Kissi Rubio H.

Universidad San Sebastián

• El término “secuencia” designa la

composición de nucleótidos en un

trozo de ADN.

• Ese trozo de ADN puede

corresponder a un gen, un

genoma, o una parte de ellos.

• Secuenciar permite determinar el

tipo y orden de sus nucleótidos.

• Para obtener el genoma basta

secuenciar una sola copia del

ADN.

• En el humano se secuencian

aprox. 3.400 millones de pb.

Imágenes:

http://www.unidaddebiofisica.org/juanma/seminario1/sem1.htm

http://www.genytec.cl/secuenciacion.html

• 1976-1977, Allan Maxam y Walter

Gilbert desarrollan un método para

secuenciar ADN basado en la

modificación química del ADN y

posterior escisión en bases

específicas

• 1975, Sanger presenta un método

de secuenciación enzimática

• 1980, Sanger y Gilbert reciben el

premio Nobel de Química.

Imágenes:

http://www.xtimeline.com/evt/view.aspx?id=131758

• Se usa P radioactivo para marcar el ADN

• Se fracciona con reacciones específicas para cada base

• 4 alícuotas de la misma muestras se tratan en

condiciones diferentes (DMS (G), ácido fórmico (A+G),

hidrazina (C+T) e hidrazina más sales (C) )

• Tratamiento con piperidina rompe en la base modificada

• Los productos se separan en gel por electroforesis según

su tamaño

Imagen:

http://www.unidaddebiofisica.org/juanma/seminario1/sem1.htm

• El método de secuenciación ideado por Sanger está

basado en el empleo de dideoxinucleótidos

• Cuando uno de estos nucleótidos se incorpora a una

cadena de DNA en crecimiento, esta cadena no puede

continuar elongándose.

• Esto es así ya que la DNA polimerasa necesita un grupo

terminal 3’ OH para añadir el siguiente nucleótido y el

dideoxinucleótido incorporado carece de este grupo

hidroxilo

• Se aísla y se clona el DNA que se desea secuenciar.

• Se emplea una sola hebra para la secuenciación.

• Se utiliza un “primer” que se encarga de suministrar el

terminal 3’OH que necesita la DNA polimerasa para

comenzar a elongar.

• Se preparan cuatro tubos de reacción, cada uno con el

DNA molde de hebra sencilla que se desea secuenciar,

con DNA polimerasa, con el “primer” y con los cuatro

nucleótidos trifosfatados.

• A cada tubo se le añade dideoxinucleótido trifosfato;

ddATP, ddTTP, ddGTP y ddCTP.

• En cada tubo se producen cadenas de DNA de distintas

longitudes.

• Los productos de las 4 reacciones, son cargados en un

gel y sometidos a electroforesis.

• Así, obtendremos un patrón de bandas en orden, del que

deducir la secuencia del ADN introducido.

Imagen:

http://universe-review.ca/R11-16-DNAsequencing.htm

Imagénes:

MOLECULAR BIOLOGY IN INFECTIOUS DISEASES. PART I. DEVELOPMENT AND

METHODOLOGIES, ALEJANDRO CORVALÁN R

http://universe-review.ca/R11-16-DNAsequencing.htm

• Existen algunas modificaciones en

la metodología

• Se pueden usar cebadores

marcados por fluorencencia o

ddNTPs marcados

• Facilitan la detección de los

nucleótidos.

• Permite realizar una sola reacción.

Imagen:

http://universe-review.ca/R11-16-

DNAsequencing.htm

• Método de secuenciación de ADN en tiempo real.

• Basado en la liberación de los pirofosfatos (PPi) en la reacción de polimerización del ADN a partir de sus dNTPs.

• No requiere correr en un gel los fragmentos de ADN generados.

• A medida que la reacción transcurra, se obtiene una serie de picos de señal en el pirograma

Imagen:

https://www-eng.llnl.gov/bio_tech/bio_tech_pyro.html

Tres pasos:

• Adición de uno de los 4 dNTPs , si es el complementario

a la base de la hebra molde que toca copiar, será

procesado, liberando un PPi.

• PPi es convertido a ATP al reaccionar con adenosina 5’-

fosfosulfato por medio de la ATP-sulforilasa.

• Emisión de radiación como consecuencia de la oxidación

de la luciferina a oxiluciferina catalizada por la luciferasa

de consumiendo el ATP

• La altura de los picks se

correlaciona con la cantidad

de nucleótidos agregados.

• A mayor altura mayor

número de nucleótido

agregados de forma

consecutiva.

Imágenes:

http://www.bdigital.unal.edu.co/8691/1/1186308.2010.pdf

https://www-eng.llnl.gov/bio_tech/bio_tech_pyro.html

• Desarrollado por Tabor y Fueller en Harvard.

• Permite secuenciar más de mil nucleotidos

• Este método permitió la caracterización del

Genoma Humano entre 1990 y 2000

• El desarrollo de la

bioinformática es clave en

las metodologías masivas.

Imagen:

http://bioinformatica.uab.es/base/base.asp?sitio=ensayosgenetica&anar=

pgh

• El ADN fragmentado se clona en un Vector.

• Se amplifica y se puede purificar a partir de las células bacterianas.

• los fragmentos purificados se secuencian completamente

• El ensamblaje se realiza de manera computacional en una secuencia larga y contigua identificando las secuencias que se solapan entre sí.

Imagen:

http://universe-review.ca/R11-16-DNAsequencing.htm

• Herramientas

computacionales y

bases datos permiten

determinar y

secuenciar con

rapidez una gran

cantidad de

nucleótidos

• La secuenciación es la herramienta que permitió

caracterizar el material genético.

• Permite leer ordenar una gran cantidad de información,

contenida en el material biológico.

• Estos grandes avances siguen teniendo limitantes en

cuanto a costos al tiempo de duración del análisis de

datos.

• Esto representa un desafío multidisciplinario desde la

biología y el desarrollo informático.

Premio Arconte X:

• 10 millones de dólares al "primer equipo que pueda

construir un dispositivo y utilizarlo para secuenciar 100

genomas humanos en 10 días o menos, con una

exactitud no menor a un error por cada 100.000 bases

secuenciadas, con secuencias que cubran

correctamente al menos el 98% del genoma, y a un

coste no mayor de USD1.000 por genoma."

Bibliografía

• Bautista R. , Las tres generaciones de la Secuenciación,

Universidad de Málaga, España, 2010.

• Trelles P., Secuenciación de ADN, universidad de Málaga, España,

2011.

• Martínez F., Secuenciación a gran escala, una carrera sin límite a la

vista, 2009.

Sitios de interés:

https://www-eng.llnl.gov/bio_tech/bio_tech_pyro.html

http://universe-review.ca/R11-16-DNAsequencing.htm