SABERES INTEGRADOS

MARCO TEÓRICO

1. PLANTAS DEL GÉNERO Vasconcella (Carica papaya)

En este apartado se puede apreciar información general sobre el origen de la papaya, caracterización de la planta, propagación y cultivo de la papaya, descripción de las diferentes variedades de papaya, composición química, importancia y usos potenciales en Venezuela información que era desconocida para los investigadores y que integra la parte exploratoria del tema con la que se identifico y caracterizo la planta y el fruto con el que se trabajo en el área experimental.

1.1. ORIGEN Y DISPERSIÓN

La papaya (Carica papaya), es una especie originaria de América Tropical, en

especial de América Central y de la Costa Occidental de América del Sur, siguiendo los

valles húmedos de la cordillera Andina. En ellos, Colombia y Ecuador presentan el mayor

número de especies pertenecientes a la familia de las caricáceas, entre las que se destacan la

papaya y los llamados papayuelos de clima cálido, medio y frío.

Actualmente se cultiva en todas las zonas tropicales y subtropicales del mundo,

entre los 32 grados de latitud norte y sur del Ecuador, como consecuencia de la dispersión

realizada por los marinos españoles y portugueses, pocos años después del descubrimiento

de América. Fue descrita por primera vez por el cronista español Oviedo en 1526 en la

Costa Caribe de Panamá y Colombia. A Panamá llegó en 1535, a Puerto Rico en 1540 y

unos años después, a Cuba. En 1611 se cultivaba en la India y a partir de 1800 fue

ampliamente distribuida en las islas del sur del Océano Pacífico. (Scheldeman y Van

Damme, 2005).

1.2. TAXONOMÍA

El género Vasconcella, que incluye 21 especies, fue definido como tal en el año

2000 y es el más importante de la familia Caricácea (Scheldeman y Van Damme, 2005).

En la Tabla 1.1, se detalla la clasificación taxonómica de este género.

Tabla 1. Clasificación taxonómica del género Vasconcella.

Reino Plantae

Subreino Tracheobionta

Superdivisión Spermatophyta

División MagnolioPhyta

Clase Magnoliopsida

Subclase Dilleniidae

Orden Violales

Familia Caricaceae

Género Vasconcella

La papaya es una planta dicotiledónea, perteneciente a la familia Caricaceae. Esta

pequeña familia tiene 4 géneros con 71 especies. Un elevado número de especies del

género Carica son nativos de América Central y la zona noroccidental del América del Sur,

principalmente de los valles húmedos de los Andes.

El fruto es una baya de tamaño, peso y forma variable, dependiendo de la variedad o

selección. Mide de 10 a 60 cm de largo y llega a pesar varios kilogramos. El color de la

pulpa también depende de la selección, normalmente amarilla o rojo-anaranjada, de textura

suave y de un espesor de 3 a 5 cm. La superficie del fruto suele tener 5 surcos poco

profundos. La cáscara se torna de verde oscuro a verde claro y luego amarillo-dorado. Las

semillas están en la cavidad interna del fruto. La planta puede producir unos 100 frutos por

año. Las semillas son esféricas, pequeñas y negras. Están envueltas en una capa

mucilaginosa llamada sarcotesta o cubierta. Un fruto bien polinizado llega a tener de 300 a

700 semillas.

La papaya pertenece a un grupo de especies de plantas conocidas como plantas

laticíferas. Estas plantas contienen una serie de células ramificadas e interconectadas que

forman una matriz de tubos complejos, dispersos a lo largo de la mayoría de los tejidos

de las plantas, que secretan una sustancia conocida como “látex”. En conjunto, estos

compuestos se cree que están implicados en la defensa de la planta contra una amplia

variedad de plagas y herbívoros. (Scheldeman y Van Damme, 2005).

1.3. MORFOLOGÍA

1.1.1. RAÍZ

El sistema radical es pivotante. La raíz principal es desarrollada y ramificada en

forma radial y puede crecer hasta 1.5 metros de profundidad, dependiendo de las

limitaciones físicas ó químicas del suelo donde se siembre. Las raíces secundarias son de

color blanco-crema y se encuentran distribuidas en los primeros 30 centímetros del suelo.

(Salazar, C.R. 1988).

1.1.2. TALLO

El tallo generalmente es único, no ramificado, algo lignificado en la base y puede

alcanzar alturas hasta de 12 metros. Con el transcurso de los años el tronco tiende a

volverse más fibroso y hueco; a medida que envejece va tomando una coloración grisácea y

se notan unas cicatrices triangulares en los puntos de inserción de las hojas ya caídas.

Cuando el brote terminal ha sido afectado por una causa extraña se presenta la ramificación

del tallo. (Salazar, C.R. 1988).

1.1.3. HOJAS

Las hojas son de pecíolos largos y huecos; de color verde, morado o una

combinación de éstos dos colores; la lámina foliar es grande, gruesa, algo coriácea, de

forma palmeada, hendida y palminervia. El haz es de color verde oscuro, lampiño; el envés

es más claro y en él se observan las nervaduras protuberantes. Las hojas aparecen en forma

alterna a lo largo del tallo; una cada cuatro días aproximadamente, para un total de 100

hojas por año. (Salazar, C.R. 1988).

1.1.4. FLORES

Las flores nacen en la axila de cada hoja y pueden ser pistaladas, estaminadas o

pistilo-estaminadas, dando lugar a plantas femeninas, masculinas o hermafroditas,

respectivamente. Son blancas cuando están maduras, de cinco pétalos, de corola carnosa y

ausentes de néctar. El papayo es una especie polígama, por presentar tres tipos sexuales

primarios: plantas estaminadas o masculinas, pistaladas o hembras y bisexuales o

hermafroditas.

1.1.4.1. FLOR ESTAMINADA O MASCULINA

Se forma en plantas machos y se encuentran en ramilletes sobre largos pedúnculos

que nacen en las axilas de las hojas. La flor es pequeña de forma tubular; posee un cáliz

muy reducido, gamosépalo y de color verde claro; la corola es gamopétala, con cinco

pétalos color blanco-cremoso y alargado. Posee diez estambres agrupados en la parte

superior de la corola y un pistilo rudimentario con ovario vestigial. Esta flor no produce

frutos, aunque algunas flores terminales del racimo pueden desarrollar un pistilo y por esta

razón se pueden encontrar plantas machos produciendo frutos que por lo general son

deformes, alargados o curvados y de mala calidad.

1.1.4.2. FLOR PISTALADA O FEMENINA

Se forma en el tallo principal de las plantas hembras, en las axilas de las hojas sobre

un pedúnculo corto. Es por lo general solitaria, aunque puede presentarse en racimos de

hasta cinco flores pero generalmente solo se desarrolla una. Son flores grandes de forma

acampanada; el cáliz es gamasépalo y la corola posee cinco pétalos grandes, de color

blanco-cremoso, ligeramente carnosos, libres o soldados en su base. Ovario superior,

grande y de forma redondeada; termina en una estigma, sentado y dividido en cinco lóbulos

en forma de abanico. En su interior posee una gran cantidad de óvulos de placentación

parietal. Carece de estambres y órganos masculinos por lo que necesita para ser polinizada

de plantas masculinas o hermafroditas. Esta flor produce frutos globosos.

1.1.4.3. FLOR HERMAFRODITA

Se encuentra solitaria o en pequeños racimos sobre un pedúnculo corto y en la axila

de las hojas de plantas hermafroditas. Se diferencia de la flor hembra en su forma, ya que

presenta un cuello o cintura por encima de su base, aunque, dependiendo del tipo de flor,

también puede ser acampanada. Flores de cinco a diez estambres, de filamentos coitos y

anteras de una coloración amarillo naranja, localizados en la cara inferior de los pétalos. El

ovario es de tipo alargado o cilíndrico; los pétalos están unidos hasta la mitad de su

longitud.

1.1.4.4. FLOR PENTANDRIA

La corola se compone de cinco pétalos unidos en su base; el ovario es globoso y con

cinco lóbulos marcados. Posee cinco estambres con filamentos largos adheridos a la base de

la corola. Los estambres se encuentran pegados a la pared del ovario, dejando claramente

marcados cinco surcos longitudinales, los cuales son fácilmente visibles cuando el fruto se

desarrolla. Esta flor es muy parecida a la flor hembra y sólo se diferencia de ella, por la

presencia de los estambres. Al igual que la flor hembra, produce frutos globosos, pero con

surcos más pronunciados.

1.1.4.5. FLOR ELONGATA

Es una flor alargada y con un cuello o cintura visible encima de la base. La corola

está formada por cinco pétalos unidos más o menos en una tercera parte de su longitud.

Tiene diez estambres, colocados en dos series de cinco cada uno, adheridos al tubo de la

corola. El ovario es alargado, por lo que produce frutos de la misma forma.

1.1.4.6. FLOR INTERMEDIA

Es un tipo intermedio entre la pentandria y la elongata; sus pétalos están unidos en

una tercera parte de su longitud, a veces lo sobrepasa, lo que hace que el tubo de la corola

varíe de tamaño. El número de estambres varía de cinco a diez, colocados irregularmente en

el tubo de la corola. Los filamentos de los estambres se funden con la pared del ovario y

causan deformaciones del fruto al crecer al tiempo con él, produce frutos alargados y

deformes, conocidos como "cara de Gato"' los cuales no son comerciales.

1.1.4.7. FLOR ESTÉRIL

Son flores muy parecidas a las masculinas y se diferencian de ellas en que se

encuentran unidas al tallo por un pedúnculo corto. Al igual que las masculinas, su corola es

gamopétala, por lo que presenta forma tubular. No posee ovario fértil. Este es filamentoso y

no funcional.

Como las flores machos, no producen frutos. La presencia de flores intermedias e

irregulares, aun cuando son de carácter genético, se presenta por cambios ambientales,

especialmente de temperatura y humedad del suelo.

1.2. PROPAGACIÓN Y CICLO DE CULTIVO

Las especies del género Vasconcella, generalmente, son propagadas por

semillas, aunque en algunas especies es posible la propagación vegetativa por

esquejes. La germinación de las semillas puede ser lenta (de aproximadamente 30 días) y

difícil, pero siempre mejora si se aplica una inmersión previa de 24 horas en ácido

giberélico (GA3). En el caso del híbrido natural Vasconcella × heilbornii, la propagación

mediante esquejes es sencilla; sin embargo, con el propósito de ampliar la variabilidad de

las nuevas plantas, se puede utilizar GA3 para estimular la germinación de las semillas

viables que se encuentren en los frutos. También es posible realizar injertos entre especies,

sobre todo con el fin de evitar algunos hongos y nemátodos de las especies sensibles

(Harling, 1990).

La determinación del sexo solo puede efectuarse en la primera floración, de manera

que es aconsejable realizar una plantación múltiple y luego de la primera floración,

seleccionar las plantas femeninas. Sin embargo, en especies dioicas, es necesario mantener

algunos polinizadores masculinos para una adecuada frutación.

En el caso de los frutos partenocárpicos de Vasconcella × heilbornii, su

propagación por esquejes da como resultado campos homogéneos de plantas femeninas. La

floración comienza, según la especie, algunos meses después del trasplante y los primeros

frutos pueden ser cosechados 6 meses más tarde (Scheldeman y Van Damme, 2005).

1.3. VARIEDADES DE PAPAYAS

1.3.1. SOLO

Variedad de tipo hermafrodita, producida en Hawai y la más conocida y sembrada a

nivel mundial, por su calidad y tamaño de la fruta. Las plantas hermafroditas producen

frutos en forma de pera, con un peso promedio de 450 gramos, con pulpa amarilla ó rosada

intensa, dependiendo de la selección.

1.3.2. CARIFLORA

Variedad recientemente creada en la Florida, de tipo dioico. Las plantas hembras

son altamente productivas, de porte intermedio, de dos a tres frutos por axila, casi esféricos

y de un peso entre 500 y 750 gramos. La pulpa es de color amarillo intenso y de buena

calidad.

1.3.3. MARADOL

Es una variedad hermafrodita originaria de Cuba, con dos selecciones de frutos con

pulpa amarilla y roja, ambos de excelente calidad y resistencia al transporte. Los frutos son

alargados, con un peso promedio de 1500 g. Esta variedad está siendo sembrada

ampliamente en México uno de los países mayores productores de papaya. CORPOICA la

está utilizando para la producción de híbridos con líneas dioicas avanzadas que presentan

tolerancia a enfermedades causadas por virus.

1.3.4. ZAPOTE

Es un tipo de papaya que se cultivaba en la Costa Atlántica y que mantuvo sus

características hasta que se iniciaron siembras de otras variedades ó tipos. Es de tipo

hermafrodita, de porte alto y muy productiva. Sus frutos son globosos ó alargados,

dependiendo del sexo de la planta, de tamaño grande, hasta de tres kilos. Pulpa de color

rosado intenso al que debe su nombre y de buena calidad para el mercado nacional.

1.3.5. MELONA

Igual que la anterior, es un tipo de papaya que en la actualidad está mezclada con

otras variedades y tipos. Ha sido ampliamente sembrada en Santander del Sur y en los

Llanos Orientales. Sin embargo, los virus han limitado su cultivo en estas zonas, ya que es

muy susceptible, llegando a reducirse el área sembrada hasta un 50%.

Es de tipo hermafrodita, de porte intermedio a alto. Produce frutos que alcanzan

hasta cinco kilos de peso, de calidad variable y pulpa amarilla. Dependiendo del sexo de la

planta, los frutos son globosos o alargados, siendo preferidos los últimos en el mercado

nacional.

1.4. OTRAS VARIEDADES

Las variedades 'Carica VP-1' y 'Carica VP-2', son las primeras variedades mejoradas

de papaya obtenidas por el ICA en Colombia, en el Centro de Investigaciones de Palmira.

Son de tipo "dioico", es decir, presentan solamente plantas machos y hembras (50% de cada

sexo).

1.4.1. CARICA VP-1

Es medianamente precoz. Florece entre los 70 y 80 días después del trasplante y

produce 170 días después. Tiene tallos morados y ñutos redondos de pulpa amarilla de un

peso aproximado de 1.200gramos.

1.4.2. CARICAVP-2

Es más precoz. Florece entre los 50 y 60 días después del trasplante e inicia

producción 150 días después. Las plantas son de tallo verde y sus frutos son pequeños de

unos 800 gramos, ligeramente alargados y de pulpa rosada.

1.4.3. CATIRA I

Al igual que las anteriores, fue producida en Palmira por el ICA, como parte del

programa de mejoramiento iniciado en 1963. Fue introducida y evaluada en 1989 en los

Llanos Orientales, destacándose por su excelente comportamiento respecto a virus,

productividad y calidad de la fruta. Es de tipo dioico, muy precoz y productiva; produce

comercialmente cerca de 70 toneladas por hectárea durante un año de cosecha bajo

condiciones de suelos fértiles bien drenados y con riego.

Es de porte mediano y de tallo verde con suaves pintas moradas. Sus frutos son

ligeramente alargados, de corteza firme y de pulpa color anaranjado intenso, con un peso

promedio de 1.050 gramos; su corteza es lisa y suave, de color verde oscuro en estado

inmaduro y amarillo anaranjado cuando ha logrado su completa madurez. La pulpa presenta

un grosor promedio de 3.0 cm y su color es anaranjado intenso. La cavidad seminal es

mediana y de forma angular. Contiene un número promedio de 1.100 semillas. El contenido

de azúcares es alto, con un promedio de 14 grados Brix completamente maduro. Los frutos

se cosechan pintones, es decir cuando aparezcan las primeras manchas amarillas en su base.

Su textura firme y el mayor tiempo que tarda en madurarse el fruto, aproximadamente 10

días desde la cosecha hasta lograr la completa maduración, la hace ideal para el transporte a

sitios alejados y para almacenamientos prolongados. (Salazar, C.R. 1988).

1.5. COMPOSICIÓN QUÍMICA Y VALOR NUTRICIONAL DE LA PAPAYA

Dentro de su composición química debemos destacar su riqueza en vitaminas C y en

provitamina A, en forma de carotenos dentro de las cuales tiene principalmente:

betacarotenos, gamma carotenos, épsilon carotenos y criptoxantina, un compuesto que

además de transformarse en vitamina A en nuestro organismo, presenta propiedad

antioxidante, atribuyéndosele acción preventiva frente al cáncer y la enfermedad

cardiovascular. También destaca la presencia de vitaminas del grupo B como son vitamina

B1, B2 y B3. En cuanto a los minerales, la papaya es rica en potasio y contiene cantidades

apreciables de calcio, magnesio, fósforo y hierro.

La papaya contiene una alta proporción de agua, siendo por el contrario su

contenido en nutrientes energéticos (hidratos de carbono, proteínas y grasa) muy bajo.

(http://www.lapapaya.info/cat/la-papaya/1).

En papayas de pulpa roja, el pigmento o colorante natural más importante es el

licopeno. En papayas de pulpa más amarillenta, los pigmentos más abundantes son el grupo

de las criptoxantinas. La intensidad del color depende de la concentración del pigmento, la

cual varía de una localidad a otra. En pulpas rojizas, los carotenos constituyen un 10% de

los pigmentos, mientras que en pulpas anaranjadas alcanzan un 30%. La pulpa contiene

muy pocos ácidos orgánicos (0.099%) y éstos son una mezcla de 50% de ácido cítrico y

50% de ácido málico. (Guía técnica. Cultivo de lechosa).

En la Tabla 2 se presentan los contenidos de humedad, proteínas, carbohidratos,

lípidos, minerales y vitaminas de la papaya. (Guía técnica. Cultivo de lechosa).

Tabla 2. Contenido de nutrientes en 100 g de pulpa fresca de papaya.

Los compuestos volátiles determinan el olor y el sabor de las frutas. Se han

detectado unos 134 compuestos volátiles en la papaya, la mayoría identificados desde 1985.

Los compuestos volátiles más importantes de la pulpa de la papaya son el linool, el bencil

isotiocianato y el ácido butanóico en la pulpa, encontrándose otros 20 compuestos de menor

importancia. (Guía técnica. Cultivo de lechosa).

El bencil isotiocianato le da a la papaya su olor fuerte característico. El linool es

responsable del sabor y el aroma de la pulpa madura. Casi todos estos compuestos se

encuentran conjugados en el fruto, liberándose cuando las células se rompen durante el

corte o consumo de las frutas. (Guía técnica. Cultivo de lechosa).

1.6. PRINCIPALES PAÍSES PRODUCTORES DE PAPAYA

Tabla 3. Principales países productores de la papaya (periodo 1990-1997).

(FAO. 1999. Production Yearbook).

1.7. IMPORTANCIA DE LA PAPAYA EN VENEZUELA

En la Venezuela Rural antes de la aparición del petróleo el país basaba su economía

en una agricultura de subsistencia donde se desarrollaban diferentes rubros agrícolas para

asegurar la alimentación de sus pobladores, aprovechando y explotando al máximo

sus espacios agrarios. En Venezuela hay extensas áreas que se ajustan a las necesidades

edafoclimáticas de una amplia gama de especies, pero el escaso número de frutas

comercialmente explotadas, el empleo de un referencial tecnológico tradicional y la

ausencia de Normas de Calidad, inciden negativamente en la productividad y en la mayor

participación de nuestro país en los mercados internacionales.

En Venezuela es un problema la falta de Asociaciones de productores en base a un

determinado cultivo como lo hay en otras naciones de Latinoamérica. En el estado Lara los

productores de frutas y hortalizas se organizaron en asociaciones, y esta experiencia les

demostrado la importancia de formar cooperativas. Son movimiento que a la larga permiten

un buen desarrollo y comercialización de los productos.

Tabla 4. Empresas procesadoras de frutas en Venezuela.

Empresa Ubicación Logo Función

Frutos Procesados

(Fruproanca).

Los Andes, Estado Mérida.

Deshidratación de frutas.

Cideri Estado Bolívar.Procesamiento

de frutas y hortalalizas.

Finca Lagunaja

Estado AraguaProcesamiento

de frutas y hortalizas.

ProfumecaEstado

Carabobo

Procesadora de frutas (pulpa de

frutas)

1.8. USOS POTENCIALES DE LA LECHOSA EN VENEZUELA

El dulce de lechosa, es un dulce tradicional de Venezuela, formando parte de

la gastronomía típica de este país, se conforma de las laminas o cortes del fruto conocido

como lechosa en su país de origen o papaya. Este plato se realiza en distintas regiones

venezolanas y tiene un consumo más alto y típico en la época de Navidad, siendo uno de

los elementos característicos de estas fiestas y en las mesas los 24 y 31 de diciembre.

Este dulce se elabora teniendo como elemento principal la pulpa en laminas o cortes

de la lechosa verde o que no este madura, siendo estos diferentes cortes de formas según la

región o el gusto de quien lo prepare, se puede realizar entonces con largas lonjas,

pequeños trocitos, finos o gruesos cortes de mediano tamaño de la fruta en cuestión. Los

otros ingredientes que conforman este dulce son el papelón como originalmente se prepara

o se puede utilizar en cambio el azúcar como muchos hoy en día lo hacen, esto se

complementa con una cucharada de bicarbonato, clavos de olor y agua.

Luego Las tiras o cortes de lechosa son rociadas con el bicarbonato y se dejan así

por unas horas y posteriormente esto pasa a ser cocinado generalmente en una olla grande

donde se adiciona el azúcar o papelón y se coloca un poco de agua, se ponen los clavos y

luego se dejan en una lenta cocción hasta que la lechosa se cristalice y se ablande al gusto.

La fruta liberara más líquido por lo que no es necesario agregar mas agua. Al estar lista se

deja reposar y se sirve en frascos o envases de vidrios para ser guardados en

la nevera donde tomaran su temperatura adecuada para poder ser degustados. El dulce de

lechosa sirve como regalo, merienda, postre o como el clásico dulce de la época

decembrina venezolana, pudiendo realizarse tanto en las cocinas convencionales como en

los fogones de leña de las distintas regiones Venezuela, sobre todo en la oriental del país.

Figura 1. Dulce de lechosa.

2. GENERALIDADES DE LAS ENZIMAS

Esta sección se dedico a conocer sobre las enzimas, propiedades de las enzimas, clasificación, especificidad y condiciones que afectan la actividad enzimática, temas pertenecientes al área de la de la bioquímica, de total innovación en la malla de procesos químicos y que permitió definir las condiciones en la que se trabajo así como el ambiente propicio para el mejor aprovechamiento de la enzima.

2.1. DEFINICIÓN DE ENZIMA

Una enzima es una molécula proteica globular capaz de catalizar y acelerar

reacciones químicas específicas, en un factor de 1012 a 1020 respecto a las reacciones no

catalizadas enzimáticamente (Madigan y col., 1999; Whitaker, 1994).La actividad molar de

las enzimas es muy alto; una molécula de enzima puede transformar hasta 600,000

moléculas de sustrato por segundo, como es el caso de Anhidrasa carbónica, 12,500 para

lactasa y 700 para invertasa (Fennema, 1993).

En una reacción catalizada por una enzima:

a) La sustancia sobre la que actúa la enzima se denomina sustrato.

b) El sustrato se une a una región específica de la enzima, llamada centro activo

y forma un estado intermedio denominado complejo enzima-sustrato. El centro activo

comprende un sitio de unión formado por los aminoácidos que están en contacto

directo con el sustrato y un sitio catalítico, formado por los aminoácidos directamente

implicados en el mecanismo de la reacción.

c) Una vez formados los productos, la enzima regresa a su forma inicial y puede comenzar

un nuevo ciclo de reacción (Boyer, 2000).

2.2. PROPIEDADES

Por tener una estructura proteica, las enzimas poseen una conformación natural más

estable que las demás conformaciones posibles, en la cual son funcionales, de modo que los

cambios en la conformación de las enzimas suelen ir asociados con alteraciones en su

actividad catalítica.

Las enzimas son catalizadores específicos, cada enzima cataliza un solo tipo de

reacción y casi siempre actúa sobre un único sustrato o sobre un grupo muy

reducido de ellos. Tienen una alta eficiencia y no se consumen en las reacciones, por tales

razones, con poca cantidad de ellas se pueden transformar en producto grandes cantidades

de sustrato. En las reacciones reversibles, las enzimas pueden actuar tanto en un

sentido de la reacción como en el otro, dependiendo de la concentración del sustrato

(Boyer, 2000).

2.3. CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS

Muchas enzimas se han nombrado añadiendo el sufijo “asa” al nombre del sustrato

o a una palabra que describe su actividad. Así la ureasa cataliza la hidrólisis de la urea y la

DNA polimerasa cataliza la síntesis de DNA. Otras enzimas, tales como la pepsina y la

tripsina tienen nombres que no se refieren a sus sustratos. A veces la enzima tiene dos o

más nombres, o dos enzimas diferentes tienen el mismo nombre.

Debido a tales ambigüedades y al número siempre creciente de enzimas

descubiertas, se ha adoptado por acuerdo de la Unión internacional de Bioquímica un

sistema de nomenclatura y clasificación de enzimas (Tabla 5). Este sistema distribuye las

enzimas en seis clases principales, cada una de ellas con diferentes subclases, según el tipo

de reacción catalizada (Lehninger, 1993).}

Tabla 5. Clasificación internacional de enzimas (Lehninger, 1993).

Nº Clase Reacción catalizada

1 OxireductasasTransferencia de electrones (iones hidruros o

átomos de H)

2 Transferasas Reacciones de transferencia de grupos

3 HidrolasasReacción de hidrólisis (transferencia de grupos

funcionales del agua)

4 LiasasAdición de grupos a dobles enlaces, o formación de

dobles enlaces por eliminación de grupos

5 IsomerasasTransferencia de grupos dentro de la molécula

dando formas isoméricas

6 Ligasas

Formación de enlaces C-C, C-S, C-O y C-N,

mediante reacciones de condensación acopladas a la

rotura de ATP

2.4. PROTEASAS

Las proteasas, conocidas también como peptidasas o enzimas proteolíticas, catalizan

reacciones de hidrólisis, que rompen los enlaces peptídicos de las proteínas o de las

cadenas polipeptídicas y dan como resultado péptidos más pequeños o aminoácidos libres.

Las proteasas que se encuentran en los organismos vivos, están implicadas en una

gran variedad de reacciones fisiológicas; desde la digestión de las proteínas de los

alimentos hasta procesos altamente regulados, como la coagulación sanguínea, la muerte

celular y la diferenciación de tejidos (González, 2004).

2.5. PAPAÍNA

La papaína es una enzima proteolítica que se obtiene del látex de frutos verdes de

papaya (Carica papaya). Posee un peso molecular de 23 kDa y está formada por una cadena

peptídica de 211 residuos de aminoácidos.

La papaína se activa mediante agentes reductores, como cisteína, cianuro de sodio o

sulfitos y es inactivada por agentes oxidantes, como los iones de metales pesados e incluso

el oxígeno atmosférico. El pH óptimo de esta proteasa se encuentra entre 6 y 7; mientras

que su punto isoeléctrico corresponde a un pH de 9,6 (Worthington, 2008). La

temperatura óptima para la acción de la papaína es de 65º C (Sigma, 2008).

La papaína, en forma de suspensión, es estable a 5° C durante 6 a 12 meses. El

EDTA, la cisteína y el dimercaptopropanol son agentes estabilizadores. La actividad de la

papaína puede ser determinada mediante la velocidad de hidrólisis de una proteína o de

sustratos sintéticos de bajo peso molecular, tales como ésteres o amidas derivadas de

aminoácidos (Álvaro y otros, 2002).

La papaína es empleada en varias industrias de gran importancia, como en la

industria cervecera, para la prueba de enfriamiento de la cerveza; en la industria

farmacéutica como sustancia auxiliar de la digestión, en tratamientos de enfermedades de la

piel y en diversas preparaciones medicinales. Tal vez su uso industrial más importante es

como ablandador de carne. También se la emplea en el desgomado de la piel, para la

elaboración de cueros; en detergentes; en la elaboración de quesos y panes; en preparados

de proteínas modificadas para alimentación humana y animal; en el procesamiento de

fibras textiles y en el tratamiento de efluentes industriales (Glibota y otros, 2000).

Su importancia económica es considerable puesto que representa las dos terceras

partes del mercado de enzimas. El crecimiento del negocio relacionado con ella ha sido tal

en los últimos años, que en la actualidad se calcula en unos 100 millones de dólares

anuales, de los cuales el 70% pertenece a las industrias relacionadas con la alimentación

(Hernández, 2007).

2.6. QUIMOPAPAÍNA

La quimopapaína, con características similares a la anterior, está constituida por

218 aminoácidos y es la cisteinproteasa más abundante en el látex de la papaya. Según se

recoge en Martindale: “es una enzima proteolítica aislada del látex de la papaya (Carica

papaya) que se diferencia de la papaína en la movilidad electroforética, la solubilidad y la

especificidad del sustrato”.

2.7. BROMELINA

La bromelina es una cisteíno proteinasa aislada y purificada a partir de los

órganos de plantas de piña (Ananas comosus), que pertenece a la familia de la papaína

(Rowan y otros, 1990).

El peso molecular de la bromelina es de aproximadamente 33 kDa. El punto

isoeléctrico de la bromelina de tallo es 9,5 el de la bromelina de fruta es relativamente más

bajo. La cisteína y el cianuro de sodio funcionan como activadores de la bromelina. El pH

óptimo de esta enzima es de 7 y la temperatura óptima es 60º C (Hernández y otros, 2005).

Con respecto al almacenamiento, esta enzima se mantienen estable a -20º C, en forma seca

(Brenda, 2007).

La bromelina posee diversas aplicaciones industriales. Esta enzima es utilizada en la

obtención de hidrolizados de proteínas para alimentación animal y humana. En la industria

alimenticia se emplea para ablandar las envolturas de las salchichas. Puede sustituir a

la papaína en el tratamiento para clarificación y almacenamiento de cerveza, para ablandar

carne y para la hidrólisis de gelatina (Hernández y otros, 2005).

2.8. FICINA

La ficina es una enzima proteolítica que se obtiene del látex de los árboles del

género Ficus, como Ficus glabrata, Ficus elástica y Ficus carica. Tiene características

similares a la papaína, con respecto a sus condiciones óptimas de pH, temperatura y

estabilidad (Álvaro y otros, 2002).

La cistatina y el ácido iodoacético son inhibidores de la ficina, mientras que la

cisteína y el mercaptoetanol son activadores de esta enzima. El pH óptimo de la ficina es

7,5. A un pH de 5,0 esta enzima tiene un 50% de su actividad máxima y a un pH de 9,0

tiene un 55% de su actividad máxima (Brenda, 2008).

Las soluciones acuosas de ficina pierden actividad después de prolongados periodos

de almacenamiento, en estado congelado. Mientras que, a temperatura ambiente, pierde un

10% de su actividad por año (Álvaro y otros, 2002).

La ficina puede ser empleada en todas las industrias que usan otras proteasas

vegetales. En Perú, el producto se conoce como leche de oje, y se usa como

antihelmíntico humano, por su acción proteolítica (Giove, 1996).

2.9. CARICAÍNA

También conocida como papaya peptidasa II, la caricaína digiere las proteínas,

rompiendo los enlaces peptídicos. Comparado con otras enzimas presentes en la papaya, la

caricaína se considera extremadamente alcalina. Al igual que otras enzimas de la papaya,

la caricaína es un antiinflamatorio y es eficaz para romper proteínas complejas en simples

aminoácidos.

2.10. CONDICIONES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Entre las condiciones que afectan la actividad enzimática de las enzimas se

encuentran las siguientes:

a) Concentración de la enzima

b) Concentración del sustrato

c) pH

d) Temperatura.

2.10.1. CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA Y EL SUSTRATO

Algunas enzimas permanecen libres en condiciones bajas de sustrato y no se alcanza

la máxima velocidad. Cuando el sustrato se encuentra en exceso, toda la enzima se

transforma en ES y la reacción se realiza a su máxima velocidad. Finalmente la reacción

entra en equilibrio cuando no ocurren más cambios. Sin embargo si el producto P se quita

después de que se produjo impedirá el establecimiento del equilibrio; por lo tanto el

sustrato S se seguirá convirtiendo en producto P .En la Figura 2 (a) se observa el efecto de

la concentración del sustrato sobre el índice de la actividad enzimática.

El índice aumenta rápidamente con incremento inicial en el sustrato; incrementos

posteriores en las concentraciones del sustrato no tienen efecto sobre el índice; ya que este

se vuelve independiente de la concentración del sustrato, el mismo efecto ocurre con un

incremento de la concentración de la enzima, como se aprecia en la Figura 2.8 (b).

Grafico 1. (a) El efecto de la concentración del sustrato y (b) el efecto de la

concentración de la enzima en la actividad enzimática. (Lehninger, 1993).

2.10.2. EFECTO DEL PH

La mayoría de las enzimas poseen un pH característico en el cual la actividad es

máxima; por encima o por debajo de este pH la actividad disminuye. Aunque los perfiles de

las curvas de actividad en función del pH de muchas enzimas son acampanados, pueden

variar considerablemente de forma (Figura 2). La relación entre el pH y la actividad de

cualquier enzima depende del comportamiento ácido –base de la enzima y del sustrato, ya

que este afecta el grado de ionización de los aminoácidos del sitio activo tanto del sustrato

como del complejo enzima-sustrato, e influyendo en la afinidad que tenga la enzima por el

sustrato (Badui, 2000).

La forma de la curva de actividad - pH varía con la concentración del sustrato, ya

que el valor de KM de muchas enzimas varían con el pH (Whitaker, 1994). Estas curvas

son mucho más significativas si la enzima se mantiene saturada con el sustrato en todos los

valores de pH a los que se experimenta. En muchos estudios de cinética enzimática, el pH

se mantiene constante al, o muy próximo pH óptimo.

El pH óptimo de una enzima no es necesariamente idéntico al pH de su entorno

intracelular normal, el cual puede hallarse a su vez en la pendiente de su curva ascendente o

descendente.

Grafico 2. Efecto del pH sobre la actividad enzimática.

2.10.2.1. EFECTO DEL PH EN LA ESTABILIDAD DE LA ENZIMA

El pH influye directamente en la estabilidad de la enzima respecto al tiempo (Figura

3), es decir, en el pH óptimo de la enzima, ésta suele ser razonablemente estable a lo largo

de los ensayos enzimáticos, pero fuera de este rango de pH hay una pérdida, como se

muestra en la Figura 3, para el caso de la pepsina, la enzima proteolítica del estómago, cuyo

pH óptimo es de 2.0 pero se desnaturaliza rápidamente a pH mayor a 8.0 (Whitaker, 1994).

Grafico 3. Representación esquemática de la velocidad d inactivación de las

enzimas a diferentes valores de pH.

2.10.3. EFECTO DE LA TEMPERATURA

Al igual que ocurre con la mayoría de las reacciones químicas, la velocidad de las

reacciones catalizadas por enzimas se incrementan en general con la temperatura, dentro

del intervalo en que la enzima es estable y permanece totalmente activa. La velocidad de

muchas reacciones se duplica, aproximadamente por cada 10 °C de aumento de temperatura

(Q10 = 2.0). Sin embargo el coeficiente de temperatura Q10, varía de una enzima a otra

según la energía de activación de la reacción catalizada, es decir, de la altura de la barrera

de energía para pasar al estado de transición.

Aunque las reacciones catalizada por las enzimas parecen con frecuencia, poseer

una temperatura óptima como se muestra en la Figura 4, donde se representar la actividad

catalítica frente a la temperatura, estas enzimas al ser proteínas, se desnaturalizan por la

acción del calor y se inactivan cuando la elevación de temperatura sobrepasa un cierto

punto.

La aparente temperatura “óptima” es por tanto, la resultante de dos procesos: 1) el

incremento habitual de la velocidad de reacción con la temperatura.

2) el incremento de la velocidad de desnaturalización térmica de la enzima al sobrepasar

una temperatura crítica. Aunque la mayoría de las enzimas se inactivan a una temperatura

comprendidas entre 55 y 60°C, algunas de ellas son completamente estables y conservan su

actividad a temperaturas muy superiores, por ejemplo las enzimas de diversas especies de

bacterias termófilas.

En cambio temperaturas extremadamente bajas, detienen la actividad enzimática

pero no las destruyen. Muchas enzimas se pueden conservar manteniéndolas a 0°C o

temperaturas más bajas.

Gráfico 4. Efecto de la temperatura en la actividad enzimática.

2.10.3.1. EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA ESTABILIDAD DE

LA ENZIMA

Cabe mencionar, que aún las enzimas estando en su aparente temperatura óptima

suelen perder actividad enzimática dependiendo de la duración del ensayo (Patnaik, 2002).

La estabilidad térmica puede determinarse incubando la enzima en ausencia del sustrato, a

diferentes temperaturas, de esta se toma una alícuota en la cual de determina su actividad

enzimática a diferentes tiempos. Dando los resultados que se muestran en la Figura 5.

Donde la enzima es completamente estable (o al menos el % de pérdida es menor) en un

rango de 20 a 30°C, pero a temperaturas mayores de 40°C las enzimas pierden un % de

actividad, siendo más notorio a temperaturas como 60 y 70°C. (Pandey y col, 2003;

Whitaker, 1994).

Gráfico 5. Efecto de la temperatura en la estabilidad de las enzimas.

2.11. OTRAS CONDICIONES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD

ENZIMÁTICA

2.11.1. OXIDACIÓN QUÍMICA

Agentes oxidantes como yodo, bromo, peróxido de hidrógeno, el oxígeno y los

metales pesados inactivan la enzima. Esto se explica debido a la participación de

sulfhidrilos en la acción catalítica de la enzima, que se activa en estado reducido y se

inactiva al oxidarse.

2.11.2. OXIDACIÓN POR LUZ

Se inactiva con luz ultravioleta, oxidándose rápidamente por exposición a los rayos

solares y el oxígeno.

2.11.3. CRECIMIENTO MICROBIANO

Debido a la naturaleza proteica del látex y a la forma de recolección, está propenso

a contaminación por micro-organismos, que realizan sobre éste acción putrefactiva.

2.11.4. MÉTODOS DE SECADO

Al ser la papaína un compuesto fácilmente alterable por agentes tales como el

oxígeno, la luz solar y la temperatura, el sistema de secado determina la calidad de la

enzima.

El secado solar, rinde un producto de baja actividad proteolítica, por lo que no se

recomienda utilizar. El secado por corrientes de aire caliente, rinde un producto de mejor

calidad que el método anterior, más claro y con mayor actividad proteolítica. El secado al

vacío, rinde un producto de alta actividad proteolítica, blanco, cremoso. Su actividad es

mayor debido a que durante el proceso de secado, el producto no está en contacto con el

aire. La papaína en polvo secada por aspersión es de alta calidad aunque es más susceptible

a la pérdida de actividad proteolítica si se almacena por largos periodos de tiempo. El

secado por liofilización permite obtener un producto con una actividad proteolítica superior

a los métodos anteriores.

2.12. ESPECIFICIDAD DE LAS ENZIMAS

Las enzimas son altamente específicas para las reacciones que catalizan. Esto es que

cada enzima cataliza un único tipo de reacción química, es decir, su intervalo de acción se

limita a un determinado tipo de compuestos que deben reunir ciertas características para

que puedan ser usados como sustrato.

Esta especificidad está relacionada con la estructura tridimensional de la molécula

enzimática, así como la interacción entre el sustrato y la enzima a través del centro activo,

dependiendo de la naturaleza de las interacciones entre estos, normalmente de las fuerzas

débiles, tales como puentes de hidrógeno, fuerzas de Van Der Waals e interacciones

hidrófobicas (Madigan y col, 1999).

2.12.1. TIPOS DE ESPECIFICIDAD DE LAS ENZIMAS

Los tipos de especificidad de las enzimas se han dividido en cuatro grupos, éstos

son: baja especificidad, especificidad de grupo, especificidad absoluta y especificidad

estereoquímica.

2.12.1.1. BAJA ESPECIFICIDAD

Se denomina como enzima de baja especificidad cuando la enzima no discrimina

entre sustratos, sino que se muestra específica únicamente para el enlace a atacar (Badui,

2000).

2.12.1.2. ESPECIFICIDAD DE GRUPO

La especificidad de grupo se presenta cuando las enzimas actúan sobre un sustrato

que contiene un determinado enlace y un grupo químico específico al lado de éste; por

ejemplo la Tripsina es específica para los enlaces péptido en el lado carboxilo de la arginina

y la lisina; igualmente las proteasas vegetales (papaína y ficina) hidrolizan la unión

adyacente a aminoácidos básicos, leucina o glicina; por su parte, la pepsina actúa sobre los

enlaces que contienen aminoácidos aromáticos o ácidos dicarboxílicos (Badui, 2000).

2.12.1.3. ESPECIFICIDAD ABSOLUTA

Se habla de especificidad absoluta cuando la enzima sólo ataca a un sustrato y

cataliza sólo una reacción. La mayoría de las enzimas pertenecen a esta categoría (Badui,

2000).

2.12.1.4. ESPECIFICIDAD ESTEREOQUÍMICA

La especificidad estereoquímica se refiere a que normalmente utilizan D o L

isómeros como sustrato; por ejemplo, todos las monosacáridos en la naturaleza son D,

mientras que los aminoácidos pertenecen a la serie L; esta especificidad se entiende si se

considera que las enzimas son polímeros integrados por L-aminoácidos y que,

consecuentemente, tienen una estructura asimétrica (Badui, 2000).

2.13. APLICACIONES DE LAS ENZIMAS EN LA INDUSTRIA

Hoy en día la tecnología enzimática ocupa un lugar preponderante dentro de la

biotecnología. Alrededor de un 65% de las enzimas proteolíticas o proteasas que se

producen industrialmente están de una u otra manera relacionadas con la industria

alimentaria, entre los usos mas comunes se encuentra la maduración de quesos,

ablandadores de carnes, producción de hidrolizados de proteína, fabricación de pan, por

mencionar algunos (Mitra y col., 1996; Pandey y col., 2003); aunque es conveniente

señalar que con las proteasas alcalinas empleadas en detergentes ocupan 25% del total de la

distribución, el 10% restante corresponde en las áreas farmacéuticas y analítica (García y

col., 1993).

Actualmente se conoce la existencia de más de 2,000 enzimas, de las cuales muchas

de ellas han sido aisladas, purificadas y cristalizadas gracias a la experiencia ganada en este

terreno (Prave y Faust, 1987). En la Tabla 5 se muestran algunas enzimas de uso industrial,

así como sus aplicaciones (Prave y Faust, 1987; Bakir y col., 2001, García y col., 1993).

Tabla 6. Enzimas de uso industrial.

Las bacterias producen principalmente proteasas alcalinas mientras que las

proteasas provenientes de hongos pueden ser ácidas, neutras y alcalinas; lo que ofrece una

gran ventaja ya que pueden crecer tanto en medio sólidos como líquidos.

Gracias a que los hongos como Aspergillus oryzae y Rhizopus oryzae son

productores de proteasas alcalinas así como de α- amilasas, glucosamilasas, lactasas,

celulasas, lipasas y pectinasas; estos crecen naturalmente en medios sólidos y se pueden

emplear en la fermentación en medio sólido utilizando generalmente salvado de trigo como

soporte, además que las enzimas que se extraen de este sistema son de mejor calidad y se

necesitan menos solventes para extraerlas (Prave y Faust, 1987).

Para la aplicación industrial de proteasas se recurrió inicialmente a la producción de

preparados enzimáticos provenientes, en su mayoría de tejidos animales y vegetales, al

incrementarse la demanda de proteasas como consecuencia de su aplicación como aditivo

en detergentes utilizados a nivel industrial y doméstico, se desarrollaron tecnologías para

producir proteasas de origen microbiano, ya que reúnen propiedades deseables como gran

estabilidad en intervalos de pH y temperatura de procesos, así como de la elevada actividad

en presencia de compuestos que normalmente inhibirían a las de origen animal y vegetal,

además de ser más factible su producción a partir de micro organismos que a partir de

tejidos (Cheftel, 1989; Pandey y col., 2003).

3. DESCRIPCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DEL LÁTEX DE LAS PLANTAS DEL GÉNERO Vasconcella.

En esta sección definimos, caracterizamos el látex, las etapas para la extracción y purificación del mismo, e inclusive las distintas pruebas que se le aplicaron a la enzima antes y después de purificar, cabe destacar que muchas de estas fueron vistas en las catedras de Laboratorio Química general (familiarización con los equipos, preparación de soluciones, titulaciones, entre otros), laboratorio de aguas (prueba de jarras, solidos totales, método de muestreo, entre otros) y laboratorio de técnicas de análisis (operación de espectrofotómetros) pertenecientes al pensum de la carrera de procesos químicos en donde resaltamos que son conocimientos básicos y que la gran mayoría de los métodos aplicados al estudio de la enzima como tal fueron visto por primera vez en la ejecución de este proyecto.

1.1. DEFINICIÓN LÁTEX

El látex es un fluido lechoso compuesto por un suero líquido que contiene en

suspensión o en solución, una mezcla compleja de componentes. Los botánicos designan el

látex como el citoplasma de los laticíferos (las células vivas especializadas que lo

contienen) y por lo tanto, éste presenta una variedad de organelas celulares, como núcleos

mitocondrias, ribosomas, plastidios, vacuolas, aparato de Golgi y retículo endoplasmático

y moléculas orgánicas como enzimas, terpenos, alcaloides, vitaminas, carbohidratos, lípidos

y aminoácidos libres. Los laticíferos se encuentran bajo presión positiva, por lo cual, una

incisión sobre éstos, resulta en una rápida emisión del látex hacia el exterior.

La Figura 6 presenta una fotografía de una papaya a la que se le han realizado varias

incisiones para obtener su látex.

Figura 2. Látex exudado de papaya.

1.2. PROPIEDADES Y FUNCIÓN

Los principios activos del látex, responsable de su valor en muchas aplicaciones

industriales, son las enzimas proteolíticas papaína y quimopapaína. Se ha demostrado que

la conversión de la forma inactiva a la activa, ocurre cuando el látex es expelido y alcanza

un máximo de actividad proteolítica en menos de dos minutos, después del corte o

pinchazo en la superficie del fruto. Paralelamente a este proceso, se hacen visibles los

síntomas de coagulación del látex, lo que evidencia que este elemento es un factor de

primera línea de defensa en plantas, pues los coágulos de látex sellan las heridas y evitan el

ingreso de patógenos. El látex desecado constituye lo que se denomina papaína cruda

constituida por una mezcla de enzimas proteolíticos, papaína propiamente dicha,

quimopapaínas y en menor proporción papaya proteinasa W y otros.

1.3. PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LAS ENZIMAS

Un proceso general de purificación y caracterización de enzimas consta de las

siguientes etapas:

a) Preparación de la muestra.

b) Extracción de la proteína.

c) Purificación primaria.

d) Purificación secundaria.

Cada una de estas etapas se realiza de una forma específica, de acuerdo con el tejido

o muestra del que se parte, la ubicación de la proteína, que puede ser intra o extracelular,

la consistencia del extracto enzimático que se obtenga, la presencia de partículas

diferentes a las enzimas de interés y las características de las enzimas proteolíticas que

puedan usarse para una purificación, como peso molecular, punto isoeléctrico, entre

otras.

Por tal razón, la purificación de enzimas a partir de látex, deben ser realizados a

través de un proceso determinado por las características específicas de la fuente, del

látex y de las enzimas que él contiene.

1.3.1. SELECCIÓN DE LA FUENTE

Para una adecuada selección de la fuente de las enzimas, es necesario

considerar los siguientes criterios:

a) Tener la cantidad suficiente de tejido o secreción de la cual se va a aislar la

proteína.

b) Escoger un tejido o secreción que contenga un porcentaje significativo de

enzimas.

c) Determinar las mejores condiciones para la extracción del tejido o la secreción vegetal;

tales como estado de madurez de la planta o el órgano vegetal, temperatura de

extracción, presencia de estabilizantes o inhibidores, tiempo

de extracción, etc. Estudios realizados recomiendan seleccionar las plantas que tengan

frutos verdes, debido a que en ellos se encuentra una mayor cantidad de látex, con

una elevada actividad enzimática (Reyes, 2 005).

d) Mientras se lleva la muestra al laboratorio y se empieza con el aislamiento de las

enzimas, mantener el tejido bajo condiciones que contribuyan a una mejor

conservación del mismo, que no afecten considerablemente a la actividad enzimática

que se va a recuperar.

Adicionalmente, es necesario tener en cuenta las precauciones que deben tenerse

cuando se trabaja con enzimas. Por ejemplo, considerar que condiciones extremas de

temperatura y pH pueden desnaturalizar a las enzimas o afectar irreversiblemente su

actividad. Algo similar sucede con la presencia de ciertas sustancias químicas o

incluso con procesos físicos, como una excesiva agitación.

1.3.2. ACONDICIONAMIENTO DEL LÁTEX

Por lo general, el látex se comercializa como producto seco, en forma de polvo; de

esta forma, se conserva adecuadamente hasta el momento de su utilización, aumenta su

vida útil y se facilita su manipulación y almacenaje, con respecto al producto fresco

(Alcayaga, 2 004).

Para tal efecto puede aplicarse uno de los siguientes métodos:

a) Liofilización.

b) Secado al vacío.

c) Secado en estufa, a temperaturas controladas.

Además, es recomendable tener un conocimiento previo de algunas

características de las enzimas a ser aisladas, con el fin de llevar a cabo un proceso

más acertado, que afecte lo menos posible a la actividad enzimática deseada.

Por ejemplo, es importante saber que las proteasas, en condiciones de baja

fuerza iónica, se vuelven inestables. Por esa razón, es necesario regular el pH con el

uso de soluciones tampón de concentraciones medias y pH generalmente fisiológico

(Universidad de Carabobo, 2 006).

Luego de analizar los factores anteriormente mencionados, se procede a

determinar el proceso de homogeneización que se va a aplicar. Especial cuidado se debe

tener con el tiempo, la temperatura y el pH de trabajo, así como con las operaciones

complementarias que se vayan a utilizar, en caso de ser necesarias, como por ejemplo la

centrifugación o la filtración.

1.3.3. PURIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS

La purificación de las enzimas es un proceso que debe considerar la poca

estabilidad que presentan estos biocatalizadores, la generalmente baja concentración en

la que se encuentran en el material de partida y la presencia de otros elementos en el

preparado enzimático (Ayala, 2 005).

Existen dos grupos principales de técnicas de purificación: las de baja resolución y

las de alta resolución.

El primer grupo corresponde a técnicas de purificación basadas en la diferencia de

solubilidad. Con ellas se eliminan los contaminantes más abundantes y se concentra

la proteína deseada en el preparado. Estas técnicas poseen una gran capacidad de

procesamiento, pero un bajo poder resolutivo. Entre ellas se encuentra la precipitación

con solventes orgánicos.

Las técnicas de alta resolución no permiten una purificación de la proteína en un

solo paso. Es necesario combinar, complementariamente, varias de ellas para alcanzar una

alta pureza. Estas técnicas tienen un alto poder resolutivo y una baja capacidad de proceso.

Entre ellas se pueden mencionar la cromatografía de filtración en gel y la cromatografía de

intercambio iónico (Chávez, 1 990).

Estas técnicas de purificación pueden ser combinadas para obtener mejores

resultados en el producto final.

1.3.4. PRECIPITACIÓN CON SOLVENTES ORGÁNICOS

Los solventes orgánicos miscibles con el agua, como el etanol o la acetona,

producen una variedad de efectos que, combinados, permiten la precipitación de las

proteínas, al ser adicionados a una solución acuosa. El principal efecto es la reducción del

poder de solvatación del agua, que puede ser explicado en términos de una reducción de su

constante dieléctrica. La estructura ordenada del agua, alrededor de los aminoácidos

hidrofóbicos, es desplazada por el solvente orgánico añadido. El efecto neto de este

proceso es la disminución de la solubilidad de las proteínas en el medio, debido a lo cual

se agregan y precipitan (Calvo, 2003).

Los precipitados son agregados de moléculas proteicas en cantidad suficiente, de

modo que puedan ser centrifugados a una velocidad razonablemente baja (Álvaro y otros,

2002).

Para la selección de un adecuado solvente orgánico se deben considerar los

siguientes criterios:

a) El solvente debe ser completamente miscible en agua,

b) El solvente no debe producir una reacción con la proteína y

c) El solvente debe garantizar una precipitación alta (Álvaro y otros, 2 002).

1.3.5. DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE LA

CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA EN LOS EXTRACTOS

OBTENIDOS

Dentro de un estudio enzimático es importante determinar la concentración de

proteína presente en los extractos obtenidos en cada etapa del proceso de purificación, con

el fin de relacionar esta información con la actividad enzimática y conocer el rendimiento y

el grado de purificación en cada paso.

Entre los métodos utilizados para la determinación de la concentración de proteína,

se encuentra el método de absorción UV a 280nm. Este método permite estimar

cuantitativamente dicha concentración en una muestra, de acuerdo con la Ley de Lambert-

Beer, puesto que las proteínas poseen un máximo de absorción aproximadamente a una

longitud de onda de 280nm, debido a la presencia de aminoácidos aromáticos,

fundamentalmente tirosina y triptófano (Yáñez, 2 006).

En una muestra que contiene proteínas, el solvente no debe absorber la luz a 280nm

y la solución debe ser clara e incolora. La turbidez puede producir resultados erróneos;

entonces, para emplear este método de manera confiable, puede ser necesario realizar un

proceso de filtrado, de centrifugación o de dilución de la muestra.

Este método es rápido y relativamente sensible. Es utilizado frecuentemente en la

detección post-columna de proteínas. Al ser una técnica no destructiva, la cantidad de

muestra empleada para la estimación cuantitativa, puede ser devuelta a la muestra original

(Yáñez, 2 006).

En óptica, la ley de Lambert-Beer es una relación empírica que combina la

absorción de luz con las propiedades del material atravesado.

La Ecuación 1.1 expresa la relación entre la absorbancia y la concentración de una

sustancia en una solución.

A=ε* c*l

Donde:

A es la absorbancia.

ε es el coeficiente de extinción, en (mg/ml)-1 cm-1.

c es la concentración de la sustancia absorbente en la muestra, en mg/ml.

l es la distancia que la luz atraviesa por la muestra, en cm.

La ley establece que existe una relación exponencial entre la transmisión de luz a

través de una sustancia y la concentración de la sustancia, así como también entre la

transmisión y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa. Si se conoce el coeficiente de

extinción (ε) de una molécula determinada y la distancia (l) que el rayo de luz atraviesa por

la muestra, la concentración de la molécula puede ser calculada al medir la absorbancia de

la solución que la contiene.

Para estas mediciones, se pueden utilizar espectrofotómetros que posean doble haz de luz,

con el fin de medir el valor exacto de absorbancia de una muestra, al compararlo

directamente con un blanco, en cada medición.

Se debe fijar la longitud de onda en el valor en el cual la sustancia analizada

presenta una máxima absorbancia, en el rango del espectro visible (400 a 700nm) o en el

ultravioleta (200 a 400nm) (Skoog y otros, 2001).

1.3.5.1. UNIDADES ENZIMÁTICAS

La cantidad de enzima en una muestra puede ser expresada en moles, como la de

cualquier otro compuesto químico, o puede ser cuantificada en términos de actividad

enzimática. La actividad enzimática es una medida de la cantidad de enzima activa

presente y del nivel de actividad de la misma, por lo que su medida es dependiente de las

condiciones de trabajo que deben ser especificadas cuando se dan valores de actividad.

La actividad expresa la cantidad de sustrato convertido en producto por unidad de

tiempo, en un volumen dado de reacción.

En el Sistema Internacional de Unidades la unidad para la actividad catalítica es el

katal (kat), pero es una unidad demasiado grande y suele usarse la unidad de

actividad enzimática (U). Su equivalencia está dada por (González, 2004):

1 kat = 1 mol sustrato convertido x s-1 = 6 x 107 U

1 U = 1 µmol sustrato convertido x min.-1 = 16,67 nkat

Otra unidad comúnmente usada es la actividad específica, que se refiere a la

actividad de una enzima por miligramo (mg) de proteína y se suele expresar en µmol/min

mg o U/mg. La actividad específica da una idea de la pureza de la enzima (González,

2004).

La papaína se vende por las siguientes actividades:

FIP units/mg:1 FIP unidad de papaína es la cantidad de enzima que hidroliza bajo

condiciones estándares 1 mmol de BAEE por minuto.

mU BAPA/mg: Una unidad se define como la cantidad de enzima que hidroliza 1mmol

de BAPA por minuto bajo las condiciones de ensayo .

USP units/mg: 1 USP unidad de actividad de papaína es la actividad que libera el

equivalente de 1 µg of tirosina de un sustrato específico de caseína bajo las condiciones del

ensayo, usando la concentración de enzima que libera 40 µg of tirosina por ml de la

solución de la prueba.

FCC-PU: La unidad de papaína (PU) se define como la cantidad de enzima que libera el

equivalente a 1 microgramo de tirosina por hora bajo las condiciones del análisis.

TU/mg: Una unidad de potencia puede ser definida como la unidad que al actuar sobre el

sustrato de caseína bajo las condiciones específicas produce un microgramo de tirosina por

minuto.

MCU/mg: Una unidad de coagulo de leche (MCU) es la cantidad de actividad en un ml

que hará coagular 5ml de sustrato de leche en 60 segundos a 40ºC.

GDU/mg: Una unidad GDU libera la misma cantidad de 1mg de amino nitrógeno a partir

de gelatina en 20 minutos a 45ºC, pH 4.5.

En la Tabla 7 se muestran las equivalencias de las principales unidades de medición

de actividad enzimática

Tabla 7. Equivalentes de las principales unidades de medición de actividad

enzimática.

1.3.5.2. ENSAYOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS

Todos los ensayos enzimáticos miden la cantidad de sustrato consumido o la

cantidad de producto generado en la reacción, catalizada por las enzimas, durante un

lapso de tiempo. Existen diversos métodos para medir la concentración de sustratos y

productos, con el propósito de determinar la actividad enzimática. Entre ellos está el

método espectrofotométrico.

En los ensayos espectrofotométricos puede seguirse el curso de una reacción

mediante la observación de la cantidad de luz absorbida por la solución, en la que se está

dando la reacción. Para poder utilizar un ensayo de este tipo, debe haber entre los sustratos

o los productos alguno que absorba luz a una longitud de onda determinada, y que sea la

única molécula de la mezcla de reacción que lo hace a esa longitud de onda; de esta

forma, se puede observar el aumento o la disminución de la absorbancia con el

transcurso del tiempo (Casamayor y González, 2008).

Es conveniente realizar un ensayo testigo o blanco, que permita determinar el efecto

real que tiene sobre el avance de la reacción, la presencia de las moléculas de interés.

1.1. PROPIEDADES DE LA PAPAÍNA

Nombre Científico: Látex de la papaya verde (Carica papaya).

Nombre Inglés: Papain

Descripción: La papaína es una enzima proteolítica que se obtiene a partir del látex de la

fruta verde de la papaya antes que comience su maduración. La papaína, se caracteriza por

ser un polvo amorfo, granuloso de color blanco, grisáceo o parduzco; ligeramente

higroscópico e insoluble en agua y en la mayoría de solventes orgánicos. Es soluble en

alcohol etílico y metílico.

Partes de la planta usada: Látex del fruto verde.

Principales componentes: Enzima proteolítica.

Actividad Enzimática: 55.000 calificada en Unidades de tirosina/mg muestra ó USP/mg,

según método AOAC 971.16 ó método BAAE. Regulada de acuerdo a pedido del cliente,

según uso y tipo de industria.

Estado: Polvo liofilizado

Color: Blanco

Solubilidad: Soluble en agua, en cualquier proporción. Insoluble en alcohol y otras

soluciones orgánicas.

pH: 5.0 – 5.5 en solución al 5%

Estabilidad Térmica De La Actividad Enzimática: Invariable por largos periodos con

almacenamiento refrigerado. Reducción de actividad enzimática inferior a 1% después de

seis meses de almacenamiento a temperatura ambiente de hasta 40 °C

Test Microbiológico: Plate count maximum: < 500/gr

Salmonella: Negativo

E. Coli : Negativo

Empaque: Contenedores de 0.5 gr. a 20 Kg. - Acordar con cliente -

Humedad: 2% - 4%

1.2. APLICACIONES DE LA ENZIMA PAPAÍNA

1.2.1. EN LA INDUSTRIA BEBIDAS

Las bebidas alcohólicas generalmente son enfriadas antes de su uso, esto tiende a

tener el aspecto turbio debido a la formación de fenoles proteicos-polihídricos complejos

durante la elaboración de la cerveza (la preparación) y el enfriamiento. La dificultad es

vencida debido al empleo de papaína, que degrada estos complejos a pequeñas partículas

que son demasiado pequeñas para enturbiar la cerveza. En USA el 80% de las cervezas son

hechas con propiedades anticongelantes a través del uso de papaína. (Fernández, Javier

2005).

1.2.2. INDUSTRIA DE LA CARNE

La papaína se usa para tenderizar la carne en diferentes procesos. (Fernández, Javier

2005).

1.2.3. INDUSTRIA FOTOGRÁFICA

La papaína se usa en preparativos para la recuperación de plata de películas gastadas

en laboratorios de tratamiento fotográficos. (Fernández, Javier 2005).

1.2.4. INDUSTRIA LÁCTEA

Es consumida en la fabricación de queso, con la que se obtienen productos de

excelente calidad y cremosos. (Fernández, Javier 2005).

1.2.5. INDUSTRIA DERMATOLÓGICA

Se usa en ciertas cremas faciales, limpiadoras y de lifting y también se usa en pasta

de dientes. (Fernández, Javier 2005).

1.2.6. INDUSTRIA DEL CURTIDO DE CUEROS

La papaína se usa para alisar los cueros y para la remoción del pelo. (Fernández,

Javier 2005).

1.2.7. INDUSTRIA DE CEREALES

Se usa para enriquecer las proteínas de los cereales y de alimentos con alto

contenido proteico. (Fernández, Javier 2005)

1.3. PARÁMETROS FÍSICOS-QUÍMICOS

1.3.1. COLOR

Para definir color debemos considerar dos conceptos:

Color verdadero: Es el color del agua a la cual se ha eliminado la turbiedad

Color aparente: Es el color debido a las sustancia en solución y en suspensión

presente en el agua.

El color se determina por comparación visual de la muestra con discos de color

calibrados, con patrones de platino-cobalto de concentraciones conocidas. El método

normal para la medición de color es el platino-cobalto y la unidad de color es la producida

por 1 mg/l de platino en la forma de ion de cloro platinado.

1.3.2. TURBIDEZ

La turbiedad de las aguas se debe a la presencia de sólidos suspendidos, tales como

arcilla, limo, materia orgánica finamente dividida, plancton y otros organismos

microscópicos. La turbiedad es una expresión de la propiedad óptica de una muestra, que

hace que los rayos luminosos se dispersen y absorban, en lugar de transmitirse en línea

recta a través de ella.

El método normal para la determinación de la turbiedad es el método turbidimétrico

que implica el uso de un turbidímetro. La determinación de la turbiedad es aplicable a

cualquier muestra de agua que se encuentre libre de basuras o de sedimentos gruesos que se

asiente rápidamente, se obtienen resultados falsos por cristalería sucia, presencia de

burbujas y por efectos de vibración que puedan alterar visibilidad en la superficie de la

muestra de agua.

1.3.3. pH

El pH es el logaritmo de la reciproca de la concentración de l ion hidrogeno en

moles por litro. El pH interviene en el cálculo del carbonato, bicarbonato y dióxido de

carbono, así como, en el cálculo del índice de corrosión o estabilidad y en el control de los

procesos de tratamiento de agua. La escala de pH comprende a la neutralidad exacta a 25

ºC. Muestra que los términos “Alcalinidad” y “Acidez” indican la reserva total o capacidad

amortiguadora de una muestra. El valor del pH representa la actividad instantánea del ion

hidrogeno.

1.3.4. DEMANDA QUÍMICA DE OXÍGENO (DQO)

Se define como la cantidad de oxigeno necesaria para oxidar la materia orgánica

presente en un agua, que puede ser oxidada mediante el uso de un agente químico oxidante

en medio acido. Se puede cuantificar con este método la porción carbonosa de los

compuestos de nitrógeno, pero no hay oxidación del contenido de amoniaco que se libere

de las materia proteicas (excepto en la presencia de cloruros).

En desechos con cargas toxicas, es el único método de que nos permite medir la

carga orgánica. Consiste en reflujar una muestra con Dicromato de potasio por un periodo

de dos horas, durante la cual se oxida la materia orgánica a dióxido de carbono y agua.

Luego de la digestión, se valora el excedente de Dicromato de potasio con una solución

estandarizada de sulfato ferroso amoniacal, de allí se detecta rápidamente la presencia de la

especia Cr2O7 -2 en exceso. Ocurriendo las siguientes reacciones:

Cr2O7 -2 + 14 H+ + 6e- → 2 Cr+3 + H2O

6 Fe+2 → Fe+3 + 6e-

Cr2O7 2 + 6 Fe+2 + 14 H+ → 2 Cr+3 + 6 Fe+3 + 7 H2O

Las especies crómicas de color verde y naranja pueden ser mediadas también

colorimétricamente con un fotómetro o con un colorímetro siendo este el método más fácil,

rápido y suficientemente seguro para todos los propósitos prácticos. A fin de garantizar una

completa oxidación de los compuestos orgánicos como el ácido acético, es necesaria la

adición de sulfato de plata como catalizador.

Si la muestra contiene cloruros, estos interfieren en el valor de la DQO, ya que

pueden ser oxidados por el Dicromato de potasio de acuerdo a la reacción:

6 Cl + Cr2O7-2 + 14 H+ → 3 Cl2 + 2Cr+3 + H2O

Esto se previene añadiendo a la muestra de Sulfato de mercurio, el cual forma un

ion complejo con el Cloruro, de acuerdo a la siguiente reacción:

Hg+2 + 2Cl → HgCl2

1.3.5. NITRÓGENO TOTAL

El nitrógeno total se determina por el método micro Kjeldahl, este método es

aplicable a las muestras que contienen concentraciones altas o bajas de nitrógeno orgánico,

pero requiere un volumen de muestra relativamente amplio para las concentraciones bajas.

El método Kjeldahl determina el nitrógeno en estado trinegativo, no toma en cuenta el

nitrógeno en forma de azida, azina, azno, hidrazona, nitrato, nitrito, nitrilo, nitroso, oxima y

semicarbonoza. Si se determina individualmente el nitrógeno Kjeldahl y el amoniacal, se

puede determinar el nitrógeno orgánico por diferencia.

En presencia de H2SO4, sulfato de potasio (K2SO4) y Sulfato mercúrico (HgSO4)

como catalizador, el nitrógeno amónico de muchas sustancias orgánicas se convierte en

Sulfato de amonio [(NH4)2SO4], después que se descompone por digestión con sulfato de

sodio. El amonio libre y nitrógeno-amonio también se convierten en sulfato de amonio

[(NH4)2SO4]. Durante la digestión de la muestra se forma un complejo mercurio amonio

que luego se descompone por el Tiosulfato de sodio (Na2Sco3). Tras la descomposición, el

amoniaco se destila en medio alcalino y se absorbe en acido bórico o sulfúrico.

1.4. MÉTODO DE COAGULACIÓN DE LECHE (BALLS AND HOOVER)

El método de coagulación de la leche, es, sin duda, uno de los métodos más

expeditos para determinar actividad enzimática de una proteinasa. Se toma como índice de

actividad proteolítica, el tiempo necesario para que una cantidad conocida de enzima

coagule un determinado volumen de solución de leche. La actividad se expresa en términos

de unidades de leche coagulada por g de preparado enzimático.

La unidad de leche coagulada se la define coma la cantidad en peso de un preparado

enzimático necesario para coagular 5 ml de solución de leche estándar por minuto, cuando

la temperatura es de 40°C y el pH 6. La principal desventaja de este método radica en el

hecho de no medir la proteólisis total, es decir, la hidrólisis de un substrato de proteína,

pero, por el contrario, mide la actividad de la coagulación de la leche. Afortunadamente, sin

embargo, la coagulación de la leche parece ser una propiedad característica de los

componentes proteolíticos de este grupo de enzimas y puede ser usada con seguridad en la

medición proteolítica.

1.5. MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS EN LECHE

Este método se basa en la descomposición de los compuestos de nitrógeno orgánico

por ebullición con ácido sulfúrico. El hidrógeno y el carbón de la materia orgánica se

oxidan para formar agua y dióxido de carbono. El ácido sulfúrico se transforma en sulfato,

el cual reduce el material nitrogenado a sulfato de amonio.

El amonio se libera después de la adición de hidróxido de sodio y se destila

recibiéndose en una solución de ácido sulfúrico 0.1N. Se titula el nitrógeno amoniacal con

una solución valorada de hidróxido de sodio 0.1N. En este método se usa el sulfato de

cobre como catalizador y el sulfato de sodio para aumentar la temperatura de la mezcla y

acelerar la digestión.

1.6. PRUEBA DE JARRAS

La prueba de jarras es un procedimiento común de laboratorio para determinar las

condiciones óptimas de funcionamiento para el agua o el tratamiento de aguas

residuales. Este método permite realizar ajustes en el pH, las variaciones en la dosis de

coagulante o polímero, alternando velocidades de mezclado, o la prueba de coagulante o

diferentes tipos de polímeros, a pequeña escala con el fin de predecir el funcionamiento de

una operación a gran escala de tratamiento. Una prueba de jarras simula los procesos de

coagulación y floculación que fomentan la eliminación de los coloides en suspensión y

materia orgánica que puede conducir a problemas de turbidez, olor y sabor.

Figura 3. Aparato utilizado para prueba de jarras.

1.6.1. DESCRIPCIÓN DEL EQUIPO

El aparato de prueba de jarra (ver figura 3) contiene seis remos que remover el

contenido de seis envases de 1 litro. Un envase actúa como un control, mientras que las

condiciones de funcionamiento puede variar entre los restantes cinco contenedores. Un

medidor de RPM en la parte superior central del dispositivo permite el control uniforme de

la velocidad de mezclado en todos los contenedores.

1.6.2. TRATAMIENTO DE AGUAS POR COAGULACIÓN-

FLOCULACIÓN

La coagulación se refiere a la formación de flóculos precipitados o incipientes,

mediante los cambios fisicoquímicos, que se originan entre el coagulante soluble y la

alcalinidad del agua.

La operación consiste en agitar suavemente el agua tratada con el coagulante,

durante un periodo de tiempo apreciable, para completar las reacciones de coagulación,

hasta alcanzar las condiciones que permitan que el material floculento se junte y adhiera,

formando grandes masas de flóculos, los cuales se separan de la solución sedimentándose

en el fondo del recipiente. El termino sedimento se refiere finalmente al depósito elevado

de flóculos en estanques, especialmente diseñados para tal fin.

Hay cierto número de sustancias químicas que se emplean como coagulantes. El

más comúnmente utilizado es en Sulfato de aluminio, denominado comercialmente

alumbre. Las reacciones entre el alumbre y los constituyentes naturales del agua están

influenciadas por muchos factores, es por ello que se considera de gran importancia,

determinar las dosis de coagulantes que se requiere para lograr la eficiencia del tratamiento.

Por lo general se logran mejores resultados con dosificaciones de alumbre que

oscilan entre 10 a 50 ppm, determinándose la dosis óptima mediante la prueba de jarra. Esta

técnica consiste en agregar cantidades conocidas de coagulantes a varias jarras de agua que

se van a tratar agitando suavemente las mezclas por un periodo de tiempo determinado y

observando después la calidad y características de sedimentación de los flóculos (Parra y

Truchsess 2010).