ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS, TECNOLOGA E INGENIERA

ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS, TECNOLOGA E INGENIERA

INGENIERA DE ALIMENTOS

Asignatura: Biotecnologa alimentaria. (301105). Segunda evaluacin (Jueves 8 de mayo.)Temtica: Tecnologa enzimtica. Extraccin, caracterizacin, purificacin y cintica.

Tutor: Glaehter Yhon Florez Guzmn.Nombre: ________________________________________

Cdigo: ____________

1. Describa una metodologa para determinar el nmero de subunidades de un enzima alostrica purificada.2. Determine el peso molecular en KDa, de la enzima mostrada en la figura 1.

Figura 1. Electroforesis correspondiente a la purificacin de la enzima inulin fructotransferasa, de Arthrobacter ureafaciens. Los marcadores de peso molecular estn dados en kilo daltons (Kda). M: marcadores de pesos moleculares, 1: muestra patron, 2: muestra de precipitacin con sulfato de amonio. Tomado de: Kelleyt R. L. 1986. Journal Of Bacteriology, Apr. P. 269-274 166, No. 1

3. En un laboratorio de Tabla 1. Caractersticas del extracto enzimtico de la fermentacin de Bacillus subtilis.ProtenaP.I.P.M. (Kd)Carga a pH 7.8Actividad (U)aPrecipitacin

con sulfato de amonio al 30%

A520+ + + + +2.03No

B5.425+ + + +0.04Si

C725++- - - - 0.00No

D8.927- - - - -1.06No

E8.535- - - -3.01Si

F7100+ 6.98Si

G9.8160+ + + + +3.70No

H5.260- - 10.1No

I745- 0.00No

a) actividad proteoltica expresada como microgramos de triptfano /ml por minuto a una temperatura de 42C, pH: 8,5, 1mg/ml de protena (BSA) y una concentracin de enzima de 0,2 microgramos por ml.

Se cuenta con las siguientes tcnicas:

a. Sulfato de amonio y una solucin al 40% de saturacin.

b. Membrana de dilisis de un tamao de poro de 12000 Da.

c. Dos cartuchos de ultrafiltracin con un tamao de poro de 30 KD y uno de 20 KD.

d. Columna de exclusin por tamao (sephadex G-100) que separa protenas entre 50 y 150 KD.

e. Columna de intercambio catinico (amberlita, la cual retiene cationes (-) a pH 7.8).3.1. Si la actividad proteoltica de la enzima se disminuye a cero cual seria el procedimiento para su purificacin.4. Complete la tabla 2. correspondiente a la purificacin enzimtica de una levanasa producida por Bacillus subtilis y clonada en E. coli.Tabla 2. Purification of B. suptilis levanase produced in E. coli.

StepProtein (mg)Total activity (U)Yield (%)Purification

Crude extract 1,944,10

Ammonium sulfate precipitation1,173,76

DEAESepharose CL-6B

Peak I 13,10,82

Peak II 12,71,14

S-Sepharoseb

Peak I 4,60,36

Peak II 2,40,2

MonoQ 1,30,12

Tomada de: Erich Wanker, Anton Huber, and Helmut Schwab: Purification and characterization of the Bacillus subtilis Levanase Produced in Escherichia coli. Applied And Environmental Microbiology, May 1995, Vol. 61, No. 5 p. 19531958 5. Determine la velocidad mxima y el Km de las dos enzimas reportadas en la tabla 3. Establezca cual de ellas tiene mayor afinidad por el sustrato, y determine que tipo de inhibicin presenta la enzima 2 en presencia de calcio.

Tabla 3. Variacin de la actividad enzimtica con respecto a la concentracin de sustrato de dos enzimas invertasas.

Enzima 1Enzima 2Enzima 2 + CaCl2 (0.3M)

Sustrato (M)aActividad (U)Sustrato (M)aActividad (U)Sustrato (M)aActividad (U)

000000

0,111,50,1110,110,5

0,221,90,221,50,221

0,332,30,3320,331,5

0,442,50,442,30,442

0,552,80,552,50,552,5

0,6630,662,80,662,8

0,7730,772,80,772,8

0,883,20,882,90,882,9

1,13,21,12,81,12,8

1,323,21,322,81,322,8

a) Concentracin molar de sacarosa en buffer fosfatos 50 mM a pH: 5.5.6. Segn la lectura de enzimas alostricas de Eduardo Cardenas, explique:

a. En que consiste el modelo concertado o simetra (MWC) y el modelo secuencial generalizado (KNF) y cual es su principal diferencia.

b. Explique el comportamiento de la enzima Alostrica mostrada en la figura 3. con la hiptesis KNF.

c. Explique en que consiste la coperatividad positiva y negativa.

Figura 2. Relacin velocidad y concentracin de sustrato de dos enzimas. --- micheliana y - - - alostrica.

7. Explique los siguientes mtodos de inmovilizacin:

a. Atrapamiento.

b. Entrecruzamiento.

c. Reticulado.

8. Describa mnimo cuatro metodologas utilizadas para la extraccin de una enzima intracelular, de una cepa de Leuconostoc mesenteroides.

9. El Vm y el Km de una enzima glucosiltransferasa son: 5,4 U, y 0,4 M respectivamente. Si se realiza los mismos ensayos, pero cambiando los siguientes tems Qu ocurrira, y como afectara el valor de Km y Vm?

a. Duplicando la cantidad de enzima inicial.

b. Aumentando la cantidad de enzima en forma exponencial.

c. Disminuyendo a una cincuentava parte la concentracin de sustrato.

10. Se requiere cuantificar la actividad enzimtica de una enzima invertasa comercial; para esto realiz una reaccin enzimtica utilizando 2ml de enzima y 5 ml de sustrato. Se cuantific produccin de glucosa a travs del tiempo Tabla 4. Determine la actividad enzimtica U/ml total de la enzima comercial.

La unidad de actividad se expresa como: cantidad de enzima necesaria para producir 1 mM de glucosa por minuto a 40C, pH 4,5 y una concentracin de sustrato del 20%p/v.

Tabla 4. Datos de los anlisis de las alcuotas del paso anterior.

Tiempo

(min)Concentracin de glucosa

(mg/ml)

00

51,5

101,9

152,3

202,5

302,8

403

503

603,2

703,2

903,2

Inulin fructotransferasa

(S)

V

Estado T

Estado R