sólo para

los EFE pigmentados.

Aunque en investigaciones previas se han evaluado estos dos parámetros, la

medición del crecimiento de B. cinerea en ocasiones se ha cuantificado por

detección visual de los pozos en la placa de ELISA con la ayuda de un

estereoscopio o espejo invertido (NCCLS, 2002; Pohanka et al., 2004) y aunque

Wilson y colaboradores (1997) realizaron recuento en microscopio, no hay una

correlación establecida reportada que explique la relación entre variables, lo cual es

necesario con miras al desarrollo de protocolos de alta eficiencia para la evaluación

y selección de compuestos antifúngicos.

85

Los resultados derivados de este trabajo en relación con la técnica, son una primera

aproximación de la asociación existente entre el porcentaje de germinación de

B. cinerea y el delta de densidad óptica (405nm), después de 16h, en un formato de

placas de microtitulación; aunque la técnica presentó limitaciones podría ser

utilizada para la evaluación preliminar de compuestos antifúngicos para determinar

su efecto en el control de B. cinerea. Sin embargo, ésta debe ser complementada

por determinación microscópica para detectar anomalías morfológicas por el efecto

de los metabolitos potencialmente inhibitorios.

5.3 ENSAYOS in Planta. 5.3.1 Selección del Bioensayo.

Ambos modelos (Foliolos y tallos), permitieron el desarrollo de la enfermedad,

expresada en valores de incidencia del 100% (Figuras 23 y 24). Sin embargo, la

aplicación puntual del patógeno en el ápice de los foliolos permitió evidenciar el

progreso del moho gris a lo largo de la estructura foliar, permitiendo evaluar el

avance del fitopatógeno. Por lo tanto, se seleccionó el método de aplicación puntual

respecto al de aspersión, ya que en este último no hay una sintomatología constante

y la lectura de los datos podría ser subjetiva sino se tiene un analizador de

imágenes.

Figura 23. Incidencia de B. cinerea en foliolos de tomate vs. modo de aplicación puntual o

por aspersión.

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15Días después de la Inoculación

Inci

denc

ia d

e la

infe

cció

n (%

)

Puntual

Aspersión

86

Figura 24. Incidencia de B. cinerea en tallos de tomate vs. modo de aplicación puntual o por

aspersión.

5.3.2 Evaluación de la actividad antifúngica de los extractos en ensayos in planta. Los extractos 49 y 66, producidos por las morfoespecies 44 (Penicillium sp.) y 110

(Aspergillus sp.), en los medios YMG y Czapeck-Dox, respectivamente y

seleccionados en los análisis estadísticos de agrupamiento (Figuras 12 y 13) dentro

del grupo 3 de inhibición alta de la germinación de B. cinerea, no fueron incluidos

dentro de los análisis de los resultados de fitoprotección contra B. cinerea, ya que

presentaron fitotoxicidad sobre los foliolos de tomate, desde los primeros días de la

inoculación (Figuras 25 y 26).

La inoculación puntual del patógeno sobre el ápice de la hoja, permitió evidenciar el

progreso de la enfermedad moho gris desde el sitio de inoculación (Figura 27). Sin

embargo, algunas hojas presentaron signos y síntomas del patógeno en otros sitios,

indicando que el inóculo de B. cinerea pudo desplazarse desde el punto inicial hasta

otros lugares de la superficie foliar, donde los conidios probablemente encontraron

las condiciones favorables para la colonización del huésped. Lo que en el testigo

patógeno, se tradujo en valores de incidencia del 100% después de 19 días (Figura

28), resultados que contrastan con los obtenidos cuando los foliolos fueron tratados

con los extractos fúngicos extracelulares, EFE 56 y 158 producidos con las

morfoespecies 223 y 150 en los medios YMG y Czapeck-Dox, respectivamente,

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20Días después de la Inoculación

Inci

denc

ia d

e la

Infe

cció

n %

PuntualAspersión

87

Figura 25. Fitotoxicidad sobre los foliolos de tomate en presencia del extracto 49 (a y b)

después de los primeros 8 días de inoculación en relación con el control no tratado (c).

Fuente: El Autor.

Figura 26. Fitotoxicidad sobre los foliolos de tomate en presencia del extracto 49 (a y b)

después de los primeros 8 días de inoculación en relación con el control no tratado (c).

Fuente: El Autor.

a b c

a b c

88

donde se presentaron porcentajes de incidencia de la enfermedad del 43.75 y

87.5% de incidencia (Figura 28), respectivamente.

Figura 27. Progreso del moho gris sobre los foliolos 8(a), 11(b), 13(c) y 19(d) días después

de la inoculación. Fuente: El Autor.

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20

Días después de la Inoculación

% d

e In

cide

ncia

Bo 56 158

Figura 28. Curva de progreso de la incidencia de la enfermedad moho gris en los foliolos de

Tomate.

a b c d

89

0,0010,0020,0030,0040,0050,0060,0070,0080,0090,00

100,00

% In

cide

ncia

56 158 Bo

Figura 29. Porcentaje de incidencia del moho gris, a los 19 d después de la inoculación

B. cinerea, en los foliolos de Tomate. Las columnas con la misma letra no son

significativamente diferentes de acuerdo con la prueba de Fisher LSD (P< 0,05).

Mediante la prueba de Fisher de diferencia de medias de mínimos significativos, se

observaron diferencias significativas (P< 0.05) en la incidencia del patógeno cuando

los foliolos se trataron con el extracto EFE 56 obtenido a partir de la morfoespecie

223 en YMG, frente al testigo patógeno y el extracto 158 obtenido por la

morfoespecie 150 en Czapeck-Dox en el último día de lectura (Figura 29). Desde el

día 8 hubo diferencias significativas entre los dos extractos, presentándose valores

del 12,5% y 41.67% de incidencia, respectivamente (Figura 28). En el día 19 los

tratamientos EFE 158 y el testigo patógeno no presentaron diferencias

estadísticamente significativas, para este parámetro de evaluación (Figura 29).

Para obtener el porcentaje de severidad se empleó el analizador de imágenes

Image J 1.33 u., de esta manera, se obtuvieron los diferentes datos de porcentaje

de área con signos y síntomas de Botrytis (Figura 30), esto permitió determinar el

incremento del Área bajo la Curva (UABC) para cada uno de los tratamientos

(Figura 31).

Tratamientos

b

a

a

Tratamientos

90

Figura 30. Menores porcentajes de área foliar con moho gris en presencia del extracto 56 (a,

día 13 y b, día 19) en relación con el testigo patógeno (c, día 19) y en presencia del extracto

158 (d, día 19). Fuente: El Autor.

0

100

200

300

400

500

600

700

0 6 8 11 13 19Días después de la Inoculación

Uni

dade

s de

Áre

a B

ajo

la C

urva

(U

ABC

)

56 Bo 158

Figura 31. Progreso de la severidad de la enfermedad moho gris en los foliolos de Tomate,

expresado en unidades de área bajo la curva (UABC).

a b c d

91

En lo que se refiere al porcentaje de severidad, se encontraron resultados

estadísticamente similares a los obtenidos para incidencia, ya que tampoco hubo

diferencias significativas entre la severidad observada en el testigo patógeno

(45,60%) y la observada cuando las hojas se trataron con el extracto (158)

proveniente de la morfoespecie 150 (66,06%) en el día 19 después de la

inoculación, pero sí se observaron diferencias frente al tratamiento con el extracto

56 (11,88%), proveniente de la morfoespecie 223, en el que si se presentaron

porcentajes de área enferma, estadísticamente diferentes P< 0,05 (Figura 33).

Aunque esta tendencia se conservó, con el análisis de varianza para la medias de

las unidades de área bajo la curva (UABC) en este mismo tiempo de lectura (19 d),

el extracto 56 sólo fue significativamente diferente respecto del extracto 158, pero

no frente al testigo patógeno. Para los que se presentaron valores promedio de

75.14 UABC, 354.88 UABC y 206.948 UABC, respectivamente (Figura 31, Anexo 3).

La diferencia de medias entre tratamientos, se observó a partir del día 13, para el

extracto 158 respecto de los otros dos tratamientos.

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

% S

ever

idad

56 Bo 158

Figura 32. Porcentaje de severidad de la enfermedad moho gris, a los 19 d después de la

inoculación de B. cinerea, en foliolos de tomate. Los valores son un promedio de

repeticiones de las áreas de lesión obtenidas con el programa Image J 1.33u. Las columnas

con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo con la prueba de Fisher

LSD (P< 0,05).

a

a

b

Tratamientos

92

El extracto 56 fue seleccionado como el más eficaz por presentar niveles de UABC

significativamente menores al presentado por el extracto 158, resultando en

porcentajes de reducción de la severidad de la enfermedad del moho gris superiores

al 70%, al finalizar el bioensayo (día 19) (Tabla 14).

Tabla 14. Porcentajes de Severidad y Eficacia, para el tratamiento EFE 56, después de 19 días de inoculación de B. cinerea Bo004.

Tratamiento % Severidad % Eficacia

EFE 56 11,83* 74,07

EFE 158 66,06 0

Los datos corresponden al promedio de cuatro repeticiones. *; Difiere significativamente

(P<0,05; F-test) del tratamiento EFE 158 y del testigo patógeno. Elad y Kapat, 1999, con el extracto fúngico de dos cepas de T. harzianum T39 y

NCIM1185 consiguieron una disminución de la severidad entre el 56 y el 100% y

entre el 30 y el 75%, respectivamente, este último valor es muy similar al porcentaje

de eficacia (74,07%) con el extracto EFE 56 con el que se obtuvo una significativa

reducción de la severidad (Tabla 14) especialmente cuando el aumento en la

incidencia se presentó en el último día de lectura (19 días).

Si se tiene en cuenta que la producción de las enzimas de B. cinerea proteasa

ácida, poligalacturonasas y lacasa, importantes en la patogénesis tienen un rango

óptimo de producción de pH de 4 a 6 (Manteau et al., 2003), en el presente trabajo

se presentó inhibición del fitopatógeno aún cuando el pH de el extracto 56 fue de

4.5, donde existen las condiciones propicias para la infección del huésped (Manteau

et al., 2003), lo que sugeriría que el efecto inhibidor se debe a otros factores

diferentes del pH presentes en dicho extracto. Aunque, el extracto EFE 158 pudo

tener un efecto en relación a este parámetro, debido a que presenta un pH de 8,0,

los resultados de incidencia y severidad (Figuras 29 y 32) demuestran que no hubo

inhibición de los síntomas y signos de B. cinerea indicando que puede no

93

correlacionarse la actividad in vitro con la presentada sobre los foliolos de tomate

(Fravel, 1988), infiriéndose que el extracto puede tener un efecto fungistático sobre

los conidios de B. cinerea in vitro, debido a que probablemente retrasó la

germinación in vitro pero permitió la infección sobre los foliolos de tomate (López-

García et al., 2000).

Respecto a los otros tratamientos EFE 49 y 66, que presentaron fitotoxicidad

(Figuras 25 y 26) se puede sugerir en la presencia de toxinas en los extractos 49 y

66 producidas por las morfoespecies de 44 y 110 correspondientes a los géneros

Penicillium sp. y Aspergillus sp. respectivamente, lo cual es concordante con lo

reportado por varios autores con el género Aspergillus sp. que encontraron que

algunos de sus metabolitos son fitotóxicos (Fravel, 1988; Evidente et al., 1996).

Cabe mencionar que es de interés el hallazgo del extracto 56 producido por la cepa

de Beauveria sp. (Figura 33), en relación con el control del moho gris in vitro e in

planta, indicando que puede llegar a convertirse en una alternativa para el

tratamiento del moho gris.

Figura 33. Beauveria sp. cepa 223, productora del extracto 56. Fuente: El Autor.

94

6. CONCLUSIONES

• Varios de los hongos del Amazonas evaluados demostraron ser una fuente

de compuestos con potencial para la inhibición de la germinación de

Botrytis cinerea.

• Se seleccionó un extracto (EFE 56) producido por Beauveria sp. por

presentar alta inhibición de Botrytis cinerea tanto in vitro (85,6%) como

in planta (74,07%), este es el primer reporte para la inhibición de este

fitopatógeno con Beauveria sp.

• La evaluación preliminar de EFE en el formato de placas microtitulación

demostró ser una técnica sencilla, eficiente y con potenciales aplicaciones

para otros procesos exploratorios, sin embargo está sujeta a las propiedades

de los extractos evaluados.

• Se seleccionó el bioensayo de aplicación puntual del patógeno en el ápice

de los foliolos de tomate, por mostrar mayor sensibilidad en relación con el

progreso del moho gris.

95

7. RECOMENDACIONES

• Caracterizar el extracto seleccionado (EFE 56) y evaluar la factibilidad de su

desarrollo como un producto fitoprotectante contra Botrytis cinerea.

• Continuar con estudios de bioprospección para buscar EFE crudos y nuevas

moléculas con alta actividad frente a la inhibición de Botrytis cinerea y de

otros fitopatógenos.

• Desarrollar una curva de crecimiento para Botrytis cinerea en el formato de

placas de microtitulación y cuantificar la longitud de los tubos germinales,

para determinar su efecto en la correlación de la densidad óptica con la

inhibición de la germinación.

• Evaluar in planta la actividad de los extractos fúngicos extracelulares (EFE)

ubicados dentro del grupo de inhibición media de la germinación de

Botrytis cinerea in vitro.

96

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109

9. ANEXOS

ANEXO 1

Medios de Cultivo

Czapeck-Dox g/L

Sacarosa 30,0

NaNO3 2,0

MgSO4 0,244

KCl 0,5

FeSO4 0,01

K2HPO4 1,0

Tween 80 1,0

YMG g/L

Extracto de Levadura 4,0

Extracto de Malta 10,0

Sacarosa 10,0

Tween 80 1,0

Agar Saboureaud g/L

Peptona Universal 2,0

Sacarosa 3,0

Agar 20,0

110

Agar Papa Dextrosa (PDA) g/L

Papa 200,0

Dextrosa 10,0

Agar 20,0

111

ANEXO 2 Modelo de calibración lineal para los EFE producidos en Czapeck-Dox Calibration Models

Y (measured): GX (actual): Deltaabs16

Linear model: Y = a + b*X----------------------------------------------------------------------------- Standard TParameter Estimate Error Statistic P-Value-----------------------------------------------------------------------------Intercept 28,1674 7,40452 3,80409 0,0008Slope 300,46 59,1177 5,0824 0,0000-----------------------------------------------------------------------------

Analysis of Variance-----------------------------------------------------------------------------Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value-----------------------------------------------------------------------------Model 3406,41 1 3406,41 25,83 0,0000Residual 3428,73 26 131,874----------------------------------------------------------------------------- Lack-of-Fit 2882,58 25 115,303 0,21 0,9608 Pure Error 546,151 1 546,151-----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.) 6835,14 27

Correlation Coefficient = 0,705951R-Squared = 49,8367 percentStandard Error of Est. = 11,4836

Residual Analysis--------------------------------- Estimation Validationn 28 MSE 131,874 MAE 9,106 MAPE 14,7229 ME -7,61296E-15 MPE -3,05431

The StatAdvisor--------------- The output shows the results of fitting a linear model to describethe relationship between G and Deltaabs16. The equation of the fittedmodel is

G = 28,1674 + 300,46*Deltaabs16

Because the P-value in the ANOVA table is less than 0.01, there is astatistically significant relationship between G and Deltaabs16 at the99% confidence level.

The R-Squared statistic indicates that the model as fitted explains49,8367% of the variability in G. The correlation coefficient equals0,705951, indicating a moderately strong relationship between thevariables. The standard error of the estimate shows the standarddeviation of the residuals to be 11,4836. This value can be used toconstruct prediction limits for new observations by selecting theForecasts option from the text menu.

The lack of fit test is designed to determine whether the selectedmodel is adequate to describe the observed data, or whether a morecomplicated model should be used. The test is performed by comparing

112

Modelo de calibración lineal para los EFE producidos en YMG Calibration Models

Y (measured): GX (actual): Deltaabs16h

Linear model: Y = a + b*X----------------------------------------------------------------------------- Standard TParameter Estimate Error Statistic P-Value-----------------------------------------------------------------------------Intercept 30,5577 7,48327 4,08347 0,0004Slope 443,166 79,4658 5,57681 0,0000-----------------------------------------------------------------------------

Analysis of Variance-----------------------------------------------------------------------------Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value-----------------------------------------------------------------------------Model 13445,5 1 13445,5 31,10 0,0000Residual 11240,3 26 432,321----------------------------------------------------------------------------- Lack-of-Fit 9897,16 21 471,293 1,75 0,2779 Pure Error 1343,19 5 268,639-----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.) 24685,9 27

Correlation Coefficient = 0,738014R-Squared = 54,4665 percentStandard Error of Est. = 20,7923

Residual Analysis--------------------------------- Estimation Validationn 28 MSE 432,321 MAE 16,0452 MAPE ME 1,01506E-15 MPE

The StatAdvisor--------------- The output shows the results of fitting a linear model to describethe relationship between G and Deltaabs16h. The equation of thefitted model is

G = 30,5577 + 443,166*Deltaabs16h

Because the P-value in the ANOVA table is less than 0.01, there is astatistically significant relationship between G and Deltaabs16h atthe 99% confidence level.

The R-Squared statistic indicates that the model as fitted explains54,4665% of the variability in G. The correlation coefficient equals0,738014, indicating a moderately strong relationship between thevariables. The standard error of the estimate shows the standarddeviation of the residuals to be 20,7923. This value can be used toconstruct prediction limits for new observations by selecting theForecasts option from the text menu.

The lack of fit test is designed to determine whether the selectedmodel is adequate to describe the observed data, or whether a morecomplicated model should be used. The test is performed by comparing

113

ANEXO 3 Análisis de comparación de medias para los porcentajes de incidencia en el día 19. Prueba de Fisher LSD (α=0.95) Multiple Range Tests for Col_6 by Col_4

--------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSDCol_4 Count Mean Homogeneous Groups--------------------------------------------------------------------------------5619 4 43,75 X 15819 4 87,5 X419 3 100,0 X--------------------------------------------------------------------------------Contrast Difference +/- Limits--------------------------------------------------------------------------------419 - 5619 *56,25 43,3377 419 - 15819 12,5 43,3377 5619 - 15819 *-43,75 40,1229 --------------------------------------------------------------------------------* denotes a statistically significant difference.

The StatAdvisor--------------- This table applies a multiple comparison procedure to determinewhich means are significantly different from which others. The bottomhalf of the output shows the estimated difference between each pair ofmeans. An asterisk has been placed next to 2 pairs, indicating thatthese pairs show statistically significant differences at the 95,0%confidence level. At the top of the page, 2 homogenous groups areidentified using columns of X's. Within each column, the levelscontaining X's form a group of means within which there are nostatistically significant differences. The method currently beingused to discriminate among the means is Fisher's least significantdifference (LSD) procedure. With this method, there is a 5,0% risk ofcalling each pair of means significantly different when the actualdifference equals 0.

114

Análisis de comparación de medias para los porcentajes de severidad en el día 19. Prueba de Fisher LSD (α=0.95) Multiple Range Tests for Col_5 by Col_4

--------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSDCol_4 Count Mean Homogeneous Groups--------------------------------------------------------------------------------5619 4 11,8825 X 419 3 45,6067 X15819 4 66,0625 X--------------------------------------------------------------------------------Contrast Difference +/- Limits--------------------------------------------------------------------------------419 - 5619 *33,7242 24,1302 419 - 15819 -20,4558 24,1302 5619 - 15819 *-54,18 22,3402 --------------------------------------------------------------------------------* denotes a statistically significant difference.

The StatAdvisor--------------- This table applies a multiple comparison procedure to determinewhich means are significantly different from which others. The bottomhalf of the output shows the estimated difference between each pair ofmeans. An asterisk has been placed next to 2 pairs, indicating thatthese pairs show statistically significant differences at the 95,0%confidence level. At the top of the page, 2 homogenous groups areidentified using columns of X's. Within each column, the levelscontaining X's form a group of means within which there are nostatistically significant differences. The method currently beingused to discriminate among the means is Fisher's least significantdifference (LSD) procedure. With this method, there is a 5,0% risk ofcalling each pair of means significantly different when the actualdifference equals 0.

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