UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICASRev. peru. biol. ISSN 1561-0837

REVISTA PERUANA DE BIOLOGAVOLUMEN 12 AGOSTO-DICIEMBRE, 2005 NMERO 3LIMA, PER

REVISTA PERUANA DE BIOLOGArgano Oficial de la Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional Mayor de San MarcosRector Dr. Manuel Burga Daz Vicerrector Acadmico Dr. Ral Izaguirre Maguia Consejo Superior de Investigacin Dr. Vctor Pea Rodrguez Decano Dr. Germn Vergaray Ulffe Instituto de Ciencias Biolgicas Antonio Raimondi Mg. Martha Valdivia Cuya

La Revista Peruana de Biologa es una publicacin cientfica arbitrada, editada por el Instituto de Ciencias Biolgicas Antonio Raimondi, Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Per, y auspiciada por el Consejo Superior de Investigacin. La Revista aparece con una periodicidad semestral y esta dedicada a la publicacin de artculos cientficos originales e inditos en las reas de Biodiversidad, Biotecnologa, Manejo ambiental, Ecologa y Biomedicina. La Revista publica los trabajos realizados por acadmicos e investigadores nacionales y extranjeros, en idioma espaol o ingls. Los trabajos recepcionados son evaluados por rbitros segn criterios internacionales de calidad, creatividad, originalidad y contribucin al conocimiento. La Revista es publicada simultneamente en la pgina web de la Universidad.

Editor jefe

Comit Editor

Leonardo Romero Jorge Len Elizabeth Morales

Comit Consultivo

Csar Arana Enrique Escobar

Ana Claudia Reis Alves, Universidade Estadual de Campinas, Brasil Jose Luis Luque, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Brasil Gabriela Rouillon, Universidad del Pais Vasco, Espaa Maximilian Weigend, Freie Universitt Berlin, Germany Edgard Lehr, SNSD, Museum fur Tierkunde, Germany Mutsunori Tokeshi, Kyushu University, Japan Alfredo Laguarda Figueras, Inst. Ciencias del Mar y Limnologa, UNAM, Mxico Edmundo Gonzalez, Instituto de Biologa, UNAM, Mxico Jorge Llorente-Bousquets, Facultad de Ciencias, UNAM, Mxico Gerardo Lamas, Museo de Historia Natural, UNMSM, Per Ricardo Fujita, Universidad de San Martn de Porres, Per Manuel Tantalen, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Per Csar Nquira , Instituto Nacional de Salud, Per Marcel Gutirrez-Correa, Universidad Nacional Agraria La Molina, Per Alan R. Smith University Herbarium, University of California,USA Richard Bodmer, University of Kent, UK Keith R. Willmott, Florida Museum of Natural History, USA Daniel H. Sandweiss, University of Maine, USA Thomas S. Schulenberg, Field Museum of Natural History, USA Blanca Len, University of Texas at Austin, USA Kenneth Young, University of Texas at Austin, USA

Resumida/Indizada (Abstracted/Indexed) en: Peridica (ndice de Revistas Latinoamericanas en Ciencias), LIPECS (Literatura Peruana en Ciencias de la Salud), Zoological Record (BIOSIS), Scielo (Scientific Electronic Library Online), Index to American Botanical Literature (The New York Botanical Garden), BIOSIS Previews, Biological Abstracts (BIOSIS).

Informacin adicional a: Revista Peruana de Biologa Facultad de Ciencias Biolgicas UNMSM Ciudad Universitaria, Av. Venezuela Cdra. 34 s/n. Lima Casilla Postal: 11-0058 Lima-11, Per. Telfono (51-1) 619700-1502 / Telefax 6197000-1509

Editor Jefe, email: lromeroc@unmsm.edu.pe Copyright 2005 Facultad de Ciencias Biolgicas, UNMSM Hecho el Depsito Legal 98-3017Revista Peruana de Biologa Rev. peru. biol. - ISSN 1561-0837 Rev. peru. biol. - ISSN 1727-9933 (on line)

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REVISTA PERUANA DE BIOLOGARev. peru. biol. ISSN 1561-0837 VOLUMEN 12 AGOSTO-DICIEMBRE, 2005 NMERO 3

CONTENIDO 339 341EDITORIAL El difcil mercado de una necesaria publicacin cientfica TRABAJOS ORIGINALES Polimorfismos del cromosoma Y humano en poblaciones de la regin norte del Per Polymorphisms of the human Y chromosome in populations from northern Peru Nstor Carbajal-Caballero, Susy Nez, Milenka Narvaiza, Carlos Aguirre, Carlos Villanueva, Juan Muro y Luis Rodrguez-Delfn Uso de la tcnica SSCP para detectar mutaciones puntuales del ADN mitocondrial humano Use of the SSCP technique to detect point mutations on human mtDNA Alejandro Estrada-Cuzcano, Jos Sandoval, Mara L. Guevara-Fujita y Ricardo Fujita Purificacin parcial y caracterizacin de una sustancia antimicrobiana producida por Alteromonas sp. de origen marino Partial purification and characterization of an antimicrobial substance produced by a marine Alteromonas sp. Jorge Len, Guillermina Tapia y Rita Avalos The early development of the Patagonian squid Loligo gahi DOrbigny, 1835 in Peruvian Waters (Cephalopoda: Loliginidae) El desarrollo temprano del calamar patagnico Loligo gahi DOrbigny,1835 en aguas peruanas (Cephalopoda: Loliginidae) Franz Cardoso, Paul Baltazar and Jorge Bautista Dinofurcula cf. ventralis en la costa central del Per y primeros registros de dos especies de Protoperidinium Dinofurcula cf. ventralis in the central coast of Peru and the first registrations of two Protoperidinium species Noem Ochoa y Maribel Bayln Lquenes de Pueblo Libre, una localidad andina en la Cordillera Negra (Huaylas, Ancash, Per) Lichens of Pueblo Libre, an Andean locality from Cordillera Negra (Huaylas, Ancash, Per) ngel Ramrez y Asuncin Cano Estudio Florstico de los Pastizales de la Costa Norte del Per Floristic Assessment of the Peruvian North Coast Pastures Oscar Tovar Alimentacin de mamferos de caza en los aguajales de la Reserva Nacional de Pacaya-Samiria (Iquitos, Per) Game mammals feeding on aguajales in the Reserva Nacional Pacaya Samiria (Iquitos, Peru) Rolando Aquino Diversidad y estado de conservacin de primates en las Sierras de Contamana, Amazona peruana Diversity and conservation status of primates in the Sierras de Contamana, Peruvian Amazonia Rolando Aquino, Jos Alvarez y Augusto Mulanovich Reconocimiento preliminar de la densidad y estructura poblacional de Saguinus tripartitus MilneEduards en la Amazona peruana Preliminary survey on population density and structure of Saguinus tripartitus Milne-Eduards from the Peruvian Amazon Rolando Aquino, Carlos Ique y Hugo Glvez

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contina...

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NOTA CIENTFICA Flora fngica de la rizosfera de Phaseolus lunatus pallar en Ica, Per Fungal flora of rizosphere of Phaseolus lunatus pallar from Ica, Peru Julissa Arenas, Fiorella G. Carpio y Juan J. Guillermo Prevalencia de hongos en harina de Lepidium peruvianum Maca en mercados de Andahuaylas, Ica y Caete - Per Fungi prevalence in Lepidium peruvianum Maca flour come from markets of Andahuaylas, Ica and Caete - Peru Alfonso Orellana1, Juan Jos Muchaypia y Juan J. Guillermo Hongos de importancia agrcola presentes en moscas de la fruta del valle de Ica, Per Fungi of agricultural importance on fruit flies from Ica valley, Peru Carlos E. Tipismana, Lilian R. Astudillo y Juan J. Guillermo Material tipo de insectos en el Laboratorio de Sanidad Vegetal, SENASA, Lima, Per Insect type material in the Laboratorio de Sanidad Vegetal, SENASA, Lima, Peru Pedro W. Lozada, Luis Valencia, Walter Daz-B. y Daniel Burckhardt Material tipo de helmintos en el Museo de Historia Natural, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, (MUSM), Lima, Per Type material of helminthes in the Museo de Historia Natural, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, (MUSM), Lima, Peru Elizabeth Morales, Luz Sarmiento, Lidia Snchez, Doris Florndez y Gerardo Lamas Dieta de Leptodactylus ocellatus (Linnaeus, 1758) (Anura:Leptodactylidae) en un humedal del oeste de Argentina Diet of Leptodactylus ocellatus (Linnaeus, 1758) (Anura: Leptodactylidae) in a western swamp of Argentina Eduardo A. Sanabria, Lorena B. Quiroga y Juan C. Acosta Notas sobre la reproduccin en cautiverio de Crocodylus acutus (Cuvier, 1807) en el Per Observations about reproduction on captivity of Crocodylus acutus (Cuvier, 1807) in Peru Oswaldo Prez y Armando H. Escobedo-Galvn

Rev. peru. biol. 12(3): 339-340 (2005) Facultad de Ciencias Biolgicas UNMSM

ISSN 1561-0837

EDITORIAL El difcil mercado de una necesaria publicacin cientficaLeonardo Romero, Editor JefeUn escenario adverso

Las revistas cientficas sensu stricto publican esencialmente los denominados artculos primarios o memorias cientficas originales 1. Estos artculos son escuetos, minuciosos, con lenguajes tcnicos especializados; son comunicaciones sobre observaciones o descubrimientos provenientes de investigaciones y que por lo general son solamente valorados por otros investigadores de la misma especialidad. Estas caractersticas hacen de las revistas cientficas un objeto de difcil circulacin, muchas de ellas solamente se distribuyen a bibliotecas de universidades e institutos especializados. Comparadas con otros medios de comunicacin, las revistas cientficas tienen muy poco impacto sobre la sociedad, y esto es una constante preocupacin para los editores y una amenaza a la existencia de las revistas cientficas, ya que con un mercado reducido sobreviene el incremento de los costos y su posible extincin. Superar esta situacin es un reto, aunque algunas revistas cientficas, principalmente del rea medica, han elaborado estrategias que les permiten acercarse al publico en general, publicando artculos de inters general, relacionados al avance de las investigaciones, nuevos medicamentos, enfermedades emergentes, etc., logrando sobretodo subrayar su rol e importancia dentro de sociedad. Para las revistas de ciencias biolgicas tambin se ha sugerido un enfoque similar2. Por otro lado, la cantidad de investigadores, las investigaciones, el nmero de artculos y las revistas cientficas, guardan una clara relacin. El estudio Worldwide Scientific Publishing Activity3, en el que se analiza la proveniencia ms de 4 millones de artculos publicados en la base de datos MEDLINE desde 1986 al 2001, califica al Per entre aquellos con menor actividad cientfica (100 publicaciones por cada milln de habitantes).Rev. peru. biol. 12(3):339-340 (2005)

La produccin cientfica nacional tambin puede analizarse por el nmero de revistas cientficas nacionales. Esto se puede observar en el registro de la base de datos Latindex4. El Per, en el Directorio Latindex reporta un total de 99 revistas cientficas vigentes, de las cuales 34 estn tambin publicadas on line, 10 revistas estn dedicadas a ciencias biolgicas y solamente dos, la Revista Peruana de Entomologa y la Revista Peruana de Biologa cumplen con las normas para figurar en el Catlogo Latindex (seleccin y clasificacin segn criterios internacionales de calidad editorial), adems de ser las nicas indizadas en las bases de datos BIOSIS.Una necesidad dentro de un nuevo orden

La publicacin de un artculo en una revista cientfica puede considerarse como la transmisin y acreditacin de los resultados de las investigaciones y a la vez parte integrante de la generacin de conocimientos. Es por este motivo que necesitamos producir ms informacin, ponerla a disposicin de la sociedad y explicar la importancia de la actividad cientfica en el desarrollo del pas. En las ultimas dcadas la humanidad ha sido envuelta por la vorgine de tecnologas que han cambiado muchos conceptos de aprendizaje e investigacin, ya no es propiedad de elites sino de toda la sociedad, la informacin se adquiere y circula a velocidades no imaginadas antes. Las revistas cientficas, como medio de informacin, tambin han desarrollado cambios, algunos no tan positivos, como el incremento en costo y la brecha de informacin existente entre los pases desarrollados y los no desarrollados. El ao pasado la UNESCO propuso oficialmente en un documento el paradigma de las sociedades del conocimiento5, con la idea central de interpretar un nuevo escenario social que comprenda nuevas dimensiones sociales, ticas 339

Editorial

y polticas mucho mas vastas y que permitirn el desarrollo de la Investigacin Innovacin y Desarrollo (IID), en este documento se resalta la importancia de la investigacin bsica, la documentacin y la diseminacin en las revistas cientficas, como uno de los elementos necesarios para cumplir con el logro de la idealizada sociedad del conocimiento.Un articulo cientfico estratgico

An as un difcil producto

Desde 1998 la Revista Peruana de Biologa ha publicado 216 artculos, principalmente sobre biodiversidad. De ellos el 80% son de carcter descriptivo, el 34% de taxonoma, incluyendo 9 artculos con descripciones de especies nuevas. Los trabajos dedicados al estudio de animales son el 45% (incluyendo parsitos), mientras los artculos dedicados a plantas y los microbiolgicos son el 16 y 11% respectivamente. Aunque an son pocos trabajos, estos representan en su mayora una contribucin al conocimiento de la biodiversidad, un recurso natural que ha cobrado especial inters por el uso que puede drsele con la biotecnologa y por lo tanto participar activamente en el desarrollo econmico del pas. El conocimiento de la biodiversidad no solamente puede ser aprovechado por la biotecnologa, sino que nos ayuda a evitar catstrofes o crisis ecolgicas o sanitarias, prueba de ello es el inters por las denominadas especies allien o invasoras, dentro de las que podemos encontrar animales, plantas y organismos causante de enfermedades. Hay que resaltar que considerar una estrategia de desarrollo cientfico en el campo de la biodiversidad y biotecnologa no es una proposicin decorativa para un pas Megadiverso como el nuestro. Por el contrario actualmente pases como Brasil han incrementado las facilidades y medios para la formacin de taxnomos y sistemticos, logrando tener mas investigadores en esas reas que en otros pases desarrollados 6 . Justamente por que los taxnomos y sistemticos son considerados parte de una estrategia de Investigacin-Desarrollo en el conocimiento, aprovechamiento y conservacin de la biodiversidad. 340

Los artculos referidos a taxonoma y descripcin de nuevas especies son de carcter especial y algunos investigadores pueden considerarlos como documentos legales7 , debido a que se guan por cdigos y normas estrictas y por la trascendencia que tienen en el campo cientfico. La descripcin de una nueva especie tiene un gran impacto sobre otros artculos que analicen la biodiversidad de un rea geogrfica, su conservacin, la determinacin de especies amenazadas, endemismos, filogenia, entre otros. Estos artculos son los cimientos de bases de datos como el antbase.org8 y otras propuestas como el ZooBank 9; ambos esfuerzos ligados al Global Biodiversity Information Facility y que promueven tecnologas de informacin para compartir datos con la finalidad de conservar la biodiversidad. A pesar de la conspicua importancia de la nominacin de una nueva especie y de los estudios taxonmicos, la revista donde stos se escriben sigue siendo de escasa circulacin, aunque sean documentos casi imperecederos.

UNESCO. Gua para la redaccin de artculos cientficos destinados a la publicacin. 2 ed. Pars: UNESCO, 1983 (PGI-3/WS/10) 2 Watson D. M. 2004. Beyond impact factor. Frontiers in Ecology and the Environment: 2(7): 346347. 3 Perez-Iratxeta C. & M. A. Andrade. 2002. Worldwide Scientific Publishing Activity. SCIENCE 297: 519 4 http://www.latindex.unam.mx 5 UNESCO. 2005. Hacia las sociedades del conocimiento. http//www.unesco.org/publications 6 De Carvalho M. R. et al. 2005 Revisiting the Taxonomic Impediment. SCIENCE 307: 353 7 Minelli A. 2005. Publications in taxomony as scientific papers and legal documents. Proceedings of the California Academy of Science. 56 (20)suppl.: 225-231 8 Agosti, D., & N. F. Johnson. (Editors). 2005. Antbase. World Wide Web electronic publication. antbase.org, version (05/2005). 9 Polaszek A. et al. 2005. ZooBank, the open-access register for zoological taxonomy: Technical Discussion Paper. Bulletin of Zoological Nomenclature 62(4): 210-2201

Rev. peru. biol. 12(3): 339-340 (2005)

Rev. peru. biol. 12(3): 341- 348 (2005) Facultad de Ciencias Biolgicas UNMSM

ISSN 1561-0837 Polimorfismos del cromosoma Y humano

Polimorfismos del cromosoma Y humano en poblaciones de la regin norte del PerPolymorphisms of the human Y chromosome in populations from northern Peru Nstor Carbajal-Caballero1, Susy Nez1, Milenka Narvaiza1, Carlos Aguirre1, Carlos Villanueva2, Juan Muro1 y Luis Rodrguez-Delfn1,2Presentado: 17/06/2005 Aceptado: 23/08/2005

ResumenSe evaluaron los loci Y-especficos DYS287, DYS199 y DYS390 en un total de 105 individuos, en cuatro poblaciones del norte del Per. Slo un individuo present el linaje YAP+/C, de probable origen africano. La frecuencia de cromosomas Y Amerindios, indicado por el linaje YAP-/T, fue mayor en la poblacin Aguaruna de Yamayakat (97%), disminuyendo en mestizos de Moche (73%), Santiago de Chuco (53%) y Trujillo (33%); por otro lado, el grado de mestizaje fue mayor en las poblaciones nor-occidentales. Los hapltipos ms frecuentes fueron YAP-/C/24 en Trujillo (47%) y YAP-/T/24 en Santiago de Chuco (23%). La diversidad haplotpica en Santiago de Chuco (0,881) fue mayor que en Trujillo (0,752). Es de resaltar la considerable proporcin de cromosomas Y Amerindios en las poblaciones peruanas a pesar de ms de 500 aos de influencia hispnica y otras culturas. Palabras clave: Cromosoma-Y, polimorfismos, microsatlite, haplotipo, Aguaruna, Per.

AbstractThe non-recombination region of the human Y chromosome is a very informative genetic tool for unraveling the history of human populations. 105 individuals from four northern populations of Peru, were genotyped for three Y-specific loci: DYS287, DYS199 and DYS390. Only one individual carried the YAP+/C lineage, more probably of African origin. The highest frequency of Amerindian Y chromosomes, represented by the YAP-/ T lineage, was found in the Aguaruna population of Yamayakat (97%), decreasing gradually in the mestizo population of Moche (73%), Santiago de Chuco (53%) and Trujillo (33%); on the other hand, the admixture level was higher in north-western populations. The most frequent haplotypes were YAP-/C/24 in Trujillo (47%) and YAP-/T/24 in Santiago de Chuco (23%). The haplotype diversity was higher in Santiago de Chuco (0,881) than in Trujillo (0,752). It stands out in the proportions of Amerindian Y chromosomes within Peruvian populations in spite of more than 500 years of influence of Hispanic and other cultures. Keywords: Y-chromosome, polymorphisms, microsatellite, haplotype, Aguaruna, Peru.

Introduccin La secuencia no-recombinante de ADN del cromosoma Y viene proporcionando informacin importante sobre diferentes aspectos biolgicos, poblacionales, de la historia del hombre, su origen y como poblaron los continentes. Debido a la forma de transmisin de genes1

y la similaridad gentica, el conocimiento de las secuencias del cromosoma Y son complementarios con los anlisis del ADN mitocondrial (Jobling y Tyler-Smith, 1995; Santos y Tyler-Smith, 1996; Hammer y Zegura, 1997; Ruiz-Linares, 1999; Underhill et al., 2001). En particular, la regin no recombinante del cromosoma Y (NRY) presenta caractersticas genticas nicas que no se encuentran en otras secuencias del ADN nuclear, como son herencia paterna y falta de recombinacin gnica (Jobling y Tyler-Smith, 1995), facilitando las interpretaciones del proceso evolutivo de las 341

Laboratorio de Biologa Molecular, Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. E-mail Nestor Carbajal: necc_bio@hotmail.com Unidad de Biologa Molecular del Instituto de Medicina Tropical e Infectologa, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Trujillo. E-mail Luis A. Rodriguez: ladelfin@amauta.rcp.net.pe

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Carbajal et a.

poblaciones humanas. Underhill et al. (2002) analizando varias mutaciones en un nucletido (SNP) tipifican diez grupos de cromosoma Y: haplogrupos I-X. Ms recientemente y a partir de 245 marcadores biallicos, el Consorcio del Cromosoma Y, reconstruye la filogenia del hombre en 18 grupos linajes del cromosoma, denominados con las letras de A-R (YCC, 2002) El cromosoma Y presenta dos grupos de marcadores moleculares: 1) polimorfismos de ADN de eventos nicos (UEPs), cuyas tasas de mutaciones son lentas (109 por base por generacin, Whitfield et al., 1995) y ocurren generalmente una sola vez y 2) polimorfismos recurrentes, cuyas tasas de mutaciones son ms rpidas (103104 por locus por generacin; Weber y Wong, 1993; Brinkmann et al., 1998), apareciendo ms de una vez en la historia del hombre. Los primeros incluyen a los polimorfismos de un nucletido (SNPs) y los de insercin/delecin (INDELs); entre los polimorfismos recurrentes se usan con mayor frecuencia las regiones repetitivas cortas dispuestas en tandem (STRs o microsatlites). En conjunto, estos marcadores definen linajes evolutivos del cromosoma Y identificables en poblaciones humanas (Bradman y Thomas, 1998). El elemento polimrfico Alu del cromosoma Y es una insercin de 300 pares de bases (pb), mapeado en el locus DYS287 (Hammer, 1994) que ocurri aproximadamente hace 140000 aos en una poblacin africana. La distribucin geogrfica de su frecuencia (YAP+) es comparable con las rutas migratorias del Hombre Moderno cuando sali de frica, con altas frecuencias en poblaciones del sur de frica y disminuyendo hacia el Norte y el resto de continentes (Hammer, 1994; Hammer et al., 1997). Una mutacin AG del locus DYS271 ha sido identificada en sub-grupos de cromosomas YAP+ de poblaciones de la regin Sub-Sahara de frica (Seiestald et al., 1994). Otros marcadores importantes para los estudios de la evolucin del hombre pueden ser consultados en Jobling y Tyler-Smith (1995), Santos y Tyler-Smith, (1996), Hammer y Zegura (1997), Underhill et al., (2001). 342

Las poblaciones del continente Americano tambin han sido analizadas para distintos marcadores especficos del cromosoma Y. En estudios iniciales, Pena et al., 1995 y Santos et al. 1996, reportaron una alta frecuencia del alelo de 186pb del microsatlite DYS19 en poblaciones autctonas de Amrica del Sur y del Norte, y ligado al alelo II del sistema alfoide. Estos hallazgos llevaron a los autores proponer un nico cromosoma Y amerindio fundador para las poblaciones nativas de Amrica. Por otro lado, Underhill et al. (1996) encuentran que la mutacin CT de locus DYS199 est presente nicamente en poblaciones nativas americanas y la ligada al cromosoma de hapltipo 186pb/II. Un segundo linaje fundador, menos frecuente, del cromosoma Y ha sido propuesta en varios estudios (Rodrguez-Delfn et al., 1997; Bianchi et al., 1998; Santos et al., 1999; Ruiz-Linares et al., 1999). Este linaje es definido por la mutacin C T del marcador M242, ligado al alelo C de DYS199, se presenta en poblaciones de Amrica (Amerindias, NaDene) y Asia (Mongolia) (Bortoloni et al., 2003). Inicialmente, Tarazona-Santos y Santos, 2002, consideran este haplogrupo como resultado del mestizaje con grupos europeos y no como una segunda linaje del cromosoma Y americano. En el Per, diversas poblaciones estn siendo estudiadas en base a marcadores de ADN (Rodrguez-Delfn et al., 1997, 2001; Tarazona-Santos et al., 2001; Delgado, 2002). En el presente estudio se reportan los resultados del anlisis de tres marcadores de ADN especficos del cromosoma Y: DYS287, DYS199 y DYS390, en poblaciones de las regiones nor-occidental (Moche, Trujillo y Santiago de Chuco) y Nor-oriental (Yamayakat) del Per. Materiales y mtodosPoblaciones

Un total de 105 varones pertenecientes a cuatro poblaciones peruanas fueron analizados. Tres poblaciones se ubican en la regin nor-occidental, en los distritos costeros deRev. peru. biol. 12(3): 341- 348 (2005)

Polimorfismos del cromosoma Y humano

Moche (30) y Trujillo (15) y el distrito andino de Santiago de Chuco (30), del Departamento La Libertad; en la regin nor-oriental fue analizada la Comunidad Nativa de Yamayakat (30) de la etnia Aguaruna, que se encuentra en el Distrito de Imaza, Departamento Amazonas. Individuos con rasgos fsicos autctonos fueron seleccionados para el presente estudio y fueron excluidos aquellos con explcita ascendencia no nativa. Para las poblaciones de Moche y Yamayakat fueron seleccionados varones con al menos el apellido paterno caracterstico de la onomstica Mochica-Chim y Jibaro, respectivamente. La pertenencia a la zona fue verificada en todos los casos. Los individuos no presentan aparentemente parentesco por lnea paterna. De cada persona se obtuvieron 23 mL de sangre perifrica que fueron colectados en tubos con EDTA. Cada participante fue previamente informado de los objetivos y procedimientos del estudio.Anlisis del ADN

TATATTATACACATTGTTGCGC-3; TACAGTAAGATGACCACATTGC-3.

5-

La amplificacin del ADN se realiz por PCR bajo las siguientes condiciones de reaccin: 1X buffer, 0,2 mM dNTPs (c/u) 1,5 mM MgCl2, 0,5 M cebadores (c/u), 0,5 U/tubo Taq-DNA polimerasa, 0,1 L ADN genmico. Treinta ciclos fueron realizados por cada PCR. Las condiciones de denaturacin y extensin fueron: 94 C/30 seg. y 72 C/60 seg., respectivamente. Las condiciones de hibridacin fueron: 45 seg. a 56 C, 60 C y 61C, para DYS287, DYS199 y DYS390, respectivamente. Los segmentos de ADN amplificados fueron diferenciados por electroforesis, utilizando geles de poliacrilamida al 4% (DYS287, DYS199) y 8% (DYS390). La coloracin se realiz con nitrato de plata 0,1% y el revelado con hidrxido de sodio 3% ms formaldehdo 0,5%.Anlisis de datos

El ADN de los individuos se extrajo a partir de clulas sanguneas usando Sarkosyl 1% y Proteinasa K 100 mg/mL para la lisis celular, y acetato de amonio a 2,5 mM y etanol absoluto fro para la precipitacin del ADN. Las muestras fueron conservadas en T-E 10:1 a -4 C. Tres loci fueron analizados: 1) DYS287, con sus alelos YAP+ de 155 pb y YAP de 455 pb (Hammer y Horai, 1995); 2) DYS199 o marcador M3, con sus alelos C y T de 201 pb (Underhill et al., 1996) y 3) DYS390, con alelos de 18 a 27 repeticiones del tetranucletido TCTA, midiendo 191 pb 227 pb, respectivamente (Kayser et al., 1997). La secuencia nucleotdica de los cebadores son: 1) DYS287: 5-CAGGAGAAGATAGAGAGGATA-3, 5ACTGCTAAGAGGAGATTTGAT-3; 2) DYS199: 5-TAGTCAGTCTCCTCGGCAGCA-3, 5GGTACCAGCTCTTCCTAATTG-3 (alelo C-especfico), 5-GGTACGAGCTCTTCCTAATTA-3 (alelo T-especfico); 3) DYS390: 5Rev. peru. biol. 12(3): 341- 348 (2005)

Las frecuencias allicas y haplotpicas fueron obtenidas por conteo de los alelos y de sus asociaciones en los individuos, respectivamente. La diversidad haplotpica (h) fue calculada usando la ecuacin de Nei:

h = n (1 i2) / n1 p donde n es el nmero de cromosomas utilizados y pi es la frecuencia del i-avo hapltipo. ResultadosAlelos y Frecuencias

La tabla 1 y las figuras 1, 2 y 3 presentan las frecuencias y patrones electroforticos de cada marcador. De los 105 cromosomas Y analizados slo uno fue YAP+, siendo procedente de la poblacin de Santiago de Chuco. El alelo T present su mayor frecuencia en la poblacin de Yamayakat (97%) y disminuy progresivamente en las poblaciones de Moche (73%), Santiago de Chuco (53%) y Trujillo (33%). El microsatlite DYS390 fue utilizado slo con las poblaciones de Trujillo y Santiago de Chuco. En ambas, el alelo 24 de 215 pb fue 343

Carbajal et a.

Tabla 1. Frecuencia allica de los loci DYS287, DYS199 y DYS390 del cromosoma Y en poblaciones del norte del PerMarcadores Yamayakat n=30 DYS287 YAPYAP+ DYS199 C T DYS390 20 21 22 23 24 25 100 0 3,3 96,7 Frecuencia allica (%) Moche n=30 100 0 26,7 73,3 Santiago de Chuco n=30 96,7 3,3 46,7 53,3 3,3 10,0 6,7 26,7 46,7 6,6 Trujillo n=15 100 0 66,7 33,3 0 13,3 0 26,7 60,0 0

el ms frecuente (60% y 47%, respectivamente), seguido del alelo 23 de 211 pb (27%).Hapltipos y Diversidad

Al asociar los marcadores biallicos DYS287 y DYS199 se formaron tres linajes: YAP/C, YAP+/C y YAP/T. En la poblacin de Santiago de Chuco se encontraron los tres linajes, en las restantes solo se encontraron los linajes YAP/C y YAP/T. Al considerar los tres marcadores se obtuvieron 10 hapltipos. Todos estuvieron presentes en la poblacin de Santiago de Chuco; en la de Trujillo se identificaron 5 hapltipos (Tabla 2).1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

El hapltipo YAP/C/24 fue el ms frecuente en Trujillo (47%) y el segundo ms frecuente en Santiago de Chuco (20%) despus del hapltipo YAP/T/24 (23%). La diversidad haplotpica (Tabla 2) en la poblacin de Santiago de Chuco (0,881) fue mayor que en la de Trujillo (0,752).Mestizaje

Asumiendo que los linajes YAP/C y YAP+/ C son de origen europeo y africano (Hammer et al., 1997; Karfet et al. 1997), la proporcin de genes no nativos en las poblaciones noroccidentales fue 67% en la poblacin de Trujillo, 46% en Santiago de Chuco y 27% en Moche; en la poblacin nor-oriental de Yamayakat fue slo 3%. Discusin

Alelo C

Alelo T

Figura 1. PCR especfico de alelo. Mutacin C T en el locus DYS199. Tipificacin de diez individuos. Los alelos tienen ~201 pb.

El linaje YAP+/C fue observado en baja frecuencia en las poblaciones analizadas (1/ 105 individuos), frecuencias similares han sido encontradas en una poblacin andina del sur del Per (Rodrguez-Delfn et al., 2001) y otras poblaciones sudamericanas (Karafet et al., 1997; Carvajal-Carmona et al., 2000). En estos casos la presencia de cromosomas YAP+/ C fue atribuida al mestizaje con descendienRev. peru. biol. 12(3): 341- 348 (2005)

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Polimorfismos del cromosoma Y humano

Tabla 2. Haplotpos y diversidad gentica (h)del cromosoma Y en base de DYS287, DYS199 y DYS390 en las poblaciones de Trujillo y Santiago de Chuco.Hapltipos DYS287 YAP YAP YAP YAP YAP YAP YAP YAP YAP YAP+ Valor de h DYS199 T T T T T C C C C C DYS390 20 21 22 23 24 22 23 24 25 24 Frecuencia haplotpica (%) Trujillo 0 13,3 0 6,7 13,3 0 20,0 46,7 0 0 0,752 Santiago de Chuco 3,3 10,0 3,3 13,3 23,3 3,3 13,3 20,0 6,7 3,3 0,881

tes de africanos llegados posiblemente en tiempos de la Colonia Espaola, puesto que es poco probable que haya llegado a Amrica a travs de la migracin de los grupos paleoindios que iniciaron el poblamiento del continente americano (Karafet et al., 1997). Una segunda posibilidad, el cromosoma YAP+/C pueda tener un origen europeos, puesto que la Pennsula Ibrica, lugar de origen de los espaoles que llegaron al Per, tambin tuvo influencia africana. Adicionales marcadores permitirn elucidar el verdadero origen del cromosoma YAP+. Por otro lado, la baja frecuencia de este linaje concuerda con los datos registrados en el Censo de Poblacin de 1940 (Ministerio de Hacienda del Per, 1940) segn el cual la poblacin agrupada como negra representa un1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 11 2

porcentaje muy bajo o nulo en las localidades censadas. Por ejemplo, en la poblacin de Santiago de Chuco, donde se encontr el cromosoma YAP+/C, este grupo tnico representaba el 0,0041%.1 2 3 4 5 6 7 8

YAP+

YAP

Figura 2. Insercin Alu del cromosoma Y (DYS287). Tipificacin de doce individuos. Los alelos tienen ~150 pb (YAP) y ~450 (YAP+).Rev. peru. biol. 12(3): 341- 348 (2005)

Figura 3. Alelos del tetranucleotidio DYS390: alelo de 203pb (columna 2), alelo de 207pb (columna 7), alelo 215pb (columnas 1, 3, 4, 8, 10, 11), alelo 219pb (columna 5, 9), alelo 223 pb (columna 6).

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Carbajal et a.

Algunos cromosomas YAP/C pueden tener un origen europeo o nativo, Bortoloni et al. (2003) encuentran este cromosoma en cinco poblaciones nativas de Amrica del Sur (Ache, Guarani, Ingano, Kaigang, Wayuu), la tipificacin de la mutacin de CT del marcador M242 permitir establecer el verdadero origen de esta linaje. Asumiendo un origen europeo, lo ms probable, el valor detectado en la poblacin de Santiago de Chuco (47%) es similar al estimado para la poblacin andina por Rodrguez-Delfn et al. (2001). En el caso de Trujillo, el grado de mestizaje (67%) es menor que el encontrado en la poblacin urbana de Antioquia-Colombia (95%) estudiada por Carvajal-Carmona et al. (2000); esta mayor proporcin de cromosomas amerindios podra tener un origen Mochica-Chim o ser producto de un patrn de migracin desde zonas rurales hacia centros urbanos. Por ltimo, el grado de mestizaje encontrado en la poblacin de Moche fue el menor de las poblaciones nor-occidentales (27%); su proporcin de cromosomas Amerindios (73%) es semejante al valor sealado para Amerindios sudamericanos (ver Tabla 1 en Carvajal-Carmona et al., 2000). La poblacin Aguaruna de Yamayakat presenta un grado de mestizaje reducido (3%) en comparacin con las poblaciones nor-occidentales estudiadas (47% en promedio). Esta diferencia puede relacionarse con la Colonizacin Espaola, la cual tuvo mayor alcance en las regiones andina y costera, siendo menor en la regin Amaznica debido a la resistencia de las tribus y al difcil acceso a la zona (Seymour, 1988). Tanto en los Aguarunas como en la poblacin de Moche, el bajo grado de mestizaje est asociado a la conservacin de costumbres socioculturales ancestrales como la unin conyugal cerrada (Brown, 1984; Cabanillas et al., 1985). Respecto al microsatlite DYS390, el alelo 24 fue el ms frecuente en ambas poblaciones analizadas. Este alelo ha sido registrado como ms frecuente en poblaciones europeas y europeo-americanas (Base de Datos YHDRSTR; Rodrguez-Delfn et al., 1997; 346

Carvajal-Carmona et al., 2000). Estos datos corroboran el mestizaje con poblaciones europeas sealado para Trujillo y Santiago de Chuco, lo cual es indicado tambin por la frecuencia del alelo 24 en el linaje YAP/C en ambas poblaciones (Tabla 2). Los valores de diversidad haplotpica calculados para las poblaciones de Trujillo (0,752) y Santiago de Chuco (0,881) son similarmente altos al calculado para la poblacin andina reportada por Rodrguez-Delfn et al. (2001); este ndice (0,871) es atribuido al mestizaje europeo-americano y afro-americano. De manera concordante, el mayor valor de diversidad se encontr en la poblacin de Santiago de Chuco, donde tambin fue identificado el mayor nmero de hapltipos. Por otro lado, si slo se considera los hapltipos del linaje YAP/T de ambas poblaciones la diversidad se reduce a 0,733, valor similar a los reportados en otros trabajos (Rodrguez-Delfn et al., 1997; RodrguezDelfn et al., 2001). Debido a las diferencias ecogeogrficas y culturales, es de esperar que estos valores de diversidad correspondientes a poblaciones de la regin nor-occidental sean mayores a los que presenten poblaciones nativas de la regin Amaznica, como ha sido sealado por Tarazona-Santos et al. (2001). Conclusiones Los componentes tnicos paternos representados por los linajes y hapltipos del cromosoma Y presentan proporciones distintas entre las poblaciones de Moche, Trujillo, Santiago de Chuco y Yamayakat. La presencia de cromosomas Y origen africano y/o europeo (YAP+/C) es reducida. En conjunto las poblaciones nor-occidentales analizadas presentan mayor grado de mestizaje (YAP/C) que la poblacin nor-oriental de Yamayakat; dicho valor, sin embargo, no es tan alto en Moche. No est descartada la posibilidad que algunos de los cromosomas YAP/C tengan un origen nativo. La conservacin de cromosomas Y Amerindios (YAP/T) en ambas poblaciones puede asociarse a hechos histricos, geogrficos y socio-culturales.Rev. peru. biol. 12(3): 341- 348 (2005)

Polimorfismos del cromosoma Y humano

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Rev. peru. biol. 12(3): 349- 358 (2005) Facultad de Ciencias Biolgicas UNMSM

ISSN 1561-0837 La tcnica SSCP para detectar mutaciones puntuales

Uso de la tcnica SSCP para detectar mutaciones puntuales del ADN mitocondrial humanoUse of the SSCP technique to detect point mutations on human mtDNA Alejandro Estrada-Cuzcano, Jos Sandoval, Mara L. Guevara-Fujita y Ricardo Fujita*Presentado: 07/07/2005 Aceptado: 02/02/2006

ResumenEn el presente trabajo se evala la tcnica de SSCP (polimorfismo de conformacin de cadena individual de ADN) para detectar mutaciones puntuales, tanto por su sensibilidad en la deteccin (alrededor 80% en condiciones ideales), como por su implementacin fcil y econmica. Se utilizaron como controles positivos y negativos, ADN de voluntarios caracterizados previamente para las mutaciones puntuales de 5 RFLPs mitocondriales. Para la optimizacin de la prueba fueron ensayadas concentraciones variables del tampn TBE (1X y 0,5X) y del glicerol (10%, 5% y 0) en geles de poliacrilamida. Cuatro de los 5 RFLPs fueron detectados en las condiciones utilizadas y pueden ser usados en estudios de rutina sin usar enzimas de restriccin. Adems, la tcnica SSCP permiti determinar mutaciones desconocidas en un segmento de 394 nucletidos de la regin hipervariable (HVI) del ADNmt. Diferencias en correspondencia a los distintos haplotipos fueron detectados e incluso permiti discernir grupos dentro del mismo subtipo. La secuenciacin de dos muestras del subtipo B1 con migracin diferencial en SSCP, corrobor la existencia de siete nucletidos distintos. Palabras clave: SSCP, ADNmt (ADN mitocondrial), mutaciones puntuales, SNP (polimorfismo de un solo nucletido).

AbstractWe evaluate the use of SSCP (single strand conformational polymorphism), a relatively easy and inexpensive technique for the detection of point mutations with a sensibility around 80% under ideal conditions. To test the technique, we used samples of volunteers whose DNA had been previously characterized for the presence or absence of 5 mitochondrial RFLPs. Optimization of the tests included variations in TBE (1X and 0,5X) and of glycerol concentration (10%, 5% and no glycerol) in polyacrylamide gels. Four out of five RFLPs were detected under the conditions used and could be applied routinely without using restriction enzymes. In addition, the SSCP technique allowed detection of unknown mutations in a 394 bp nucleotide segment of the hypervariable (HVI) region of mtDNA. Differences corresponding to different haplotypes were detected, helping to distinguish groups within the same subtype. Sequencing of two samples of subtype B1 with differential migration on SSCP gels, proved the existence in seven different nucleotides. Keywords: SSCP, mtDNA, point mutation, SNP.

Introduccin La comparacin del genoma de dos individuos del mismo sexo revelara millones de mutaciones esparcidas a lo largo de todas las regiones cromosmicas. La mayora de las mutaciones cambian una sola base de cada 5001000, frecuentemente en segmentos no codantes y eventualmente en los codantes. Por(*) Instituto de Gentica y Biologa Molecular, Facultad de Medicina Humana, Universidad de San Martn de Porres, Alameda del Corregidor 1531, La Molina, Lima, Per. Tel: (511) 3652300 / 365-2574 anexo 152, fax: (511) 3650487. E-mail Ricardo Fujita: rfujita@amauta.rcp.net.peRev. peru. biol. 12(3): 349- 358 (2005)

esta razn la mayor parte de stas no tiene efectos fenotpicos. Sin embargo algunas pueden provocar o estar asociadas a enfermedades. Cuando una mutacin puntual est en una frecuencia mayor al 1% en la poblacin, se le conoce como SNP (single nucleotide polymorphismpolimorfismo de un nucletido). Con el estudio del genoma humano se ha incrementando el conocimiento del nmero de genes involucrados en diversas enfermedades hereditarias. Actualmente se registran cerca de 5700 diferentes enfermedades con componente gentico (OMIM-On-Line Mendelian 349

Estrada et al.

Inheritance in Man, 2004). Se han identificado mutaciones que causan o predisponen a enfermedades y su caracterizacin sirve para el diagnstico, pronstico, tratamiento y eventualmente prevencin de la enfermedad. Algunos SNPs tambin son tiles como marcadores genticos porque constituyen la mutacin que predispone o porque estn fsicamente cerca a la mutacin causal de la enfermedad. En la bsqueda de mutaciones puntuales, se emplean mtodos como el secuenciamiento directo, RFLPs (Southern, 1975), clivaje qumico, CCM (Cotton et al., 1988), clivaje por RNAsa (Goldrick et al., 1996) u oligonucletidos alelo especficos para hibridacin (ASO) (Nollau & Wagener, 1997), entre otros. Estos mtodos presentan diferentes rangos de sensibilidad, adems de requerir reactivos y equipos sofisticados, que aumentan su complejidad y costo operativo. Frente a ellos, el mtodo de SSCP es fcil y econmico, pues usa segmentos amplificados por PCR visualizados en geles de acrilamida con adyuvantes (Orita et al., 1989). El SSCP es un mtodo capaz de identificar la variacin de un slo nucletido en un segmento de ADN, tpicamente entre 150 a 200 nucletidos de largo. En condiciones ideales el rango de sensibilidad del SSCP vara entre 80 90% para detectar mutaciones en fragmentos menores de 200 pares de bases (Sheffield et al., 1993). El mtodo del SSCP se basa en que bajo condiciones no desnaturalizantes una hebra individual de ADN adopta una conformacin espacial que es especfica de la composicin de su secuencia nucleotdica (Fig. 1). Esta conformacin sera dependiente de la hibridacin entre distintas regiones de un segmento de ADN replegado sobre s mismo. La configuracin diferente es provocada por el cambio de una sola base, entonces podra ser detectada en algunas condiciones de migracin electrofortica en una matriz de poliacrilamida (Orita et al., 1989, Humphries et al., 1997). La tcnica es simple, verstil y econmica, pero exige la optimizacin de parmetros en la composicin del gel para cada fragmento a evaluar. 350

Los polimorfismos del ADN mitocondrial (ADNmt) son utilizados usualmente para el estudio de la diversidad del genoma humano. Esto permite la comparacin entre individuos de diferentes poblaciones e incluso entre individuos de distintas pocas. El mtodo ms usado para determinar subtipos de ADNmt en nativos americanos (amerindios) consiste en la deteccin de 8 sitios polimrficos en diferentes regiones del ADNmt. Siete son SNPs detectados por el mtodo llamado RFLP (polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin) y uno es la insercin/delecin de un segmento de 9 pares de bases. El RFLP es un SNP que coincide en el sitio de reconocimiento de una enzima de restriccin. Su presencia o ausencia determina que la enzima corte o no el segmento de ADN. Evidentemente solo una pequea porcin de SNPs sern detectadas por la tcnica RFLPs. A partir de la combinacin de los sitios polimrficos en cada individuo se confeccionan haplotipos que definirn tipos y subtipos de ADNmt. Los ADNmt amerindios han sido definidos en 4 tipos (haplogrupos) ms frecuentes A, B, C y D (SchurrMuestra 1 GAATCGATCCTAGGCA CTTAGCTAGGATCCGT Muestra 2 GAATCGATACTAGGCA CTTAGCTATGATCCGT

Hebra individual

Hebra doble

Figura 1. Representacin esquemtica del fundamento de la tcnica de SSCP durante la electroforesis en un gel no desnaturalizante. La movilidad electrofortica de cada fragmento depende del auto plegamiento de acuerdo a la formacin de estructuras secundarias.Rev. peru. biol. 12(3): 349- 358 (2005)

La tcnica SSCP para detectar mutaciones puntuales

(a)

(b)

(c)

(d)generan fragmentos de 168 bp por ausencia del sitio AluI en +5176. Panel c: El fragmento de ADN de 181 bp presenta sitio de corte para HincII en la posicin 13259 (polimrfico)que genera fragmentos de 155 y 26 bp en las muestras 1 y 2, la muestra 3 no presenta este sitio de restriccin por lo tanto el fragmento de 181 bp permanece intacto. Panel d: fragmento de 335 bp (muestra 1) susceptible a digestin con DdeI, presenta sitios de restriccin en las posiciones +10356 (constitutivo) y +10394 (polimrfico) que generan fragmentos de 175 y 38 bp en la muestras 2, 8 y 10; en las muestras 1, 3, 4, 5, 6, 9, y 11 vara la secuencia CTGAG por CTGAA lo que elimina el sitio de restriccin generando fragmentos de 213 y 122 bp. Panel e: fragmento de 261 bp (muestra 1) que presenta sitios de restriccin para HaeIII en el las posiciones +16517 (polimrfico) y +16456 (constitutivo), esto genera fragmentos de 171, 61 y 29 bp en las muestras 2, 3 y 6. Las muestras 4 y 5 presentan una variacin en la posicin +16517 que altera el sitio de restriccin generando fragmentos de 90 y 171 bp. M es el marcador de tamao, P es la ubicacin del sitio polimrfico, las lneas punteadas () representan fragmentos de ADN resultado de cortes de restriccin en sitios constitutivos, por lo que siempre estn presentes en las digestiones de ambos alelos.

(e)Figura 2. Cinco RFLPs del ADNmt humano usados para las pruebas de SSCP. Se indica la posicin del RFLP (P) y la secuencia nucleotdica que reconoce la enzima de restriccin, si sta secuencia es diferente la enzima no corta al ADN en esa posicin. Panel a: fragmento de 121 pares de bases (bp) susceptible a la digestin con la enzima de restriccin HaeIII en la posicin +626 (sitio de restriccin constitutivo) y +663 (sitio de restriccin polimrfico), que generan fragmentos de 66, 38 y 17 bp en muestra 3; en muestras 1 y 2 solo se generan dos fragmento de 104 y 17 bp debido a un cambio del sitio +663. Panel b: fragmento de 183 bp susceptible a la digestin con AluI en las posiciones +5042 (constitutivo) y +5176 (polimrfico), muestras 1, 3 y 5 presentan fragmentos de 134 y 34 bp denotando el sitio AluI, muestras 2, 4 y 6Rev. peru. biol. 12(3): 349- 358 (2005)

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Estrada et al.

et al., 1990). La adicin de un sitio polimrfico diseca los haplogrupos en subtipos A1, A2, B1, B2, C1, C2 y D1 y D2 (Bailliet et al., 1994). En el ADNmt existe la regin D-loop, que tiene 2 segmentos muy variables denominadas HVI (regin hipervariable I) y HVII (regin hipervariable II). Debido a que contienen secuencias no codantes y no tienen el sistema de reparacin tan eficiente como el nuclear, acumulan rpidamente mutaciones en pocas generaciones. Por esta razn HVI y HVII estn siendo usados paulatinamente para obtener un anlisis ms refinado de SNPs del ADNmt. En este trabajo presentamos los resultados de la implementacin del mtodo SSCP utilizando como controles, SNPs de 5 RFLPs del ADNmt. Subsecuentemente la metodologa nos permiti detectar mutaciones dentro de la regin D-loop. Esta regin fue escogida por su conocida variabilidad y que permite refinar el anlisis de los diferentes linajes mitocondriales en las poblaciones que estamos estudiando. Material y mtodosMaterial humano

Amplificacin por Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

Para las pruebas de estandarizacin de la tcnica SSCP, usamos como controles ambos alelos de 5 RFLPs del ADNmt (ver Tabla 1) que fueron analizados siguiendo las indicaciones de Sandoval et al. (2004) (Figura 2). Subsecuentemente evaluamos un segmento de 394 pares de bases cubriendo la regin hipervariable HVI (ver Tabla 1), sobre la que no tenamos informacin previa de posibles diferencias entre las muestras. La amplificacin por PCR se realiz en un volumen total de 20 microlitros (l), 0,2 micromolar (M) de cada par de oligonucletidos cebadores (primers) correspondientes (Operon Technologies Inc, California), 2,5 M de cada uno de los deoxinucletidos trifosfatados (dNTP) (Applied Biosystems,California); 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3; 2,5 mM MgCl2, 1 unidad de Taq polimerasa (Applied Biosystems, California) y 40 nanogramos (ng) de ADN. Los segmentos fueron amplificados en un termociclador AmplitronII (Thermolyne) con un programa de amplificacin de 35 ciclos: desnaturalizacin a 94 C por 30 segundos; hibridacin por 30 segundos a una temperatura especfica acorde al par de cebadores utilizados (Tabla 1) y replicacin a 72 C por 45 segundos.

Las muestras de ADN fueron obtenidas de sangre perifrica de 16 isleos voluntarios del Lago Titicaca (UrosTorani, Taquile, Amantan, Anapia) y 8 pobladores de la ciudad de Lima, luego del consentimiento pertinente (Sandoval et al., 2002).

Tabla 1. Caractersticas principales de fragmentos de mtDNA polimrficos empleados como controles positivos para estandarizar la tcnica de SSCP. stas incluyen tamao del fragmento amplificado, la posicin de la mutacin, la regin a la que pertenecen, enzima de restriccin que determina el RFLP, temperatura de apareamiento para el PCR y porcentaje de guanina/citocina del fragmento amplificado (%G+C).Regin 12SrRNA ND5 ND2 D-loop ND3 D-loop Cebadores L635/H708 L5054/H5189 16287-16306/ 16547-16527 10235-10254/ 10569-10550 L16055/H16410 Longitud (pares de base) 121 181 183 261 335 394 Posicin del SNP +663 -13259 +5176 +16517 +10394 +10397 Enzima de RFLP Hae III Hinc II Alu I Hae III Dde I Alu I T de hibridacin 62 C 58 C 62 C 58 C 50 C 58 C % G+C 42,98 52,54 38,80 50 35,52 46,33

L13257/H13393

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La tcnica SSCP para detectar mutaciones puntuales

Condiciones de los geles de poliacrilamida

Cinco l de producto PCR se mezclaron con igual cantidad de tampn de carga (95% de formamida, 89 mM Tris base, 89 mM cido brico y 2 mM EDTA (ethylene diamine tetra acetic acid), 0,1% de Azul de Bromofenol, 0,1% de Cianol-xileno); luego fueron desnaturalizados a 95 C por 5 min. y se mantuvieron en hielo durante 10 min. Se cargaron 6 l de la mezcla en los cuatro diferentes geles tipo secuenciamiento (20 cm x 40 cm x 0,4 mm). En todos los casos, los ensayos electroforticos se realizaron a 280 voltios, durante 16 horas a temperatura ambiente. Para la visualizacin de los segmentos amplificados se ti el gel con la tcnica de nitrato de plata (Creste et al., 2001). Los geles se prepararon con poliacrilamida al 8% (49:1, acrilamida : bisacrilamida) y con cuatro diferentes proporciones de glicerol y de tampn TBE (89 mM Tris base, 89 mM cido brico y 2 mM EDTA) obtenindose cuatro tipos de geles: I) II) III) IV) 10% de glicerol y TBE 1 X. 10% de glicerol y TBE 0,5 X. 5% de glicerol, TBE 0,5 X. Sin glicerol, TBE 0,5 X.

petri con ampicilina. Colonias selectas fueron cultivadas en 5 mL de medio Luria-Bertani, se extrajo el ADN plasmdico con mtodos convencionales (Sambrook et al., 1989) y se procedi a secuenciarlo utilizando el kit de secuenciamiento Silver Sequence DNA Sequencing System (Promega, WI, USA), pero modificado con cebadores marcados por kinasa con 1 microcurie (Ci) de fsforo 33 -dATP (Amershan, Il, USA). Una vez separadas las muestras por electroforesis y secado el gel, ste se expuso a un film Bio-max (Kodak) por 12 horas.Anlisis de las secuencias nucleotdicas

Las lecturas de los geles de secuencia se realizaron entre 2 personas y al menos 2 veces para evitar ambigedades o errores de lectura. Los alineamientos de ADN se realizaron utilizando el programa Bioedit (www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). ResultadosDeterminacin de condiciones para detectar mutaciones por SSCP en algunos RFLPs del ADNmt

Secuenciamiento

Las muestras amplificadas de ADN se extrajeron cortando el fragmento de un gel de agarosa y filtrndolo a travs de un tubo purificador Coastar. El segmento purificado se insert en un vector plsmido pCR2.1 (Invitrogen Life Technologies, CA), luego se realiz la transformacin bacteriana en E. coli y los clones fueron seleccionados de placas

Se evaluaron varias condiciones experimentales variando la composicin de los geles de SSCP con controles positivos y negativos para 5 polimorfismos conocidos (RFLPs del ADNmt). Las variables fueron la concentracin del tampn de electroforesis, TBE y la concentracin de glicerol (Tabla 2). Cuatro de los 5 fragmentos analizados mostraron diferencias en la migracin electrofortica, aunque sea en una de las condiciones probadas. Solo el fragmento de 183 pares de bases (AluI,

Tabla 2. Aqui los signos >>, > y N indican diferencias en la migracin electrofortica: >> seala diferencias en las bandas visibles, > seala diferencias en algunas bandas e identidad en otras. N denota no diferencias.Tamao ADN 121 bp 181 bp 183 bp 261 bp 335 bp 394 bp 10% glicerol, TBE 1X >> >> N >> N >> 10% glicerol, TBE 0,5X > > N >> > > 5% glicerol, TBE 0,5X > N N > > N Sin glicerol, TBE 0,5X N N N > > N

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Figura 3. Comparacin de condiciones para SSCP en polimorfismos de RFLPs mitocondriales. Paneles a y b, presentan el segmento que contiene el RFLP Alu I de 183 bp (posicin 5176) en 2 personas previamente caracterizadas como positivas para el sitio polimrfico Alu (+) y en 2 personas que carecen del sitio Alu (-). Panel a: gel de 8% acrilamida; 10% glicerol y 1X TBE; panel b: gel de 8% de acrilamida; sin glicerol y 0,5 X TBE. Las flechas en ambos paneles muestran bandas que son iguales en ambas condiciones; corresponde a N (No diferencias) en tabla 2. Paneles c y d representan el segmento que contiene el RFLP DdeI/AluI de 335 bp (posicin 10394/10397). Las flechas horizontales en panel c indican bandas idnticas en 4 personas previamente caracterizadas; 2 como positivas para el sitio polimrfico DdeI/AluI (+) y en 2 personas que carecen del sitio DdeI/AluI (), las condiciones fueron 10% glicerol y 1X TBE. Las flechas inclinadas en panel d indican bandas diferentes dependiendo de la presencia del sitio AluI; las condiciones de migracin fueron 8% acrilamida sin glicerol y 0,5 X TBE y corresponde a > (algunas bandas diferentes y otras idnticas) en tabla 2. Paneles e y f, representan al segmento que contiene el RFLP HaeIII de 121 bp (posicin 663). Las flechas horizontales en panel e indican bandas idnticas en 4 personas previamente caracterizadas; 2 como positivas para el sitio polimrfico HaeIII (+) y en 2 personas que carecen del sitio HaeIII; las condiciones fueron no glicerol y 0,5 X TBE. Las flechas inclinadas en panel f indican bandas diferentes dependiendo de la presencia del sitio HaeIII, las condiciones de migracin fueron 8% acrilamida, 10% glicerol y 1 X TBE y corresponden a >> (todas las bandas son diferentes) en tabla 2.

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(a)

(b)Figura 4. Comparacin de electroforesis de un segmento de la regin hipervariable I del mtDNA (D-loop) de 24 individuos nativos. En el panel a se muestra la electroforesis en condiciones denaturantes con 8% de acrilamida y 50% rea, utilizada para determinar diferencias en tamaos. No se ven diferencias de tamao entre las 24 muestras. En panel b se muestra electroforesis para condiciones de SSCP en 8% de acrilamida 10% de glicerol y TBE 1X. Ntese la diferencia entre los segmentos que corresponden a los diferentes haplotipos amerindios. Esto indica que a pesar de la igualdad en longitud hay diferencias en la secuencia que son detectadas por la migracin en el gel de SSCP.

+5176) no mostr diferencias en ninguna de las condiciones (Fig. 3a y b). Para el segmento de 335 pares de bases se obtuvo mejor diferenciacin en condiciones de baja concentracin de TBE (0,5X) y sin glicerol (Fig. 3c y d). Sin embargo para los otros 3 segmentos restantes, las mejores condiciones de deteccin estaban asociadas a la mayor concentracin de glicerol (10%) y a una concentracin de 1X del tampn TBE (Tabla 2), ver como ejemplo la figura 3e y f.Diferenciacin de segmentos polimrficos de la regin hipervariable (HVI) del D-loop mitocondrial por SSCP

distintos haplogrupos mitocondriales. La mayora de muestras del mismo haplogrupo tenan migracin similar; pero algunas presentaban diferencias. Por ejemplo, la muestra A0008 de un poblador de Lima, present una migracin diferente a las dems muestras de su mismo haplogrupo B (subtipo B1). Esta diferencia fue corroborada por la secuenciacin directa del segmento en A0008 y la muestra T6 (de la isla Taquile) con migracin similar al resto de individuos de haplotipo B subtipo B1 (Fig. 4). Se obtuvo la secuencia de estas dos muestras (Fig. 5), encontrndose siete diferencias en su composicin nucleotdica (Tabla 3), cinco fueron transiciones, una fue transversin y una sola insercin no detectada por gel desnaturalizante. Posteriormente se utiliz el software Bioedit, se compar las secuencias T6 y A0008 con secuencias de referencia estndar humano (Anderson et al., 1981), y con las de grupos Yanomami (Easton et al., 1996), Brasil (Alves-Silva et al., 2000) y Arequipa y Tayacaja (Fuselli et al., 2003), que pertenecen al haplogrupo B subtipo B1. Al compararlas, pudimos observar que las varia355

Amplificamos un segmento diseado para 394 bases de la regin hipervariable I (HVI) en el ADN de 24 muestras pertenecientes a individuos previamente caracterizados con diferentes haplotipos mitocondriales (A, B, C, D). Un anlisis de longitud de segmentos en condiciones desnaturalizantes sugiere tamao uniforme en las muestras (Fig. 4a). La migracin de las mismas en condiciones de SSCP 10% glicerol y 1X TBE mostraron diferencias notables entre los individuos pertenecientes aRev. peru. biol. 12(3): 349- 358 (2005)

Estrada et al.

Figura 5. Secuenciacin de las muestras T6 y A0008 correspondientes al ADNmt de la regin del D-loop que presentaron migracin diferencial en el SSCP mostrado en la figura 2. Se aprecia la similitud de las secuencias; pero tambin se observa variaciones nucleotdicas en las posiciones 16124, 16354 y 16357 bp.

ciones TC en las posiciones 16189 y 16217 eran comunes en estas muestras (Tabla 3). No apreciamos estas variaciones al compararlas con las secuencias de diferentes haplotipos, lo cual nos indica que estas son exclusivas del subtipo B1. La secuencia A0008 muestra la insercin de una citosina en la posicin 16194, la cual no es frecuente en secuencias de subtipo B1.

Discusin La mejor tcnica para detectar las mutaciones desconocidas es la secuenciacin directa, pero es laboriosa y costosa para ser usada rutinariamente. Frente a esta, la tcnica SSCP es comparativamente econmica, rpida y fcil, habindose empezado a usar en muchos laboratorios de investigacin en el

Tabla 3. Resultados del alineamiento de la secuencia reportada por Anderson (1981) con la secuencias del HV-I de A0008 y T6, adems de los grupos: Yanomami (Yan 61 y Yan 96), Arequipa y Tayacaja (And 20, And 21 y And 32) y Brasil (Br 17, Br 26 y Br 30), todos de haplotipo B. Note las posiciones 16189 y 16217 que indican una variacion TC en todas las muestras pertenecientes al haplotipo B. Adems de la insercin de una citosina en la posicin 16194 de la muestra A0008.Posicin en HV-I Muestra Anderson T6 (B) A0008 (B) And 20 (B) And 21 (B) And 32 (B) Yan 61 (B) Yan 96 (B) Br 17 (B) Br 26 (B) Br 30 (B) 1 6 1 2 4 T . C . . . . . . . . 1 6 1 8 2 A . C . . . . . . . . 1 6 1 8 3 A C C . . . C C . . . 1 6 1 8 8 C T . T . . . . . . T 1 6 1 8 9 T C C C C C C C C C C 1 6 1 9 4 A . iC . . . . . . . . 1 6 2 1 7 T C C C C C C C C C C 1 6 2 1 9 G A . . . . . . . . . 1 6 3 5 4 C T . . . . . . . . . 1 6 3 5 7 T C C . . . . . . .

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mundo. Uno de los principales inconvenientes de esta tcnica, es que an no se ha podido determinar con precisin los efectos de algunos parmetros que afectan la sensitividad del anlisis de SSCP, como por ejemplo: la composicin del gel, el tamao del fragmento de ADN, la composicin del tampn, los aditivos como el glicerol, la concentracin de ADN y el contenido de guanina/citosina (G+C) del ADN. En el presente trabajo se encontr que las concentraciones altas de glicerol proporcionan las mejores condiciones de sensitividad en las muestras analizadas (Tabla 2). Sin embargo en las muestras de 183 y 335 pares de bases se observ dificultades en la deteccin, probablemente debido a que presentan un contenido de G+C inferior al 40% (Tabla 1). Estudios previos han demostrado que una sustitucin en regiones ricas en G+C pueden tener un mayor efecto en su movilidad. Nataraj et al. (1999) compararon fragmentos de 100-300 nucleotidos de longitud conteniendo 60% de G+C que fueron fcilmente resueltos por SSCP a temperatura ambiente, mientras otras secuencias de similar tamao con un contenido de 40% de G+C no pudieron ser detectados. Probablemente por que los enlaces de hidrgeno influencian la complejidad de la estructura terciaria de una hebra individual de ADN en un gel no desnaturalizante. Por otro lado se ha sealado que SNPs en fragmentos mayores de 200 nucletidos son menos sensibles a ser detectados por SSCP (Sheffield et al., 1993), sin embargo, el presente trabajo ha demostrado que en condiciones adecuadas alelos de 261 y 335 pares de bases pueden ser detectados. En el caso del fragmento de 394 pares de bases del HVI del D-loop, no sabemos si se podra detectar una mutacin de una sola base. En la nica oportunidad que se pudo secuenciar, se compar 2 muestras del haplotipo B subtipo B1 (A0008 y T6) que presentaban diferencias en la migracin en SSCP, entre ellas se detectaron siete bases nucleotdicas diferentes.Rev. peru. biol. 12(3): 349- 358 (2005)

El secuenciamiento de los fragmentos A0008 y T6 de la regin HVI del D-loop mitocondrial y su comparacin con otras secuencias similares del haplotipo B, nos ha permitido establecer variaciones (TC) exclusivas de este haplotipo en las posiciones 16189 y 16217, adems, en la secuencia del fragmento A0008 en la posicin 16194 muestra la insercin de una citosina, que al compararla con otras secuencias, se constata que es una variacin muy rara en el subtipo B1, lo que nos permitira establecer subgrupos dentro del subtipo B1 basados en la secuencia de la regin HVI y los sitios de restriccin a lo largo del ADNmt. Nuestros resultados muestran la factibilidad de utilizar la tcnica SSCP para detectar mutaciones puntuales conocidas o las desconocidas, estas ltimas, las ms numerosas entre todas las mutaciones del genoma y las ms difciles de reconocer. Es sorprendente la correlacin fortuita entre los haplotipos mitocondriales y los SSCP de la regin HVI del ADNmt. Los haplotipos estn constituidos de ocho polimorfismos, distribuidos de manera casi uniforme en los 16569 pares de bases (promedio) del ADNmt. Mientras que el SSCP de la regin HVI se realiza en un segmento de 394 pares de bases (ver figura 1 en Sandoval et al., 2004). A pesar de tener diferentes relojes moleculares en su tasa de mutacin, la correlacin es mantenida a travs del tiempo. Desde el punto de vista prctico, en el establecimiento de haplotipos del ADNmt, el mtodo SSCP podra ahorrar tiempo y dinero. Primero, porque algunos RFLP pueden ser detectados directamente sin necesidad de digerir los segmentos amplificados con la respectiva enzima de restriccin. Segundo y ms interesante, es el hecho que en la mayor parte de las reacciones probadas aqu para la regin HVI, podran discriminar los cuatro haplotipos mayores del ADNmt amerindio en un solo experimento. Esto implica menos trabajo que la identificacin seriada y secuencial de los ocho polimorfismos utilizados para determi357

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nar los haplotipos de cada individuo. Lo que podra hacer accesible el estudio del ADNmt a laboratorios con escasos recursos. Cabe la posibilidad que el anlisis con SSCP pueda ser extensivo a otros haplotipos definidos con RFLPs prevalecientes en otros continentes. Agradecimientos Este trabajo ha sido financiado con fondos de la Universidad de San Martn de Porres y cofinanciamiento del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa del Per (CONCYTEC). Nuestro reconocimiento al Dr. Marc Ghislain del Centro Internacional de la Papa por su valioso apoyo. Literatura CitadaAlves-Silva J.; M. Da Silva Santos, P. Guimares, P. Ferreira, H. Bandelt, S. Pena, V. Ferreira Prado. 2000. The ancestry of brazilian mtDNA lineages, Am. J. Hum. Genet. (67): 444-461. Anderson S., A. T. Bankier, B.G. Barrel, M. H. L. deBrujin , A. R. Coulson, J. Douin, et al. 1981. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. (290): 457-465. Bailliet A., F. Rothhammer, F. Carnese , C. Bravi & N. Bianchi. 1994. Founder mitochondrial haplotypes in Amerindian population. Am. J. Hum. Genet. (54): 27-33. Cotton R. G., N. R. Rodrigues and R. D. Campbell. 1988. Reactivity of cytosine and thymine in single-base-pair mismatches with hydroxylamine and osmium tetroxide and its application to the study of mutations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (85): 4397-4401. Creste S., A. Tullman-Neto & A. Figueira. 2001. Detection of Single Sequence Repeat Polymorphisms in Denaturing Polyacrilamide Sequencing Gels by Silver Staining. Plant Molecular Biology Reporter. (19): 299-306. Easton R., A. Merriwether, D. Crews, & R. Ferrel. 1996. mtDNA variation in the Yanomami: evidence for additional new world founding lineages. Am. J. hum. Genet. (59): 213-225. Fuselli S., E. Tarazona-Santos, I. Dupanloup, A. Soto, D. Luiselli & D. Pettener. 2003. Mitochondrial DNA diversity in South America and the genetic history of andean highlanders. Mol. Biol. Evol. (10): 1682-1691. Goldrick M., G. Kimball, Q. Liu, L. Martin, S. Sommer & J. Tseng. 1996. Nirca(Tm) - A Rapid Robust Method For Screening For Unknown Point Mutations. Biotechniques (21): 106-12.

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Rev. peru. biol. 12(3): 359- 368 (2005) Facultad de Ciencias Biolgicas UNMSM

ISSN 1561-0837 Sustancia antimicrobiana producida por Alteromonas sp.

Purificacin parcial y caracterizacin de una sustancia antimicrobiana producida por Alteromonas sp. de origen marinoPartial purification and characterization of an antimicrobial substance produced by a marine Alteromonas sp. Jorge Len1, Guillermina Tapia2 y Rita Avalos1Presentado: 07/09/2005 Aceptado: 09/01/2006

ResumenUn miembro del gnero Alteromonas sp. (cepa N22.C), aislado del neuston marino y productor de sustancias que inhiben el crecimiento de ictiopatgenos fue caracterizado fenotpicamente mediante pruebas morfolgicas, fisiolgicas y bioqumicas convencionales. Para determinar la naturaleza qumica de la sustancia inhibitoria, extractos crudos de sobrenadantes de cultivos fueron precipitados con concentraciones crecientes de Sulfato de Amonio hasta el 70% y filtrados a travs de columnas de Sephadex G-25. Ensayos con Dodecil Sulfato de Sodio-electroforesis en Geles de Poliacrilamida (SDS PAGE) revelaron que la sustancia antimicrobiana es un compuesto proteinceo con una masa molecular de aproximadamente 34000 Da, que carece de residuos de azcares asociados. Otros ensayos realizados con extractos crudos y fracciones semipurificadas de la cepa de Alteromonas sp. N22.C mostraron un amplio espectro de actividad antibitica contra cepas de bacterias patgenas de peces, moluscos y crustceos. Palabras claves: bacterias marinas, actividad inhibitoria, sustancia extracelular, Alteromonas, antibiosis.

AbstractA member of the genus Alteromonas sp. (strain N22.C) isolated from marine neuston and substance-producer which inhibit growth of ichthyopathogenics was characterized phenotipically by means of morphological, physiological and biochemical conventional tests. To determine the chemical nature of the inhibitory substance, raw extracts of supernatans from cultured strains were precipitated with increasing concentrations of Ammonium Sulphate up to 70% and filtered through columns of Sephadex G-25. Assays by Sodium Dodecyl SulfatePolyacrylamide Gel Electrophoresis (SDSPAGE) revealed that the antimicrobial substance is a proteinaceous compound with a molecular mass of approximately 34000 Da, which lacks sugar associated residues of it. Other assays made with raw semipurified fractions extracts of Alteromonas sp N22.C show the wide spectrum of antibiotic activity against pathogenic bacterial strains of fish, mollusks and crustaceans. Keywords: marine bacteria, inhibitory substances, extracellular substance, Alteromonas, antibiosis.

Introduccin Los microorganismos marinos han recibido particular atencin en las ltimas dcadas como fuentes de nuevos recursos biomdicos (Kelecom, 2002). Asimismo, diversos metabolitos secundarios y nuevas substancias de naturaleza qumica nica y de origen microbiano presentan aplicaciones promisorias en el mbito de la biotecnologa marina (Fenical1 Laboratorio de Microbiologa Ambiental y Biotecnologa, Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Apartado 110058, Lima 11, Per. E-mail Jorge Len: jleonq@unmsm.edu.pe 2

& Jensen, 1993; Bradley, 1995; BioScience, 1996). Entre las numerosas substancias con principios bioactivos de origen marino destacan los antibiticos producidos en forma natural por microorganismos (Gatesoupe, 1999). Estos podran ser de gran utilidad en el control de enfermedades en la acuicultura (Abraham, 2004) en particular en patologas de peces, moluscos y crustceos (Austin et al. 1995; Gatesoupe, 1999). La produccin de substancias antibiticas por bacterias aisladas del ecosistema marino ha sido largamente documentada (Kelecom, 2002). Uno de los primeros reportes que marc un hito en el estudio de bacterias marinas productoras de substancias antibiticas fue el 359

Laboratorio de Bioqumica, Facultad de Ciencias Bsicas Carrera de Bioqumica Universidad Catlica de Valparaso, Chile.Rev. peru. biol. 12(3): 359- 368 (2005)

Len et al.

de Rosenfeld & ZoBell (1947), quienes sugirieron que el ambiente marino debera ser considerado como una fuente potencial de antibiticos naturales. Posteriormente se ha evaluado ese efecto frente a diversas bacterias patgenas de humanos (Jayanth et al., 2002) de peces y moluscos (Dopazo et al., 1988; Lodeiros et al., 1988; Len, 1996; Riquelme et al., 1996) y en la actualidad se ha llegado a conocer incluso el efecto bactericida que tienen frente a cepas resistentes a antibiticos como Staphylococcus aureus meticilino-resistentes (Isnansetyo & Kamei, 2003). El desarrollo de mtodos de extraccin y purificacin de substancias inhibitorias activas, ha permitido conocer su naturaleza qumica, encontrndose compuestos proteinceos (Riquelme et al. (1996), glicoproteinas termolbiles Barja et al. (1986) y lipopolisacridos (Gauthier, 1970), todos con un amplio espectro de actividad inhibitoria. En el presente trabajo se describen caractersticas fenotpicas de una cepa de Alteromonas productora de una sustancia antibacteriana. Asimismo, se describen aspectos de la extraccin, purificacin y caracterizacin bioqumica de la sustancia inhibitoria, y la determinacin de capacidades antibiticas de extractos crudos y semipurificados. Material y mtodosAislamiento y caracterizacin bacteriana

Condiciones de cultivo y extraccin de la substancia inhibitoria

El medio de cultivo para la caracterizacin de la substancia antibitica producida por la cepa descrita se prepar segn la formulacin de Gauthier (1976), modificada por el autor en la adicin de 0,1% de glucosa en lugar de 5% de almidn. Se utiliz el caldo marino de ZoBell (CMZ), conteniendo los siguientes componentes: proteosa-peptona 0,5% (p/v) (Oxoid), extracto de levadura 0,1% (p/v) (Oxoid), FePO4 0,01% (p/v), glucosa 0,1% (p/v), todo diluido con una mezcla de agua de mar envejecida y agua destilada (3:1), y con un pH 7,6. La cepa N22.C se inocul a partir de un pre-cultivo de 24 h, en 200 ml de CMZ distribuidos en Erlenmeyer de 500 mL. Los cultivos se incubaron a 20 C con agitacin constante de 60 golpes por minuto hasta alcanzar la fase estacionaria a los 4 das. La extraccin del producto antimicrobiano se realiz segn el mtodo de Barja et al. (1989), con modificaciones de los autores. El proceso de extraccin se realiz a 4 C. El cultivo fue centrifugado a 8000 xg por 15 minutos en una centrfuga refrigerada (Sorvall RC-5B). El sobrenadante colectado fue sometido a precipitaciones fraccionadas de protenas segn Keen (1966) con Sulfato de Amonio a concentraciones saturantes hasta 70%. Luego de 16 h, la muestra se centrifug a 13000 xg por 20 minutos. El precipitado fue disuelto en agua destilada estril, luego liofilizada y conservado a la temperatura de 20 C hasta su posterior anlisis. La muestra as obtenida fue considerada como extracto crudo del sobrenadante (ECS). Con la finalidad de determinar la posible localizacin intracelular de la sustancia antibacteriana, se realizaron pruebas complementarias de actividad inhibitoria utilizando el pellet celular, segn Barja (1989). Los extractos crudos intra y extracelulares obtenidos fueron probados para determinar su actividad inhibitoria frente a Staphylococcus aureus ATCC 11632.Rev. peru. biol. 12(3): 359- 368 (2005)

La cepa de Alteromonas marina N22.C fue aislada de la pelcula superficial del agua (interfase agua-aire) recolectada en las pozas intermareales de Montemar Instituto de Oceanologa de la Universidad de Valparaso, Chile (3227S, 7133 W). El aislamiento bacteriano se realiz en Agar Marino 2216 (Difco) con incubaciones de 20 C por 6 das. Las caractersticas morfolgicas y bioqumicas de las cepas fueron determinadas segn los procedimientos descritos en por Baumann & Baumann (1984) en el Bergeys Manual of Systematic Bacteriology. Complementariamente se hicieron observaciones al microscopio electrnico de transmisin (Siemens, Elmiskop Tipo IA). 360

Sustancia antimicrobiana producida por Alteromonas sp.

Filtracin en columnas de gel de Sephadex

La filtracin en gel se realiz en columnas de Sephadex G-25 (2,2 por 25 cm) equilibrada con tampn Tris-HCl 50 mM (pH 8,1) y 0,1M de NaCl, con un flujo de 60 mL/h. El Azul Dextrano fue utilizado para determinar el volumen vaco de la columna y la homogeneidad del empaque de gel. Para el proceso de filtracin, 0,5 g de ECS liofilizado se disolvi en 2 mL de agua destilada para luego aplicar 1 mL a la columna cromatogrfica. Las fracciones colectadas (1 mL) fueron determinadas por su absorbancia a 280 nm (Shimadzu UV-150-02) y su actividad inhibitoria frente a S. aureus ATCC 11632. Las fracciones activas de los eludos fueron juntadas (5,0 mL), luego liofilizadas y mantenidas a 20 C. Estas muestras fueron consideradas como substancias semipurificadas (SP).Determinacin de la concentracin de protenas

5 mm de dimetro y se inocularon 30 L de la muestra en cada pocillo. Las placas fueron incubadas a 30 C por 24 h y luego evaluadas los halos de inhibicin. Para las muestras semipurificadas (SP) se emple el mtodo de difusin directa segn Naclerio et al. (1993). Las cepas testigo fueron sembradas de manera similar al anterior, pero la inoculacin de las muestras (10 L) se hizo directamente sobre el cultivo despus de la difusin de la segunda capa por 30 minutos.Preparacin de geles y condiciones de electroforesis

La concentracin de protenas en las muestras activas fue estimada segn Brown et al. (1989), por el mtodo del cido bicinconnico (BCA). Para la construccin de la curva patrn se utiliz una solucin estndar de 1,0 mg/ml de Seroalbmina Bovina (BSA). La lectura de la absorbancia se realiz a 562 nm (A562).Ensayos de actividad inhibitoria

La actividad inhibitoria de las fracciones obtenidas durante la extraccin y purificacin fue ensayada por dos mtodos adaptados para bacterias marinas: el mtodo de difusin en pocillos (Vignolo et al., 1993) y el mtodo de difusin directa en placas (Naclerio et al., 1993). En ambos casos, se us S. aureus ATCC 11632 y Vibrio anguillarum NCMB 2133 como cepas testigo y Tripticasa Soya Agar (TSA) como medio de siembra. El mtodo en pocillos se emple para ensayos con ECS. El medio TSA fue cubierto con una suspensin del cultivo testigo (10L) en 3 mL del medio semislido. Luego de 30 minutos de difusin se prepararon pocillos deRev. peru. biol. 12(3): 359- 368 (2005)

Los reactivos utilizados para electroforesis fueron de grado analtico Sigma. Todas las electroforesis se llevaron a cabo en geles discontinuos de Poliacrilamida-Dodecil Sulfato Sdico (PAGE-SDS), siguiendo la metodologa de Laemmli (1970). La composicin final de los geles fue de 3% de acrilamida y 0,08% de bis-acrilamida en tampn Tris-HCl 0,25M; pH 6,8 para el gel concentrador y 12,5% de acrilamida y 0,22% de bis-acrilamida en tampn Tris-HCl 1,5M; pH 8,0 para el gel separador. La polimerizacin se realiz con TEMED (N,N,N,N-tetrametil-etilendiamina) al 0,4% (gel concentrador) y al 0,03% (gel separador) y persulfato amnico al 0,02% como agente catalizador. El tampn de corrida fue Tris-Glicina-SDS, pH 8,3. Muestras de SP reconstituidas en agua destilada estril fueron cargadas sobre la placa de gel (14 x 16 cm) en volmenes de 50 L a cada carril. El proceso se desarroll a una corriente constante de 30 mA. Se utilizaron como marcadores (Kit MW-SDS-200, Sigma) las siguientes protenas: miosina 205000 daltons (Da), galactosidasa 116000 Da, fosforilasa B 97400 Da, albmina bovina 66000 Da, ovoalbmina 45000 Da y anhidrasa carbnica 29000 Da.Tincin de protenas

Para la observacin del perfil proteico se utiliz la tincin de nitrato de plata segn Sambrook et al. (1989) y ocasionalmente la tincin de Azul de Coomassie. Las soluciones para las tinciones se prepararon de acuerdo a 361

Len et al.

especificaciones, empleando reactivos de grado analtico. El fijado se realiz en papel celofn transparente, previamente humedecidos en una solucin acuosa de glicerol al 5%, dejando secar a temperatura ambiente.Tincin de Glicoprotenas

N22.C se realiz frente a una coleccin de cepas ictiopatgenas. El mtodo empleado para esta prueba, fue el de difusin directa en placas de cultivo descrita anteriormente. ResultadosCaractersticas fenotpicas del cultivo

Para detectar posibles azcares asociados a la protena inhibitoria se utiliz un sistema comercial adaptado para PAGE-SDS (Glicoprotein Detection Kit, Sigma) (tincin del cido Peridico-Schiff-PAS para glicoprotenas). La presencia de estas molculas se visualiza como bandas de color magenta con un fondo incoloro o rosado dbil. Como marcador de glicoprotenas se utiliz peroxidasa de rbano (40000 Da). Para la tincin de glicoprotenas se siguieron las instrucciones del catlogo indicadas por el fabricante.Ensayo directo de actividad antimicrobiana en PAGE-SDS.

La cepa N22.C de Alteromonas se observ como bacilos ligeramente rectos y con extremos redondeados, mviles por flagelos,Tabla 1. Caractersticas fenotpicas de Alteromonas sp. cepa N22.C aislada de las pozas intermareales de Montemar, Valparaso, Chile.Caracteres Cepa N22.C

Para determinar la actividad antimicrobiana del perfil proteico en PAGE-SDS de la sustancia SP, se utiliz el ensayo por bioautografa. La corrida de electroforesis se realiz en las mismas condiciones que las anteriores, pero preparativa. Muestras de la sustancia SP activas fueron colocadas en volmenes de 100 L a dos carriles. Despus de realizada la electroforesis (4 h a 50 mA), el gel fue retirado y cortado aspticamente en dos partes iguales. Una parte fue sometida a tincin para protenas, en tanto la otra fue procesada para ver la actividad antimicrobiana por el mtodo de Bhunia et al. (1988). Para este ltimo ensayo el gel fue fijado inmediatamente con la solucin de isopropanol al 20% en Tris HCl 10 mM (pH 7,5) por 3 h, y lavado con Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) por 1,5 h. Luego el gel fue colocado sobre una placa conteniendo el medio TSA previamente inoculada con S. aureus ATCC 11632. La actividad de la substancia inhibitoria fue evidenciada por zonas de inhibicin de crecimiento.Espectro inhibitorio de la substancia semipurificada (SP)

Gram Oxidasa + Catalasa + Luminiscencia Pigmento Presencia de Polihidroxibutirato (PHB) Motilidad + Posicin de flagelos Polar Metabolismo OF (Glucosa) O Reduccin de NO3 a NO2 Hidrslisis de: Gelatina + Casena + Celulosa Almidn + Quitina Alginato Tween-80 + Lecitina + DNA + Urea Requerimiento de agua de mar. si Requerimiento de sodio (Na+) si Crecim. NaCl 0% 3% + 5% + 7% + 10% (+) Crecim. a 8 oC 28 oC + 35 oC + 42 oC Sensibilidad a O/129 R Crecim. Mc Conkey NC Crecim. en TCBS NC Produc. Indol/H2S -/Anaerobio facultativo +, reaccin positiva; - , reaccin negativa; ( ), reaccin dbil; O, oxidativo; R, resistente; NC, no crecimiento.Rev. peru. biol. 12(3): 359- 368 (2005)

El espectro de actividad antimicrobiana de la substancia semipurificada (SP) de Alteromonas 362

Sustancia antimicrobiana producida por Alteromonas sp.

Figura 1. Micrografa electrnica de Alteromonas cepa N22.C, exhibiendo los flagelos. Amplificados x 15,000. Barra = 1,0 m

Gram negativos, aerobios estrictos, y metabolismo oxidativo que llega a alcanzar la fase estacionaria a las 72 h (Fig. 1). Generalmente se presentaron como clulas simples durante la fase exponencial y pleomrficas o en filamentos de cadenas cortas en cultivos viejos. Asimismo, ob