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Recibido el 20 de abril de 2001 y aceptado el 10 de julio de 2001.* Departamento de Produccin Animal: Aves, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autnoma de Mxico,

04510, Mxico, D. F.

Nota de investigacinEvaluacin del conteo total de ooquistes de Eimeria tenella a

partir del ciego o heces, efectuado con la cmara deMcMaster y el hemocitmetro de Neubauer

Evaluation of Eimeria tenella oocyst total count carriedout with both the McMaster camera and the Neubauerhaemocytometer from faeces or caecal tissue samples

Marco Antonio Jurez Estrada*Jos Jess Cabriales Jimnez*Vctor Manuel Petrone Garca*

Guillermo Tllez Isaas*

AbstractResearch evaluation regarding Eimeria spp requires a trustworthy oocyst count technique. The aim of this studywas to determine the efficacy of total oocyst count using the Neubauer haemocytometer and the McMastercamera. E. tenella sporulate oocysts were inoculated per os to two groups of Leghorn chicks. Faecal samples werecollected at seven days postinoculation, and different technicians counted oocysts in both cameras. The Hartleytest was used to analyze homocedasticity variance level within counts with each camera. One counting, set bythe same technician, showed variance heterocedasticity in one from two counting samples with the haemocyto-meter but not with the McMaster camera. Furthermore, there was a significant difference in the total oocystcounts carried out with the McMaster camera between two technicians but not with the Neubauer haemocyto-meter. It is concluded that the Hartley test is a trustworthy statistical method to evaluate laboratory techniques.

Key words: MCMASTER CAMERA, NEUBAUER HAEMOCYTOMETER, OOCYST COUNT, HARTLEYTEST, LEGHORN CHICKEN.

Resumen

En la evaluacin de vacunas y frmacos anticoccidiales contra Eimeria spp, se requiere contar con una tcnicade conteo de ooquistes confiable. En el presente estudio se determin la fiabilidad estadstica del conteo total deooquistes de Eimeria tenella con el hemocitmetro de Neubauer y con la cmara de McMaster. Se inocularonooquistes esporulados de E. tenella a dos grupos de aves Leghorn. Siete das posinoculacin y a partir de muestrasde heces, dos operarios efectuaron series de conteos con ambas cmaras. Los datos se analizaron para probarhomocedasticidad de varianza con la prueba de Hartley. Las series de conteo de una misma muestra presentaronheterocedasticidad de varianza en uno de dos operarios con el hemocitmetro, pero no con McMaster. Hubodiferencia en el nmero total de ooquistes de los conteos efectuados con la cmara de McMaster entre operarios,pero no cuando el conteo se realiz con Neubauer. La prueba de Hartley es un mtodo estadstico adecuado paraprobar la confiabilidad de diversas metodologas de laboratorio, que impliquen mediciones o conteos.

Palabras clave: CMARA DE M CMASTER, HEMOCITMETRO DE NEUBAUER, CONTEO DEOOQUISTES, PRUEBA DE HARTLEY, AVES LEGHORN.

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ara la cuantificacin de ooquistes de Eimeria sppse utilizan diferentes tcnicas que emplean elhemocitmetro de Neubauer y la cmara de

McMaster. stas han sido descritas y modificadas deacuerdo con las necesidades del investigador.1-6 En losestudios que evalan la eliminacin total de ooquistespor ave en heces o el nmero de replicacin de ooquis-tes en el intestino, es importante considerar la fuente ymagnitud de variacin aleatoria, como es el tipo dedistribucin en la eliminacin de ooquistes, la distribu-cin de los ooquistes en cada cmara de conteo y lacantidad de muestra utilizada.2,4-7 El ms frecuenteerror en los anlisis de resultados es no tomar en cuentala heterocedasticidad de varianza existente de un gru-po experimental a otro.8,9 Por lo anterior, es recomen-dable verificar continuamente los mtodos de labora-torio, con la finalidad de que cumplan con la homoce-dasticidad de varianza. El objetivo del presente estudiofue determinar la variabilidad de resultados entre cadaconteo de ooquistes provenientes de una misma mues-tra y la variabilidad existente entre diferentes opera-rios que efectan el conteo a partir de una mismamuestra, evaluando estadsticamente a travs de laprueba de Hartley cul de las dos tcnicas de conteo esms confiable.8,9

Se utilizaron ooquistes de E. tenella recin cosechadosy suspendidos en dicromato de potasio al 3%. El conteode ooquistes en la cmara de McMaster se realiz segnlo descrito por Long et al.6 y el del hemocitmetro deNeubauer de acuerdo con Dorney.4 Se utilizaron dosgrupos experimentales, cada uno con tres repeticionesde cinco aves (Leghorn) de cinco semanas de edad,alojadas aleatoriamente en bateras de cinco niveles (1 1.5 m) con calefaccin elctrica. A las aves se les propor-cion agua y alimento estndar (sin anticoccidiano) adlibitum. En el grupo 1 a cada ave se le inocul per os 5 000ooquistes esporulados de E. tenella, contados con lacmara de McMaster;6 en el grupo 2 cada ave recibi peros 5 000 ooquistes esporulados de E. tenella contados conla cmara de Neubauer.4

En el primer estudio (conteo a partir de heces), sietedas posinoculacin (pi) y a partir de las repeticiones decada grupo, se obtuvo el total de heces acumuladas enlas ltimas 24 h. Las heces se conservaron en 1 500 mlde solucin acuosa con dicromato de potasio al 3%.6 Apartir de las repeticiones de cada grupo se efectuaronen la cmara de McMaster, seis series de tres conteos,cada conteo consider la suma de ambas celdas de lacmara. Con la cmara de Neubauer y a partir de lasrepeticiones de cada grupo se realizaron cinco series decinco conteos por serie, en cada conteo se sumaron lasdos celdas. Las series de conteo se efectuaron aleatoria-mente a partir de una sola muestra hasta completar unnmero de series semejantes para cada cmara. En elconteo con la cmara de McMaster se realiz una

ifferent techniques such as the Neubauerhaemocytometer and the McMaster cameraare used for the quantification of Eimeria spp

oocysts. These techniques have been described andmodified according to researchers needs.1-6 It isimportant to consider the source and aleatory variationmagnitude which includes the type of distribution inthe oocysts elimination, the distribution of oocysts ineach counting camera, and the quantity of the sampleused in the study when evaluating the total eliminationof oocysts per bird in faeces, or the number of replicationof oocysts in the intestine. 2,4-7 The most common errorwhen analyzing results, is not taking into account theexisting heterocedasticity variance from an experimen-tal group towards another. 8,9 It is therefore,recommendable to continuously verify laboratorymethods aiming at accomplishing heterocedasticityvariance. The objective of this study was to determinevariability results within each sample, and the existingvariability among different technicians who follow thecounting from the same sample through the statisticalHartley test evaluating which of the two countingtechniques is the most reliable one. 8-9

Recent cultured Eimeria tenella oocysts suspendedin 3% potassium dichromate were used. Oocystscounting followed by the McMaster camera was doneas described by Long et al.6. and the Neubauerhaemocytometer counting according to Dorney 4. Twoexperimental groups with each three repetitions of 5birds (Leghorn) aged 5 weeks were used. Birds wereallocated at random in 5 leveled batteries (1 x 1.5 m)with electric heating. Water and standard feed (withoutan anticoccidiastat) was provided ad libitum. Everybird in Group 1 was inoculated 5,000 sporulated E.tenella oocysts per os; these oocysts were counted withthe McMaster6 camera. Birds in Group 2 received 5,000esporulated E. tenella per os, and oocysts were countedwith the Neubauer camera.4

Total accumulated faeces were obtained in the last24 hrs in the first study (counting from faeces) at sevenpostinoculation (pi) days and from the repetitions ofeach group. Faeces were kept in a 1,500 ml waterysolution with 3% potassium dichromate.6

Six series of 3 countings were followed from therepetition of each group with the McMaster camera;each counting considered the addition of both cells ofthe camera. The same was done with the Neubauercamera, except that five series included five countingsper serie. Counting series were done at random from asingle sample until accomplishing a similar number ofcounting per camera. A final dilution of 1:100 in asaturated saline solution was included when countingthe McMaster camera according to Long et al. 6 For thecountings with the Neubauer camera, 5 samples of 1 mlaccumulated faeces were set at a 1:2 dilution using

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dilucin final de 1:100 en solucin salina saturada deacuerdo con lo sealado por Long et al.6 Para los con-teos efectuados con la cmara de Neubauer se tomaroncinco muestras de 1 ml de las heces acumuladas y sehizo una dilucin 1:2, utilizando agua destilada. Secontaron los ooquistes de los cuatro cuadrantes extre-mos y central de cada celda. En el segundo estudio(conteo directo a partir de tejido cecal) al da siete pi, lossacos ciegos diseccionados a nivel de tonsilas cecales sepesaron y molieron individualmente en 10 ml de dicro-mato de potasio al 3%; se tomaron dos gramos y seajustaron a 20 ml con dicromato de potasio al 3%. Paraobtener el nmero de ooquistes por gramo de tejidocecal despus de ajustar el nmero de ooquistes a 1 ml,ste se multiplic por el peso del saco ciego de dondeproceda la muestra, ms los 10 ml del dicromato utili-zado en la molienda inicial; para ajustar a gramos sedividi entre el peso original del ciego. Para efectuareste clculo se plante la frmula siguiente:

NO C D PO + V / PO

donde:

NO = Nmero de ooquistes contados en 10 cuadrosC = 103 (considera el volumen utilizado en la cmara

0.001 ml, para ajustar a 1 ml)D = 10 (factor de dilucin empleado en el afora-

miento 1:10)PO = Peso original total del ciegoV = 10 (ml que se agregaron para la molienda de la

muestra original)

Para el conteo con las cmaras de McMaster y deNeubauer se tomaron muestras directas de cada sus-pensin y se contaron de manera idntica al primerestudio. Los conteos obtenidos con ambas cmaras seanalizaron a travs de la prueba de Hartley,8 la cualdetermina un valor de la distribucin cuadrtica de lavarianza (Fmx) que es calculada a partir de la diferenciaentre la varianza mxima de una serie de conteos y lavarianza mnima de otra serie de conteos efectuados apartir de una misma muestra obtenida a partir de cadauna de las repeticiones del mismo grupo de inoculacin.Ambas varianzas obtenidas con una misma cmara secompararon con un valor crtico de tablas para distribu-cin de Fmx a una significancia de P < 0.05. Para deter-minar una posible variabilidad en la distribucin nor-mal de los conteos, se transform el nmero de ooquis-tes contados a travs de Log10.8,9 Se obtuvo la mediageomtrica de los conteos de E. tenella por ave, realiza-dos en cada grupo de inoculacin.6 Con la finalidad deencontrar diferencias entre conteos efectuados con cadacmara, y entre los conteos con una misma cmara, serealiz anlisis de varianza por el mtodo de cuadrados

distilled water. Oocysts were counted from the 4 extreme-and control quadrants at each cell. In the second study(direct counting from caecal tissue) at 7 pi days, caecumdissected blind sacks were weighed and groundindividually in 10 ml of 3% potassium dichromate; 2gwere taken and were adjusted to 20 ml of 3% potassiumdichromate. In order to obtain the number of oocystsper gram of caecum tissue after adjusting the numberof oocysts to 1 ml, it was multiplied by the weight of theblind sack sample plus 10 ml of the dichromate used inthe initial grinding. To adjust the obtained value ingrams, it was divided by the original weight of thecaecum. The following formula was used in order to dothe calculation:

NO C D OP +V / OW

where

NO = number of counted oocysts in 10 squaresC= 103 (considers the used volume in the camera,

0.001 ml to be adjusted to 1 ml)D= 10 (dilution factor used in the measuring 1:10)OW= original weight of the caecumV=10 (added ml for the ground mix of the original

sample)

For both countings, using the McMaster camera andthe Neubauer camera, direct samples of each suspen-sion were taken and counted as was done in the firststudy. Obtained countings with both cameras wereanalyzed through the Hartley test8 which determinedvariance quadratic distribution valve (Fmax) calculatedfrom the difference between the maximum variance ofa counting series, and the minimum variance fromanother counting series from the same sample obtai-ned from each of the repetitions of the same inocula-tion group. Both variances obtained with the samecamera were compared with a critical value of tablesfor the distribution of Fmax to a significance of P

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mnimos.8,9 Para cada anlisis se consider el origen dela muestra segn la tcnica empleada para el conteo delinculo original. Se determin la diferencia de los con-teos realizados por dos operarios con ambas cmaras.2,6El coeficiente de variacin se obtuvo a partir del prome-dio y la varianza de cada una de las series de conteos.8 Lacomparacin mltiple de las medias entre y dentro delas series de conteo se realiz por medio del paqueteestadstico SAS* a travs de la prueba de Tukey consignificancia de P < 0.05.10

Para obtener la Fmx de las tablas de Hartley, conMcMaster las seis series de conteos se consideraroncomo tratamientos y los tres conteos de cada serie comorepeticin, con 17 grados de libertad en el primer estu-dio se obtuvo un valor de 266. Para la tcnica de Neu-bauer, se tomaron cinco series como tratamientos ycinco conteos de cada serie como repeticin, con 24grados de libertad se obtuvo un valor de 25.2; al compa-rar ambos valores con la Fmx calculada a partir de cadagrupo de inoculacin, se observ heterocedasticidad devarianza (P < 0.05) en los conteos con Neubauer deloperario 1, a partir de muestras provenientes de lainoculacin con ooquistes contados originalmente conla cmara de McMaster (Cuadro 1). En el primer estudiono se lograron determinar los factores que hicieron quela Fmx calculada fuera diferente a la del operario 2, el cual

* (PSR 6.03 Inc. Cary, NC 27512-8000 U.S.A. 1987).Cuadro 1COMPARACIN DE VALORES DE F

mx CALCULADA CON LA PRUEBA DE HARTLEY, PARA DETERMINAR HOMOCEDASTICIDAD DE

VARIANZA EN CONTEOS DE OOQUISTES DE HECES EFECTUADOS CON LAS CMARAS DE MCMASTER Y NEUBAUERCOMPARISON FROM F

mx VALUES WITH THE HARTLEY TEST IN ORDER TO EVALUATE VARIANCE HOMOCEDASTICITY BETWEEN

FAECES OOCYST COUNTING CARRIED OUT WITH THE MCMASTER- AND NEUBAUER CAMERAS

Tcnica Origen de la Valores de Fmx calculadaOperario empleada muestraA Total de ooquistes Datos transformados

Sample Fmax valuesTechnician Technique SourceA Total oocysts Transformation data

1 McMaster Grupo 1 31.22 87.84Grupo 2 46.30 46.09

1 Neubauer Grupo 1 111.25 * 131.62 *Grupo 2 18.11 5.00

2 McMaster Grupo 1 6.40 9.77Grupo 2 8.94 18.23

2 Neubauer Grupo 1 14.86 7.27Grupo 2 3.36 4.58

A Every counting technique used samples from birds inoculated with E. tenella sporulated oocysts originally counted with McMaster (Group 1)and Neubauer (Group 2) chambers.* F calculated values within every column were different (P

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no rechaz la hiptesis nula. Esta diferencia entre con-teos est relacionada posiblemente con aspectos espec-ficos al realizar la tcnica, descritos ya anteriormente porLong et al.6 Sin embargo, existe la probabilidad de que elprimer operario pudo haber cometido error tipo 1; esdecir, rechazar algo que es cierto. El origen de las mues-tras no pudo afectar esta variabilidad, ya que los prome-dios de ooquistes por ave observados en el grupo 1 nofueron diferentes a las del grupo 2, contadas con ambascmaras. Los valores transformados con Log10 no au-mentaron el grado de significancia en la distribucin denormalidad, con relacin a la significancia observadapara los valores originales (Cuadro 1).

Algunos autores han mencionado que este tipo detransformacin conduce a cometer error tipo 1;9 sinembargo, mencionan su utilizacin para la distribucinen la eliminacin de ooquistes y no para la distribucinde los ooquistes en los conteos efectuados con diferentescmaras; por lo tanto, en las condiciones de este estudioes vlido efectuar el anlisis a partir de datos originales.

Cuando se compararon los promedios de ooquistesexcretados por ave, entre las cmaras de McMaster y deNeubauer, se observ que los conteos del operario 1fueron diferentes (P < 0.05), independientemente delorigen de las muestras (Cuadro 2). El operario 2 nomostr diferencias entre los valores contados con ambascmaras. Tampoco hubo diferencia entre el nmero deooquistes contados que provenan de grupos con dife-rente mtodo de cuantificacin del inculo original (gru-pos 1 y 2) y los que se contaron con la misma cmara(Cuadro 2). Al comparar los conteos promedio efectua-

Cuadro 2COMPARACIN ENTRE CONTEOS DE OOQUISTES EN HECES, EFECTUADOS CON LAS CMARAS DE MCMASTER Y NEUBAUER

COMPARISON BETWEEN FAECES OOCYST COUNTING CARRIED OUT WITH THE MCMASTER- AND NEUBAUER CAMERAS

Tcnica Origen de Media de ooquistes error estndarempleadaA N la muestra Operario 1 Operario 2

Source Oocysts average Standard errorsTechniqueA N of the sample Technician I Technician II

McMaster 18 Grupo 1 104 097 222.0 80 788 889.0( 3 469 497.0) a* ( 2 727 350.0) a*

25 Grupo 2 116 333 333.0 88 236 111.0( 2 490 324.3) a ( 4 687 359.2) a

Neubauer 18 Grupo 1 68 184 000.0 55 188 000.0( 5 391 730.2)b ( 4 949 893.0) a

25 Grupo 2 74 256 000.0 80 460 000.0( 6 167 782.0)b ( 6 340 891.0) a

*Values within a column followed by different superscript letters are significantly different (P

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dos con McMaster por el operario 1, en relacin con losrealizados por el operario 2, se observ diferencia (P