revista Canaria de las Ciencias Veterinarias, nº 8 - gi.ulpgc.es · 4 • - Número 8 La tristeza...

Artículos científicos

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Comunicaciones cortas

Artículos de revisión

4 • �� - Número 8

La tristeza nos invade cuando alguien aquien queremos, de verdad, deja de estar entrenosotros. Y nos vuelve a acongojar, cuando larecordamos por cualquier razón personal oprofesional. Se crea un hueco, incluso doloro-so por momentos, porque nos falta alguien delos nuestros, del equipo, de la familia. Así, tansimple, es como siento, que cualquier personaallegada definiría el profundo espacio vacíoque ha dejado Mari Carmen Pieltáin.

Mari Carmen, “puro nervio, pura vida”,siempre estuvo para lo que necesitáramosdesde la Universidad, desde laFacultad de Veterinaria, desde elInstituto Universitario de Sa-nidad Animal y SeguridadAlimentaria (IUSA). Ellaera una universitariamás, que hizo su doc-torado y se doctoróen muchas “cosasprofesionales y dela vida misma”.Ella fue la primeraprofesora doctoradel Máster SASA(Sanidad Animal ySeguridad Alimen-taria) perteneciente ala administración auto-nómica (Dirección

General de Ganadería del Gobierno deCanarias). Coordinadora y responsable deuna parte fundamental de este Máster, alque ha dejado huérfano, como tambiénhuérfano ha dejado a tantos y tantas vete-rinarios y veterinarias a los que cuidaba yprotegía como a sus propios hijos.

Ella quedará en nuestro recuerdo y ennuestros corazones como un referente“moral” como una profesional noble yhonesta, siempre de frente, inteligente y efi-caz, con un corazón que superaba en pro-

porciones a su propia anatomía. Su espíri-tu quedará en muchos sitios, pero

nosotros (“amigos para siem-pre”), además, la dejaremos in-

mortalizada en nuestro InstitutoUniversitario de Sanidad Ani-

mal y Seguridad Alimentariay en nuestra Revista de las

Ciencias Veterinarias.Desde lo más profundo de

nuestros corazones, contoda nuestra tristeza, tededicamos estas pala-bras, en nombre de todoslos que te quisieron y tesiguen queriendo. Nosvolveremos a encontrar.

“Amigos para siempre”, nos volveremos a encontrar

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Número 8 - 5716428�838568��7�)84�673684�172756385684 • 5

Introducción

El agua potable es un bien público ob-jeto de las Directivas 2000/60/CE (1)y 98/83/CE (2).

Gran Canaria es una isla españoladel archipiélago Canario, situada enel Océano Atlántico, con una pobla-ción de 838.000 habitantes (460/km2)y un consumo de agua potable de 140litros por habitante y día (frente aotros países industrializados en losque sube a 300 litros) (3).

No hay ríos en la isla, lo que haceque la captación de agua sea muy dis-persa en varios puntos a lo largo de laisla. En Gran Canaria hay 36 gestores

del agua inscritos en el SINAC(Sistema de Información Nacional deAguas de Consumo).

La gestión del agua en una islacomo Gran Canaria presenta una grancomplejidad, que generalmente impli-ca incluir diversas unidades como losmunicipios, servicios públicos locales,laboratorios de ensayo y de la admi-nistración de salud pública. Debido aesto, la vigilancia sanitaria del aguatiene un papel muy importante.

En este trabajo se describe el sis-tema de abastecimiento de agua pota-ble en Gran Canaria y las característi-cas de la red de abastecimiento yvigilancia de la salud, así como los

resultados microbiológicos y físico-químicos de 3 años consecutivos.

Los datos han sido recogidos porel Departamento de Salud de GranCanaria, como resultados de los aná-lisis realizados en el marco de la vigi-lancia de la salud del agua potable.Estos análisis tienen como objetivoproporcionar información periódicasobre los criterios sanitarios de lacalidad del agua para consumo huma-no, así como llevar a cabo el segui-miento de ciertos parámetros de con-trol cuando se considere necesario,bien porque la historia analítica delárea de distribución o suministro dered lo indica, o porque se considera


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una situación de nueva detección defallos o alertas.

Material y Métodos

En el desarrollo de este trabajo fueronconsultadas las autoridades de saludlocales y gestores del agua. Se reali-zaron visitas a las instalaciones desuministro de agua potable y un estu-dio sobre el abastecimiento.

El control de calidad se llevó a cabopor el administrador que proporcionabala monitorización de agua potable y porla autoridad sanitaria que fue responsa-ble de la vigilancia de la salud y el con-trol del agua en el grifo del consumidorcomo punto de muestreo.

Los parámetros microbiológicosy físico-químicos analizados en loscuatro tipos de análisis realizados (S,S1, S2 y S3) en los años de 2008 y2009, se describen en tabla 1. La fre-cuencia del ensayo dependía delvolumen de agua tratada por día.

El control de estos parámetros serealizó durante los años 2008 y 2009,con un número de muestras que osci-ló para el primer y segundo semestre,respectivamente, entre 158 y 173 en2008 y entre 181 y 205 en 2009.

En la tabla 2 se muestra el análi-sis periódico de distribución en los 21municipios de la isla.

Durante el primer semestre del año2010 se recogieron 171 muestras, yotras 142 en el segundo, con el fin deanalizar los siguientes parámetros(según RD 140/2003, transposición dela normativa española de UE de aguapotable) (4):

Microbiológicos: colonias a y, coli-formes, E. coli y C. perfringens.

Físico-químicos: olor, sabor, color,turbidez, conductividad, pH, clororesidual libre, amoniaco, nitratos,nitritos, índice de Langelier, fluoru-ros, cloruros, sodio, hierro total, alu-minio, boro y manganeso.

Resultados y Discusión

Se verificó que la red de distribuciónde la captación de aguas constaba de185 pozos, 20 plantas de desalinización

de agua de mar (Figura 1) y acuíferossubterráneos. La red de distribución deagua suministra al 98% de la poblaciónde Gran Canaria.

Las Figuras 2 y 3 referentes a losaños de 2008 y 2009 sugieren que losparámetros más comunes que nocumplen los criterios fueron el índice

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6 • 5716428�838568��7�)84�673684�172756385684 - Número 8

Tabla 1. Parámetros analizados según el tipo de análisis.

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Tabla 2. Análisis periódico de distribución.

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Granja AgrícolaExperimental

Figura 1. Plantas de desalinización en Gran Canaria.

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de Langelier (índice para calcular elcarácter incrustante o agresivo delagua) y el cloro libre residual. Sin em-bargo, en general, y de acuerdo con lalegislación vigente, los parámetrosmicrobiológicos y físico-químicosrestantes, muestran una buena calidady seguridad del agua.

En las figuras 4 y 5 (correspon-dientes al año 2010) se muestra quelos principales incumplimientos fue-

ron detectados en los valores recogi-dos para:

- Cloro libre residual.- Índice de Langelier (debe estar

comprendido entre -0,5 y 0,5).- Aerobios totales (> 100 UFC / ml).- Hierro.- Sodio.- Flúor y manganeso (de una mane-

ra muy esporádica).

Se verifica también que en el segun-do semestre de 2010 los resultadosobtenidos fueron menos favorablesque aquellos demostrados en el pri-mer semestre del mismo año.

Conclusiones

La isla de Gran Canaria cuentacon una amplia red de distribución deagua, suministrando a casi la totali-dad de sus habitantes, siendo la cali-dad / seguridad de su agua potablemuy aceptable, como se muestra enlos resultados obtenidos en los pará-metros físico-químicos y microbioló-gicos del presente estudio.

La mayoría de los análisis realiza-dos demostraron valores de acuerdocon la legislación vigente. Sin embar-go, es posible afirmar que en el primersemestre de 2010 se obtuvieron mejo-res resultados que en el segundosemestre de ese mismo año. En lacomparación entre 2008 y 2009, tam-bién es factible decir que en el segun-do año los resultados obtenidos fueronmejores que los obtenidos en 2008.

Bibliografía

1.- Directiva 2000/60/CE del Parla-mento Europeo y del Consejo, de23 de octubre de 2000, por la quese establece un marco comunitariode actuación en el ámbito de lapolítica de aguas.

2.- Directiva 98/83/CE del ParlamentoEuropeo y del Consejo, de 3 denoviembre de 1998, relativa a lacalidad de las aguas destinadas alconsumo humano.

3.- Cifras INE. Boletín Informativo delInstituto Nacional de Estadística(2008). Estadísticas e indicadores delagua. Disponible en http://www.ine.es/revistas/cifraine/0108.pdf.(Accedido 28 Nov. 2012).

4.- Real Decreto 140/2003, de 7 defebrero, por el que se establecenlos criterios sanitarios de la cali-dad del agua de consumo humano.

Figura 3. Porcentaje de muestras insatisfactorias para los parámetros microbioló-gicos en 2008/2009.

Figura 2. Porcentaje de muestras insatisfactorias de parámetros físico-químicosen 2008/2009.

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8 • 5716428�838568��7�)84�673684�172756385684 - Número 8

Figura 5. Porcentaje de muestras insatisfactorias (parámetros microbiológicos) en 2010.

Figura 4. Porcentaje de muestras insatisfactorias (parámetros físico-químicos) en 2010.

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Introducción

La coccidiosis caprina, producida porlas diferentes especies del géneroEimeria, es una de las enfermedadesparasitarias más frecuente y amplia-mente extendida. Ha sido descrita enun gran número de regiones y paísesde Europa, África, Asia y América,constituyendo en todos los casos unaimportante limitación para la produc-ción caprina (1, 7, 18, 25). Pero essobre todo en las áreas rurales semiá-ridas que dependen económicamentede la producción caprina, como lasIslas Canarias (España) u otras zonasde África u Oriente Medio con condi-ciones climáticas análogas, donde lacoccidiosis caprina afecta con másseveridad a la salud animal y a la ren-tabilidad de la industria caprina (25).

De entre las especies del géneroEimeria que con más frecuencia afec-tan al ganado caprino, E. ninakohlya-kimovae se considera como la demayor patogenicidad (11). Indepen-dientemente de cual sea el sistema deproducción, la mayoría de los anima-les se infectan durante los primerosmeses de vida, pudiendo en algunasáreas verse afectados más del 96% delos cabritos en edades comprendidasentre las 4 y 10 semanas de vida, aun-que el desarrollo clínico de la enfer-medad está influenciado por diferen-tes factores, como los sistemas deproducción intensivos, el estadoinmune de los animales, la edad y lascondiciones climáticas (25).

Un gran número de compuestos,combinados con medidas de manejo,han sido utilizados para el control yprofilaxis de la coccidiosis tanto paracorderos (8, 10, 14) como terneros(12, 21, 22) o aves de corral (9), peroel uso extensivo de drogas anticocci-diósicas ha provocado la aparición decepas resistentes de Eimeria (23). Estehecho ha llevado a la realización deensayos de inmunización frente a lacoccidiosis mediante el empleo dedistintos tipos de vacunas. Diversosestudios se han llevado a cabo condistintas cepas de Eimeria en aves,utilizando tanto vacunas atenuadas

mediante pases en huevos embriona-dos (Livacox ®), como cepas preco-ces (Paracox ®) o cepas de baja pato-genicidad seleccionadas de infeccio-nes naturales (NobilisCox ATM1 ®).Otros estudios se han basado en elempleo de vacunas recombinantes (5,20). Por otra parte, diversas investiga-ciones han demostrado que la irradia-ción gamma puede ser utilizada paraatenuar varias especies de coccidiosaviares, como Eimeria acervulina, E.tenella, o E. maxima, y prevenir la re-producción asexual del parásito y laformación de ooquistes (17). Hasta elmomento no se ha realizado ningúnestudio similar que aborde el controlinmunológico de las infecciones ca-prinas causadas por Eimeria spp. Enel presente trabajo se ha investigado elefecto inmunoprotector frente a lacoccidiosis experimental en cabritosutilizando ooquistes irradiados deEimeria ninakohlyakimovae.

Material y métodos

Parásitos y atenuación de los ooquistes

La cepa GC de E. ninakohlyakimovaeutilizada en este estudio fue aisladapor primera vez en el año 2006 en laisla de Gran Canaria a partir de hecesde un grupo de cabras infectadas deforma natural y desde entonces se hamantenido por pases sucesivos encabritos (24). Para la producción deooquistes, los cabritos fueron infecta-dos vía oral a la edad de 4 semanascon 2 x 105 ooquistes esporulados deE. ninakohlyakimovae. Los ooquistesexcretados fueron aislados de lasheces a partir de los 14 días p. i.,según el método descrito porHermosilla et al. (13), y se llevaronhasta la fase de esporulación trasincubación en solución de dicromatopotásico al 2% p/v a temperaturaambiente durante al menos una sema-na. Los ooquistes esporulados fueronrecogidos y almacenados a 4 °C hastasu utilización.

Para la atenuación, los ooquistesesporulados de E. ninakohlyakimovaefueron sometidos a una irradiación

total de 20 kilorads con una intensitadde 6 mV x-rays, a una velocidad de 50cGy/min durante 15 minutos. La irra-diación se realizó en frascos de culti-vos de 25 cm2 (Nunc) sobre un volu-men total de solución de ooquistes de20 ml utilizando como fuente de irra-diación X el acelerador lineal Meva-tron (Siemens, Germany).

Animales y diseño experimental

Un total de 18 cabritos de raza Ma-jorera fueron adquiridos en una gran-ja local cuando tenían entre 1 y 5 díasde vida; inmediatamente fueron trata-dos con Vecoxan® (Laboratorios Jan-sen) y Halocur® (Intervet) y se anali-zaron para descartar cualquier infecciónparasitaria. Una vez comprobado queestaban libres de parásitos fueron ubi-cados en jaulas metabólicas previamen-te esterilizadas, en las que se mantu-vieron hasta el final de la experiencia.Durante todo el proceso los cabritosfueron alimentados con leche de sus-titución Bacilactol® (Capisa) y pien-so de arranque comercial (Capisa).También dispusieron de heno esterili-zado y agua ad libitum.

Los animales se dividieron en lossiguientes cuatro grupos experimen-tales:

• Grupo 1 (n=5): animales infecta-dos a las 5 semanas de edad conooquistes irradiados y reinfectados3 semanas más tarde con ooquis-tes no irradiados.

• Grupo 2 (n=5): animales infecta-dos a las 5 semanas de edad conooquistes no irradiados y reinfecta-dos 3 semanas más tarde con estemismo tipo de ooquistes.

• Grupo 3 (n=4): animales primoin-fectados con ooquistes no irradia-dos a las 8 semanas de edad (con-trol de reinfección).

• Grupo 4 (n=4): animales no infec-tados (grupo control).

La dosis infectante tanto en lasprimo- como en las reinfecciones fuede 2 x 105 ooquistes esporulados deE. ninakohlyakimovae (cepa GC),irradiados o no irradiados. Todas las

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10 • ?A2B@5CD>C=C?BCD(AD,C@D>BA=>BC@D2A5A?B=C?BC@ - Número 8

infecciones se realizaron por vía oralmediante sonda gastroruminal. Elpeso de los animales se controlósemanalmente, y con la misma perio-dicidad se tomaron muestras de san-gre por punción yugular para los aná-lisis biopatológicos. Para el estudioparasitológico se tomaron muestrasfecales directamente del recto a partirdel día 14 post-infección, y el sacrifi-cio de los animales se realizó a los 21días post-infección (semana 11 devida). Durante todo el estudio se exa-minó la evolución clínica de los ani-males. La intensidad de los signosclínicos se estableció teniendo encuenta la consistencia de las heces ylas características de la diarrea, desdeheces normales a fluidas, diarreaacuosa o sanguinolenta.

Análisis parasitológico y biopatoló-gico

La carga de ooquistes en heces (OPG:ooquistes por gramo de heces) fuedeterminada utilizando la técnica deMacMaster modificada (2). Para ladeterminación del recuento total deleucocitos y concentración de hemo-globina, las muestras se recogieronen tubos VetCollect ® de IDEXX einmediatamente fueron procesadasutilizando el analizador hematológicoLaserCyte (IDEXX). El hematocritose determinó mediante centrifugaciónutilizando tubos capilares estándaresy centrífuga de microhematocrito. Elrecuento diferencial de leucocitos serealizó sobre frotis de sangre teñidoscon la tinción panóptica (Diff-Quick)contando un total de 200 leucocitospor frotis.

Para el análisis estadístico, los re-cuentos fecales de ooquistes se trans-formaron en Log (OPG + 1) paraobtener distribuciones normales se-gún el test de Normalidad de Kolmo-gorov-Smirnov. La normalización delos datos no fue necesaria para anali-zar la evolución del peso corporal nipara los parámetros hematológicos.La evolución del peso corporal seexpresó como tasa de crecimiento (Lnpeso 1 – Ln peso 2/t*100), donde “t”

es el tiempo (en días) entre los puntosde muestreo 1 y 2. Las comparacionesse realizaron mediante análisis facto-rial de la varianza ANOVA y el test deComparación Múltiple de Turkey,más la pruebe “t” de Student. Todoslos análisis se realizaron mediante elprograma informático SigmaStat 2.03,considerándose significativas las dife-rencias entre las distintas comparacio-nes para valores P < 0,05.

Resultados

Clínicos

Durante la primoinfección, los cabri-tos infectados con ooquistes irradia-dos mostraron signos clínicos mode-rados, mientras que los infectados conooquistes no atenuados desarrollaronunos signos clínicos mucho más seve-ros, aunque con importantes diferen-cias individuales (Tabla 1A). Despuésde la reinfección, tanto los animalesinfectados con ooquistes irradiadoscomo con ooquistes no irradiadospresentaron signos clínicos leves,mientras que el grupo control de rein-fección mostró signos clínicos demoderados a severos. Dentro de estegrupo, un animal murió en el curso de

la infección (Tabla 1B). A pesar delos signos clínicos observados, sólose detectó un ligero incremento en elpeso corporal de los controles noinfectados cuando se comparó con losanimales primo- y reinfectados (Fig. 1).

Parasitológicos

Durante la infección primaria, loscabritos infectados con ooquistes irra-diados eliminaron una cantidad deooquistes significativamente menorque aquéllos infectados con ooquistesno irradiados (Fig. 2A). La mayor eli-minación de ooquistes se pudo obser-var a los 16 dpi en el grupo de anima-les infectado con ooquistes no atenua-dos, permaneciendo los valores eleva-dos hasta los 20 dpi. En los cabritosinfectados con ooquistes irradiados elpico máximo se observó a los 17 dpi,descendiendo a valores mínimos a los19 dpi. Los recuentos fecales deooquistes fueron negativos en los ani-males del grupo control no infectado.

Durante la reinfección, los valoresde OPG fueron significativamentemenores en los cabritos infectados,tanto con ooquistes irradiados comocon ooquistes no irradiados, cuando secomparó con los animales del grupo


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Figura 1. Evolución del peso corporal en animales no inmunizados y no infecta-

dos (G4, controles de infección), no inmunizados e infectados (G3, control de rein-

fección), inmunizados con ooquistes irradiados de Eimeria ninakohlyakimovae y

reinfectados (G1, X-irradiados) e inmunizados con ooquistes no atenuados (G2 -

no atenuados) y reinfectados. Se representan las medias ± SEM.

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control de reinfección (Fig. 2B). Lasdiferencias fueron particularmenteimportantes en los días 16 y 17 post-infección. En todos los grupos losrecuentos fecales de ooquistes comen-zaron a descender a partir de los 16 dpiy fueron negativos a los 21 dpi.

En general, los cabritos infectadoscon ooquistes irradiados eliminaron porheces 95,3% menos ooquistes que losinfectados con ooquistes no atenuados

durante la infección primaria. Durantela reinfección se produjo una reduccióndel total de ooquistes eliminado del87,7% y del 60,5% en los animales sen-sibilizados con ooquistes irradiados yno atenuados, respectivamente.

Biopatológicos

Los análisis hematológicos no mos-traron importantes cambios en la serie

roja (Tabla 2), sólo una ligera dismi-nución en los valores de hematocritoy hemoglobina en los grupos 1 (infec-tados con ooquistes irradiados) y 2(infectados con ooquistes no irradia-dos) durante la primoinfección, pudién-dose comprobar que durante la rein-fección estos valores tendieron a lanormalización en ambos grupos. En elgrupo 3 (grupo control de reinfección)se observó un incremento en los valo-res de hematocrito y hemoglobina apartir de los 8 dpi, con valores máxi-mos a los 16 dpi, coincidiendo con lafase clínica de la enfermedad.

En la serie blanca, las principalesdiferencias se observaron en los recuen-tos de neutrófilos en los grupos 1 y 2durante la primoinfección. Duranteesta fase, los neutrófilos de los cabri-tos del grupo 1 apenas sufrieronmodificaciones y durante la reinfec-ción los valores se incrementaronligeramente, mientras que en el grupo2 los neutrófilos tendieron a dismi-nuir a partir de la primera semanapost-infección y durante la reinfec-ción los valores permanecieron sincambios considerables. Los neutrófi-los periféricos también tendieron adisminuir en las semanas subsiguien-tes a la infección en los animales delgrupo 3.

La concentración de proteínasplasmáticas permaneció sin modifi-caciones considerables durante laexperiencia. En general los cambioshematológicos fueron ligeros omoderados, motivo por el cual lasdiferencias entre semanas y gruposno llegaron a ser significativas.

Discusión

En este estudio se pone en evidenciaque la inmunización con ooquistesirradiados de E. ninakohlyakimovaepodría ser una alternativa para el con-trol de la coccidiosis caprina. El pro-tocolo de inmunización seguido evitóque los animales sensibilizados conooquistes irradiados padecieran cocci-diosis clínica severa durante la pri-moinfección, al tiempo que desarrollóuna respuesta inmune protectora que,



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Figura 2. Recuentos de ooquistes por gramo de heces (OPG) durante la fase de

primoinfección (A) y reinfección (B) en cabritos no inmunizados e infectados (G3,

control de reinfección), inmunizados con ooquistes irradiados de Eimeria ninakohl-yakimovae y reinfectados (G1, X-irradiados) e inmunizados con ooquistes no ate-

nuados (G2, no atenuados) y reinfectados. Los datos se expresan como valores

transformados del log (OPG + 1) y se representan las medias ± SEM.

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Figura 2b.

en términos globales, redujo la pro-ducción de ooquistes en un 90%. Hastael momento no hay datos bibliográfi-cos disponibles sobre ensayos deinmunoprotección frente a la eimerio-sis en rumiantes utilizando ooquistesirradiados, pero el grado de protec-ción alcanzado en el presente estudioes equiparable al descrito en ensayossimilares realizado con pollos frente aEimeria tenella (15) o Eimeria maxi-ma (16), en este último caso utilizan-do irradiación gamma. Los resultadosson incluso comparables con el nivelde inmunoprotección inducido porvacunas recombinantes recientementeensayadas en pollos frente a la cocci-diosis por Eimeria tenella (19) u otrasespecie de Eimeria (6) y próximos alos obtenidos en experiencias realiza-das con vacunas comerciales comoParacox ® (3). En algunos ensayos deinmunización de pollos con ooquistesatenuados por irradiación se observa-ron importantes diferencias en base alas características del inóculo (gradode atenuación de los ooquistes y dosisinfectantes) (15), por lo que no se des-carta que los beneficios inmunoprofi-lácticos obtenidos en este estudio pue-dan ser implementados modificandola estrategia de inmunización. Estetipo de actuación sería necesaria paraque el proceso de inmunización deri-ve en una mejora de los diferentesparámetros productivos.

Los beneficios clínicos y parasito-lógicos de la inmunoprotección sí fue-ron más contundentes. Los cabritossensibilizados con ooquistes irradiadosno sólo presentaron menores manifes-taciones clínicas y menores recuentosde ooquistes durante la fase de pri-moinfección, en relación con los infec-tados con ooquistes no atenuados, sinoque, además, el inóculo utilizado fuesuficiente como para desarrollar unarespuesta inmunoprotectora adquiriday reducir la severidad de los signos clí-nicos y la eliminación de ooquistesdurante la reinfección, en porcentajesincluso superiores a los conseguidosdurante la infección con ooquistes noirradiados (87,7% vs 60,5%). En con-cordancia con lo encontrado en el pre-

sente estudio, el nivel de inmunopro-tección alcanzado en pollos inmuniza-dos con ooquistes irradiados tambiénse correlacionó con una mejora de laclínica y una disminución de losrecuentos de ooquistes (3). En algunosestudios sí se logró asociar la inmuno-protección con un beneficio en losparámetros productivos (3, 15, 16).

Los cambios hematológicos resul-taron en general ligeros en todos losanimales infectados independiente-mente de si fueron inmunizados o no,por lo que no fue posible estableceruna correlación entre el grado deinmunoprotección y la normalizaciónde los parámetros hematológicos. Eneste sentido, los valores de hematocrito



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Tabla 1. Intensidad y características de la diarrea durante la primo-infección (A) y

reinfección (B) en cabritos infectados con Eimeria ninakohlyakimovae.

y hemoglobina sólo mostraron unaligera disminución en los grupos G1(infectados con ooquistes irradiados)y G2 (infectados con ooquistes noatenuados) durante la primoinfec-ción, pudiéndose deber, como indicanBangoura y Daugschies (2) a ligeraspérdidas de sangre vía intestinal quese producen como consecuencia de lainfección aguda. Igualmente, segúndescriben estos mismos autores, en elgrupo G3 (grupo control de reinfec-ción) observamos un incremento enlos valores de hematocrito y hemo-globina a partir de los 8 dpi, alcanza-do valores máximos a los 16 dpi,coincidiendo con la fase clínica de laenfermedad, pudiéndose deber esta

hemoconcentración a la pérdida defluidos a través del intestino. En laserie blanca, durante la primoinfec-ción, los neutrófilos disminuyeron deforma considerable en los grupos 2 y3, posiblemente debido al paso de losneutrófilos desde la sangre hasta lamucosa intestinal, hacia donde se mo-vilizan en respuesta a diversos facto-res quimiotácticos producidos por lostejidos inflamados (4); por el contra-rio, durante la fase de primoinfeccióndel grupo G1 (cabritos inmunizadoscon ooquistes irradiados) los neutrófi-los apenas sufrieron modificaciones,posiblemente por el escaso daño queel parásito produjo en estos animales.

En base a los resultados obtenidos

en el presente estudio no es posibleestablecer con certeza los mecanis-mos inmunológicos responsables dela inmunoprotección inducida frentea E. ninakohlyakimovae mediante lainmunización con ooquistes irradia-dos. La hipótesis más probable seríaque los ooquistes atenuados siguieranmanteniendo la facultad de exquistar-se in vivo y que los esporozoítosresultantes invadieran las célulasendoteliales sin desarrollar, debido asu atenuación, ni igual número deesquizontes maduros, ni esquizontesdel mismo tamaño que en el caso deinfecciones con ooquistes no atenua-dos, pero que sí fueran capaces deestimular una respuesta inmune pro-tectora. Esta posibilidad explicaría lamenor intensidad de los signos clíni-cos observada en el grupo de anima-les inmunizado con ooquistes irradia-dos y el elevado grado de protecciónconseguido. La hipótesis de que duran-te la primera merogonia pueden yadesencadenarse los mecanismos parael desarrollo de una respuesta inmuneadquirida concordaría con observa-ciones realizadas por nuestro grupo(datos no publicados) según las cua-les el número de esquizontes inmadu-ros encontrado en el periodo prepa-tente (7 dpi, merogonia I) es signifi-cativamente menor en animales rein-fectados que en primoinfectados. Esteplanteamiento está en consonanciacon datos publicados por Jenkins etal. (15), según los cuales la inmuniza-ción de pollos con ooquistes irradia-dos de E. tenella desarrolla una pro-tección que no requiere del desarrollode una primera generación de esqui-zontes durante la infección primaria.

En principio no sería descartableque debido a la irradiación los ooquis-tes no hubieran tenido la aptitud deexquistarse y que el menor número deooquistes que sí lograron hacerlopudiera haber sido suficiente para de-sarrollar una respuesta inmune protecto-ra en ausencia de signos clínicos seve-ros. Sin embargo, esta posibilidad con-trasta con la apariencia microscópicanormal que presentaban la totalidad delos ooquistes que se sometieron a



Tabla 2. Parámetros hematológicos durante la primo-infección y reinfección en

cabritos infectados con Eimeria ninakohlyakimovae.

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irradiación. Además, el diseño delprotocolo de atenuación se realizó detal forma que todos los ooquistes reci-bieran igual dosis de irradiación. Paraeste fin los ooquistes se dispusieron enla botella de cultivo de manera que for-maran una fina película en el fondo,que fue donde se concentró el haz derayos X. Esta posibilidad también se hadescartado en trabajos similares al rea-lizado en el presente estudio (15), enlos que demostró que la exquistaciónde ooquistes expuestos a 10, 15, 20 y30 kilorads de irradiación-X no deter-minó diferencias en la liberación de es-porozoítos móviles. Este mismo grupode investigación también demostró quela exposición a 15 o 25 kilorads de irra-diación-gamma tiene un mínimo efec-to sobre los antígenos estructurales delos ooquistes irradiados (17).

El presente trabajo constituye laprimera evidencia de inmunoprotec-ción realizada en rumiantes frente a lacoccidiosis producida por Eimeriaspp. utilizando ooquistes irradiados.El grado de inmunoprotección conse-guido en términos de reducción de losrecuentos fecales de ooquistes y lamenor severidad del cuadro clínicoabren la posibilidad de la utilizaciónde este tipo de inmunizaciones en elcontrol de la coccidiosis caprina y enrumiantes en general. No obstante,como requisito previo, serían necesa-rios estudios adicionales que clarifi-caran los mecanismos intrínsecossubyacentes al proceso de inmunpro-tección así como el ensayo de nuevosprotocolos que aumentaran la rentabi-lidad de la inmunización en términosproductivos.

Agradecimientos

El presente trabajo ha sido finan-ciado por el Ministerio de Ciencia yTecnología de España (MEC, proyec-to nº AGL2007-63415) y los FondosFEDER, así como por la AgenciaCanaria de Investigación, Innovacióny Sociedad de la Información (ACII-SI) (Ref. SolSubC200801000244).

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Número 8 - >@1A?4CDBC<C>ACD,@D(C?DBA@<BAC?D1@4@>A<C>AC? • 17


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18 • >@1A?4CDBC<C>ACD,@D(C?DBA@<BAC?D1@4@>A<C>AC? - Número 8

Introducción

Los coccidios del género Eimeria sonparásitos que se desarrollan funda-mentalmente en las células epitelialesde aparato digestivo, siendo la princi-pal acción patógena del parásito ladestrucción de dichas células. Algunasespecies como Eimeria ninakohlyaki-

movae (E. ninakohlyakimovae) tam-bién incluyen en su desarrollo endó-geno la multiplicación asexual encélulas endoteliales (28) del intestino,todo lo cual provoca diarreas y deshi-dratación, y en ocasiones la muerte,principalmente en animales jóvenes.En general, el daño producido por lacoccidiosis se traduce en cuantiosaspérdidas económicas en la produc-ción ganadera (11). E. ninakohlyaki-

movae, considerada una de las espe-cies de Eimeria más patógenas para elcaprino (8), presenta una distribuciónmundial, siendo la tercera especie másfrecuentemente encontrada en loscaprinos canarios (30% aproximada-mente) después de E. arloingi e E.

alijevi (26).Existen diversos factores que influ-

yen en la distribución y presencia deEimeria spp. en los sistemas de produc-ción caprina, entre ellos: 1) el régimende explotación (intensivo/extensivo), 2)las condiciones climáticas, 3) la edadde los animales y 4) el manejo, inclu-yendo las prácticas higiénico-sanitarias(7, 10, 16, 26). El conocimiento de to-dos estos factores, en combinación conla profilaxis terapéutica, ha sido tradi-cionalmente la base para el diseño deestrategias de control eficaces. Entre losanticoccidiósicos y anticoccidiostáticosmás comúnmente utilizados en rumian-tes destacan las sulfonamidas (31),derivados del acetonitrilo de bencenocomo el tortrazuril (22) o el diclazuril(27, 33) o el decoquinato (35).

El empleo de fármacos comercia-les en el control de la coccidiosis enrumiantes, al igual que ocurre en otrasparasitosis, presenta algunas limitacio-nes, como el elevado coste de los pro-

ductos disponibles en el mercado, losresiduos de dichos fármacos en leche ocarne y, sobre todo, la creciente apari-ción de resistencias (23). Todo lo ante-rior ha incentivado la búsqueda de nue-vas alternativas, como el empleo deplantas medicinales que, por tratarse deun recurso más sostenible, está experi-mentando un especial resurgimiento.La mayoría de los trabajos de investi-gación realizados hasta el momento sehan enfocado al estudio de la actividadantihelmíntica de diferentes plantasfrente a nematodos gastrointestinales,como Annosa squamosa (30) oZiziphus nummularia y Acacia nilotica

(3). En cambio, los estudios realizadoscon parásitos pertenecientes al Phylum

Apicomplexa no son tan numerosos.Éstos han sido dirigidos principalmen-te a la realización de ensayos in vitro

para evaluar la actividad frente aPlasmodium (1, 2). Otros estudios sehan centrado en la búsqueda de plantascon actividad anticoccidiósica, espe-cialmente ensayos in vivo con especiesde coccidios que parasitan a aves. Así,extractos procedentes de Artemisia

annua y el aceite esencial del oréganousado como suplemento en la dieta debroilers infectados experimentalmentecon Eimeria tenella disminuyeron losrecuentos de ooquistes por gramo deheces de los animales (9, 12).

El Archipiélago Canario constitu-ye, por su localización geográfica, unode los enclaves de mayor diversidadflorística y riqueza en especies autóc-tonas del país (4, 5). En un importantenúmero de plantas de esta flora autóc-tona la sabiduría tradicional ha atribui-do propiedades medicinales, entre lascuales se encuentra Ruta pinnata, de lafamilia de las Rutaceae, también cono-cida como ruda salvaje. En general eluso de las rutáceas en medicina estáextendido por todo el mundo, espe-cialmente en el área del mediterráneo.Un ejemplo de esto es un ensayo reali-zado a partir de extractos obtenidos porla cocción de Ruta graveolens en elNorte de Italia, en el cual se comprobó

una alta actividad frente a nematodosde rumiantes, ectoparásitos del perroproductores de sarna o eliminandomoscas en granjas de porcino. (13).Otros estudios realizados en Canadáhan demostrado el empleo de R. gra-

veolens en la práctica etnoveterinaria,concretamente en el tratamiento deendoparásitos de cerdos, gatos yperros, como Giardia y Toxoplasma(18). El objetivo del presente estudioha sido la evaluación in vitro del efec-to anticoccidiósico de extractos meta-nólicos procedentes de Ruta pinnata

frente al coccidio caprino Eimeria

ninakohlyakimoave.

Material y métodos

Obtención del material vegetal y pre-

paración de los extractos

El material vegetal de partida fueronfrutos maduros de la planta endémicacanaria Ruta pinnata. Inmediatamentedespués de su recogida, las muestrasvegetales fueron enviadas al InstitutoUniversitario de Bioorgánica AntonioPadrón (Universidad de La Laguna),donde se realizó la preparación delextracto. Tras su secado y homogenei-zación, el material vegetal se sometióa un proceso de extracción usandometanol como disolvente. La extrac-ción se realizó en columna hasta ago-tamiento utilizando un equipo Soxhlet,para lo cual se emplearon 1,5 litros dedisolvente por cada 70 g de fruto secoy homogenizado.

El extracto obtenido fue utilizadoa diferentes concentraciones en losensayos in vitro, diluidos con DMSO99% p/v (Sigma-Aldrich) a concentra-ciones que no afectasen a la viabilidadde los parásitos. El DMSO que se utili-zó para disolver el extracto tuvo unaconcentración final máxima del 3% v/v.

Animales donantes

Como animales donantes de parásitosse usaron cabritos de raza Majora de

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1 a 3 días de edad. Los cabritos fueroncriados en condiciones de esterilidaden boxes previamente desinfectados yalimentados mediante lactancia artifi-cial, agua, pienso para cabritos yheno estéril. A las 4 semanas de vidalos animales se infectaron oralmentecon 2 x 105 ooquistes esporulados dela cepa GC de Eimeria ninakohlyaki-

movae aislada inicialmente en la islade Gran Canaria.

Obtención de los parásitos

Para la obtención de ooquistes de E.

ninakohlyakimovae se recogieron lasheces de los animales infectadosdesde el día 14 post-infección duran-te aproximadamente una semana.Para la concentración de los ooquis-tes se uso un método de flotación ensolución concentrada de azúcar (1,5g/l) mezclando al 50% la solución deazúcar con una solución de heces pre-viamente filtrada a través de variosfiltros con poro decreciente para dis-minuir al máximo la cantidad dedetritus. Los ooquistes obtenidos trasla flotación se volvieron a concentrarpor centrifugación en tubos de 50 mla 3.000 r.p.m. durante 10 minutos.

Parte de los ooquistes no esporu-lados se destinaron a la realización delos ensayos de inhibición de la espo-rulación, para lo cual se transfirierona botellas de cultivo y se mantuvierona 4ºC hasta el comienzo del ensayo,que nunca excedió los 3 días desde surecogida. El resto de ooquistes noesporulados se incubaron a tempera-tura ambiente (TA) en una soluciónde dicromato potásico al 2% duranteuna semana con aireación forzadapara favorecer la esporulación. Losooquistes esporulados se usaron parala obtención de esporozoítos con loscuales realizar el ensayo de viabilidadde esporozoítos. Para la purificaciónde los ooquistes esporulados se utili-zaron gradientes de Percoll y laexquistación tuvo lugar en dos fases.En una primera fase los ooquistes sesuspendieron en L-cisteína HCl esté-ril 0,02 M y NaHCO3 0,02M y seincubaron a 37°C y 5% CO2 durante

20 horas. A continuación los ooquistesse mezclaron en solución balanceadade Hank´s con 0,4 % de tripsina(Sigma, Aldrich) y 8% de bilis bovi-na filtrada obtenida de muestras dematadero, y se incubaron a 37°C, 5%CO2 durante un máximo de 4 horas.Los esporozoítos libres se lavaron 3veces con medio RPMI centrifugandoa 1500 x g durante 20 minutos.

Ensayo de inhibición de la esporula-

ción

Este test determina la capacidad delextracto muestreado para inhibir elproceso de esporulación de losooquistes. Para la realización delensayo se incubaron en tubosEppendorf a TA 5.000 ooquistes noesporulados con diferentes concen-traciones de extracto. En cada tubo sedispensaron 20 µl de solución con losooquistes, 30 µl de dH2O, 50 µl dedicromato potásico al 10% y 100 µlde cada dilución de extracto. Losperiodos de incubación seleccionadosfueron 30 minutos, 4 horas y 24horas. Después de que transcurrieseel tiempo seleccionado, los ooquistesse lavaron con dH2O mediante centri-fugación (1.500 x g, 5 mi). Tras elúltimo lavado, los ooquistes se dis-pensaron en una placa de 24 pocillosen una solución de dicromato potásicoal 2% (C.F.). Como control negativose usó el DMSO a diferentes concen-traciones, atendiendo a las dilucionesde los extractos, y como control posi-tivo se emplearon diluciones seriadasde formaldehido al 4%. La lectura delos resultados se realizó después deincubar las placas a TA durante 48horas. Se realizaron triplicados de cadacondición y el ensayo se repitió en dosdías diferentes; para todas las condi-ciones se contaron al menos 100ooquistes, diferenciando entre espo-rulados y no esporulados.

Ensayo de viabilidad de esporozoítos

Este ensayo permite determinar siun extracto vegetal es capaz de pro-ducir daños irreversibles que conduz-

can a la muerte de los esporozoítos.Para realizar este ensayo se dispensa-ron 5.000 esporozoítos diluidos enmedio RPMI (Sigma) en placas de 96pocillos con diferentes concentracio-nes de extracto metanólico de Ruta

pinnata y las correspondientes dilu-ciones del control negativo (DMSO).Como control positivo se usaron espo-rozoítos inactivados por calor a 60° Cdurante 30 minutos. Tras 3 horas deincubación se retiraron cuidadosamen-te 100 µl de sobrenadante y los espo-rozoítos se tiñeron añadiendo 100 µlde Sytox Orange (Invitrogen) diluidoen medio RPMI a concentración 5 µM,resultando una concentración final deSytox Orange de 2,5 µM. Tras 15 mide incubación adicional, se procedióa la lectura de los resultados utilizan-do un microscopio de fluorescencia(Olympus, Eclipse 80i) usando unalongitud de onda de excitación de510-560 nm y 575-590 nm de emi-sión. Se realizaron triplicados de cadacondición y el ensayo se repitió en dosdías diferentes; para todas las condicio-nes se contaron al menos 100 esporo-zoítos, diferenciando entre viables(no teñidos) y no viables (teñidos).

Análisis estadístico

Para el análisis estadístico de losdatos se agruparon todas las repeticio-nes para cada uno de los correspon-dientes ensayos y se estimaron lasdiferencias mediante el test no para-métrico Chi-cuadrado. El efecto de lasdiferentes concentraciones de extractose comparó con los correspondientescontroles DMSO y se consideraronsignificativas las diferencias para P <0,05. En todos los análisis se utilizó elprograma estadístico Sigmastat 3.1bajo entorno Windows.

Resultados y discusión

En el presente trabajo se ha evaluadola actividad anticoccidiósica in vitro

de extractos metanólicos de la plantaendémica canaria Ruta pinnata y, ensu conjunto, los resultados obtenidosdemuestran que los extractos vegetales


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poseen una importante actividad fren-te al coccidio de caprino Eimeria

ninakohlyakimovae, inhibiendo laesporulación de los ooquistes y dis-minuyendo la viabilidad de los espo-rozoítos.

El grado de inhibición de la espo-rulación varió en función del tiempode exposición de los ooquistes noesporulados con los extractos de Ruta

pinnata. Tal y como puede observar-se en la Fig. 1A, a los 30 minutos deincubación la mayoría de los ooquis-tes habían esporulado (80-90%) enlos controles negativos y en la mayo-ría de las concentraciones del extrac-to de Ruta pinnata ensayadas, conexcepción de la concentración de 3mg/ml, en la que sí se apreció unareducción significativa (P < 0,01) delporcentaje de esporulación. Tras 4horas de incubación, el porcentaje deooquistes esporulados disminuyó deforma significativa (P < 0,001) a con-centraciones de extracto de 1,5 y 3mg/ml y ligeramente, pero sin signifi-cación estadística, para las concentra-ciones C3 y C4 (Fig. 1B). Por último,después de 24 horas de exposición delos ooquistes no esporulados a losextractos de la planta el efecto inhibi-torio se observó a concentracionesfinales de extracto por encima de0,75 mg/ml (P < 0,001), presentandola concentración de 3 mg/ml delextracto una actividad similar a la delcontrol positivo (formaldehido 2% eneste caso) (Fig. 1C).

La importancia de este hallazgoradica en la capacidad del extractometanólico de Ruta pinnata para dete-ner la evolución de los ooquistes, y portanto, abortar el ciclo exógeno del pará-sito. Los ooquistes de E. ninakohlyaki-

movae, como ocurre con el resto deespecies del género Eimeria, son elimi-nados al medio por las heces de los ani-males infectados en forma no esporula-da y al cabo de 48 horas sufren un pro-ceso de reproducción asexual (esporo-gonia) que los convierten en elementosinfectantes (19). Los extractos de Ruta

pinnata reducirían de esta forma lasposibilidades de contagio de nuevoshospedadores, con un efecto similar al

que presentan ciertos antisépticos quese usan para la desinfección de loscorrales, algunos de los cuales han sidoevaluados in vitro frente a ooquistes deE. tenella (14). Recientemente se haestudiado también el efecto antisépticoin vitro de determinados aceites esen-

ciales de origen vegetal en base a sucapacidad de destrucción de ooquistesde Eimeria spp. aviares, siendo losaceites de artemisa, té, tomillo y clavolos más efectivos (24). También delCacho et al. (9), al evaluar extractosprocedentes de Artemisia annua,

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Tabla 1. Concentraciones finales de un extracto metanólico de Ruta pinnata, con-

trol positivo (formaldehído) y control negativo (DMSO) utilizadas en los ensayos de

inhibición de la esporulación de ooquistes.

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Tabla 2. Concentraciones finales de extracto metanólico de Ruta pinnata y control

negativo (DMSO) utilizadas en los ensayos de viabilidad de esporozoítos.

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Figura 1A. Ensayo de inhibición de la esporulación de ooquistes de Eimeria nina-kohlyakimovae. Se evaluó el efecto anticoccidiósico del extracto metanólico de

Ruta pinnata a diferentes concentraciones tras 30 mi (Fig. 1A), 4 h (Fig. 1B) y 24

h (Fig. 1C) de incubación. Como control negativo se empleó DMSO y como con-

trol positivo formaldehído (formol). El porcentaje de esporulación se determinó tras

lavar y posteriormente incubar los ooquistes a TA durante 48 h. Nivel de significa-

ción estadística al comparar los extractos con el control negativo: P < 0,01 (**) y P

< 0,001 (***).

C

encontraron una gran inhibición en eldesarrollo y esporulación de los ooquis-tes de E. tenella debido a una alteraciónde la pared de los mismos. En cambio,Saratsis et al. (29) no lograron inhibir laesporulación de ooquistes in vitro deespecies de Eimeria ovinas más allá deun 10,7% empleando diferentes extrac-tos de la planta forrajera conocida comoesparceta o pipirigallo (Onobrychisviciifolia).

El efecto de los extractos de Ruta

pinnata sobre la viabilidad de losesporozoítos de E. ninakohlyakimovae

fue dosis dependiente tal y comopuede apreciarse en la Fig. 2. A con-centraciones de 5 y 10 mg/ml losextractos produjeron la muerte del100% de los esporozoítos, con efectosimilar a la inactivación por calor (P <0,001). A diluciones más altas delextracto siguió observándose elmismo efecto, siendo significativas lasdiferencias en todos los casos (P <0,001); la menor concentración queprodujo una inhibición significativa dela viabilidad de los esporozoítos(30%) fue de 0,1 mg/ml (Fig. 2). Elinterés científico de la actividad de losextractos de Ruta pinnata frente a losesporozoítos radica en el potencial dela planta como anticoccidiósico o anti-coccidiostático, ya que los esporozoí-tos constituyen el estado evolutivo delparásito que en primera instanciainfecta las células del hospedador, lascélulas endoteliales de los vasos linfá-ticos del íleon distal en el caso de E.

ninakohlyakimovae (34). Hasta elmomento no se han publicado estudiosdonde se evalúe la actividad anticocci-diósica in vitro de material de origenvegetal frente a esporozoítos deEimeria spp. de rumiantes, aunque síse han realizado algunos ensayos in

vitro en aves. Así, se ha demostradoque la curcumina presenta un marcadoefecto inhibitorio in vitro frente aesperozoítos de E. tenella induciendocambios morfológicos y reduciendo suviabilidad e infectividad (17). Delmismo modo, Burst et al. (6) hanobservado que la viabilidad de losesporozoítos de E. tenella es inhibidapor el efecto del carvacrol, la curcumi-

na y extractos de Echinacea purpurea,por lo que podrían ser utilizados comoaditivos anticoccidiósicos en el piensoo en el agua de bebida en el control dela coccidiosis aviar.

El mecanismo de acción de losextractos de Ruta pinnata frente a losesporozoítos de E. ninakohlyakimovae

no es posible determinarlo en base aensayos realizados en el presente estu-dio. Este mecanismo no necesariamen-te tendría que ser el mismo que el res-ponsable de la inhibición de la esporu-lación de E. ninakohlyakimovae. Encualquier caso, resulta evidente que, aigual concentración, el esporozoíto esmás susceptible que el ooquiste, al tra-tarse este último de un elemento de

resistencia. Este hecho podría justificarla ausencia de efecto inhibitorio de laesporulación de ooquistes de origenovino descrito previamente por Saratsiet. al. (29) al utilizar forraje deOnobrychis viciifolia a pesar de queestos mismos autores pudieron consta-tar un importante efecto anticoccidiósi-co in vivo utilizando extractos de estamisma planta. También en ganadocaprino se han realizado algunos estu-dios in vivo para evaluar la actividadanticoccidiósica de extractos vegetales.Así, se ha demostrado que extractos deAloe ferox, Elephantorrhiza elephanti-

na y Leonotis leonurus presentan unefecto antiparasitario en infeccionesmixtas por helmintos y coccidios


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Figura 1C

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caprinos en Sudáfrica (20). Del mismomodo, Markovics et al. (21) han publi-cado que el consumo de plantas ricasen taninos como Pistacia lentiscus

mejoran la respuesta frente a la cocci-diosis en cabritos en torno al destete.

En este tipo de estudios, no sólo esimportante conocer la actividad anti-parasitaria del extracto utilizado, sinotambién evaluar su citotoxicidad.Aunque no se ha evaluado en profun-didad a nivel de laboratorio la citoto-xicidad de Ruta pinnata, éste no seríaen principio un factor limitante de suuso como antiparasitario. Así, en unestudio coprológico realizado en lagar-tos endémicos de Canarias se encon-tró que las semillas de las rutáceas sehallaban entre las más frecuentementeencontradas en las heces, concluyen-do así que éstas formaban parte de laalimentación de los lagartos (25).

Los hallazgos obtenidos en el pre-sente estudio suponen una contribu-ción al descubrimiento de nuevoscompuestos con actividad antiparasi-taria como alternativa al uso de anti-coccidiósicos y anticoccidiostáticosconvencionales. El efecto frente a lainhibición de la esporulación deooquistes y de la viabilidad de los

esporozoítos podría implementarsevalorando diferentes métodos deextracción, diferentes partes de laplanta e incluso distintos momentosde maduración del fruto, además derealizar una comparación de la activi-dad anticoccidiósica entre diferentesrutáceas, como R. graveolens y R.

pinnata. En este sentido, existen estu-dios que demuestran la actividad anti-helmíntica del extracto crudo meta-nólico de Calatropis procera esmenor que el efecto obtenido por elextracto acuosos de la misma plantaen los mismos días de tratamiento(15). También existen ejemplos deplantas que muestran diferentes nive-les de actividad antihelmíntica segúnlos extractos procedan de una partede la planta u otra, como ocurre conMaesa lanceolata (32). Finalmente,con el fin de validar el empleo de losextractos habría que realizar estudiosin vivo utilizando la especie hospeda-dora de destino.

En resumen, los resultados del pre-sente estudio demuestran que la plantaendémica canaria Ruta pinnata presentauna importante actividad anticcocidió-sica in vitro frente a Eimeria nina-

kohlyakimovae, lo cual abre la posibi-

lidad de diseñar nuevas alternativas decontrol frente a la coccidiosis caprina,no descartándose que la actividad de laplanta pueda ser trasladable a otrosparásitos animales o humanos.

Agradecimientos

El presente trabajo ha sido financiadopor el Ministerio de Ciencia yTecnología de España (MEC, proyec-to nº AGL2007-63415) y los FondosFEDER, así como por la AgenciaCanaria de Investigación, Innovacióny Sociedad de la Información (ACII-SI) (Ref. SolSubC200801000244).

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Figura 2. Ensayo de esporozoítos de Eimeria ninakohlyakimovae. Se evaluó el

efecto anticoccidiósico del extracto metanólico de Ruta pinnata a diferentes con-

centraciones tras 30 mi (de incubación. Como control negativo se empleó DMSO

y como control positivo esporozoítos inactivados por calor. La viabilidad de los

esporozoítos se determinó mediante tinción vital con Sytox Orange y observación

en microscopio de fluorescencia. Nivel de significación estadística al comparar los

extractos con el control negativo: P < 0,01 (**) y P < 0,001 (***).


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Introducción

La disponibilidad de anticuerpos mono-clonales o mAc ha ocasionado un granimpacto en inmunología de peces. Enel mercado existen mAc específicosfrente a las inmunoglobulinas (Ig) devarias especies de peces que reaccio-nan frente a antígenos de membranasde estas últimas permitiendo la identi-ficación y caracterización de sub-poblaciones de leucocitos. De entrelos diferentes métodos para marcarcélulas de peces con anticuerpos espe-cíficos, los más usados son:1) Técnica Panning y Ensayo por

inmunoabsorción ligado a enzi-mas (ELISA)(3-6-12-19) inclu-yendo el método ELISPOT (25).En todos estos métodos las célu-las son inmovilizadas sobre unasuperficie sólida.

2) Inmunobeads, en este método lascélulas son separadas con unimán (13).

3) Citometría de flujo (2-20-24).

La técnica ELISA siempre ha sidoconsiderada el mejor método (16) yaque las técnicas de aglutinación sonrápidas y efectivas pero menos sensi-bles que ELISA (22).Con respecto ala citometría de flujo (CF), el métodoclásico es utilizar un primer anticuer-po no conjugado seguido por unsegundo anticuerpo conjugado con unfluorocromo que excite y emita fluo-rescencia a 488 nm (26).

La vacunación es una alternativasostenible a la quimioterapia que per-mite proteger el pez frente a las infec-ciones y tiene la ventaja de no gene-rar residuos (23). Recientemente, elinterés en desarrollar métodos estan-darizados para medir la producciónde anticuerpos se ha incrementadoenormemente. Esto se debe básica-mente a la introducción de programasde monitoreo en acuicultura, comopor ejemplo la detección de anticuer-pos séricos frente a nodavirus en cul-tivos de de lubina. Los niveles deanticuerpos en el suero también sehan utilizado en varias especies comoindicador de la eficacia de la vacuna-

ción (9). En algunos casos existe unacorrelación positiva entre los anti-cuerpos producidos y la protecciónfrente a la enfermedad, pero no siem-pre es así, y sobre todo en el caso dela vacunación por baño frente a Phdp.Mulero et al. (17) encontraron unaumento de la sensibilidad frente a lainfección en doradas vacunadas porbaño largo respeto al grupo controlsin vacunar. Estos autores utilizaronla técnica ELISA para detectar lasIgM en los peces vacunados. Elmecanismo de defensa de la doradafrente a las infecciones, y la correla-ción entre vacunación y la producciónde células IgM positivas queda aúnpor dilucidar.

Material y Método

2.1 Animales experimentales

Un total de 1500 juveniles de doradacon peso medio de 3 g fueron propor-cionados por una granja local(ADSA, Alevines y Doradas S.A.) ymantenidos en las instalaciones delICCM (Instituto Canario de CienciasMarinas, Taliarte) durante todo elexperimento. Los peces se distribuye-ron de forma aleatoria en 15 tanquesde 500 l (150 peces/tanque y por tri-plicado por cada tratamiento). Todoslos tanques presentan aireación conti-nua, sistema abierto de renovación deagua, la temperatura del agua se man-tuvo alrededor de 22 °C y los pecesfueron expuestos a un fotoperiodonatural de 12 h. Los peces fueron ali-mentados hasta la saciedad aparentecon una dieta comercial de la casaSkretting (Burgos, España) dos vecesal día.

2.2. Bacteria y vacunas

La cepa de Phdp 94/99 utilizada paraelaborar las vacunas fue aislada de unbrote natural ocurrido en las islasCanarias en 1999. Esta cepa fuecaracterizada utilizando el sistemaminiaturizado de identificación API20E (BioMérieux ®, España) y la téc-nica de la PCR. La cepa se cultivó en

agar sangre enriquecido con el 2% decloruro de sodio y el 1% de glucosapara que produjera cápsula (1). Seprepararon tres vacunas inactivadasdiferentes (bacterinas):1) Vacuna inactivada con formol al 5

‰ en agitación continua durantela noche

2) Vacuna inactivada con calor. Lainactivación se produjo exponien-do la bacteria a una temperatura-de 80ºC durante 10 minutos (15).

3) Vacuna inactivada con rayos UV.La bacteria fue expuesta a rayosUV durante dos horas utilizandoun transiluminador BIORAD(transiluminator 2000).

La concentración final de cadauna de las bacterinas fue ajustada a108ufc/ml por espectrofotometría(GENESYS 10UV®, Thermo) ymedida a una longitud de onda 600nm. Se utilizó la vacuna comercialIctiovac PD® (Hipra,España) comocontrol positivo.

2.3 Inmunización de los peces

Una vez alcanzado los 5 g de pesomedio, los peces de cada grupo fue-ron inmunizados por inmersión direc-ta en una dilución 1:10 de cada vacu-na (9 litros de agua de mar: 1 litro devacuna) durante 60 segundos (bañocorto). Después de la inmunización lospeces recibieron otro baño en agua demar limpia antes de ser devueltos asus respetivos tanques. El grupocontrol positivo recibió un baño cortocon la vacuna comercial (Fig 1) y elgrupo control negativo recibió elmismo tratamiento pero con tampónsalino (PBS) (9 litros agua de mar: 1litro PBS) (Fig 2). Posteriormente serecogieron muestras de bazo y bran-quias los días 4, 9, 11, 14, 18 y 23post vacunación, para ello se tomaron8 peces por tanque los cuales fueronanestesiados con 2-fenoxietanol ysacrificados en agua con hielo. Seprocedió a aislar los leucocitos de losanimales muestreados por métodospreviamente descritos (7) y se alma-cenaron a –80 ºC en medio dMEM

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(Sigma) adicionado con un 10% dedimetilsulfóxido. Treinta y un díasdespués de la primera vacunación lospeces recibieron una segunda vacuna-ción por baño corto (booster) y nue-vamente se recogieron muestras debazo y branquias de otros ocho pecesde cada tanque.

2.4 Citometría de Flujo

Antes de empezar el experimentose realizaron varios ensayos prelimi-nares para determinar un protocolo decitometría de flujo eficaz para leuco-citos de dorada.Para ello se diseñó unmétodo de tinción directa de IgM dedorada utilizando un anticuerpomonoclonal (AquaMab, AquaticDiagnostics Ltd, Stirling, Escocia)conjugado con FITC que reaccionófrente los leucocitos de las branquiasy del bazo. La conjugación con FITCse realizó utilizando el FluoroTag™FITC Conjugation Kit (Sigma, USA)

siguiendo las recomendaciones delfabricante. Los leucocitos extraídosde bazo y branquias se ajustaron a 106

cel/ml, se suspendieron en un volu-men final 250 ml de PBS, y finalmen-te se incubaron con 6 µl del conjuga-do anti-IgM-FITC a temperaturaambiente (25 ºC) en oscuridad duran-te 30 min. Las muestras en suspen-sión fueron analizadas con un citóme-tro Coulter Epics XL flow (Coulter,Miami, FL, USA) equipado con unlaser de argón a 488 nm. Cada célulase caracterizó por tres parámetrosópticos: dispersión de luz hacía ade-lante o forward-angle-scatter (FSC),dispersión de luz hacía los lados oside-angle-scatter (SSC) y fluores-cencia verde emitida (525 nm, detec-tor FL1). Los datos recolectadosfue-ron analizados conel softwareSYSTEM II (Coulter) y con el soft-ware WinMDI versión 2.8 (JosephTrotter; theScripps Research Institute,La Jolla, CA, USA).

Resultados

Los resultados muestran que latinción directa con anticuerpos mono-clonales conjugados con FITC es unbuen método para marcar las célulasIgM positivas de dorada. Los histo-gramas de CF muestran un pico muyalto de fluorescencia (Fig. 1) y losdatos son repetitivos. El grupo con-trol negativo muestra los niveles másbajos de células teñidas (Fig. 2). Laproducción de IgM fue más débil des-pués de la primera vacunación (Fig. 3y Fig. 4) comparada con la produc-ción de IgM después del booster (Fig.5 y Fig. 6). Destacamos que la pro-ducción de IgM en los peces inmuni-zados fue mucho más alta en las bran-quias que en el bazo. La cinética derespuesta inmune no fue igual entodos los grupos ya que algunas vacu-nas presentaron un pico más tempra-no que otras. Por ejemplo, después dela primera vacuna, en las branquias la

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Figura 1. Porcentaje de células IgM positivas en el bazo y branquias de los peces vacunados. Valores expresados como incremento sobre el control.

producción de IgM empezó el día 11mientras que en el bazo empezó el día4 pero con unos niveles más bajos. Lavacuna inactivada con UV presentóun pico el día 4 después del booster,mientras que la vacuna comercial eldía 9 y la vacuna inactivada con calorel día 11. La vacuna inactivada conformol presentó los niveles más bajosde IgM y el pico fue el día 23. En elbazo la producción de IgM fue consi-derablemente inferior a la producciónen las branquias. En este órgano lavacuna inactivada por UV presentóun pico el día 14, la vacuna de formoly la comercial el día 9 y la inactivadapor calor presentó un pico que sequedó constante entre los días 4 y 9.

Discusión

La citometría de flujo es una téc-nica sensible que permite hacer unanálisis multiparamétrico y analizarcualitativamente y cuantitativamenteuna muestra célula por célula (4).Hasta la fecha no se ha realizado nin-gún estudio sobre células IgM positi-vas de dorada utilizando la citometríade flujo. En este trabajo describimospor primera vez un método paramedir la producción de IgM de dora-da en el bazo y en las branquias des-pués de vacunación por baño. Ennuestro estudio, la vacunación porbaño produjo un incremento en elnúmero de células IgM positivas enlos peces vacunados. Los resultadosson de considerase fiables ya que seutilizaron anticuerpos monoclonalesfrente IgM de dorada y que ademáslos picos de fluorescencia fueronrepetitivos. Los resultados muestranque la producción fue más alta en lasbranquias que en el bazo. Este resul-tado está en concordancia con lo des-crito por Dos Santos et al. (2000) (6),en el estudio de este autor las lubinasvacunadas por baño presentaron unamayor producción de IgM en lasbranquias con respeto a otros órganosinmunitarios. Esto indica la impor-tancia de las branquias en la vacuna-ción por baño. Nakanishi y Ototake(18) ya habían postulado que la bran-

quias y la piel son los sitios de mayorcaptación de antígeno durante lavacunación por baño y que solo unapequeña cantidad de antígeno estransportada al bazo. Según estosautores la duración de la vacunacióntambién tiene que ver con la cantidadde antígeno captado. En este experi-mento hemos decidido suministrar lavacuna por baño corto para no estre-sar demasiado los peces. En el traba-jo de Raida et al. (19) las truchasarcoíris inmunizadas por baño tam-bién presentaron un incremento en laproducción de IgM; en el trabajo deRaida y colaboradores las IgM fueronmedidas con ELISA. La FC deberíaconsiderarse un método fiable paramedir las IgM en peces. Hasta lafecha esta técnica ha sido utilizadapor otros autores para medir la fago-citosis en macrófagos de dorada fren-te algunas bacterias tipo V. anguilla-rum (8), frente levaduras (5) o paraanalizar las funciones de los leucoci-tos en algunas especies como salmónAtlántico (20), carpa (14), ostra planaEuropea (21), ostra común (10),percaplateada y perca dorada (11).

Una buena vacuna en acuiculturadebe presentar ciertas característicascomo: Ser fácil de administrar, confe-rir una protección rápida y duradera yser rentable desde el punto de vistaeconómico. En este estudio hemosdecidido vacunar por baño ya que esuna práctica muy común en acuicul-tura frente patógenos como por ejem-plo Photobacterium spp. La vacuna-ción de peces en fases tempranas deldesarrollo es una buena estrategia yaque la manipulación resulta sencilla(baño frente inyección intraperitone-al) y requiere menos cantidades deantígeno y de tiempo. Otra ventaja devacunar los peces por baño es que estavía de administración es la mismaque utilizan muchos patógenos y porlo tanto genera una inmunidad muco-sal específica.

En nuestro estudio el incrementode IgM apareció bastante rápido enlas branquias y bazo de las doradasvacunadas sobre todo después de lasegunda administración (booster). No

obstante hemos encontrados diferen-cias en las cinéticas de las diferentesvacunas. Es entonces necesarioseguir investigando y ampliando losconocimientos sobre el sistema inmu-ne de la dorada para poder conocercuál es el mejor momento para reva-cunar. Sugerimos que la citometría deflujo es un método sensible, fiable yrápido que se puede utilizar comotécnica principal o complementariapara medir IgM de dorada en bran-quias y bazo.

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Introducción

La refrigeración y la congelación delsemen reducen la actividad metabóli-ca de los espermatozoides y, conse-cuentemente, preserva la viabilidadespermática (Meyers 2006). Sinembargo, ambos procedimientosmuestran ventajas y limitaciones. Elsemen canino es altamente establedurante el proceso de refrigeración,permitiendo el mantenimiento deniveles aceptables de calidad seminala corto plazo (Verstegen y cols. 2005;Ponglowhapan y cols. 2004).Diferentes estudios han confirmadoque el semen canino puede ser preser-vado a 4 ºC durante 5-7 días en undiluyente a base de Tris-glucosa-huevo (Verstegen y cols. 2005;Nizänski y cols. 2009), y tras esteperiodo de tiempo, la calidad seminaldisminuye. Sin embargo, desde unpunto de vista práctico, el semenrefrigerado debería utilizarse en lasprimeras 48 horas (Peña y cols.2006), y numeroso estudios han con-firmado que el periodo de conserva-ción y el tipo de recipiente que con-

tiene el semen influencian marcada-mente sobre la viabilidad del semenrefrigerado (Pinto y cols. 1999;Lopes y cols. 2009). Por otro la lado,la congelación seminal es más com-pleja que la refrigeración y generauna marcada degradación de la cali-dad seminal tras la congelación-des-congelación (Peña y cols. 2006). Noobstante, la congelación del semenrepresenta una herramienta básica enlas técnicas de reproducción asistida(ART), permitiendo el almacena-miento de muestras biológicas de altovalor genético durante un periodoindefinido de tiempo.

En las últimas décadas, el trans-porte de material biológico (entreterritorios cercanos y lejanos) se havuelto un procedimiento común den-tro de la ART (Hendricks y cols.2010). En las Islas Canarias, el envíode muestras de semen hacia otros paí-ses, que se encuentran geográficamen-te alejados de las islas, ocurre cada vezcon mayor frecuencia. La mayor partede las veces, estas muestras son envia-das como semen refrigerado, y eltransporte de semen tarde entre 12 y

48 horas, por lo que esas muestras seutilizan habitualmente para perras quese encuentran en celo y requieren unainseminación inmediata. Por el contra-rio, el transporte de semen congelado,especialmente si se tratan de envíosinternacionales, siempre requiere eluso de nitrógeno líquido (Peña y cols.2006; Hendricks y cols. 2010). En elmomento actual, el transporte aéreo demuestras seminales en nitrógeno líqui-do se encuentra sujeto a regulacióncomo material peligroso y, en conse-cuencia, el transporte se muestras con-geladas de semen resulta muy comple-jo y difícil de realizar (Bielanski2005). Tales restricciones tienden adesaparecer cuando el semen es remi-tido como semen refrigerado (Her-mansson y Linde-Forsberg, 2006). Portanto, sería muy interesante valorar laposibilidad de remitir muestras refri-geradas y una vez llegada a destino,congelar esas muestras para su alma-cenamiento a largo plazo para un usoposterior.

El objetivo del presente estudioera determinar la calidad seminal demuestras congeladas-descongeladas,

tras haber sido previamente refrigera-das (a 4 ºC) hasta 48 horas en un dilu-yente a base de Tris-glucosa-yema ycomparar la viabilidad espermáticacon aquella observada en muestrascongeladas siguiendo un protocolotradicional.

Material y métodos

Animales

Se utilizaron 6 perros adultos, entre 2y 5 años de edad y pesando entre 12 y30 kg, cedidos por sus propietariospara el estudio. Los animales se ali-mentaban a base de pienso comercial,disponían siempre de agua y se encon-traban con un plan sanitario adecuado.Todo el trabajo experimental se realizóde acuerdo a la normativa europeapara experimentación animal.

Diseño experimental

Tres eyaculados de cada uno de los 6perros, se recogió y tras su valoraciónindividual, se mezclo en un pool, paraposteriormente dividir las muestrasresultantes en 6 alícuotas. La primeraalícuota (alícuota C, control) se dilu-yo con un primer diluyente (Tris-glu-cosa, 20% yema de huevo, 3% glice-rol) y después de 1 hora de equilibra-do a 4 ºC, se añadió un 2º diluyente(Tris-glucosa, 20% yema de huevo,7% glicerol), para alcanzar una con-centración final de 100 x 106 esper-matozoides/ml, 20% de yema dehuevo y 5% glicerol. Las restantes 5alícuotas (R1, R6, R12, R24, R48) sediluyeron con un diluyente de refrige-ración (Tris-glucosa, 20% yema dehuevo, 0% glicerol) y se enfriaron a 4ºC durante diferentes periodos detiempo (1, 6, 12, 24 y 48 horas, res-pectivamente); tras el periodo derefrigeración, se añadió un segundodiluyente (Tris-glucosa, 20% yemade huevo, 10% glicerol). Finalmente,las muestras seminales (alícuotas C,R1, R6, R12, R24 y R48) se envasa-ron en pajuelas (0.5 mL) y congela-ron en nitrógeno líquido. Tras la des-congelación, la calidad seminal se

valoró, en un total de 30 dosis paracada uno de los grupos experimenta-les.

Recogida y valoración seminal

Los eyaculados se recogieron porestimulación manual, intentandoobtener exclusivamente la 2ª fraccióndel eyaculado que se deposito en untubo graduado. Inmediatamente trasla recogida, el volumen, concentra-ción espermática, motilidad indivi-dual y porcentajes de morfoanomalí-as y acrosomías espermáticas fuerondefinidas en cada una de las muestrasseminales.

El volumen se determinaba porlectura directa sobre el tubo gradua-do, mientras la concentración esper-mática se valoró utilizando un espec-tofotómetro (Spermacue®, MinitubeGmbH) calibrado para semen canino.El porcentaje de espermatozoidesmótiles (motilidad total, motilidad indi-vidual) se determinó utilizando unsistema de automático de análisiscomputerizado (CASA system, SpermVision Lite®, Minitube Ibérica) sobreun mínimo de 1000 células espermá-ticas/muestra. Finalmente, los por-centajes de espermatozoides conacrosoma alterado y morfología anor-mal (cabeza, pieza intermedia y cola)se determinaron mediante la técnicade tinción Spermac®, valorando unmínimo de 100 células espermáticaspor preparación, mediante un micros-copio de contraste de fases a 1000Xde magnificación (Peña, 2004).

Procesado seminal, refrigeración ycongelación seminal

Tras la evaluación individual, loseyaculados se mezclaron y el poolresultante se dividía en 6 alícuotas (1-2 ml/alícuota). Una alícuota (alícuotacontrol, C), representando 1/6 partedel total del volumen del pool, se pro-ceso siguiendo el método tradicional(primera dilución, 1 hora de equili-brado a 4 ºC, segunda dilución), parafinalmente envasarse en pajuelas de0.5 mL y congelarse en nitrógeno

líquido. Las restantes muestras semi-nales (5/6 de las alícuotas) se dispu-sieron en un tubo calibrado (a tempe-ratura ambiente) y se adicionó undiluyente de refrigeración (Tris-glu-cosa, 20% yema de huevo, 0% glice-rol), para obtener una concentraciónfinal de 200 x 106 espermatozoides/ml;estas 5 alícuotas fueron enfriadasdurante diferentes periodos de tiem-po: R1 (1 hora), R6 (6 horas), R 12(12 horas), R 24 (24 horas) y R 48 (48horas), para posteriormente añadirleun diluyente de congelación (similarcomposición al de refrigeración, perocon un 10% de glicerol), alcanzandouna composición final similar a laobtenida en la alícuota C. Finalmente,las muestras seminales fueron enva-sadas (0.5 mL) y congeladas en nitró-geno líquido.

Valoración de la calidad seminalpost-descongelación

Aproximadamente 1 mes tras la con-gelación, las pajuelas se descongela-ron en baño María (70 ºC, 8 segun-dos) y se disponían en un tubo con0.5 mL de un tampón Tris precalenta-do a 37 ºC. Tras un calentamiento (37ºC) durante 5 minutos, la calidadseminal (motilidad espermática, por-centajes de acrosomías y morfoano-malías espermáticas) se valoraba, uti-lizando las mismas técnicas y proce-dimientos que los descritos para elsemen fresco.

Análisis espermático

Los resultados se presentan comomedia (± error estándar de la media).Los datos de motilidad espermática,porcentajes de morfoanomalías y por-centajes de acrosomías se analizaronutilizando un análisis repetido devarianza (ANOVA) mediante SASsoftware (SAS Institute, NC, USA).Cuando se detectaron diferencias sig-nificativas, las medias se comparabanutilizando el test de Tukey. Los valo-res se consideraban significativamen-te diferentes cuando p <0.05.

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Resultados

Las características seminales del semenen fresco (una vez mezclado) se pre-sentan en la Tabla 1. Los valores fue-ron bastantes uniformes entre losmachos, no existiendo diferenciassignificativas entre ninguno de loseyaculados seleccionados.

Respecto al porcentaje de motili-dad espermática, antes de la congela-ción, los valores fueron muy similaresentre los grupos experimentales (70-80%), sin detectarse diferencias signi-ficativas. En la Tabla 2, se reflejan losporcentajes de espermatozoides conmotilidad total y con motilidad pro-gresiva, en las muestras congeladas-descongeladas. Tras la descongela-ción, las muestras previamente refri-geradas durante 1 y 6 horas (R1 y R6)mostraban los valores más elevadosde motilidad espermática, detectándo-se diferencias significativas (p<0.05)respecto a las muestras R12, R24 yR48. Al compararse el grupo control(C) con las muestras refrigeradasantes de la congelación (R1, R6, R12,R24, R48), no se observaron diferen-cias significativas en los porcentajesde espermatozoides mótiles totales.

Los porcentajes de espermatozoi-des con morfología anormal se mues-tran en la Tabla 3, observándose queno existen diferencias significativasentre los grupos, con valores muyhomogéneos entre un 15 y un 20%. Lamayor proporción de anormalidadesespermáticas se observaron a nivel dela cola espermática, siendo esta distri-bución muy uniforme en todos losgrupos experimentales. Finalmente, laTabla 4 registra los valores de acroso-mas alterados; de manera similar a lamorfología espermática, los valoresmedios de acrosomas alterados(rango: 7-10%) no mostraba cambiossignificativos entre las muestras refri-geradas antes de congelarse (R1, R6,R12, R24, R48) y el grupo control.

Discusión

Los resultados del presente estudioclaramente demostraron que la cali-

dad seminal post-descongelación demuestras caninas refrigeradas hasta48 horas era comparable a la observa-da en muestras congeladas siguiendoun protocolo tradicional.

Una gran mayoría de estudios hanconfirmado que la motilidad esper-mática no se modifica marcadamente

durante las primeras 48 horas de con-servación a 4 ºC, con valores mediosentre 60 y 80% (Rota y cols. 1995,England y Ponzio 1996, Iguer-Ouaday Verstegen 2001a, Ponglowhapan ycols. 2004, Shahiduzzaman y Linde-Forsberg 2007, Nizânsky y cols.2009). Sin embargo, otros autores(Hermansson y Linde-Forsberg 2006,

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Tabla 4. Porcentajes (media ± dem) of acrosomas dañados en muestras congela-das-descongeladas.

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Tabla 3. Porcentajes (media ± dem) de espermatozoides con morfología anormalen muestras congeladas-descongeladas

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Tabla 2. Porcentajes (media ± dem) de espermatozoides mótiles totales y conmotilidad progresiva en muestras congeladas-descongeladas.

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Tabla 1. Características (media ± dem) del semen fresco una vez mezclado (pool)

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Ponglowhapan y cols. 2006) afirmanque la motilidad espermática caninadisminuye tras sólo 48 horas de refri-geración. En nuestro estudio, la moti-lidad espermática permaneció prácti-camente inalterada en el semen refri-gerado, con porcentajes medios supe-riores al 70% durante las 48 horas;asimismo, no se detectaron diferen-cias entre las muestras refrigeradas(R1, R6, R12, R24, R48) y el grupocontrol. Por tanto, podría asumirseque la motilidad espermática de losdiferentes grupos experimentalesantes de la congelación era práctica-mente similar. Tras la congelación-descongelación, la motilidad esper-mática total de las muestras refrigera-das hasta 48 horas no mostraba dife-rencias con las muestras conservadasde un modo convencional (C). Estosresultados son comparables a los des-critos por la mayoría de los autoresque utilizan un sistema convencional(sin refrigeración previa) para la crio-preservación del semen, con valoresde motilidad post-descongelaciónque oscilan entre un 45-70% (Hay ycols. 1997, Ström y cols. 1997, Rota ycols. 1999, Yildiz y cols, 2000, Iguer-Ouada y Verstegen 2001b, Martins-Bessa y cols. 2006, Bencharif y cols.2010). Por lo tanto, los resultados demotilidad espermática pueden indicarque la refrigeración del semen a 4ºChasta durante 48 horas antes de sucongelación no muestran desventajasrespecto al método directo de criopre-servación.

Por otro lado, la motilidad esper-mática post-descongelación en lasmuestras refrigeradas antes de conge-larse, mostraba diferencias significa-tivas en función del periodo de alma-cenamiento a 4ºC. De hecho, las alí-cuotas R1 y R6 presentaron mayoresporcentajes de espermatozoides conmotilidad progresiva que las alícuotasR12, R24 y R48. Esta perfectamenteasumido que los espermatozoides delperro son muy estables cuando serefrigeran, y que la motilidad esper-mática puede permanecer elevadadurante un elevado periodo de tiempo(Verstegen y cols. 2005, Shahiduz-

zaman y Linde-Forsberg 2007), y nose detectan cambios en la capacidadfuncional del espermatozoide (Kumi-Diaka y Badtrama 1994). Del mismomodo, la criopreservación del semencanino produce una degradación evi-dente de las células espermáticas,resultando en una obvia reducción dela motilidad espermática (Farstad1996, Peña y cols. 2006). En nuestroestudio, la motilidad espermáticaantes de la congelación no se modifi-co por el tiempo de refrigeración; sinembargo, el descenso detectado en lamotilidad post-descongelación de lasmuestras pertenecientes a los alícuo-tas R12, R24 y R48 puede ser resulta-do de una reducción en la capacidadde los espermatozoides para soportarel proceso de criopreservación, comoconsecuencia del incremento delperiodo de refrigeración. En cual-quier caso, no hay que descartar quelas diferencias en la motilidad esper-mática post-descongelación puedenser debidas a la refrigeración o lacongelación, y por las interaccionesentre ambos procesos.

Respecto al porcentaje de anor-malidades espermáticas, los resulta-dos mostraron que la refrigeracióndel semen hasta 48 horas antes decongelarse no generaba un mayordesarrollo de morfoanomalías esper-máticas, con una distribución muyuniforme entre los grupos experimen-tales. Nuestros resultados fueronsimilares a los descritos por otrosautores, tanto en semen refrigerado a4 ºC (Farstad 1996, Peña y cols.2006) como en muestras congeladas-descongeladas (Silva y Verstegen1995, Silva y cols. 1996, Álamo ycols.. 2005, Batista y cols.. 2006) endiferentes razas caninas. De maneraparalela a las anomalías morfológi-cas, los porcentajes de acrosomasalterados mostraron valores (7-10%)compatibles con los descritos paramuestras refrigeradas y tras su des-congelación (5-22%; Hay y cols.1997; Álamo y cols. 2005, Batista ycols. 2006). En espermatozoides pro-cedentes del epidídimo, la refrigera-ción del semen (hasta 4 días) antes de

la congelación no generaba modifica-ciones en el porcentaje de espermato-zoides con acrosoma dañado (12-20%; Ponglowhapan y cols. 2006).Por el contrario, Hermansson yLinde-Forsberg (2006) detectaron unprogresivo incremento en el porcen-taje de acrosomas dañados post-des-congelación, conforme se incremen-taba el periodo de refrigeración pre-vio a la congelación (de un 20 a un38%), si bien no encontraron diferen-cias significativas, probablementecomo consecuencia del bajo númerode pajuelas que evaluaron en dichoestudio. En nuestro estudio, la faltade diferencias en los porcentajes deanomalías morfológicas y acrosomíaspost-descongelación entre los dife-rentes grupos experimentales resultaconsistente con el análisis de motili-dad espermática, puesto que la moti-lidad espermática no se modifica sus-tancialmente en las muestras congela-das tras un periodo previo de refrige-ración y las muestras congeladas trasun protocolo convencional. En estesentido, la refrigeración del semen(hasta 48 horas) antes de congelarse yla crio-preservación directa podránconsiderarse procesos igualmenteválidos.

En conclusión, nuestro estudiomostró que la refrigeración del semen(4ºC) hasta 48 horas antes de la con-gelación no producía una disminu-ción en la calidad del semen cuandose comparaba con muestras seminalescongeladas de una manera tradicio-nal. Por lo tanto, en la especie canina,la congelación del semen que hayasido previamente refrigerado hasta 2días podría ser una alternativa tanefectiva como el método habitual decriopreservación seminal. Las limita-ciones asociadas con el transporte desemen congelado podrían superarsecon el uso del semen refrigerado. Deesta forma, el semen refrigeradopodría ser directamente crioconserva-do tras su envío, confirmando la com-plementariedad de ambas técnicaspara la preservación de muestrasseminales.

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Introducción

La tomografía axial computarizada(TAC) es una técnica diagnóstica queutiliza rayos-x como fuente de ima-gen. Su fundamento está basado en elestudio de una delgada sección trans-versal del cuerpo examinada desdemúltiples ángulos mediante un finohaz de rayos-x. La radiación transmi-tida se calcula con un detector queconectado a un ordenador analiza estainformación mediante un algoritmomatemático que la transforma en unaimagen tomográfica (8). Cuando secompara con la radiografía conven-cional, la imagen digital generada porla TAC permite un mejor contraste detejidos. La manipulación de su escalade grises permite una visualizaciónóptima de todos estos tejidos dentrode una sección corporal. Normalmente,el paciente se posiciona horizontal-

mente en la camilla del aparato deTAC para la adquisición de una ima-gen en el plano transversal. La mayo-ría de los aparatos de tomografía axialcomputarizada pueden reorientarestos datos para elaborar cambios enlos planos sagital, dorsal, paraxial uoblicuo (11).

Los avances y mejoras recientesen esta técnica de imagen han permi-tido la aplicación de prógramas infor-máticos para la generación de imáge-nes tridimensionales de un área deinterés anatómico. Esta técnicarequiere de múltiples secciones depequeño grosor que permiten obtenerimágenes de las estructuras óseas condiferentes grados de rotación y unamejor visualización de los detallesanatómicos (10). La reconstruccióntridimensional mediante tomografíaaxial computarizada ha sido usadapreviamente para la evaluación de la

columna vertebral cervical y lumbarcanina (6) y el estudio anatómico dela cabeza de leones marinos (3).

La contribución de la TAC alconocimiento anatómico y clínico dela especie equina está limitada por elalto coste y la ausencia de un adecua-do diseño de estos equipos para caba-llos adultos. Los escáner de TAC usa-dos en medicina veterinaria procedende aquellos diseñados para pacienteshumanos; por lo tanto, este tipo demáquinas son aptas únicamente parapotros debido a las limitaciones detamaño del equipo. Debido a esto, lamayor parte de los estudios en elcaballo se centran en los procedi-mientos técnicos (2), o estudios par-celarios de la cabeza (1, 13, 15) y dela parte distal de las extremidades(12, 14).

Este trabajo describe la porcióncervical de la columna vertebral en dos

potros mediante la reconstrucción tri-dimensional con tomografía axialcomputarizada. La aplicación de estatécnica podría contribuir al conoci-miento de la relación normal de lasvértebras cervicales y a una mejorcomprensión y evaluación clínica dealgunas patologías responsables decausar incoordinación y alteracioneslocomotoras en caballos.

Material y métodos

Las imágenes de TAC fueron obteni-das de dos potros neonatos de 5 díasde edad y de raza Quarter Horse, clíni-camente normales. Para realizar esteestudio ambos animales fueron prea-nestesiados con xylacina a 0,5 mg/kg,IV (Rompun®, Bayer HealthCareAG, Alemania). La anestesia se indu-jo con un bolo de propofol a 2.0-2.5mg/kg, IV (Diprivan®, AstraZeneca,Reino Unido) administrado a travésde un catéter yugular. Los potros fue-ron intubados con un tubo endotra-queal para mantener la vía aérea. Lospotros anestesiados se colocaron endecúbito esternal sobre la mesa delescáner, monitorizando su frecuenciarespiratoria y cardíaca. Mediante unequipo de cuarta generación (GeneralElectric Medical System, Milwaukee,USA) se obtuvieron una serie de imá-genes transversales de 2mm de espe-sor, desde los cóndilos occipitaleshasta la quinta vértebra cervical,haciendo especial enfasis en las áreasatlantoaxial y atlantooccipital. Losparámetros usados para las imágenesde TAC fueron 120 kVp y 560 mAs.

Resultados

La reconstrucción tridimensional porTAC permitió la visualización detodas las partes de las vértebras, inclu-yendo sus articulaciones (Figuras 1,2A, 2B). Las imágenes más represen-tativas fueron seleccionadas paramostrar detalles anatómicos de lasestructuras incluidas en la región cer-vical de la columna vertebral. Lasúltimas dos vértebras no se incluyenporque éstas mostraron multiples arte-factos en su reconstrucción. En una

visión lateral de una imagen tridimen-sional reconstruida por TAC de laregión cervical se puede ver la morfo-

logía del atlas o primera vértebra cer-vical. Ésta se articula con la cabezacranealmente, mostrando procesos

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Figura 1. Imagen tridimensional por TAC de la columna cervical, visión lateral. 1. Arco dor-sal del atlas. 2. Apófisis transversa (ala) de Atlas. 3. Agujero transverso del atlas. 4. Apófisisespinosa del axis. 5. Apófisis articular caudal del axis. 6. Apófisis transversa del axis. 7. Agujerotransverso del axis. 8. Apófisis articular craneal de la tercera vértebra cervical. 9. Tubérculo ven-tral de la apófisis transversa de la tercera vértebra cervical. 10. Tubérculo dorsal de la apófisistransversa de la tercera vértebra cervical. 11. Apófisis articular caudal de la tercera vértebra cer-vical. 12. Cresta ventral del cuerpo de la cuarta vértebra cervical. 13. Articulacion entre los pro-cesos articulares.

Figura 2. Imagen tridimensional reconstruida por TAC de la columna cervical, visión dor-sal (A) y ventral (B). 1. Apófisis paracondilar del hueso occipital (vista ventral solamente). 2.Cóndilos occipitales (vista dorsal solamente). 3. Articulación atlantooccipital (solo en la visiónventral). 4. Escotadura alar (vista dorsal solamente). 5. Ala del atlas. 6. Agujero magno (vistaventral solamente). 7. Fosa del atlas (vista ventral solamente). 8. Tubérculo dorsal del atlas (vistadorsal solamente). 9. Agujero transverso del atlas. 10. Diente del axis y articulación atlantoaxial.11. Apófisis espinosa del axis (vista dorsal solamente). 12. Apófisis articular craneal del axis.13. Apofisis transversa del axis. 14. Agujero transverso del axis. 15. Apófisis espinosa de la ter-cera vértebra cervical (vista dorsal solamente). 16. Tubérculo ventral de la apófisis transversa dela tercera vértebra cervical. 17. Articulación entre los cuerpos vertebrales. 18. Articulación entrelas apófisis articulares. 19. Tubérculo dorsal de la apófisis transversa de la quinta vértebra cer-vical. 20. Cresta ventral de la quinta vértebra cervical (vista ventral solamente).

articulares modificados tambiéndenominados fóveas articulares, queuna vez que se relacionan con los cón-dilos del hueso occipital forman laarticulación atlanto-occipital. Tambiénse visualizaron los agujeros transver-sos localizados lateralmente en lasalas del atlas. El axis o segunda vérte-bra cervical mostró un proceso espi-noso alargado y modificado comoprincipal característica. En esta visiónse observó la superficie articular cra-neal y los procesos articulares cauda-les orientados ventrolateralmente. Anivel de la base de su proceso trans-verso podia ser identificado el peque-ño agujero transverso. En el resto delas vértebras se identificaron lostubérculos dorsales y ventrales de losprocesos transversos, donde se podíaobservar como los tubérculos ventra-les eran más prominentes en las vérte-bras cervicales más caudales. En estasúltimas vertebras se identificaban losprocesos articulares caudal y craneal,así como sus superficies articulares.Se pudo observar además, la crestaventral surgiendo de los cuerpos ver-tebrales (Figura 1). En la vista dorsaly ventral de la columna cervical(Figura 2), se podían observar los cón-dilos occipitales articulándose con lasfóveas articulares craneales del atlas.En esta imagen también se identifica-ba el diente del axis y su fijación a lafóvea articular caudal situada en el cau-dal del arco ventral del atlas. Los pro-cesos articulares craneales del axis seajustaban a cada fóvea caudal delatlas. En la visión dorsal, el procesoespinoso del axis se continuaba cau-dalmente hasta los procesos articula-res caudales mediante dos crestas. Laraíz de cada ala del atlas estaba perfo-rada por la escotadura alar, que des-embocaba dentro de la fosa del atlas.El agujero transverso se situaba cau-dalmente dentro de las masas lateralesdel atlas, asi como a cada procesotransverso del resto de vértebras cer-vicales. En ambas visiones, los tubér-culos dorsales y ventrales del procesotransverso de cada vértebra podían seridentificados. En la visión ventral semostraban otras estructuras como el

proceso paracondilar del hueso occi-pital y el agujero magno (Figura 2).

Discusión

Recientemente, la disponibilidad deequipos usados y la disminución enlos costes de mantenimiento, han faci-litado un incremento del uso de laTAC en medicina veterinaria (1, 2, 6,12, 13, 14, 15). Ésta permite obtenerimágenes de alta resolución con unadecuado contraste de los tejidosblandos. Sin embargo, la calidad deestas imágenes puede verse afectadanegativamente por el movimiento delpaciente, por lo que generalmentetodos los estudios de TAC son realiza-dos sobre pacientes anestesiados. Apesar de ello, esta técnica es una exce-lente herramienta para el diagnósticode muchas enfermedades en medicinade pequeños y grandes animales.

La reconstrucción tridimensionalpor TAC es un eficaz procedimientoque hasta la fecha no ha sido usadocon mucha frecuencia en medicinaveterinaria. La recopilación de datosrequiere de múltiples secciones para-lelas obtenidas en el mismo plano.Para reducir los artefactos producidospor el movimiento del paciente se uti-liza un escáner muy rápido que permi-te obtener una secuencia de imágenesde gran calidad (8). Las ventajas deeste procedimiento son que la superfi-cie de las estructuras óseas pueden servisualizadas con diferente grado derotación y sin la superposición de teji-dos blandos. Además, la extensión delas lesiones óseas puede ser visualizadacon excelente detalle gracias a un pro-grama informático que permite que lasuperficie ósea puede ser representadacomo una imagen en 3-D (10).

El uso de la reconstrucción en 3-D por TAC ha sido una importanteayuda diagnóstica en la evaluaciónclínica de malformaciones de verte-bras cervicales, cambios degenerati-vos en sus caras articulares o esteno-sis cervicales en animales domésticos(6). En contraste, solo unos pocosestudios han hecho mención a des-cripciones anatómicas de áreas espe-

cíficas (3). La TAC es uno de losmétodos más empleados para la valo-ración de la columna vertebral y eldiagnóstico de enfermedades lumbo-sacras en medicina humana (4, 5). Sinembargo, existen pocos informes dis-ponibles sobre la aplicación de laTAC o la reconstrucción en 3-D decualquier región de la columna verte-bral de mamíferos terrestres y lamayoria de éstos han sido realizadosen animales muertos, destacandoaquellos que describen la anatomíanormal de la columna vertebral cani-na mediante comparación de imáge-nes tomográficas con cadáveres (7,9). En este estudio hemos intentandohacer nuestras observaciones sobreestructuras reconocibles en animalesvivos neonatales. Aún así seríannecesarios más trabajos para definirel alcance de la reconstrucción en 3-D por TAC, tanto para imágenes mor-fológicas básicas, como para la inter-pretación de aquellas en pacientescon signos clínicos. Gran parte deesto, sin embargo, tendrá que venir dela experiencia clínica continuada y lacomparación constante entre imáge-nes anatómicas o patológicas y elresultado de estudios post-mortem.

Desde el punto de vista docente,la tecnología de imágenes en tresdimensiones puede facilitar la ense-ñanza de anatomía a los estudiantesde veterinaria, permitiendo la visiónde estructuras de una forma realista ytridimensional. Por lo tanto, esta téc-nica es una herramienta anatómicaque permite la visualización de loshuesos, la red vascular y de ciertostejidos blandos seleccionados en unaimagen tridimensional. Esta técnicaelimina la dificultad de visualizarestructuras de la columna vertebral enimágenes o dibujos usados en lamayoría de los libros de texto de ana-tomía. Como la experiencia con laradiografía simple sugiere que exis-ten variaciones entre caballos norma-les, serian necesarios más casos paradeterminar variaciones en potros clí-nicamente normales.

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Introducción

Las hepatitis han sido diagnosticadastanto en delfines de vida libre comoen cautividad (1, 6, 8, 16, 24, 30,).Los desordenes hepáticos crónicos decausa desconocida son comunes endelfines y suelen estar caracterizadosclínicamente por pérdida de peso eictericia. Las lesiones hepáticas con-sisten en la degeneración de hepatoci-tos, cambios grasos y fibrosis. Lahepatitis aguda en delfines puedeestar causada por toxinas alimenticiaso ambientales, y agentes biológicoscomo virus, bacterias, hongos y pará-sitos. Generalmente, Los cambio his-topatológicos del hígado pueden daruna idea de la etiología de este tipo dehepatitis en delfines (30). En todosestos estudios previos, las formasmás comunes de hepatitis fueronhepatitis no purulentas, hepatitisintersticiales y pericolangitis subagu-da o crónica. Sin embargo, solo enalgunos de éstos ha sido descrita lahepatitis reactiva crónica no específi-ca (NSRH) (16).

En mamíferos terrestres, laNSRH es una forma de hepatitis cró-nica que se define como una entidadmorfológica ampliamente distribuidapor el hígado, representando el resi-duo de una enfermedad intrahepáticainflamatoria previa o una respuesta auna variedad de procesos extrahepáti-cos como por ejemplo enfermedadesfebriles, inflamación en alguna partedel lecho visceral o enfermedad celia-ca (26, 27, 28, 32).

Los delfines, como otros cetáceos,están en la cima de la cadena alimen-taria marina y pueden acumular conta-minantes en sus tejidos durante suvida. Los compuestos organoclorados(OCs), especialmente bifenilos poli-clorados (PCBs) y diclorodifeniltriclo-roetanos (DDTs) han tenido una granrepercusión por sus efectos perjudicia-les en la salud de los mamíferos mari-nos (2, 3, 7, 12, 17, 18, 20, 31).

A pesar del gran número de estu-dios toxicológicos realizados en del-fines, no se han realizado trabajosque correlacionen los estudios toxico-

lógicos e histopatológicos del hígado.Dichos estudios podrían proporcionaruna valiosa información sobre lacausa de hepatitis crónica y otrasenfermedades que afectan a mamífe-ros marinos.

El propósito de este estudio con-sistió en describir los cambios histo-patológicos y la naturaleza del infil-trado inflamatorio en las lesiones deNSRH observadas en 17 delfinesmulares varados en las Islas Canarias,correlacionando la gravedad de laNSRH con los niveles de un númerode contaminantes en la grasa y elhígado, y la presencia de otras infec-ciones y enfermedades sistémicas.

Material y métodos

Animales y estudio patológico

Un total de 17 delfines mulares (9machos y 8 hembras) fueron incluidosen este estudio. El examen post-mor-tem fue realizado según el protocoloestándar para los cetáceos (25). Tresmuestras de cada hígado, así como delos nódulos linfáticos fueron incluidosen el estudio, para después ser fijadasen formol al 10%, deshidratadas enalcohol e incluidas en parafina. Lassecciones (4 mm de grosor) fueroncortadas y teñidas con hematoxilina-eosina para su examen histopatológi-co. El número de neutrófilos, linfoci-tos y células plasmáticas presentes enel infiltrado inflamatorio se contaronen 15 campos seleccionados al azar de640x, incluyendo espacios porta ysinusoides hepáticos. Las NSRH fue-ron clasificadas como leves, cuando

se observaban entre 20-50 células porcampo; moderadas (entre 50-75 célu-las por campo) y severas (mas de 75células por campo).

Estudio inmunohistoquímico

Las secciones seleccionadas fue-ron teñidas con el test de inmunope-roxidasa para morbilivirus (23). Elmétodo de la avidina-biotina-peroxi-dasa (ABC) fue utilizado para estu-diar el inmunofenotipo del infiltradoinflamatorio presente en las lesioneshepáticas (15). La actividad endóge-na de la peroxidasa fue bloqueada porla incubación en peróxido de hidróge-no al 0.3% en metanol durante 30minutos. La incubación en pronasa al0.01% (Sigma Chemicals, St Louis,MO, EEUU) durante 10 minutos atemperatura ambiente fue utilizadacomo método en la recuperación delantígeno para todos los anticuerpos aexcepción del MHC de Clase II,donde se aplicó incubación en ácidocítrico al 0.01 M en microondas a100º durante 7 minutos (Tabla 1).Posteriormente, las secciones fueronaclaradas en solución tampón fosfatosalino (PBS) al 0.01 M, pH 7.2 eincubadas durante 30 minutos consuero normal de cabra al 10% (VectorLaboratories, Burlingame, CA, USA)a temperatura ambiente (20-25ºC).

Después de tres aclarados en PBS,un suero biotinilado de cabra paraanticuerpos anti-inmunoglobulina Gde conejo diluido en PBS (VectorLaboratories, Burlingame, CA, USA)fue utilizado durante 30 minutoscomo reactivo secundario para los

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Tabla 1. Detalle de los anticuerpos primarios usados en este estudio.

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anticuerpos policlonales primarios(pAbs), mientras que este mismosuero de cabra biotinilado para anti-cuerpos anti-inmunoglobulina de ratóndiluido en PBS (Dako) se utilizo comoreactivo secundario para los anticuer-pos monoclonales primarios (mAbs)durante 30 minutos. El complejo ABC(vector) diluido en PBS fue aplicadocomo tercer reactivo. Entonces, estassecciones fueron incubadas con 33’ -tetrahidrocloridro de diaminobencidi-na (sigma), diluido al 0.035% en tam-pón salino (pH 7.6) conteniendo peró-xido de hidrógeno al 0.01%. Final-mente, las secciones fueron aclaradasen agua corriente, contrateñidas conhematoxilina de Mayer y montadascon Eukitt. Como controles negativos,los anticuerpos primarios específicosfueron sustituidos por un tampón fos-fato salino de conejo o ratón. Comocontroles positivos se utilizaron sec-ciones de tejido procedentes de nódu-los linfáticos mesentéricos de delfín yhumano. Las secciones de tejido deanimales sin evidencia de enfermedadhepática fueron utilizadas como híga-dos control.

Estudio toxicológico

Para llevar a cabo este estudio se ana-lizaron muestras de grasa e hígadopara detectar las concentraciones dePCB y DDT en 11 de 17 delfinesmulares. La concentración total dePCB fue calculada como la suma de11 derivados policlorados bifenílicos(PCBs) (IUPAC # 28, 52, 101, 105,118, 138, 149, 153, 156, 180 y 187).Las concentraciones de DDTs se cal-cularon como la suma de seis com-puestos de DDT (pp’-DDE, pp’-DDT, pp’-DDD, op’-DDE op’-DDT,op’-DDD). Los niveles de PCB yDDT se compararon con el umbraltoxicológico de aquellas concentra-ciones encontradas en otros estudiosen mamíferos marinos (5, 12, 18, 19).

Resultados

La hepatitis reactiva crónica no espe-cífica (NSRH) fue diagnosticada en

todos los animales examinados,donde se observo como 2 de las 17eran severas, otras 2 eran moderadas,y las restantes fueron consideradascomo leves. La única evidenciamacroscópica de esta enfermedad fueun moderado aumento en el tamañodel hígado. De acuerdo a la composi-ción y gravedad del infiltrado infla-matorio identificado en estos tejidosse distinguieron dos tipos diferentesde NSRH: Hepatitis reactiva activacrónica no específica y hepatitis reac-tiva crónica no específica.

Histologicamente, la NRSH esta-ba compuesto por un infiltrado infla-matorio en las áreas portales y en elparénquima sin evidencias de necro-sis hepatocelular; en el primer tipo(hepatitis reactiva activa crónica noespecífica) había un infiltrado leve-moderado, compuesto principalmentepor neutrófilos en el estroma de lasáreas portales y de diferente intensi-dad entre las mismas, que incluiatractos portales normales, así comode una leve a marcada proliferaciónde leucocitos y células de Kupffer enlos sinusoides y algunos neutrófilosen el estroma alrededor de las venashepáticas. En el segundo tipo (hepati-tis crónica reactiva no específica), lainflamación estaba compuesta por

células plasmáticas y linfocitos en elestroma de las áreas portales, alrede-dor de las venas hepáticas y tambiéndentro de los sinusoides hepáticos(Fig. 1).

La hepatitis reactiva activa cróni-ca no específica fue diagnosticada en3 de los 17 animales del estudio;donde también se detectó colangitisparasitaria. Los cetáceos con severaNRSH (una del tipo crónico y otra deltipo activo) mostraron abundanteinfiltrado inflamatorio de neutrófilos,linfocitos y células plasmáticas en lasáreas portales y los sinusoides hepáti-cos, en estos últimos se observaronacúmulos intravasculares de linfocitosy células plasmáticas (Fig. 1).

Cinco animales con NRSH mos-traron parásitos en conductos biliaresque fueron identificados comoCampula spp.. Estos trematodos pro-ducian un daño severo en los conduc-tos biliares, dando lugar a colangitisfocal supurativa, colangitis necroti-zante severa o una colangitis crónicagranulomatosa. Estos parásitos tam-bién fueron encontrados en los con-ductos pancreáticos de dos de los ani-males examinados con NRSH.

Todos los animales diagnosticadosde NRSH presentaron algún procesoextrahepático pre-existente que podía

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Figura 1. Hígado de delfín mular. Hepatitis reactivas crónicas no específica, infiltrado infla-matorio en el estroma de areas portales (flecha) y sinusoides hepáticos, donde se identifican acu-mulaciones de linfocitos y células plasmáticas (flecha). HE, Bar = 200 µm.


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haber influido en la aparición de lasNSRH (Tabla 2). De esta manera, seobservó una abundante infestación pornasitrema spp en los sacos paranasalesde 3 de los animales con NRSH. Variostipos de neumonía fueron encontradosen los cetáceos de este estudio. Seis deestos casos con grave o leve infestaciónpor parásitos pulmonares (Pseudaliusinflexus y Stenurus minor), mostrandolesiones macroscópicas e histológicas

consistentes con neumonía parasitaria,mientras que otros 2 casos de neumoníarean debidos a una infección bacteriana(Corynebacterium spp. y, Staphylococ-ccus spp.). Otros animales fueron diag-nosticados de gastritis y/o enteritis; en 4animales. la gastritis se debía a unainfestación por el nematodo Anisakissimplex. Otros 2 animales con NRSHpresentaron enteritis de etiología desco-nocida.

No se detectaron antígenos paraMorbillivirus en ninguno de los ani-males del presente estudio. El patrónde inmunoreactividad y la distribuciónde las células inmunomarcadas conanticuerpos CD3, IgG, S-100, lisozi-ma y MHC de Clase II fue muy simi-lar en los nódulos linfáticos humanosy de delfín mular. En los hígados con-trol sólo se aislaron linfocitos T CD3+

y en menor cantidad células plasmáti-cas IgG+ tanto en los espacios portacomo en los sinusoides hepáticos. ElMHC de Clase II fue expresado oca-sionalmente por células dentríticas enlos espacios porta, mientras que lalisozima era expresada por células deKuppfer, monocitos circulantes ymacrófagos aislados dentro de losespacios porta. En las NSRH, el infil-trado inflamatorio estaba compuestopor células plasmáticas y algunos lin-focitos localizados en el parénquimahepático y las áreas portales. En estaslesiones se encontraron pequeños gru-pos de células T CD3+ tanto en los espa-cios porta, como en los sinusoideshepáticos (Figura 2). Algunos macró-fagos en los espacios porta, así comocélulas de Kupffer, y ocasionalmentemonocitos circulantes fueron positi-vos a lisozima. El anti-S100 pAbreaccionó con un número variable delinfocitos en las áreas portales y sinu-soides hepáticos, así como con célulasde Kupffer y células epiteliales de losconductos biliares. Un escaso númerode macrófagos localizado en las áreasportales, asi como de células deKupffer fueron positivos para el MHCde Clase II. La mayoría de las célulasplasmáticas observadas en las áreasportales y los sinusoides hepáticosfueron positivos para IgG (Figura 3).

Los niveles de compuestos orga-noclorados (OCs) en el blubber y elhígado de los delfines mulares se pre-senta en la tabla 3. De todos estoscompuestos, fueron los PCBs los quepresentaban mayor concentración enlos tejidos analizados. En general, seobservo que los niveles de PCB en elhígado eran menores que los encontra-dos en el blubbler. En este último, losniveles oscilaron entre 301 y 33,212

Tabla 3. DDTs y PCBs en blubber (ng g-1

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Tursiops truncatus y grado de NRSH.

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Tabla 2. Diagnóstico de causas extrahepaticas en animales con diferente grado de

NSRH.

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ng/g ww, mientras que en hígado sesituaron entre 373 y 52,374 ng/g ww.Similar composición de derivados dePCB fue identificada en los dos teji-dos, aparentemente con gran contri-bución de hexa y heptaclorobifenilos.Dentro de los pesticidas organoclora-dos, el DDT, estuvo presente enmayor concentración (Tabla 3). Laconcentración de DDTs en el blubberoscilaron entre 147 y 21,050 ng /gww y en el hígado entre 220 y 3171ng/g ww. El p,p´-DDE fue el compo-nente, del grupo del DDT, con mayorconcentración en los dos tejidos ana-lizados.

Discusión

Los cambios hepáticos en la serie decetáceos estudiados fueron similaresa los hallados en un grupo de 14ejemplares de delfín común (15). Deesta manera, la hepatitis reactiva cró-nica no específica fue la lesión hepá-tica más común en este estudio. Estalesión ha sido definida en humanos(11, 13, 27, 28) y perros (9, 32) comouna entidad caracterizada por la pro-liferación de células de Kupffer y lapresencia de granulocitos así comocélulas mononucleares diseminadaspor todo el parénquima hepático y elestroma portal o perivenular, sin ocon minima evidencia de necrosishepática. La causa de este tipo dehepatitis no es bien conocida y se hansugerido diferentes etiologías inclu-yendo endotoxinas debido a sepsis oincremento de la absorción gastroin-testinal, una reacción inmunológicaen el hígado por una enfermedad sis-témica, enfermedades febriles o infla-mación en el lecho visceral (32).

Una variedad de procesos infla-matorios hepáticos y extrahepáticosfue hallado en los animales conNRSH de nuestro estudio. Con fre-cuencia se observaba la acumulaciónde linfocitos y de células plasmáticasintrasinusoidales en aquellos cetáce-os con severa NSRH en asociacióncon parasitosis de los conductos bilia-res, parásitos pulmonares e infesta-ción de sacos paranasales, así como

infecciones bacterianas. Por lo tanto,este hallazgo, probablemente, seaconsecuencia de la persistencia localo sistémica de la estimulación antigé-nica del sistema inmune causada porla infección o la infestación, lo cualha sido descrito en seres humanos(28) y perros (9, 32).

Los anticuerpos anti-CD3, IgG,lisozima y proteína S100 expresaroninmunoreacción en los cortes proce-dentes de nódulos linfáticos de delfín,con un patrón similar a la obtenida enla especie de origen u otras especies(29). Estos resultados sugieren queestos anticuerpos son apropiados paraestudios inmunohistoquímicos entejidos fijados en formol. Esto es deinterés debido a la escasez del núme-ro de anticuerpos de los leucocitosutilizados en tejidos. El estudio inmu-nohistoquímico reveló que la NSRHestaba compuesta principalmente porinfiltración de células plasmáticasIgG+ dentro de los sinusoides y enlos espacios porta, y en menor núme-ro de linfocitos T CD3+ , principal-mente localizados en los espaciosporta. En otras especies, como elperro, la hepatitis crónica reactiva noespecífica está también caracterizadapor un infiltrado linfoplasmocitarioen los espacios portales y sinusoides

hepáticos (9, 32); sin embargo, toda-vía el inmunofenotipo de este infiltra-do no ha sido descrito. La naturalezadel infiltrado inflamatorio observadoen los cetáceos de este estudio sugie-re una respuesta humoral local ya quelas células IgG eran abundantes,mientras que la cantidad variable delinfocitos CD3+ indica una respuestacelular local variable.

La bioacumulación de Ocs entejidos de delfines ha sido descrita endelfines (10, 14, 39), pero las impli-caciones patológicas no están deltodo claras (4, 37). Los niveles dePCB y DDT en el blubber y el hígadose consideraron en el rango mediocon respecto a otras poblaciones dedelfines (7, 35). La concentración dePCB en el blubber de cuatro de nues-tros delfines fue más elevada que laconcentración umbral establecidapara mamíferos marinos (21). En lossiete animales donde se detectaronPCBs, también se observó NSRH.Dos de los animales con mayor seve-ridad de NSRH mostraron mayorconcentración de derivados de PCBs,lo que podría estar relacionado con lapatogenia de este proceso. Las con-centraciones de DDT en algunosmachos adultos analizados en esteestudio puede haber sido peligrosa.

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Figura 2. Hígado de delfín mular. Hepatitis reactivas crónicas no específica, se observan peque-ños grupos de células CD3+ T en espacios porta y sinusoides hepaticos. ABC, Bar = 200 µm.

Así, las concentraciones de DDTs enel hígado de tres machos adultos (TT78, TT 93, C124) fueron más deldoble de la dosis efectiva que produ-ce desórdenes endocrinos en mamífe-ros terrestres (22) y marinos (36).Todos los animales analizados conpesticidas organoclorados mostraronNSRH, pero en éstos últimos laNSRH fue más severa. Lesioneshepáticas similares fueron observa-das en especies salvajes como lososos polares y los zorros árticosexpuestos a contaminantes orgánicospersistentes en su dieta natural (33,34) donde las lesiones más comunesfueron hepatomegalia, esteatosis,leve hiperplasia biliar e infiltraciónvascular de leucocitos.

En conclusión, las hepatitis reac-tivas crónicas no específicas fueronobservadas en animales con desórde-nes extrahepáticos relacionados conprocesos infecciosos o parasitarios ypresencia de contaminantes persis-tentes en el blubber y el hígado. Losdelfines con severa NSRH mostraronlos niveles más elevados de PCBs enhígado. Aunque un efecto directo nopuede ser establecido para cualquierade estas etiologías es razonable pre-sumir que la acción combinada de

estos contaminantes podría afectar ala salud de los animales estudiados.Grupos más amplios de animales debe-rían ser estudiados para saber más sobrelos efectos fisiológicos de estos con-taminantes en mamíferos marinos.

Agradecimientos

Este trabajo fue subvencionado por laConsejeria de Educación, Cultura yDeportes del Gobierno de Canarias(Pi 2005/170). También queremosagradecer a Marisa Mohamad yJamal Jaber por sus comentarios parala realización de este trabajo.

Bibliografía

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Número 8 - �83974:�5:6:�9:�/8��:7�598659:7�3848�96:�9:7 • 47

La torsión del lóbulo pulmonar (TLP)es una patología rara, que pone en peli-gro la vida del paciente y que ha sidodescrita en perros, gatos y humanos(Dye et al., 1998; Venuta et al., 2012).La TLP se define como la rotación deun lóbulo pulmonar en su eje largocomprometiendo a su pedículo bronco-vascular a nivel del hílio. La TLP hasido descrita como de origen espontá-neo (en animales sin historia previa deenfermedad o trauma) o secundaria acondiciones predisponentes. En opi-nión de los autores, se hace necesariorevisar la anatomía funcional y topo-gráfica del tracto respiratorio inferior,para comprender las regiones que pue-den desarrollar esta patología y locali-zar las estructuras comprometidas.

Anatomía y anatomía topográfica

Los pulmones derecho e izquierdo,son los órganos fundamentales delaparato respiratorio, ya que de lafisiología de su parénquima dependeel intercambio gaseoso en sangre.Entre los bronquios principales queresultan de la bifurcación traqueal yel tejido funcional respiratorio (alvé-olos pulmonares) se intercala uncomplejo árbol bronquial (Figura 1),de bronquios de distinto calibre ybronquiolos, gracias al cual se asegu-ra una distribución equitativa del airea los alvéolos y se completan los pro-cesos de humidificación y calenta-miento del aire. Si prescindimos delcorazón y los grandes vasos, y de las

porciones intratorácicas de la traqueay el esófago, los pulmones ocupan lacavidad torácica y se disponen comoórganos semicónicos a uno y otrolado del corazón, desde la aberturacraneal del tórax hasta el diafragma(Figuras 1 y 2).

Lobulación pulmonar

Los pulmones, derecho e izquierdo,de la especie canina presentan unlóbulo craneal y un lóbulo caudal. Ellóbulo craneal del pulmón derecho seencuentra dividido en una porcióncraneal y una porción caudal. Ellóbulo caudal no se encuentra divido,y entre éste y la porción caudal dellóbulo craneal se topografía el lóbulo

Casos clínicos

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medio. También, el pulmón derechodel perro presenta en su cara medialun lóbulo accesorio (Figura 2).

Vascularización pulmonar

Los pulmones presentan dos circuitosvasculares independientes: un circui-to sanguíneo funcional, del quedepende el intercambio gaseoso, yun circuito sanguíneo trófico o nutri-tivo que depende de los vasos bron-quiales. Por el interior del pulmón, lostrayectos vasculares de ambas circu-laciones acompañan al árbol bron-quial (Figura 2), llegando en el cir-cuito funcional a alcanzar las paredesde los alvéolos y deteniéndose a nivelde los bronquiolos en el circuito trófi-co. Íntimamente relacionado con elcircuito trófico discurren las fibrasnerviosas simpáticas y parasimpáti-cas, así como las finas redes de vasoslinfáticos. Debido a la multitud deramas de estos circuitos vasculares ynerviosos, cuya explicación e ilustra-ción serían tan extensas como ocuparotro artículo, remitimos a los lectoresa alguno de los numerosos tratados deanatomía veterinaria con el objeto deobtener un conocimiento pormenori-zado de la vascularización pulmonar.

Etiología

En principio cualquier mecanismoque incremente la movilidad de unlóbulo pulmonar parece favorecer eldesarrollo de la torsión. Esta ideainduce a pensar que las torsionesespontáneas de alguno de los lóbulospulmonares deberían ser poco fre-cuentes, ya que son órganos que ocu-pan casi la totalidad de la cavidadtorácica, sin embargo y como vere-mos en el apartado de discusión,debemos de considerar la torsión deun lóbulo pulmonar en el diagnósticodiferencial de perros con disnea sinpatología respiratoria previa. En pri-mer lugar el colapso parcial del pul-món lo libera de sus relaciones espa-ciales normales con la pared torácica,mediastino y lóbulos pulmonaresadyacentes, que pueden incrementar

la movilidad. Un neumotórax a ten-sión junto a la consecuente atelectasialobular pulmonar, puede facilitar unaumento de la movilidad que predis-pone a la torsión. Los perros de razasgrandes y tórax profundo se afectancon frecuencia y en estos casos seasocia a causas espontáneas y secun-darias, teniendo los animales afecta-dos una edad media de 3,5 años. Enlas razas toy los animales afectadostienen una edad media de 1,7 años(Murphy et al., 2006).

Signos clínicos

En estudios recientes los motivos deconsulta más frecuentes de pacientescon TLP fueron letargia, taquipnea,anorexia, disnea, tos, hematemesis,reducción de los sonidos pulmonares,taquicardia, hipertermia, crepitacio-nes en la auscultación, palidez demucosas, deshidratación, pulso débily vómito (Neath et al., 2000;D´Anjou et al., 2005) (Tabla 1). Laduración de los signos clínicos esvariable y según algunos autorespodría estar relacionado con la tallade los pacientes. En las razas toy lossignos clínicos tienen una duraciónmedia de 3 días (de 1 a 9 días), en lasrazas pequeñas la media se sitúa en3,5 días (1 a 21 días) y en las razasgrandes encontramos una media de(4,5 días (de 2 a 102 días) (Murphy etal., 2006). Los pacientes afectadospor TLP suelen desarrollar neutrofíliacon desviación a la izquierda, mono-citosis, eosinofilia y anemia(D´Anjou et al., 2005; Murphy et al.,2006). En un caso reciente se descri-be en un carlino hembra de 3,5 años,un síncope tusígeno con torsión delóbulo pulmonar en la porción crane-al del lóbulo izquierdo. En este casolos signos clínicos observados fueronúnicamente taquipnea y taquicardiacon síncope tras un episodio de tos(Davies et al., 2011).

Diagnóstico

El diagnóstico de TLP se hace en fun-ción de diferentes hallazgos como son;

disnea, hallazgos radiográficos deefusión pleural y de patrón de consoli-dación lobular pulmonar, sin o conorientación anormal del bronquio enel lóbulo afectado. La ecografía torá-cica y la bronquioscopia aportan mayorfiabilidad al diagnóstico. Otros méto-dos diagnósticos que pueden realizarse

Figura 1. En estas imágenes esquemáti-cas se aprecia la topografía y lobulación pul-monar. a. lóbulo craneal izquierdo con susporciones craneal y caudal, a´. lóbulo crane-al derecho, b. lóbulo caudal izquierdo, b´.lóbulo caudal derecho, c. lóbulo medio, d.corazón, e. diafragma.

Figura 2. En esta imagen esquemática seaprecia la lobulación pulmonar de la especiecanina y se representa su árbol bronquial. a.lóbulo craneal izquierdo con sus porcionescraneal y caudal, a´. lóbulo craneal derecho,b. lóbulo caudal izquierdo, b´. lóbulo caudalderecho, c. lóbulo medio, d. lóbulo accesorio.

Tabla 1.

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son la tomografía axial computeriza-da, la toracoscopia y una broncogra-fía de contraste. Los diagnósticosdiferenciales para la TLP (Tabla 2)serían; neumonía, tromboembolismopulmonar, contusión torácica, neopla-sia, atelectasia, hemotórax, piotórax,quilotórax y hernia diafragmática. Eldiagnóstico definitivo sólo es posiblemediante la inspección visual directamediante el uso de toracoscopia, tora-cotomía o en la necroscopia (Murphyet al., 2006).

Tratamiento

El tratamiento para los perros afecta-dos por TLP siempre debe ser laresección quirúrgica del lóbulo afec-tado. A menos que la TLP sea diag-nosticada con prontitud, la reduc-ción de la torsión y el mantenimientodel lóbulo afectado no se aconsejanpor el elevado riesgo de reperfusiónde toxinas a la circulación sistémica yla iniciación de la cascada de la coa-gulación. Por otra parte, se ha descri-

to la recurrencia de la TLP en casosen los que no se realizó lobectomía.Además, se ha descrito la recurrenciade TLP en un perro de raza carlino.En este caso el lóbulo pulmonar afec-tado en un principio fue el lóbulo cra-neal izquierdo, y tras dos años en losque el perro permaneció clínicamentesano, el paciente fue remitido al vete-rinario por una historia clínica de dis-nea, intolerancia al ejercicio e inape-tencia de 3 días de duración. Tras laexploración clínica y por la sospechade TLP, se procedió a realizar unatoracotomía en el cuarto espaciointercostal derecho confirmándoseuna torsión de 180º del lóbulo crane-al derecho (Spranklin et al., 2003). Elpronóstico para la mayoría de los ani-males afectados de TLP es bueno si eldiagnóstico de realiza con celeridad yla cirugía tiene lugar en pocas horas.

Caso clínico

Se remite al Servicio de Necropsiasde la Facultad de Veterinaria de laUniversidad de Las Palmas de GranCanarias, un perro carlino, macho, dedos meses de edad. La historia clínicamencionaba únicamente disnea sinespecificar la duración, intensidad onaturaleza (inspiratoria o espiratoria)de la misma, y muerte súbita en pocashoras.

Necropsia

Durante la realización de la necropsiay a la apertura de la cavidad torácicase evidenció severo y extenso hemo-tórax (Figura 3). Al retirar el aparatorespiratorio en su totalidad, se pusode manifiesto la torsión de 180º de laporción craneal del lóbulo cranealizquierdo (LCrI) (Figuras 4 a 6). Latorsión afectaba al hilio del LCrIcomprometiendo su vascularización einervación. La porción craneal delLCrI presentaba aumento de tamaño,coloración rojo oscuro y una consis-tencia firme, manifestando la consoli-dación del lóbulo. La lesión que seproduce en estos casos, y que puedediagnosticarse macroscópicamente se

denomina infartación hemorrágica.Esta lesión se produce cuando el riegoarterial a un órgano no se ve interrum-pido (debido a su mayor presión),pero el drenaje venoso (de menor pre-sión) se ve dificultado por una torsión oestrangulación (tal como ocurre en losvólvulos intestinales, intususcepciones,

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Casos clínicos

Figura 3. A la apertura de la cavidad torá-cica se evidenció un moderado hemotórax. Laapertura reglada de la cavidad torácica (hemi-tórax derecho) no permite en primera instan-cia determinar el origen de la hemorragia.

Tabla 2.

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Figura 4. Tráquea y pulmones. Consolida-ción de la porción craneal del lóbulo cranealizquierdo. Este lóbulo presenta unos bordes re-dondeados y un color rojo oscuro en contrastecon el color rosa pálido del resto de lóbulospulmonares.

Figura 5. Se observa con mayor detalle latorsión del pedículo bronco-vascular (Flechas).La superficie pulmonar presenta una marcadadepresión (cabezas de flecha) originada por latensión sobre la pleura visceral.

Figura 6. Al resolver la torsión manual-mente durante la necropsia (flechas), la super-ficie del lóbulo pulmonar presenta una superfi-cie uniforme a diferencia de la figura 5.

torsiones ováricas, etc). El resultadoes que sigue llegando sangre a la zonaafectada y al no evacuarse se produceacumulación de toxinas y se activa lacascada de coagulación. En la cavi-dad abdominal pudo observarse uncolor pálido de la serosa del intestinodelgado y otros órganos. Este colorpálido podría ser indicativo de unshock de tipo distributivo, que tienelugar en casos de torsiones, vólvulos,etc. La causa de la muerte más proba-ble en este paciente sería la del des-arrollo de un distres respiratorioagudo, asociado a un shock hipovolé-mico que produjo falta de riego san-guíneo a órganos vitales. Además, aeste proceso patológico hemos deañadir la acumulación de toxinasdebido al estasis vascular y su poste-rior reabsorción por parte de la circu-lación sistémica.

Discusión

La torsión del lóbulo pulmonar es unaenfermedad rara que puede llegar arepresentar un riesgo vital y que en lamayoría de los casos requiere de larealización de una lobectomía.Aunque se ha descrito en perros detodos los tamaños, aquellos perros derazas grandes y tórax profundo tienenuna especial predilección para des-arrollar esta patología (Gelzer et al.,1997). Por otra parte, los casos des-critos señalan el lóbulo medio delpulmón derecho como el más fre-cuentemente afectado, seguido porlos lóbulos craneales derecho eizquierdo (Gallagher et al., 1993;DÁnjou et al., 2005). En los últimosaños se han descrito varios trabajoscientíficos en los que se ha puesto demanifiesto una especial predilecciónpor los perros de razas toy, especial-mente los pug (carlinos), para des-arrollar torsiones espontáneas delóbulo pulmonar (Rooney et al.,2001; Spranklin et al., 2003;DÁnjou et al., 2005; Murphy et al.,2006; Davis et al., 2011). Los perroscarlinos desarrollan la TLP con unaedad media de 1,5 años, mientras quela edad media para perros de razas de

talla mediana y grande se sitúa en los7 y los 3,5 años respectivamente. Elsexo parece ser un factor predispo-nente puesto que en un estudio retros-pectivo sobre 7 perros de raza carlinoen los que se había desarrollado TLP,6 de los pacientes eran machos(Murphy et al., 2006). Por otra parte,en este estudio también se señala unadiferencia de esta patología respectode la TLP que acontece en perros derazas mayores, ya que mientras enotras razas el lóbulo afectado con másfrecuencia suele ser el lóbulo mediodel pulmón derecho (Gelzer et al.,1997; White et al., 2000; Hofeling etal., 2004; Della Santa et al., 2006, eneste estudio se resalta como en 6 delos pacientes la torsión se desarrollóen el lóbulo craneal izquierdo. Enotro estudio anterior, también se des-cribió el desarrollo de TLP en dosmachos carlinos de 1,5 y 2 años deedad (Rooney et al., 2001). La recu-rrencia de la TLP también ha sidodescrita. En este caso Spranklin et al.,en 2003 proporciona datos sobre eldesarrollo de TLP craneal derecho, enuna perra carlina de 4 años a la que alos 2,5 años se le había realizado unalobectomía por una TLP cranealizquierdo. Se ha sugerido que la pre-dilección para desarrollar una TLPcraneal izquierdo sea una displasiadel cartílago bronquial a nivel delhilio pulmonar (Hoover et al., 1992),pero ninguno de los autores que hansugerido esta hipótesis han encontra-do hallazgos histopatológicos que locorroboren.

En nuestro caso clínico describi-mos una TLP en un perro carlino,macho, de dos meses de edad conuna historia clínica de disnea de dura-ción desconocida y muerte súbita. Elpaciente presentó torsión del lóbulocraneal izquierdo coincidiendo conlos hallazgos de otros autores(DÁnjou et al., 2005; Murphy et al.,2006; Davies et al., 2011). Todos losdatos expuestos corroboran que losperros de raza carlino, y en particularlos animales muy jóvenes están espe-cialmente predispuestos para desarro-llar una TLP.

El pronóstico para los perros conTLP varía en función de la rapidezcon la que se diagnostique esta pato-logía al tiempo que se resuelva ade-cuadamente de manera quirúrgica.Por otra parte, parece evidente que laraza tiene que tenerse en cuenta yaque los perros de raza carlino presen-tan aparentemente un mejor pronósti-co que otras razas de mayor tamaño.

Debido a que en la actualidad, laraza carlino está teniendo un mayoréxito como animal de compañía, esposible que aumente la incidencia deesta patología por lo que los veterina-rios deben de considerar esta patologíaen el diagnóstico diferencial de tras-tornos respiratorios en perros jóvenesde razas toy (Choi et al., 2006).

Conclusión

La TLP es una afección respiratoriarara, espontánea o secundaria a pato-logía respiratoria previa, que afecta aperros y a gatos, con predisposiciónen perros de razas grandes y tóraxprofundo y que acontece de maneraespontánea en perros carlinos. Asímismo cuando esta patología se des-arrolla en los perros carlinos existendiferencias en cuanto al lugar en queasienta la torsión y en su pronóstico.La TLP debe de considerarse siempreen el diagnóstico diferencial deperros carlinos jóvenes que presentenuna sintomatología de disnea, tos yletargia y que no tengan historia clíni-ca previa de patología respiratoria.

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Número 8 - �83974:�5:6:�9:�/8��:7�598659:7�3848�96:�9:7 • 51

Casos clínicos

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La enzima prostaglandina G/H sinteta-sa, también conocida como ciclooxi-genasa (COX), controla la síntesis deprostaglandinas a partir del ácido ara-quidónico. Se reconocen fundamental-mente dos isoformas de esta enzimaque son denominadas COX-1 y COX-2. En la actualidad sabemos que uncierto número de tumores expresanaltos niveles de COX-2, mientras queesto no sucede en los tejidos normalesde los cuales proceden, definiendoeste hecho como una neo-expresión osobre-expresión de esta enzima.Existen sólidas pruebas que sugierenque a nivel celular la COX-2 contribu-ye a la transformación neoplásica, a lacapacidad de invasión de tejidos y aldesarrollo de metástasis, pese a quelos mecanismos exactos por los cualesejerce su acción no están totalmentedilucidados. Estos datos han condicio-nado que la expresión tumoral de laCOX-2 se haya convertido en un áreade intensa investigación. De hecho,recientes trabajos indican que la COX-2 puede usarse como objetivo terapéu-tico en el tratamiento de algunos tiposde tumores en el hombre, perro y gato(Dore 2011).

Se han publicado recientementevarios trabajos sobre la expresióninmunohistoquímica de COX-2 endiferentes tipos tumorales en las espe-cies canina y felina. Entre los tumoresque sobre-expresan o neo-expresanCOX-2 se encuentran los carcinomasde células escamosas, mamarios, decélulas transicionales, melanomas ylos mastocitomas cutáneos caninos(Dore 2011; Prada et al., 2011).

En la actualidad sólo se hademostrado una acción antitumoralde los inhibidores de la COX-2 en loscasos de carcinomas de células transi-

cionales. No obstante, los altos nivelesde expresión observada en otros tipostumorales, hace probable que la mani-pulación farmacológica con inhibido-res de la COX-2 en aquellos casos enlos que se demuestre su sobre-expre-sión, pueda producir algún tipo de res-puesta antitumoral. En todo caso, estahipótesis debe de ser contrastada en ungran número de paciente en los quehaya realizado la detección de estaenzima.

Uno de los métodos empleadospara detectar la presencia de la COX-2 es la técnica inmunohistoquímica.Esta técnica tiene la ventaja de reali-zarse sobre cortes de tejido, proce-dentes de la misma muestra que seremitió al laboratorio de anatomíapatológica para su diagnóstico, por loque no requiere de nuevas tomas demuestra. Además esta técnica permitevisualizar de manera directa en quécélulas ocurre la expresión de la enzi-ma, por lo que puede determinarse siesta ocurre en las células neoplásicaso en células reactivas y/o inflamato-rias (Dore 2011).

Actualmente el Servicio deDiagnóstico AnatomopatológicoVeterinario de la Universidad de LasPalmas de Gran Canaria es el únicoque oferta esta técnica de diagnósti-co, y colabora con diversos centrosveterinarios y con la empresa farma-céutica Merial en el estudio de laexpresión de COX-2 en neoplasiascaninas y felinas.

Esperamos que la petición másgeneralizada, por parte de los oncólo-gos clínicos veterinarios, de esta téc-nica de diagnóstico, permita arrojarluz sobre el verdadero papel de laenzima COX-2 en las neoplasias delos animales de compañía.

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Figura 1. Carcinoma simple túbulo-papi-lar de mama, Grado II. Especie felina.Tinción inmunohistoquímica empleando elanticuerpo anti-COX-2. Sobreexpresión deCOX-2 en células epiteliales neoplásicas deorigen mamario.

Figura 2. Carcinoma de células transi-cionales. Especie canina. Tinción inmunohis-toquímica empleando el anticuerpo anti-COX-2. Obsérvese que el epitelio de transi-ción normal es negativo (esquina superiorderecha), mientras que las células neoplási-cas que invaden la túnica muscular presentansobreexpresión de COX-2.

Número 8 - +/#0-%3='3(3+03=�/=�3-='0/('03-=#/%/+0(3+03- • 53

Los linfomas son un diverso grupo deneoplasias que se originan de célulaslinforeticulares. Con frecuencia sedesarrollan en tejidos linfoides talescomo los ganglios/nódulos linfáticos,bazo y médula ósea, no obstante tam-bién pueden originarse en casi todoslos tejidos del organismo. El linfomaes una de las neoplasias más comunesen el perro. La incidencia anual estima-da es de 13 a 24 casos por cada 100.000pacientes en riesgo (Backgren, 1965;Dorn et al., 1968), mientras que, laincidencia anual para pacientes conmás de 10 años de edad se cifra en 84por cada 100.000 (Dorn et al., 1970).

La clasificación de los linfomasse realiza en base a la localizaciónanatómica, tipos histológicos y a lacaracterización inmunofenotípica.

El protocolo diagnóstico debe derealizarse en base a un meticuloso eimprescindible examen clínico quedebe incluir un estudio hematológico ybioquímico, así como a una evaluacióncitológica (Tabla 1) e histológica de losnódulos linfáticos o de tejidos extrano-dales. De esta manera, el examen mor-fológico de las células que componenel proceso neoformativo es esencial enel diagnóstico del linfoma. Debe detenerse la precaución de evitar el estu-dio de ganglios linfáticos de áreas defácil inflamación como la región man-dibular, siendo de elección los gangliospreescapulares y los poplíteos.También, debe de tenerse en cuentaque las células linfoides son frágiles yque durante la extensión de las prepa-raciones citológicas debe de realizarsela menor presión posible para evitarfragmentar las células de la muestra.

Para un diagnóstico histológicopreciso, se recomienda la extirpación

completa, incluyendo la cápsula, deun ganglio linfático, su fijación enformol tamponado al 10% y su envíoa un laboratorio de AnatomíaPatológica. La disponibilidad de estetejido no sólo resulta esencial para eldiagnóstico del proceso, sino queademás, nos permite sobre las mis-mas secciones de tejido realizar técni-cas inmunohistoquímicas para carac-

terizar inmunofenotípicamente laneoplasia.

Así, la determinación del inmu-nofenotipo del linfoma canino, en lin-foma de células B y células T, hademostrado ser una test diagnósticode utilidad a la hora de emitir un pro-nóstico (Teske et al., 1994, Raskin2010) en este grupo de neoplasias.Los anticuerpos empleados en cada


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Tabla 1. Criterios de evaluación para el estudio de preparaciones citológicas encasos de linfoma.

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Casos clínicos

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caso son, anti-antígenos CD20, CD21,CD79�, para determinar el origen delos tipos B, mientras que los anticuer-pos anti-antígenos CD3, CD4 y CD8,se emplean para identificar las neo-plasias de células T.

De esta manera, se ha descritoque los pacientes caninos con linfo-mas de tipo T, presentan significati-vamente un mayor riesgo de recidivas(52 vs 160 días) y un menor tiempode supervivencia total (153 vs 330días) en comparación con los linfo-mas de células B, tras la instauracióndel tratamiento farmacológico.

En el Servicio de DiagnósticoAnatomopatológico Veterinario de laUniversidad de Las Palmas de GranCanaria, tenemos a disposición de loshospitales y clínicas veterinarias eltest inmunohistoquímico para ladetección de células B (Figura 1) ycélulas T (Figura 2), en los casos enlos que se ha emitido un diagnósticode linfoma. Cuando el oncólogo soli-cita la inmunotipificación del linfo-ma, ésta se realiza sobre el mismotejido que fue remitido al laboratoriopara su diagnóstico histológico.

Como conclusión, hay que enfati-zar la importancia de un diagnóstico

preciso, destacando para ello la ana-tomía patológica, así como la utiliza-

ción de nuevas herramientas convalor pronóstico como la inmunotipi-ficación, que puedan ayudar en latoma de decisiones en relación alpaciente con linfoma.

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Figura 1. Ganglio linfático. Especiecanina. Tinción inmunohistoquímica emple-ando el anticuerpo anti-CD3, que identificacélulas T en la zona parafolicular de un gan-glio linfático normal.

Figura 2. Ganglio linfático. Especiecanina. Tinción inmunohistoquímica emple-ando el anticuerpo anti-CD79�, que identifi-ca células T en los folículos linfoides de unganglio linfático normal.

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La medicina comparada es el estudiocon mentalidad abierta de las enfer-medades comparables en las diferen-tes especies. Esta disciplina fomentael intercambio de conocimientosentre las ciencias básicas y clínicas ylas medicinas humana y veterinaria.Hay que recordar que la determina-ción del papel de diversos virus en laoncogénesis y el extraordinario de-sarrollo de la tecnología reproductivaen la especie humana fueron impulsa-dos inicialmente por estudios en ani-males, sin olvidar la existencia de laszoonosis, enfermedades que se trans-miten entre humanos y animales(Michell, 2000 y 2005).

Rudolf Virchow es considerado elpadre de la patología moderna y juntocon Sir William Osler, padre de lamedicina moderna, fueron grandesdefensores de “Una Medicina”. Esteconcepto une la profesión de médicoy de veterinario. Como hijo de un car-nicero, Virchow notó la conexiónentre las enfermedades humanas yanimales, acuñando el término dezoonosis. A pesar de su prometedorfuturo, el concepto “Una Medicina”necesitó que el epidemiólogo CalvinSchwabe lo redefiniera en 1984. Sebasó en la estrecha relación entrehumanos, animales domésticos y lasalud pública y propuso un enfoqueunificado humano y veterinario de laszoonosis (Cardiff y cols., 2008).

Posteriormente, el concepto de“Salud de los Ecosistemas” extendió“Una Medicina” a todo el ecosis-tema, incluyendo la fauna silvestre,

por lo que el término, con una claraconnotación clínica reflejaba insufi-cientemente las interacciones entre lasalud humana y animal, incluyendo laecología, salud pública y otras dimen-siones sociales (Zinsstag y cols.,2011). Por todo esto “Una Medicina”evolucionó a “Una Salud”, enfatizan-do la importancia de la epidemiologíay la salud pública. Este nuevo con-cepto cambia la percepción de que losanimales son un riesgo para la saludhumana hacia la perspectiva de quelos humanos y animales compartimosriesgos (Rabinowitz y cols., 2008).

La medicina comparada es unaapuesta de futuro real para el conoci-miento en nuestros tiempos. Se tratade una estrategia basada en el trabajomultidisciplinar, cuyos frutos han con-ducido a avances importantes en elconocimiento de múltiples aspectos demuchas enfermedades. Esto ha per-mitido, a su vez, obtener mayor infor-mación sobre la relación causa-efectoexistente en dichas entidades nosoló-gicas, lo que conlleva nuevas solucio-nes terapéuticas y preventivas amuchas patologías, sobre todo a lasque por su carácter crónico y sigilosoresultaban difíciles de estudiar en laspoblaciones humanas (Michell, 2005).

Los modelos de experimentaciónanimal, llevados a cabo predominan-temente con roedores, están empe-zando a mostrar sus limitaciones en elestudio de muchos aspectos de lasenfermedades que afectan a laspoblaciones humanas, debido a lasconsiderables diferencias entre estas

especies, y ello a pesar de los múlti-ples esfuerzos de los investigadorespor mejorarlos (Coleman, 2003). Portanto, hay que apostar por la búsque-da de modelos de experimentación yde estudios observacionales con ani-males alternativos que nos permitancrear un escenario propicio para esta-blecer comparaciones mejores y másfiables entre el desarrollo de la enfer-medad en las poblaciones humanas yanimales (Galibert y cols., 2001).

El crecimiento exponencial delestudio de genomas individuales hademostrado la alta conservación enlas secuencias de los genes entrehumanos y especies domésticas comolos perros. También se ha visto quelas prácticas de crianza de perros depura raza están siendo de mucha uti-lidad a genetistas y a patofisiólogosde enfermedades tales como el cán-cer, diabetes y desórdenes mentales(Argyle, 2005).

Michell (2005) también va másallá, entrando en el desarrollo nove-doso de diagnósticos y terapéutica.Tratamientos contra cánceres induci-dos en roedores que fueron exitososhan resultado fallidos en pacienteshumanos. Sin embargo, se ha demos-trado que el comportamiento del cán-cer en perros es similar al de huma-nos. Consecuentemente, perros contumores desarrollados de forma natu-ral son un objeto de estudio ideal parael estudio de nuevas técnicas diag-nósticas y para probar nuevos medi-camentos anticancerígenos, en unentorno de evaluación pre-clínica en

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un modelo relevante sin la necesidadde utilizar perros de experimentación(con tumores inducidos).

Las principales ventajas que apor-ta la Medicina Comparada al estudiode las enfermedades serían (Michell,2005):

• El control de aquellos factoresdifíciles de controlar cuando seestudian las poblaciones huma-nas, como pueden ser la dieta o laselección genética.

• La mayor presencia de partosmúltiples en determinadas espe-cies animales, además de unmenor espacio de tiempo entregeneraciones, implica una inesti-mable ventaja para el estudio delos factores asociados a las enfer-medades pre y perinatales.

• Una esperanza de vida más corta,así como las diferencias de espe-ranza de vida entre razas de unamisma especie, puede dar infor-mación sobre qué factores estánrelacionados con la evoluciónbiológica de las distintas razas, ycomo se relaciona con la esperan-za de vida.

• Ventajas a la hora de la realizaciónde estudios alométricos, ya queespecies como la canina cuentancon razas cuyos pesos puedenvariar entre 2 y 80 kg dependien-do de la raza y del estado demadurez sexual.

• Mayor acercamiento a la hora derealizar estudios de rendimientodeportivo.

• El estudio de las zoonosis y deaquellas enfermedades que tienenque ver con los ambientes com-partidos por las poblacioneshumanas y animales, como puedeser el caso de la exposición a alér-genos, sustancias tóxicas, etc.

Actualmente, nos enfrentamos aldesafío que implica el estudio de lasenfermedades crónicas y la importan-cia del conocimiento de los factoresque favorecen su aparición. Un ejem-plo de este tipo de enfermedades es,sin duda, la artritis reumatoide huma-na. Las artritis humanas están fre-

cuentemente asociadas con procesosde tipo infeccioso, al contrario de loque ocurre aparentemente con laartritis reumatoide, que se caracterizapor presentarse en forma de poliartri-tis crónica, cuya etiología se desco-noce. La artritis reumatoide tiene unacausa multifactorial. Lo que desenca-dena la enfermedad continúa siendoun misterio, sin embargo, se ha obser-vado que los factores que juegan unpapel importante en la enfermedadson genéticos, medioambientales y laautoinmunidad. La hipótesis másaceptada en la actualidad es que laartritis reumatoide está desencadena-da por la acción de un agente infec-cioso. Se han sugerido como estimu-lantes artritogénicos muchas infec-ciones bacterianas y virales, aunqueel mecanismo de la enfermedad reu-matoide es una reacción antígeno-anticuerpo más que un tipo de enfer-medad infecciosa transmisible. Elfenómeno autoinmune podría expli-carse por una alteración agente-mediada de los antígenos del hospe-dador. Parece que hay consenso enque la acumulación de células infla-matorias, la activación del sistemadel complemento por inmunocomple-jos y la liberación de linfocinas poractivación de células linfoides sonimportantes en la patogénesis de laartritis reumatoide. Una respuestainmune en contra de un antígeno per-sistente podría iniciar y perpetuarestas reacciones. Además, podría serinnecesario que el antígeno persistie-ra en las articulaciones, ya que loscomplejos inmunes podrían ser gene-rados en un lugar distante y luegoatrapados en el cartílago articular(Cole y Ward, 1979).

Cualquiera que sea el mecanismopatogénico involucrado, parece claroque ni los eventos iniciadores ni lossostenedores de la artritis reumatoidehan sido identificados. A pesar delinterés de encontrar una etiologíaviral a la enfermedad, la mayoría desus características se pueden observaren varias artritis animales crónicasinducidas por micoplasmas (OrdenMollicutes) (Cole y Ward, 1979).

Desde que en los años 50 ThomasMcPherson Brown apuntó a los mico-plasmas como causas potenciales deartritis (Brown y Scammell, 1988),algunos autores han implicado a losmicoplasmas como cofactores de lasenfermedades inflamatorias articula-res, especialmente en la artritis reu-matoide. Muchas características de laartritis reumatoide pueden ser obser-vadas en artritis crónicas producidaspor diferentes especies animales(Cole y Ward, 1979). En la Tabla 1 sepuede ver una relación de micoplas-mas y la especie a la que le puedeprovocar artritis.

La mayoría de estos micoplasmastambién causan problemas respirato-rios. Por el contrario, existen especiescuyo principal cuadro lesional afectaa las vías respiratorias y que a su vezpueden exhibir complicaciones arti-culares asociadas (Cole y Ward, 1979).Es conocido que Mycoplasma (M.)pneumoniae, agente productor de laneumonía atípica en humanos (Embreey Embil, 1980), induce secuelas res-piratorias como no respiratorias, inclu-yendo la artritis (Taylor-Robinson,1981). Sin embargo, la proporción deinfecciones respiratorias producidaspor este microorganismo que termi-nan desarrollando artritis es descono-cida.

Mycoplasma arthritidis, M. fer-mentans y M. hominis han sido aisla-dos de articulaciones de pacientescon artritis reumatoide y, alguna vez,de pacientes que no presentaban lamisma enfermedad (Jansson yWagner, 1967; Mårdh y cols., 1973).Sin embargo, la mayoría de los cien-tíficos ha fallado en el aislamiento demicoplasmas a partir de las articula-ciones afectadas por la artritis reuma-toide (Stewart y cols., 1974; Cole yWard, 1979; Taylor-Robinson, 1981).

La habilidad de M. penetrans, M.pneumoniae y M. genitalium de inva-dir células del hospedador y de esta-blecer una residencia durante unacoincubación prolongada sugiere unpapel intracelular más activo para losmicoplasmas del que se había consi-derado previamente (Baseman y

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cols., 1995). Además, durante elcurso de la infección natural produci-da por micoplasmas en humanos, lascélulas B pueden ser activadas de unamanera no-específica, conduciendo auna estimulación policlonal y a laproducción de auto-anticuerpos(Schäffner y cols., 1998).

La presencia de anticuerpos espe-cíficos en el suero o fluido sinovial enpacientes con artritis reumatoide seha utilizado para implicar a los mico-plasmas en la artritis reumatoide.Bartholomew (1967) utilizó un antí-geno polivalente compuesto a partirde cuatro cepas de micoplasmassupuestamente aisladas de pacientesenfermos de artritis reumatoide y dela enfermedad de Reiter, describiendoasimismo, la existencia de anticuer-pos (por la técnica de fijación decomplemento) en los pacientes conartritis reumatoide. Williams yBruckner (1971) encontraron anti-cuerpos frente a M. fermentansmediante la técnica de inhibición delmetabolismo en pacientes con artritisreumatoide, así como Jansson y cola-boradores (1975) encontraron ocasio-nalmente anticuerpos frente a M.arthritidis también en pacientes conartritis reumatoide. En cambio, otrosinvestigadores fallaron en demostraruna única asociación con la artritisreumatoide. Hernández y colaborado-res (1977) sugirieron que la artritis

podía ser una complicación secunda-ria en la infección por M. pneumo-niae, el agente causal de la neumoníaatípica primaria en humanos, mien-tras que Obeck y colaboradores(1976) encontraron que un monoRhesus con poliartritis severa crónicadesarrolló aglutininas y anticuerposfrente a dicho micoplasma; no obs-tante, ningún micoplasma ni otra bac-teria pudo ser aislada de sus articula-ciones.

Hasta ahora uno de los problemasal intentar clasificar la artritis reuma-toide como una enfermedad infeccio-sa era la carencia de evidencia epide-miológica. Con el estudio epidemioló-gico desarrollado por Ramírez y cols.(2005) se intentó determinar si existíaalguna relación entre M. pneumoniaey la artritis reumatoide, mediante unestudio de casos y controles. Para surealización se obtuvo el consenti-miento de los pacientes y la aproba-ción del Comité Ético Local.

Se estudiaron en dicha ocasión 78casos de pacientes con artritis reuma-toide, todos pacientes externos delHospital Insular (Gran Canaria,España) que cumplían los criteriosrevisados por la AmericanRheumatism Association, y se empa-rejaron cada uno con dos controles,sumando un total de 156 controles(para lo que se eligieron personas queno presentaban artritis reumatoide asícomo ninguna otra enfermedadautoinmune). Se compararon,mediante pruebas estadísticas, diver-sas variables entre los dos grupospara intentar identificar diferencias.Las variables estudiadas fueron:edad, género, estado civil, trabajo, sihabían sufrido neumonía y si presen-taban anticuerpos frente a M. pneu-moniae, lo que implicaría un contactoanterior con este microorganismo.

Se demostró la existencia de unaasociación estadísticamente signifi-cativa entre la presencia de una infec-ción previa por M. pneumoniae y laposterior aparición de la artritis reu-matoide (Ramírez y cols., 2005),mientras que Horowitz y cols. (2000)no encontraron diferencias en la pre-

valencia de anticuerpos en suero a M.fermentans entre pacientes con artri-tis reumatoide y los controles sanos.Por otro lado en el trabajo de Ramírezy cols. (2005) no se encontró ningunarelación entre haber padecido un epi-sodio de neumonía y el padecimientode la artritis reumatoide, tal vez debi-do a que la clínica de infección pul-monar puede cursar desde síntomasparecidos a la gripe hasta la neumo-nía patente.

Sin embargo, estos resultados nose pueden traducir en considerar queM. pneumoniae es la causa de la artri-tis reumatoide. El tipo de estudio epi-demiológico realizado (de casos ycontroles) sólo detecta relacionespero no causalidades. Además, nopuede establecerse qué ocurrió pri-mero: si la infección por M. pneumo-niae desencadenó la aparición de laenfermedad o si una persona con laenfermedad está más predispuesta aser infectada con M. pneumoniae(Ramírez y cols., 2005).

¿Por qué se sigue pensando que losmicoplasmas podrían estar involu-crados en el desencadenamiento dela artritis reumatoide?

El fracaso en el aislamiento sistemá-tico de micoplasmas en pacientes conartritis reumatoide puede ser debido,por un lado, a que la acción del siste-ma inmune produce su desaparición,y por otro lado, a la dificultad queentraña su aislamiento debido a sudependencia de nutrientes específi-cos. De igual manera, en las poliartri-tis por Mycoplasma hyosynoviae enla especie porcina, resulta imposibleaislar este microrganismo en las arti-culaciones después de un mes de evo-lución de la enfermedad.

M. pneumoniae posee adhesinas oproteínas que le permiten adherirse alos tejidos humanos. Estas adhesinasestán relacionadas con la patogenici-dad de este microorganismo. Además,la composición de estas proteínas esmuy similar a ciertas estructuras mole-culares existentes en distintos tejidosde mamíferos. Este mimetismo podría

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Tabla 1. Relación de animales y losmicoplasmas que les pueden provocarartritis.

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generar los auto-anticuerpos que seencuentran en la artritis reumatoide(Baseman y Tully, 1997).

Mycoplasma arthritidis (produc-tor de la artritis en roedores) produceun superantígeno que hiperestimulala producción de anticuerpos y desen-cadena enfermedad autoinmune yotras enfermedades inflamatorias.También se ha sugerido que puedeexistir un equivalente a este superan-tígeno en micoplasmas humanos(Cole y Griffith, 1993).

Otra información que apoya lahipótesis de la posible implicación demicoplasmas en el desencadenamien-to de la artritis reumatoide es la utili-zación con éxito de la minociclina,antibiótico perteneciente al grupo delas tetraciclinas, en el tratamiento dela artritis reumatoide, sabiendo quelos micoplasmas son sensibles a lastetraciclinas y que los micoplasmasson la causa más común de artritis enpacientes con inmunodeficiencia pri-maria (O’Dell y cols., 1997).

Por otra parte, cuando se desarro-lló el estudio al que hacemos referen-cia (Ramírez y cols., 2005), no existíael grado de desarrollo de las técnicasbasadas en la reacción en cadena dela polimerasa que existe en la actuali-dad, las cuales nos permiten la detec-ción de ADN bacteriano, incluso unavez que el hospedador ha logradodestruir al agente causal de la enfer-medad. En este sentido, un estudiorelativamente reciente ha logradodetectar la presencia de ADN de M.pneumoniae mediante una técnica dePCR anidada aplicada a muestras delíquido sinovial en 19 de 24 pacientescon artritis reumatoide (79%), en 6 de6 pacientes con artritis no reumatoide(100%) y en 8 de 10 muestras (80%)de pacientes que acudieron a la con-sulta de reumatología con el fin deque le drenaran una articulacióninflamada. Asimismo, se relacionó lapresencia de ADN de M. pneumoniaecon el aumento de la producción delíquido sinovial y con la presencia deartritis recidivante, no habiéndosedetectado ADN de este agente causalen las muestras de líquido sinovial de

pacientes con artritis traumática(Johnson y cols., 2007).

A raíz de los resultados de estetipo de estudios (Johnson y cols.,2007), parece cada vez más lógicopensar que agentes causales como M.pneumoniae y otras especies de mico-plasmas (como M. fermentans o M.salivarium) pueden actuar como fac-tores determinantes en la artritis reu-matoide. Es muy probable que la cro-nificación de una infección causadapor alguna o varias especies de mico-plasmas conduzca a la producción deun proceso sistémico en el que lasarticulaciones puedan convertirse enórganos diana (de ahí la presencia deADN de estos agentes causales en ellíquido sinovial). Asimismo, tambiéncabe la posibilidad de que los mico-plasmas causantes de este procesosistémico y fruto de la convivenciahostil con su hospedador, generen unproceso de tipo autoinmune queincluya la producción de autoanti-cuerpos por parte del hospedador quegeneren un proceso de artritis reuma-toide (Schäffner y cols., 1998; Cole yWard, 1979).

Conclusiones

A pesar de las numerosas investi-gaciones realizadas, todavía se tieneque presentar evidencias convincentesque impliquen a los micoplasmas en laetiología de la artritis reumatoidehumana. Las similitudes entre lasartritis crónicas animales inducidaspor micoplasmas y la artritis reumatoi-de humana justifican que se continúecon la investigación orientada a la bús-queda de una posible etiología común(Cole y Ward, 1979; Brown y Scam-mell, 1988; Ramírez y cols., 2005;Johnson y cols., 2007).

La artritis reumatoide es un granreto para los epidemiólogos y para lamedicina comparada en estos tiem-pos, ya que la profundización en elconocimiento de los factores queinfluyen en el desarrollo de este tipode enfermedades será fundamentalpara diseñar nuevas estrategias de tra-tamiento y prevención basadas en la

actuación sobre la causa de la enfer-medad, a diferencia de las estrategiasde tratamiento existentes en la actua-lidad, que se basan principalmente enpaliar los síntomas de esta enferme-dad crónica.

La investigación de los procesosartríticos en las especies animales quecomparten hábitats con las poblacio-nes humanas y que no están sujetos auna vida ligada a la producción ani-mal, como puede ser el caso de laspoblaciones de perros como animalesde compañía, contribuirán a suminis-trar información de importancia cru-cial sobre los diferentes factores queinfluyen en el desarrollo de este tipode enfermedades, que a su vez, podráser de aplicación en el estudio de laartritis reumatoide en las poblacioneshumanas. En Canarias, la prevalenciamedia anual de artritis reumatoide enla población de mayores de 20 añosde edad es de 2 enfermos cada 10.000habitantes (estando situado hasta lafecha el valor de prevalencia anualentre 1 y 4 enfermos cada 10.000 habi-tantes), según datos de la AsociaciónEspañola de Reumatología.

La medicina comparada podríacontribuir a mejorar la vida de laspersonas y animales que han de con-vivir con el padecimiento de este tipode enfermedades, pero para ello, seránecesaria una mentalidad abierta porparte de los equipos de investigación,pues los agentes causales no entien-den de la fronteras del conocimientohumano. En el caso de los agentesbiológicos infecciosos, éstos sola-mente tratan de sobrevivir basándoseen una convivencia con el hospeda-dor que, en el caso de los enfermos deartritis reumatoide, es sumamentemolesta y dolorosa.

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Introducción

La fiebre Q es una zoonosis que hasido diagnosticada por todo el mundoa excepción de Nueva Zelanda(Hilbink y cols., 1993). Y a pesar deser una enfermedad emergente o ree-mergente en muchos países, ha estadomuy desatendida. Si bien, habría quematizar que el uso de técnicas dediagnóstico más sensibles y unaumento de su vigilancia puede habercolaborado en considerar la enferme-dad como emergente (Arricau-Bouvery y Rodolakis, 2005).

El término de fiebre Q provienedel inglés “Q fever o Query fever” yfue propuesto en 1937 por Edward H.K. Derrick para describir una enfer-medad febril de causa desconocidaque se presentaba en los trabajadoresde un matadero de Australia (Derrick,1937). Intentó sin éxito el aislamien-to del agente causal de la enfermedad,realizando inoculaciones en cobayasa partir de muestras obtenidas de pa-cientes aquejados de la misma. Locontrario ocurrió con Burnet y sucolaborador Freeman que al teñir cor-tes de bazo de cobayas inoculadas,lograron visualizar numerosas formasbacilares que recordaban a las rickett-sias sugiriendo que la enfermedadpodría estar ocasionada por microor-ganismos del género Rickettsia, (Burnety Freeman, 1937). Paralelamente, Davisse encontró con que al alimentarcobayas con garrapatas obtenidas enNine Mile, Montana, alguno de estosanimales experimentaban un cuadrofebril (Davis y Cox, 1938). En 1938,Cox logró replicar este agente en hue-vos embrionados de gallina (Cox yBell, 1939). Finalmente, se llegó a laconclusión de que el agente productorde la fiebre Q y el agente Nine Mile eranel mismo microorganismo (Cox, 1938;Davis y Cox, 1938; Cox y Bell, 1939).

Este agente etiológico recibió ini-cialmente el nombre científico deRickettsia burnetii, para posterior-mente renombrarse como Coxiella

(C.) burnetii en honor a los científicosCox y Burnet por su contribución alconocimiento de la fiebre Q. La cepaNine Mile es su cepa tipo (Skerman ycols., 1980). En la Tabla 1 se muestrala clasificación taxonómica.

C. burnetti ha sido aislada demultitud de especies animales, huma-nos, especies domésticas ganaderascomo rumiantes, cerdos, caballos,conejos, animales de compañía comoperros y gatos, así como de animalessilvestres como ungulados, peces,reptiles y anfibios, además de estarpresente en garrapatas. Desde elpunto de vista de la salud pública hayque resaltar el carácter epidémico dela misma, mientras que en la sanidadanimal se trata de un problema pato-lógico en las explotaciones (Arricau-Bouvery y Rodolakis, 2005).

Características generales ytaxonomía

C. burnetii es una pequeña bacteria,parásito intracelular obligado, nocapsulada, inmóvil y muy pleomórfi-ca. Su aspecto varía entre coco ybacilar, y sus dimensiones oscilanentre 0,4 y 1 micra de largo, y 0,2 y0,4 micras de ancho (Baca y Paretsky,1983; Weiss y Moulder, 1984). Sureplicación se realiza por fisión bina-ria (Baca y Paretsky, 1983).

Actualmente, se considera que C.

burnetii es la única especie incluidaen el género Coxiella. No obstante,Tan y Owens (2000) aislaron, de can-grejos de río que presentaban una altamortalidad, microorganismos cuyogen 16S ARNr tiene un 95,6% desimilitud con C. burnetii. Decidieronnombrarla C. cheraxi, aunque esta

nomenclatura tiene que ser todavíavalidada. De igual forma Woc-Colburny cols. (2008) detectaron microorga-nismos del Género Coxiella en lorosde cabeza azul con signos clínicos ydespués de analizar los resultadoscreen que se trata de una nueva espe-cie.

Por otro lado, se ha detectado lapresencia de microorganismos sim-biontes en garrapatas, cuya secuenciadel gen 16S del ARNr está tambiénmuy relacionada con la de C. burne-

tii. Más específicamente se trata deendosimbiontes, simbiontes que tie-nen una asociación con sus hospeda-dores tan íntima que se considera quees beneficiosa para ambos. Estosmicroorganismos que se transmitentransováricamente se han encontradoen la mayoría de las garrapatas (Noday cols., 1997). Noda y cols. (1997)consideraron a estas coxiellas unaforma de C. burnetii que evolucionóa endosimbionte en garrapatas. Estepaso se lleva a cabo, entre otrascosas, mediante la reducción de sugenoma (Gil y cols., 2004).

El ciclo de vida de C. burnetii noestá completamente caracterizado,pero tiene varios participantes distin-tos que varían tanto morfológica comofisiológicamente (Seshadri y Samuel,2001), similar a lo que ocurre en laFamilia Chlamydiae (Hackstadt yWilliams, 1981). Éstas serían lasvariantes celulares grandes (LCV) ylas pequeñas (SCV), considerándoseestas últimas una especie de endospo-ra (Weiss y Moulder, 1984). Tambiénse ha descrito una tercera varianteconocida como la variante celularpequeña y densa (SDC) (McCaul ycols., 1981). Las mencionadas formasde C. burnetii se corresponden a dife-rentes fases de desarrollo de esta bac-teria durante su ciclo intracelular(McCaul y cols., 1991). A las SCVs y

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las SDCs se les considera como lasformas de resistencia tanto dentro delhospedador como en el medio externo(Amano y Williams, 1984).

Además, C. burnetii sufre varia-ción de una fase similar a la variaciónlisa/rugosa de algunas bacterias Gramnegativas (Weiss y Moulder, 1984).En la naturaleza y en los animales delaboratorio, C. burnetii existe mayo-ritariamente con un fenotipo denomi-nado fase I. La fase II es una formarelativamente avirulenta que se puedeobtener en pureza tras repetidos pasesde los microorganismos por huevosembrionados o cultivo celular. Estavariación está relacionada con cam-bios en la capa de lipopolisacáridos(LPS) (Woldehiwet, 2004).

C. burnetii ha desarrollado unaestrategia única que le permite lamultiplicación y supervivencia en losfagolisosomas de las células hospeda-doras eucariotas, cuyo medio internoes ácido, con pH entre 4,7 y 5,2 (Se-shadri y Samuel, 2001). Normalmen-te se encuentran en fagocitos, siendolas células hospedadoras más usualeslos macrófagos (Tissot-Dupont yRaoult, 2008). Tras su entrada en lacélula hospedadora, C. burnetii resul-ta capturada por los fagosomas, loscuales se unen rápidamente a los liso-somas, formando fagolisosomas, quese unen rápidamente entre ellos. Estafusión progresiva de los fagolisoso-mas conduce a la formación de unagran y única vacuola en el interior dela célula hospedadora (Hackstadt yWilliams, 1981).

Ciclos de la enfermedad

La enfermedad presenta dos ciclos,un ciclo doméstico donde el contagioes de animal a animal y otro ciclo, elsalvaje, donde están involucradoshospedadores de la fauna silvestre yla intervención de las garrapatascomo vectores es esencial. Aunqueambos ciclos están bien diferencia-dos, pueden estar interrelacionados.Así, cuando existe un estrecho contac-to con animales infectados o en zonasde alta contaminación ambiental se

produce la infección humana(Arricau-Bouvery y Rodolakis,2005).

Vías de infección

La ruta aerógena ha sido descrita tra-dicionalmente como la vía de trans-misión más frecuente en la especiehumana. Cuando la infección tienelugar por esta vía, se supone que lasprimeras células en ser infectadasdurante la fase aguda de la enferme-dad son los macrófagos alveolares(Maurin y Raoult, 1999; Arricau-Bouvery y Rodolakis, 2005). Lascélulas hepáticas de Kupffer son tam-bién susceptibles de ser parasitadaspor vía sanguínea, especulándose quela fuente de infección de estas célulaspodría provenir de la vía digestiva(La Scola y cols., 1997). Sin embar-go, se considera que la vía oral en elconsumo de leche contaminada o susderivados no es tan importante(Arricau-Bouvery y Rodolakis,2005).

Fiebre Q humana

La fiebre Q en humanos se describiópor primera vez en la década de los30 del siglo pasado. Se considera fun-damentalmente una enfermedad ocu-pacional, afectando a personas rela-cionadas con el ganado como ganade-ros, veterinarios, trabajadores demataderos, personal de laboratorio…El periodo de incubación de la fiebreQ aguda varía entre 1 y 3 semanas,dependiendo de la dosis infectante ala que haya estado expuesto elpaciente. En la mayoría de los casos(60%), la enfermedad en su faseaguda resulta ser inaparente o bienpresenta una sintomatología inespecí-fica. Esto conduce a que la fiebre Qsea una enfermedad de difícil diag-nóstico clínico y que probablemente,estemos ante una enfermedad infra-diagnosticada (Marrie, 1990b).

El 20% de los casos agudos pue-den requerir de medicación y/u hospi-talización. La mayoría de los pacien-tes infectados muestran una fase de

bacteriemia que normalmente se haceperceptible en las fases tardías delperiodo de incubación. La enferme-dad podría producir neumonía ohepatitis. En cualquier caso e inde-pendientemente de la ruta de infec-ción, la presencia de C. burnetii en lasangre puede involucrar a otros órga-nos tales como el hígado, el bazo, lospulmones, la médula ósea o el tractogenital femenino. Es más, se puedenpresentar determinadas complicacio-nes que pueden amenazar la vida delos pacientes entre las que se incluyenla meningoencefalitis, la miocarditiso la pericarditis (Stein y Raoult, 1998).

En pacientes con valvulopatíaprevia (Raoult y cols., 1990), y enmenor medida, en mujeres embaraza-das (Stein y Raoult, 1998) y en pacien-tes inmunocomprometidos (Raoult ycols., 1993), la fiebre Q puede croni-ficarse y convertirse en una enferme-dad de curso fatal para el paciente,presentando alrededor de un 15% demortalidad. De este modo, la fiebre Qcrónica se define como aquel procesoprovocado por la infección de C. bur-

netii que se extiende en el tiempo másde seis meses y que se caracteriza porla presencia de IgA e IgG contra antí-genos de la fase I (Peacock y cols.,1983).

Fiebre Q en rumiantes

Los animales que se infectan demanera natural con C. burnetii nosuelen experimentar síntomas clíni-cos relacionados con la enfermedad.En la fase aguda de la infección, lapresencia de fiebre Q puede serdemostrada mediante diferentes téc-nicas diagnósticas a partir de mues-tras de sangre, pulmón, bazo e híga-do. Aún así, la mayoría de los anima-les suelen mantenerse asintomáticos,sin mostrar siquiera un cuadro febril.A menudo, la infección por C. burne-

tii en estos animales se cronifica y secaracteriza por una excreción conti-nua de la bacteria en heces y orina,con lo que estos animales se conviertenen portadores excretores del agentecausal que, además, se caracterizan por

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ser portadores inaparentes. El útero ylas glándulas mamarias son los prin-cipales órganos diana en la infeccióncrónica por C. burnetii en estos ani-males, siendo esta cualidad de lainfección en los animales favorecedo-ra de la dispersión de C. burnetii en elmedioambiente durante y tras lasépocas de parto. Las secreciones departo y postparto y las placentas pre-sentan una alta contaminación porparte de esta bacteria.

Sin duda, entre las lesiones causa-das por la fiebre Q entre los rumian-tes, las de más impacto en la sanidadde las explotaciones, y por tanto, lasque provocan las mayores pérdidaseconómicas, son las relacionadas conel aparato reproductor. En rumiantesdomésticos se ha descrito metritis,que se traduce en disminuciones delos índices de fertilidad, abortos,nacimientos prematuros acompaña-dos de aumentos en la mortalidadneonatal y perinatal (Arricau-Bouveryy Rodolakis, 2005).

El comportamiento de la enfer-medad es distinto según las especies,en el ganado vacuno produce princi-palmente infertilidad mientras que enel ovino y caprino es el aborto. Losabortos son más frecuentes en elganado ovino que en el caprino, pre-sentando los fetos una apariencia nor-mal, mientras que las placentas deanimales con un grado de infecciónconsiderable muestran un engrosa-miento de las áreas intercotiledona-rias acompañado de exudados copio-sos, de aspecto cremoso, de coloramarillento o marrón decolorado(Masala y cols., 2007).

En el caso concreto del ganadocaprino, se ha observado que la infec-ción por C. burnetii produce cuadrosde aborto en el último tercio de lagestación. Pero a diferencia con laoveja, especie en la que el aborto es laprincipal manifestación clínica de lainfección, en la cabra cobra másimportancia relativa el nacimientoprematuro y el nacimiento a términode crías débiles, lo que se traduce enun aumento de la mortalidad neonataly perinatal (Berri y cols., 2007).

Diagnóstico clínico

Existen estudios que relacionan a lafiebre Q con la producción de fiebre,debilidad, anorexia, rinitis, conjunti-vitis, bronconeumonía, pérdida depeso, artritis y mamitis, además dehaberse observado el nacimiento deanimales débiles que sobreviven alparto, con anemia, ataxia, emaciacióny parálisis. En el caso concreto delganado ovino, en hembras preñadasinfectadas en el segundo y tercer ter-cio de gestación, los primeros signosclínicos se detectan entre los 5 y 12días tras la infección, apareciendo enprimer lugar un proceso febril bifási-co (Barlow y cols., 2007). A una perraparturienta, fuente de infección en unbrote de neumonía por fiebre Q envarios miembros de una familia queestaban presentes en el parto del ani-mal, se observó que una parte de loscachorros murieron poco después denacer, muriendo el resto de cachorrosantes de las 24 horas postparto(Buhariwalla y cols., 1996). Sin duda,los signos clínicos observados en losrumiantes domésticos, al margen dela consabida importancia de estaenfermedad en los índices reproducti-vos de estos animales, deben tenerrepercusiones considerables en laproductividad de los animales afecta-dos, no cuantificadas aún. Estos sínto-mas, además, son asociables en dife-rentes tipos de cuadros cuya repercu-sión en la sanidad y producción animalhan sido ampliamente estudiados,como es el caso de las neumonías, lasmamitis subclínicas y las artritis(Buxadé y cols., 1996).

Diagnóstico anatomopatológico

C. burnetii cuenta con una serie deórganos diana. La detección de dichoagente causal a partir de muestras detejidos de dichos órganos es posiblegracias a técnicas inmunológicas. Lastécnicas existentes serían la inmuno-peroxidasa (Brouqui y cols., 1994), elsistema de captura de antígenomediante ELISA/ELIFA (Thiele ycols., 1992) y la inmunofluorescencia

a partir de anticuerpos monoclonales opoliclonales, siendo aplicable esta últi-ma técnica únicamente en las muestrastratadas con parafina (McCaul yWilliams, 1990; Thiele y cols., 1992;Muhlemann y cols., 1995). Estas téc-nicas son utilizadas rutinariamente enmedicina humana con el fin de anali-zar los tejidos de las válvulas cardia-cas en los pacientes de fiebre Q cróni-ca, una vez estas han sido extraídas delpaciente (Maurin y Raoult, 1999).

En medicina veterinaria, la prin-cipal aplicación de estas técnicas enanimales vivos ha sido el análisis deplacentas y, en menor medida, el deórganos diana en los fetos tras losabortos, ya que la Coxiella sueleafectar de manera más importante a laplacenta que al feto (Masala y cols.,2007; Sánchez y cols., 2007).

Diagnóstico mediante cultivo deCoxiella burnetii

Esta técnica diagnóstica se utiliza máscomo una herramienta para poderreplicar a esta bacteria para posterio-res pruebas laboratoriales o ensayosexperimentales que como técnica ruti-naria de diagnóstico. Además, dado elfuerte riesgo de contagio para el hom-bre, el cultivo de C. burnetii precisade ser llevado a cabo en instalacionesque cumplan las exigencias contem-pladas para el Grupo de Contención 3(Manual de la OIE sobre animalesterrestres, 2008). Cuando en el exa-men microscópico de las muestras sedetecta un bajo nivel de contamina-ción por otras bacterias y un númeroimportante de células de C. burnetii,es posible el aislamiento directo porinoculación de huevos de gallinaembrionados o de cultivos celulares.El proceso dura entre 10 y 15 días ypueden ser necesarios varios pasespara llegar a obtener un cultivo purode C. burnetii (Ho y cols., 1995).

En el caso de muestras muy con-taminadas con otras bacterias (placen-tas, descargas vaginales, heces, leche,etc.) puede ser necesario recurrir pre-viamente al cultivo celular, a la inocu-lación en animales de experimentación.

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En este sentido, los animales másapropiados son los ratones y, preferi-blemente debido a la facilidad con laque detectan los síntomas tras la ino-culación, las cobayas (Scott y cols.,1987).

Diagnóstico serológico

En medicina humana, las técnicasserológicas en conjunción con loshallazgos clínicos, han sido amplia-mente utilizadas para confirmar eldiagnóstico rutinario de la fiebre Q. Aello ha contribuido su sencillez, asícomo su sensibilidad y especificidad.Por otra parte, estas técnicas permitendiferenciar la enfermedad aguda de lacrónica. Eso sí, es necesario esperarun mínimo de dos o tres semanas des-pués de la infección para poder detec-tar la fase aguda de la enfermedad,produciéndose el pico máximo deproducción de anticuerpos contra C.

burnetii en torno al mes y medio trasla infección (Maurin y Raoult, 1999).

Aunque en medicina veterinaria,la serología también ha sido amplia-mente utilizada en estudios sobrediferentes poblaciones animales conel fin de establecer las tasas de sero-prevalencia de las mismas, su aplica-ción rutinaria orientada al diagnósticoindividual de la enfermedad puederesultar compleja. La ausencia de sig-nos clínicos en muchas ocasionesunido a que los animales infectadospueden permanecer seropositivosdurante varios años tras la infecciónaguda, o pueden eliminar la bacteriaal medio antes de desarrollar anti-cuerpos, o también pueden ser infec-tados sin expresar seroconversión,contribuye a la citada complejidaddel diagnóstico serológico individualen los animales. Para interpretar losresultados en las poblaciones se pre-cisan al menos de 10 animales (aborta-dos o no), precisándose para estable-cer la presencia de infección, tanto larespuesta serológica cómo la evidenciade la existencia de C. burnetii

mediante cultivo o técnicas como laPCR (Arricau-Bouvery y cols., 2001;Berri y cols., 2001).

Las técnicas más utilizadas hoyen día son: la fijación del comple-mento (FC) (Guigno y cols., 1992), lainmunofluorescencia indirecta (IFI)(Tissot-Dupont y cols, 1994), y elmétodo del enzimoinmunoensayo(ELISA) (Waag y cols., 1995).

Otras técnicas serológicas propues-tas para el diagnóstico de la fiebre Qincluyen el “dot inmunoblotting” (Cow-ley y cols., 1992), el “Western blotting”(Blondeau y cols., 1990), el test de lahemólisis indirecta (Tokarevich ycols., 1990) y el radioinmunoensayo(Doller y Gerth, 1984).

Diagnóstico mediante la reac-ción en cadena de la polime-rasa (PCR)

El diagnóstico de la fiebre Q median-te PCR ha sido utilizado con éxitotanto en la medicina humana como enla veterinaria para la detección de C.

burnetii en cultivos y en muestrasprocedentes de tejidos diana, leche,secreciones vaginales, semen, orina yheces (Maurin y Raoult, 1999;Rodolakis y cols., 2007; Vaidya ycols., 2008). Este método ha sido pro-bado directamente sobre muestras desangre humana, pero los resultadosno han sido satisfactorios para lasPCR convencionales, siendo frecuen-tes los falsos positivos (Maurin yRaoult, 1999). Las técnicas nuevas dePCR a tiempo real parecen habersolucionado este problema, convir-tiendo a este tipo de técnicas en unmedio de detección precoz, siendo muyeficaz antes de los 17 días tras la infec-ción. Es capaz de detectar la enferme-dad en el periodo de tiempo en el queno se puede detectar una respuestainmune por medio de técnicas seroló-gicas. Por otra parte, la PCR detectaC. burnetii en cultivos en viales debioseguridad de muestras de sangrede pacientes de fiebre Q aguda y cróni-ca que ya habían iniciado su tratamien-to antibiótico, mientras que el cultivode C. burnetii por sí solo, no permitela detección de la bacteria en este tipode pacientes que ya han iniciado sumedicación (Musso y Raoult, 1995).

Se han desarrollado cebadoresespecíficos a partir de la secuencia dediversos genes como el gen de lasuperóxido dismutasa (conocido tam-bién como sodB), el gen com1 quecodifica una proteína de 27 kDa de lamembrana, el operón que codificados proteínas de choque térmico(htpA y htpB), el gen que codifica laisocitrato deshidrogenasa (icd) y elgen IS1111, el cual codifica para unatransposasa, siendo éste último elmás usado para la detección de C.

burnetii mediante PCR (Spyridaki ycols., 2002; Vaidya y cols., 2008).También se han desarrollado PCRsbasadas en la amplificación de regio-nes de genes presentes en otras bacte-rias para la detección de C. burnetii.Un ejemplo de este tipo de genes es el16s ARNr (Spyridaki y cols., 2002).

De las PCR convencionales desti-nadas al diagnóstico de la fiebre Q, lade mayor éxito ha sido la Trans-PCR,basada en la amplificación de regio-nes específicas del gen IS1111. Estetransposón se encuentra en un núme-ro variable de copias (entre 7 y 110)según el análisis de este gen en dife-rentes aislamientos de C. burnetii

realizados en distintas regiones delmundo (Klee y cols., 2006). La pre-sencia de copias múltiples del gen enel genoma de C. burnetii logra que laamplificación de sus regiones especí-ficas en una sola etapa sea mayor quela lograda para otras PCRs basadas enla amplificación de regiones específi-cas de un único gen, con lo que lasensibilidad de la prueba se ve consi-derablemente aumentada.

Vacunas

En materia de Medicina Preventiva,existen publicaciones sobre el diseñoy prueba de diferentes tipos de vacunasde aplicación en animales desde fina-les de la década de los 80, diseñándo-se también con posterioridad vacunasde aplicación en medicina humana(Williams y cols., 1993). Las pérdidaseconómicas provocadas por la fiebre Qentre profesionales de riesgo (gana-deros y trabajadores de matadero)

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han sido evaluadas en Australia, lle-vando a las autoridades sanitarias deeste país a la puesta en marcha de unplan de prevención basado en lavacunación contra la enfermedad enestos colectivos de riesgo desde elaño 2002, con resultados positivosespectaculares (Gidding y cols.,2009). Otro ejemplo de resultadossatisfactorios tras la instauración, estavez, de un plan de control integral dela fiebre Q, con medidas de preven-ción aplicadas al campo de la SanidadAnimal, lo tenemos en el plan de con-trol de la fiebre Q llevado a cabo enEslovaquia (Serbezov y cols., 1999).

España y fiebre Q

En España, la primera evidencia que setuvo de la existencia de la fiebre Q fueel aislamiento de C. burnetii a partir detres especies diferentes de garrapatas(Hyalomma marginatum, Rhipicepha-

lus bursa y Rhipicephalus sanguineus)recogidas de animales de Sevilla yMadrid en el año 1949 (Pérez Gallardoy cols., 1949), siendo diagnosticadapor primera vez en la especie humanaen el año 1950 en Salamanca (Prada ycols., 1950). Desde entonces, ha sidodetectada en múltiples regiones denuestro país, si bien, quizás donde hahabido una mayor continuidad en lalabor investigadora sobre esta enfer-medad ha sido en el País Vasco, dondela fiebre Q es endémica y cuya presen-tación clínica aguda más frecuente enhumana es la neumónica (Téllez ycols., 1988; Sanzo y cols., 1993).

En Canarias, se tenía conocimien-to de la presencia de fiebre Q desde

los años 70, tras el estudio de unaserie de casos de fiebre Q de ciudada-nos finlandeses que habían contraídola enfermedad durante su estancia enel Archipiélago Canario y en otroslugares donde la enfermedad eraendémica (Palosuo y cols., 1974). Elprimer estudio seroepidemiológicosobre fiebre Q humana en Canarias serealizó en Lanzarote en el año 1986utilizando la fijación del complemen-to (FC) (Pascual, 1994), siendo el pri-mero de una serie de tres estudiosrealizados en esta isla entre 1986 y1991. En el último estudio de estaserie se detectó una seroprevalenciaen la especie humana del 10,9%mediante FC y del 18,7% medianteinmunofluorescencia indirecta (IFI).Además, verificó en una muestrarepresentativa de la ganadería decaprino de la isla (principal produc-ción de rumiantes de la región), queel 32,7% de las ganaderías analizadasfueron positivas por IFI (Pascual,1994).

Trece años después, se publicó elprimer estudio epidemiológico de fie-bre Q humana en la totalidad delArchipiélago Canario, también reali-zado mediante IFI y arrojó una sero-prevalencia de entre el 21,5% al35,8% (Bolaños y cols., 2004). Eneste año, otro estudio serológicobasado en la aplicación del ELISA enel que se estudiaba una muestrarepresentativa de los ganados capri-no, ovino y bovino de la isla de GranCanaria, arrojó unos valores de sero-prevalencia de 60,4%, 31,7% y12,2% respectivamente para las men-cionadas especies (Rodríguez y cols.,2010). Asimismo, en Canarias se hanpublicado varias revisiones de casosde fiebre Q clínica en la especiehumana, de entre las cuales, destacala que se realizó sobre la poblacióndel sureste de Gran Canaria (Bolañosy cols, 2003).

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Tabla 1. Clasificación taxonómicaactual de C. burnetii.

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La pioderma es una de las enfermeda-des más comunes de la piel en perros(WAEL, M.K et al., 2011). La pioder-ma literalmente significa presencia depus en la piel y puede ser causado porprocesos infecciosos, inflamatoriosy/o causas neoplásicas; incluso algu-nos acúmulos de exudado neutrofíli-co pueden llamarse piodermas. Sinembargo, la pioderma debida a infec-ción bacteriana de la pieles la máscomún. Las piodermas son comunesen perros y menos en gatos (LEIB yMONROE, 1997; FRANK et al., 2003;LOEFFLER, 2005; MORRIS, 2010).

Las piodermas se clasifican segúnla profundidad de la infección en(IHRKE, 1996;LEIB y MONROE,1997):

1. Piodermas de superficie: pioder-mas que se restringen a la superfi-cie de la piel, y no se extiendemás profundo del estrato córneo odentro del folículo del pelo.

2. Pioderma superficial: infeccionesque incluyen el folículo del pelopero no se extienden dentro de ladermis.

3. Piodermas profundas: son infec-ciones que se extienden dentro dela dermis.

Las pseudopiodermas no son real-mente piodermas, ya que la infecciónsolo juega un papel secundario, esdecir, que estamos ante un procesoinflamatorio de la epidermis en los quesolo existe un crecimiento de gérme-nes sobre ésta, pero sin infección ypor tanto, la terapia antiinfecciosa noes efectiva (BENSIGNOR, 2009).

Una pioderma resistente es aque-lla que no responde a un determinadonúmero de tratamientos habituales,particularmente antibióticos y, enconsecuencia, necesita un tratamientoagresivo que incluye antibióticos

específicos (FOGEL y MANZUC,2009).

Se debe sospechar de pioderma si elpaciente tiene una historia de prurito,especialmente si el prurito tiene res-puesta previa a la terapia antimicro-biana. La presencia de pápulas, pústu-las y collaretes epidérmicos debe crearun alto indicio de sospecha de pioder-ma (CARLOTTI, 1996; LEIB y MON-ROE, 1997; SCOTT et al., 2001). Ob -viamente, hay que llevar a cabo un apro-piado diagnóstico diferencial teniendoen cuenta que otras enfermedades de lapiel pueden manifestarse con la presen-tación de pústulas aunque no tengan unorigen bacteriano (ej., dermatofitosis,pénfigo foliáceo, dermatitis pustulareosinofílica). Además hay que consi-derar que muchas enfermedades de la pielcursan con infecciones secundarias, loque nos obliga a realizar un diagnósticoexacto (FOGEL y MANZUC, 2009).

Causas bacterianas de la pio-derma canina

La superficie de la piel en animales yhumanos está colonizada por bacteriasque están bien adaptadas al microen-torno del estrato superficial córneo yfolículos pilosos (LLOYD, 1992). Deesta manera, la flora normal contribu-ye a la inmunidad de la piel.

Las bacterias del género estafilo-cocos viven como miembros de la floranormal de la piel y las mucosas dehumanos y animales (SCOTT, et al.,2001; LEE et al., 2003).

Sin embargo, muchas especiesson también patógenos oportunistasque pueden causar serias enfermeda-des de la piel y en otros tejidos delcuerpo y cavidades (KLOOS, 1975;SCOTT et al., 2001).

Aunque, en la actualidad a los esta-filococos coagulasas negativos se les

esté prestando una mayor atención asu importancia médica, (KLOOS,1994), son las especies coagulasaspositivas las que desde siempre se lesha dado una consideración importan-te como patógenos en medicina vete-rinaria. Durante muchos años, cuatroespecies coagulasas positivas hansido reconocidas y documentadas comopatógenas: Staphylococcus aureus, S.intermedius, S. hyicus y S. schleiferi(WERCKENTHIN et al., 2001;FRANK et al., 2003). Considerandoque S. aureus es el patógeno predo-minante de humanos, mientras que S.intermedius y S. schleiferi son patóge-nos predominantes del perro (KLUYT-MANS et al., 1998; HERNÁNDEZ etal., 2001; FRANK et al., 2003; MAYERet al., 2005).

Staphylococcus intermedius, esuna bacteria gram positiva coagulasapositiva reconocida como una especiediferente de Staphylococcus aureusdesde los años ochenta. Está conside-rada el agente infeccioso más comúnen las piodermas caninas. Sin embar-go, la nomenclatura ha ido cambian-do debido a recientes avances en lacaracterización molecular. El grupo delos Staphylococcus intermedius inclu-yen 3 especies generalmente diferen-tes: Staphylococcus intermedius ais-lado de palomas, Staphylococcuspseudointermedius que es el verdade-ro patógeno canino, y Staphylococcusdelphini originalmente aislado deldelfín (DEVRIESE et al., 2005).

Los Staphylococcus intermediusse adhieren a las células epidérmicasde perros sanos, pero muestra unamayor capacidad de adhesión a lascélulas epidérmicas de los perros ató-picos (McEWAN, 2000; SIMOU etal., 2005; McEWAN et al., 2006). Estose produce porque cambia la disponi-bilidad de la fijación de los receptores

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cutáneos para los estafilococosy faci-lita la adhesión de la bacteria (WAELy HUSEIN, 2011).

Actualmente, se siguen conside-rando como patógenos aislados de laslesiones de piodermas caninas:Staphylococcus aureus, S. schleiferi(subsp. Schleiferi, coagulasa negativoy subsp. Coagulans, coagulasa positi-vo) y S. hyicus (SAIJONMAA-KOU-LUMIES, 1996).

Entre las bacterias que residen deforma normal en la piel del perro tam-bién se encuentran los estafilococoscoagulasa negativos, Streptococcus,Micrococcus spp, y Acinebacter spp.

Las bacterias transitorias de la pielcanina incluyen: Baccillus spp,Corynebacerium spp, EscherichiaColi, Proteus mirabilis y Pseudomonaaeruginosa (PATEL, 2006).

Pseudomona aeruginosa es unpatógeno frecuente en perros con oti-tis crónica externa y otitis media(HARRIS, 1978; GOODWIN et al.,1978; COLE et al., 1998), pero es infre-cuente aislarlo de infecciones de piel.(KRISTENSEN et al., 1978; KROGHet al., 1981; SCOTT et al., 2001; SEOLet al., 2002). Estos organismos suelenaislarse de la piel de perros con pio-dermas profundas crónicas donde típi-camente se asocian con infeccionescausadas por otros agentes tales comoS. intermedius y Escherichia Coli(SCOTT et al., 2001). El aislamientoúnico de Pseudomona aeruginosa delesiones de pioderma es muy raro ylos autores solo tienen constancia deun caso descrito en la literatura(DONE, 1974). No obstante, recien-temente se ha publicado un trabajo(HILLER, 2006) en donde se analiza-ron los patrones de presentación clí-nicos e histopatológicos de 20 perroscon pioderma afectados únicamentepor Pseudomona aeruginosa.

Manifestaciones clínicas de lapioderma

1. Pioderma superficial

En este caso la infección abarca laepidermis y sus anexos, no alterando

las membranas basales. En consecuen-cia, las bacterias se desarrollan en elinterior de los estratos epidérmicos oen el folículo piloso. A estos lugaresllegan también células inflamatoriasy es frecuente observar pústulas, ycuando éstas se rompen, se formancostras y collaretes epidérmicos(FOGEL y MANZUC, 2009). Cuandola pioderma se desarrolla en el estra-to córneo, puede separar a este últimode los estratos más profundos, comoocurre en los márgenes de algunoscollaretes epidérmicos, que crecencentrífugamente a causa de esta situa-ción. A esto se lo denomina piodermadisecante (FOGEL y MANZUC, 2009).

Existen varios tipos dentro de estegrupo:

• Pioderma de los pliegues de lapiel (Intertrigo) (FOURRIER etal., 1986; IHRKE, 1996;LEIB yMONROE, 1997): Estas lesionesson vistas en defectos anatómicosdonde hay una importante coloni-zación bacteriana: labios, cara,vulva, abdomen caudal, plieguesgruesos, pliegues mamarios y porobesidad. La dermatosis es locali-zada con eritema, exudación,supuración y mal olor.

• Impétigo:- Impétigo juvenil: aparecen pús-

tulas subcorneales con costrasen la zona ventral del cuerpo(FOURRIER, et al., 1986;IHRKE, 1996; LEIB y MON-ROE, 1997): Esta enfermedades auto limitante. Se desarrollaen animales jóvenes de 16 sema-nas de vida. El StaphylococcusPseudointermedius es el agen-te etiológico principal (NES-BITT y ACKERMAN, 1998).

- Impétigo adulto: pústulas gran-des (bullas) por todo el cuerpo.Esta enfermedad es en ocasio-nes severa, y puede provocarpostración. En general el impé-tigo en perros adultos suele sersecundario a una enfermedad debase como hiperadrenocorticis-mo, terapia con corticoides, omúltiples traumas, por ejemplo,durante cacerías (FOURRIER,

et al., 1986; IHRKE, 1996; LEIBy MONROE, 1997). Se hanpodido aislar de estas lesionesbullosas, Bacterias GramNegativas (Pseudomona, E.Coli y Enterobacter) así comoS. intermedius (NESBITT yACKERMAN, 1998).

• Foliculitis:- La Foliculitis bacteriana super-

ficial es la forma más comúnde pioderma. Hay una ampliavariación en la historia y sig-nos clínicos asociados con laenfermedad. El agente patóge-no principalmente asociado afoliculitis es S. pseudointerme-dius (NESBITT y ACKER-MAN, 1998).

- Foliculitis juvenil: se presentacon numerosas pústulas folicu-lares en la parte ventral delabdomen. La afección a menu-do se cura en la pubertad, aun-que algunos casos podría deber-se a una alergia temprana, y dehecho, tratarse de una foliculi-tis secundaria (FOURRIER, etal., 1986).

- Foliculitis de los perros de pelocorto: hay pústulas folicularesgeneralizadas, collaretes epidér-micos y costras, pelos mordi-dos (“pelaje apolillado”). Estaenfermedad está presente enrazas de pelo corto. El pruritodesaparece cuando la lesiónse cura. Puede ser recurrente(FOURRIER, et al., 1986;IHRKE, 1996;LEIB y MON-ROE, 1997).

- Foliculitis secundaria: es unaenfermedad muy común carac-terizada por pústulas folicula-res, collaretes epidérmicos ycostras que pueden aparecer de

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manera generalizada. El pruritopermanece después de curadaslas lesiones en los casos queexiste una dermatosis pruríticade base. La enfermedad tambiénpuede generar prurito en derma-tosis no pruríticas. (En tal casoel prurito desaparece cuando lalesión se cura). La foliculitis se-cundaria puede ser recurrentesi la causa de base no se trata(FOURRIER et al., 1986).

• Hipersensibilidad bacteriana y/opioderma de extensión superficial:es una enfermedad poco comúnbasado en una triada clínica: pús-tulas eritematosas foliculares, pla-cas seborreicas y bullas hemorrá-gicas. A veces hay un severo prurito.La existencia de una alergia real abacterias es presumible y debati-ble (FOURRIER, et al., 1986). Enla pioderma de extensión superfi-cial, las áreas de alopecia y eritema-tosas se expanden centrífugamen-te y aparecen también collaretesepidérmicos y costras. Estas lesio-nes están frecuentemente asocia-das a pústulas foliculares intactasy transitorias. Estas entidades sona menudo recurrentes (FOURRIER,et al., 1986; IHRKE, 1996; LEIBy MONROE, 1997).

• Foliculitis profunda: es la llamada“dermatitis acral de lamido”, queen la mayoría de los casos se carac-teriza por ser una infección folicu-lar bacteriana profunda, a menudoacompañada de hidroadenitis retró-grada. Se debe buscar una causaalérgica o psicógena después deinstaurar un tratamiento antiinfec-cioso (FOURRIER, et al., 1986).

• Foliculitis piotraumática: algunoscasos de foliculitis (ej. En labrador

retriever) aparecen placas exuda-tivas que producen dolor. Estánrodeadas de pústulas foliculares oforúnculos lo que puede ayudar adiferenciar de la clásica dermati-tis piotraumática. Esta enferme-dad puede ser secundaria a enfer-medades alérgicas de la piel y lle-gar a ser recurrentes (FOURRIER,et al., 1986; IHRKE, 1996; LEIBy MONROE, 1997).

2. Pioderma profunda

Las piodermas profundas son menoscomunes que las piodermas superfi-ciales pero son más complicadas decontrolar. Existen diversos factoresque predisponen a la pioderma pro-funda. A menudo son el resultado deuna foliculitis superficial preexisten-te. En otras ocasiones se debe ademodicosis, endocrinopatías, enfer-medades metabólicas, deficienciasinmunes, alergias y traumas. Lostraumas con penetración de la dermispredisponen a la entrada de bacterias(NESBITT y ACKERMAN, 1998;FOGEL y MANZUC, 2009).

• Forunculosis (FOURRIER, etal.,1986):- Acné, pápulasy pústulas se

aprecian en la cara, particular-mente en la zona del mentón.La enfermedad tiene más inci-dencia en perros jóvenes.

- Forunculosis secundaria: pús-tulas localizadas o generaliza-das. Se asocia a foliculitis yestá provocada o agravada poruna terapia excesiva por ejem-plo, con glucocorticoides.

- Pioderma nasal: pústulas y cos-tras están presentes sobre elpuente de la nariz y párpados. La

causa es desconocida. Puedenquedar cicatrices severas. Estaverdadera pioderma nasal bacte-riana debe diferenciarse de laforunculosis estéril eosinofílicaposiblemente debida a picadurasde artrópodos y no originada poruna infección bacteriana.

• Celulitis (FOURRIER, et al., 1986;IHRKE, 1996; LEIB y MONROE,1997):* Celulitis localizada:- Pioderma de los puntos de pre-

sión: hay lesiones necróticas enlos codos, la grupa, metatarso,zonas laterales de los dedos. Sedebe a un trauma continuado porapoyo en perros de gran peso.

- Otras celulitis localizadas:Hay otras lesiones necrotizan-tes que aparecen en otras loca-lizaciones como, por ejemplo,región perianal. La causa no seconoce bien y, algunas veces,son secundarios a forunculosis.

* Celulitis generalizada (FOU-RRIER, et al. 1986; IHRKE,1996; LEIB y MONROE, 1997):

- Piodemodicosis: se trata deuna enfermedad necrotizanteextensa de la piel, que essecundaria a una demodicosisgeneralizada por un estado deposible inmunodeficiencia.

- Otras: lesiones necrotizantesextensas y frecuentemente se-cundarias a inmunodeficienciassubyacentes.

* Complejo pioderma interdigital(FOURRIER, et al., 1986;IHRKE, 1996; LEIB y MON-ROE, 1997): En la pododerma-titis no infecciosas (no hay pio-derma) se caracteriza por eritema,edema, heridas exudativas yalopecia. Hay numerosas causasde pododermatitis incluyendoaumento de la flora superficial

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bacteriana, bacterias exógenasy/o dermatitis por sobrecreci-miento de Malassezia spp. Seencuentran las mismas lesionesen la pododermatitis que en lapioderma interdigital junto conotras como forunculosis, ulce-ración, fístulas y necrosis (celu-litis). La pioderma interdigitalcon frecuencia es secundaria apododermatitis debida a otrascausas. Puede llegar a ser cró-nica si la causa subyacente nose identifica y se trata.

3. Pseudo-pioderma

• Dermatitis piotraumática:La dermatitis piotraumática (“hotspot”, dermatitis húmeda aguda) noes una verdadera pioderma pero sonlesiones auto-infligidas con excesi-vo crecimiento bacteriano en susuperficie. Las lesiones típicas tie-nen una presentación aguda y secaracterizan por tener alopecia, eri-tema, supuración, prurito y /o dolor.Estas lesiones están comúnmenteasociadas a enfermedades pruríticasde la piel (alergia a pulgas, otitis,saculitis, etc) aunque se entiendenpoco su etiología. Se suele producirla curación espontánea en unos días(NESBITT y ACKERMAN, 1998).

• Piodermas juveniles:- Piodermajuvenil de cachorros

recién nacidos: lesiones costro-sas presentes en la cara, tórax yárea dorso-lumbar. Éstas sedeben a causas traumáticas. Nose requiere tratamiento ya quela cura es espontánea (FOU-RRIER, et al., 1986).

- Celulitis juvenil: la etiologíade esta enfermedad es desco-

nocida. El cuadro típico clínicoes edema facial y forunculosiscon fístulas, costras y otitisexterna supurativa. También,adenopatías y abscesos estéri-les pueden estar presentes. Laaparición de esta enfermedadpoco común ocurre antes delos 4 meses de edad, en uno ovarios cachorros de una cama-da. Hay curación espontánea enpocas semanas dejando cicatri-ces como secuela. Sin embargo,a veces se requiere de terapiainmunosupresora sistémica, yun control de las infeccionessecundarias es beneficioso(FOURRIER, et al., 1986;IHRKE, 1996;LEIB y MON-ROE, 1997).

Diagnóstico de la pioderma: clí-nico y laboratorial

El diagnóstico de la pioderma caninaestá basado en la historia clínica, exa-men físico y exámenes complementa-rios. Existen varias pruebas que puedenusarse para confirmar el diagnósticoclínico de la pioderma (BENSIGNOR,2009):

A. Citología dérmica

La citología es la prueba más rápidapara evaluar la presencia de piodermao el crecimiento bacteriano excesivo.Los casos verdaderos de piodermadeberían demostrar bacterias intrace-lulares con la citología, por lo generaldentro de neutrófilos. Cuando laslesiones se hacen más crónicas y másprofundas, se pueden identificar célu-las mononucleares y macrófagos. Lapresencia de células plasmáticas y

fibroblastos sugieren una estimula-ción antigénica crónica o la cicatriza-ción. Más de dos bacterias por campode aceite de inmersión son sugestivasde crecimiento bacteriano excesivo.Un número anormal de bacterias esmás típico de citologías de naturalezacrónica (IHRKE, 1996; KWOCHKA,1993).

Características de las citologías:• Intertrigo: el examen citológico

de los frotis cutáneos o las prue-bas con cinta adhesiva revelanimágenes de colonización bacte-riana, con bacterias muy numero-sas, a menudo agrupadas en raci-mos sobre corneocitos. Es raroobservar imágenes de invasiónbacteriana (polimorfonuclearesdegenerados que han fagocitadobacterias) (BENSIGNOR, 2009;FOGEL y MANZUC, 2009).

• Pioderma mucocutánea: el exa-men citológico puede ofrecerimágenes de colonización bacte-riana, pero es poco patognomóni-co (BENSIGNOR, 2009; FOGELy MANZUC, 2009).

• Impétigo del perro joven: el exa-men citológico de las lesionespustulosas, después de pincharcuidadosamente la cúpula de unapústula, permite observar abun-dantes microorganismos asocia-dos a polimorfonucleares neutró-filos degenerados. Abundan lasimágenes de fagocitosis, que indi-can una invasión bacteriana(BENSIGNOR, 2009; FOGEL yMANZUC, 2009).

• Impétigo del perro adulto: el exa-men citológico revela numerosasimágenes de fagocitosis y microor-ganismos, que indican una invasiónbacteriana (BENSIGNOR, 2009;FOGEL y MANZUC, 2009).

• Foliculitis: el examen citológico delas pústulas intactas, cuidadosa-mente pinchadas, permite visuali-zar abundantes polimorfonuclearesdegenerados que han fagocitadobacterias (BENSIGNOR, 2009;FOGEL y MANZUC, 2009).

• Forunculosis localizada: es funda-mental realizar frotis cutáneos

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para examen citológico. En estasinfecciones profundas son raras lasimágenes de fagocitosis de cocos,caracterizadas por una inflamaciónpiogranulomatosa rica en polimor-fonucleares y macrófagos (BEN-SIGNOR, 2009; FOGEL y MAN-ZUC, 2009).

• Forunculosis piotraumática: amenudo el examen citológico esdecepcionante, aunque muestraimágenes de colonización bacte-riana por cocos (BENSIGNOR,2009; FOGEL y MANZUC, 2009).

• Forunculosis generalizadas: pre-sencia de polimorfonucleares dege-nerados, macrófagos y bacterias(BENSIGNOR, 2009; FOGEL yMANZUC, 2009).

• Celulitis localizada: el examen cito-lógico es bastante útil, pues per-mite identificar polimorfonuclea-res, macrófagos y bacterias. Sinembargo, no siempre es fácil iden-tificar imágenes de fagocitosis(BENSIGNOR, 2009; FOGEL yMANZUC, 2009).

• Dermatitis piotraumática: el exa-men citológico es poco útil, ya queapenas muestra imágenes de colo-nización bacteriana inespecíficas(BENSIGNOR, 2009; FOGEL yMANZUC, 2009).

• Forunculosis eosinofílica: abundan-tes polimorfonucleares eosinófi-los y ausencia de microorganis-mos (BENSIGNOR, 2009; FOGELy MANZUC, 2009).

B. Histopatología

El estudio histopatológico es pocoutilizado para el diagnóstico de lapioderma, en la mayoría de las oca-siones las bacterias no se observan enel estudio de la biopsia, pero el mode-lo de inflamación y los tipos de célu-las pueden ser útiles para el diagnós-tico. La presencia de bacterias es másfrecuente en las capas superficiales.La principal ventaja de la biopsia esque nos sirve para dar pistas sobre laenfermedad subyacente que origina lapioderma. Siempre se deben tomarvarias muestras y éstas deben referir-

se a un servicio de dermopatología(IHRKE, 1996; KWOCHKA, 1993).

C. Bacteriología

En presencia de piodermas profundas(celulitis, pioderma interdigital pro-funda, etc). Conviene realizar estoscultivos para tipificar correctamentela flora responsable. En casos de pio-dermas superficiales, son muy pocoutilizados, ya que no brindan infor-mación útil para la terapéutica, porlos siguientes motivos (FOGEL yMANZUC, 2009).

La bacteria principalmente impli-cada en la génesis de las piodermas esStaphylococcus Pseudointermedius.Siendo menos habituales las piodermaspor gram negativos. S. Pseudointer-medius es muy sensible a los antibió-ticos típicos para gram positivoscomo Cefalexina, Lincomicina o En-rofloxacina, y más del 99% de laspiodermas responden bien a estosantibióticos (FOGEL y MANZUC,2009).

Muchos antibióticos potencial-mente útiles no tienen buen resultadoen la piel por tener poca difusión,mala actividad en exudado purulentoo carecer de actividad intracelular(lugar donde permanece vivo Staphy-lococcus Pseudointermedius) (FOGELy MANZUC, 2009).

La sensibilidad in vitro de deter-minados antibióticos no siemprecoincide con la sensibilidad in vivo,por consiguiente, muchas bacteriassensibles a algunos antibióticos en ellaboratorio, no lo son en el organismo(FOGEL y MANZUC, 2009).

El germen aislado en un cultivode piel puede no ser la causa de lapioderma o no estar involucrado en elcuadro (FOGEL y MANZUC, 2009).

Se recomienda realizar cultivosen los casos de piodermas profundasgeneralizadas crónicas, en toda pio-derma recidivante crónica que ha sidotratada con varios antibióticos y enlas otitis bacterianas crónicas (FOGELy MANZUC, 2009).

Resultados de sensibilidad yresistencia antibiótica

Antibióticos sistémicos útiles para eltratamiento de la pioderma canina:

Los antibióticos más usados parael tratamiento de la pioderma caninaestán incluidos en la siguiente tabla.Todos ellos tienen una buena difusióncutánea debido a su liposolubilidad yse pueden administrar oralmente loque facilita la medicación a largoplazo (facilita la administración). Sontodos bactericidas excepto los macró-lidos que son bacteriostáticos (CAR-LOTTI, 1996; BENSIGNOR, 2009).

Las cepas MRSP (MeticillinResistente Staphylococcus Pseudointer-medius) expresan resistencia a otraclase de antibióticos como losMacrólidos, Tetraciclinas, Aminoglu-cósidos y Fluoroquinolonas (MORRISet al., 2006; JONES et al., 2007).Particularmente, la resistencia a lasFluoroquinolonas (Enrofloxacina, Mar-bofloxacina) es alrededor del 55%.(INTORRE et al., 2007). En un estu-dio, las tasas de MRSP y MRSS(Meticillin Resistente Staphyloco-ccus Schleiferei) aisladas de pioder-mas y otitis fueron del 17 y 40% res-pectivamente (MRSA 35% en infec-ciones profundas). Los antibióticosorales que ejercieron un efecto másseguro frente a MRSP fueron Clo-ranfenicol y Trimetoprin-sulfa. MRSSmostró buenos ratios de susceptibili-dad a toda clase de antimicrobianosexcepto a Fluoroquinolonas (MORRISet al., 2006).

Las Tetraciclinas tienen muy bajaactividad contra estafilococos. Sinembargo, la Minocilina puede usarseen caso de pioderma debida aStaphylococcus spp. meticilin- resis-tente a dosis de 15 mg/kg BID(KAWAKAMI et al., 2010).

Los Aminoglicósidos tienen unabaja difusión cutánea al ser hidroso-lubles, pero además presentan el pro-blema de ser tóxicos (elevado poten-cial nefrotóxico) (NOLI, 2011).

La Rifampicina es un antibióticoefectivo frente a estafilococos pero,como todavía se utiliza para tratar la


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tuberculosis en humanos, y sobretodo porque su uso en medicina vete-rinaria tiene una gran tasa de resisten-cias, debería usarse excepcionalmen-te y realmente cuando no exista otraposibilidad terapéutica. Además,debería asociarse a betalactámicospara minimizar el riesgo de apariciónde cepas resistentes de estafilococos(CARLOTTI et al., 1997; DECRIS-TOPHORIS el al., 2011).

La Novobiocina: este antibióticoestá disponible en algunos países paratratar la enfermedad de vías respirato-rias altas agudas o crónicas en anima-les combinados con Tetraciclinas. Sinembargo, no hay estudios clínicos quehayan demostrado su efectividad enla pioderma canina. (FULHAM et al.,2011).

Para aquellos casos con pioder-mas recurrentes debidas a una derma-tosis subyacente incurable y frecuente-mente de origen alérgico, que requierande tratamiento intermitente antibióti-co para el control de las erupciones, seplantea la pregunta de si sería aconse-jable este tipo de terapias. En un estu-dio controlado doble ciego placebo,perros alérgicos con piodermas recu-rrentes se trataron con Cefalexina a ladosis estándar o placebo durante 3días a la semana para prevenir recidi-vas. Estas fueron más frecuentes en elgrupo placebo. Los perros afectadoscon alergia alimentaria tenían menosrecaídas debido a la facilidad de con-trolar la causa subyacente. Pero lomás relevante es que no aparecieronresistencias a estafilococos en esteestudio. (GUAGUÉRE et al., 2003).

• Antibióticos tópicos útiles para eltratamiento de la pioderma canina:- La Mupirocina y el Ácido

Fusídico son los tratamientostópicos para mascotas másefectivos frente a estafiloco-cos, (SCOTT et al., 2001)debido a su alta actividadsobre los estafilococos coagu-lasa- positivo, incluyendo cepasresistentes a Meticilina de Sta-phylococcus pseudointerme-dius que son de particular im-portancia.

- La Mupirocina penetra bien enla piel y es bien tolerada.Muestra alta eficacia in vitrosobre estafilococos suscepti-bles y resistentes a Meticilinasen perros sanos y perros conpiodermas (FULHAM et al.,2011). Aunque, no hay estudiosclínicos publicados en perroscon pioderma, en un estudioabierto sobre acné felino se havisto que la Mupirocina esefectiva (WHITE et al., 1997).En la actualidad, hay una ten-dencia entre veterinarios der-matólogos de no usar antibióti-cos de uso humano debido aldesarrollo de resistencias.

- El Ácido Fúsidico en cremaestá disponible para uso veteri-nario, el producto está registra-do en Europa. Se sabe que

Staphylococcus Pseudointer-medius se puede eliminar de lapiel y mucosas de perros sanoscon un tratamiento tópico abase de Ácido Fusídico (SAI-JONMAA et al., 1998). Nohay publicados estudios sobreesta formulación, sin embargo,es ampliamente utilizado endermatología veterinaria aun-que se necesitan datos clínicos.El Ácido Fusídico podría seruna buena alternativa al trata-miento sistémico en los casosde pioderma canina localizada,sin embargo, se observa unaresistencia significativamentemás elevada en cepas de S.pseudointermedius meticilin-resistentes comparando concepas meticilin-susceptibles,de ahí la importancia una vez

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Tabla 1.

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más de realizar antibiogramas(MEUCCI et al., 2010).

Piodermas producidas poragentes meticilin resistentes

Desde el inicio del uso de terapias anti-microbianas en la práctica de la me-dicina, los estafilococos han desarro-llado respuesta de resistencias contralos antibióticos. Recientemente, se haencontrado un número significativo deespecies de estafilococos que infectana humanos y animales domésticos conun cierto grado de resistencia a losantimicrobianos (WERCKENTHIN etal., 2001; VANDENESCH et al., 2003).

En medicina humana, la resisten-cia ejercida por los S. aureus metilre-sistentes ha contribuido al desarrollode resistencias a múltiples drogas desdecomienzo de siglo (BARBER et al.,1961). La Meticilina y la Oxacilinason miembros de una clase de antimi-crobianos conocidos como penicilinassemisintéticas, resistentes a las peni-cilinasas. La Oxacilina y la Meticilinase emplean en laboratorios para lostests de detección de sensibilidadbacteriana toda esta clase de antibió-ticos (CHAMBEERS et al., 1997).

Las penicilinas semisintéticas sedesarrollaron para combatir a los esta-filococos resistentes a las penicilinasde primera generación, actuando sobrela producción bacteriana de la enzimapenicilinasa. La enzima penicilinasa esuna enzima elaborada por los estafilo-cocos capaces de hidrolizar e inactivara las penicilinas. Aunque, la clasesemisintética sea resistente a las peni-cilinasas, ésta tiene una susceptibilidadadquirida a la proteína fijadora de peni-cilina, conocida como PBP2a o PBP2.La PBP del estafilococo está codifica-da por el gen mec A, que confiere unaresistencia intrínseca a todos los anti-bióticos beta-lactámicos y sus deriva-dos (BERGER-BACH et al., 2002).

La resistencia de muchos estafilo-cocos meticilin resistentes a S. aureus(MRSA) ejercida sobreAminoglucósidos, Fluoroquinolonas,Macrólidos, Ácido Fúsidico yMupirocina es también común, aun-

que por mecanismos que difieren dePBP. (BERGER-BACH et al., 2002;DESHPANDE et al., 2002).

Los S. aureus Meticilin Resistentes(MRSA) pueden transmitirse dentro delos hospitales y por contacto ocasionaldentro de la comunidad (SAIID-SALIM et al.,2003; FEY et al., 2003;ROBERTS et al., 2005). Debido a laproblemática de las infecciones porMRSA en poblaciones humanas, lasinfecciones en animales domésticosestán recibiendo una especial atenciónen los últimos tiempos en la literaturacientífica. La posibilidad de zoonosisinversa y la creación de animalesreservorios que puedan reinfectar per-sonas es un tema de especial preocu-pación (SCOTT et al., 1988; CEFAI etal., 1994; SEGUIN et al., 1999;MANIAN et al., 2003;VAN DUIJKE-REN et al., 2004; GUARDABASSI etal., 2004; WEESE et al., 2005;O´MAHONEY et al., 2005; LOEF-FLER et al., 2005).

Por otro lado, las metil resisten-cias ejercidas por Staphylococcusintermedius (MRSI) y S. schleiferi(MRSS) en veterinaria han sidomenos estudiadas (GORTEL et al.,1999; PATEL et al., 1999; GUAR-DABASSI et al., 2004;KANIA et al.,2004; MAY et al., 2005).

La pioderma bacteriana y otitisson extremadamente común enperros, y las infecciones por estafilo-cocos son usualmente tratadas empí-ricamente con Beta-lactámicos,Macrólidos, o Sulfonamidas (parapiodermas) o uso tópico deAminoglucósidos, Fluoroquinolonaso Ácido Fusídico (para otitis exter-nas) (HILLet al., 1994; WHITE etal., 1996; IHRKE et al., 1999).

Recientemente se han publicadodiversos trabajos sobre Staphylococ-cus intermedius meticilin resistentes(MRSI) tanto en Estados Unidoscomo en Europa (MORRIS et al.,2003-04; LOEFFLER et al., 2007).Estos estudios han aislado cepas resis-tentes de la piel y conducto auricular.En los Estados Unidos también se hanconseguido aislar cepas resistentes deS. schleiferi(MRSS) en estas mismas

zonas (MORRIS et al., 2003-04). Estaresistencia se debe al gen mec A(BEMIS et al., 2006). La resistenciaantibiótica múltiple puede llegar a serun verdadero desafío en tales casos.Esto es probablemente la causa de lamayoría de las piodermas resistentes.Se sabe que existen además, otros fac-tores de riesgo asociados a la resisten-cia antimicrobiana en casos de pioder-mas canina producida por estafiloco-cos (BEMIS et al., 2006).

El seguimiento de las resistenciasantimicrobianas en bacterias aisladasen veterinaria es muy importante, yaque el aumento de la resistencia enanimales puede llevar a conducir alfracaso de los tratamientos individua-les de pacientes y supone un riesgo dezoonosis para el propietario. (GUAR-DABASSI et al., 2004; MANIAN etal., 2003). Además, el aumento de lasresistencias a antimicrobianos, que sonde vital importancia en los tratamien-tos de medicina humana, debe valorar-se su uso veterinario y si es necesarioaplicar restricciones (MANIAN et al.,2003; WHO et al., 2005).

Por otro lado, el aumento de cepasmec A positivas de S. intermedius(MRSI), resistentes a todos los agen-tes antimicrobianos avalados y conlicencia como terapia sistémica en eltratamiento de pioderma canina y feli-na u otitis suponen un importantísimoproblema (LOEFFLER et al., 2007).

Rara veces, se puede presentaruna pioderma profunda severa debidaa Pseudomona aeruginosa. Algunascepas de esta bacteria pueden originaruna grave presentación clínica y lasmultiresistencias constituyen un retoterapéutico (HILLIER et al., 2006).

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Número 8 - .0*/+1�-1,1.1�)0�(1/�-0,-1/�*0+0.,1.1/ • 79

La globalización, la sanidad animaly la salud pública.

La integración económica avanza entodo el mundo a ritmos agigantados.La globalización ha logrado ingentesbeneficios a muchos países y ciuda-danos, fruto de las relaciones comer-ciales entre las denominadas econo-mías abiertas (23). Aunque no existeuna definición universalmente conve-nida de globalización, los economis-tas emplean comúnmente el términopara referirse a la integración interna-cional de los mercados de productosbásicos, capitales y trabajo (3).Dentro del capítulo de los productosbásicos toman una posición notablelos animales vivos y los productos deorigen animal, al ser estos una impor-tante fuente de aminoácidos, vitami-nas y minerales a nivel nutricional, ala par que una notable fuente de sub-productos destinados a otras indus-trias no alimentarias (22). La deman-

da internacional de estos productos seha visto incrementada en las últimasdécadas, valiéndose del desarrolloparalelo de nuevas iniciativas innova-doras en materia de transporte ylogística comercial, siendo posible enla actualidad transportar animalesvivos y productos de origen animalde un extremo a otro del planeta enapenas días (36). En este sentido cabedestacar que los agentes patógenos noentienden de fronteras físicas, sinotan solo de reservorios y hospedado-res. Estos productos proceden de paí-ses terceros con sistemas de produc-ción intensivistas distintos a los euro-peos, y por ende productos que ofre-cen distintas garantías sanitarias. Laintroducción de enfermedades anima-les en un territorio libre de la mismapuede traer consigo consecuenciasdrásticas en la cabaña ganadera delpaís importador, con una repercusiónindirecta sobre los indicadoresmacroeconómicos ganaderos, o lo

que es peor, directa, en casos en queel agente patógeno sea capaz de atra-vesar la barrera interespecie produ-ciendo las tan temidas zoonosis(18,45). Según datos de la Organiza-ción Mundial de la Sanidad Animal,el 60 % de los patógenos humanosson de naturaleza zoonótica, así comoel 75 % de las enfermedades emer-gentes. Es por ello, que el país impor-tador debe de establecer unas medi-das de control exhaustivas que otor-gue a las partidas animales importa-das garantías para el binomio de lasanidad animal y la salud pública(46). A esta ecuación, debemos añadiruna nueva variable, los consumido-res. Los europeos demandamos pro-ductos agroalimentarios no solo decalidad sino también seguros. La ali-mentación, ha sufrido un proceso detransformación partiendo desde unamera necesidad fisiológica, hastaalcanzar las cotas más altas de unproceso social, económico y cultural,

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que se sustenta en la seguridad ali-mentaria como pilar fundamental.Con la visión integrada de la granja ala mesa, los más de 500 millones deeuropeos nos abastecemos de produc-tos no solo procedentes del mercadoúnico comunitario, sino también delos más de 200 países terceros con losque comercializa la Unión, gracias algigante de la globalización (4, 7).

El comercio internacional deanimales y sus productos: prin-cipios y acuerdos sanitarios.

Según la Oficina Estadística de laUnión Europea (Eurostat) (20), en elaño 2010 la Unión de los 27 importó79,3 millones de toneladas de anima-les y productos de origen animal.Dentro de las importaciones de car-nes y sus preparados, Brasil fue elpaís de origen principal con casi lamitad del total (45,8 %). Una propor-ción relativamente elevada de carnede bóvidos de las importaciones delos 27 procede de América del Sur.Dentro de los pequeños rumiantes, lacarne de cordero es la principalimportada, siendo su origen NuevaZelanda y Australia. Respecto a lascarnes de aves, destacan en númerolas importaciones de origen brasileñoy Tailandés (Gráfica 1). En esemismo año, el mayor suministradorde productos de la pesca fue Noruegacon un 21 %, seguido de China conun 10,8 %, y Vietnam con un 7,1 %.Las importaciones asiáticas en estesector quedan dominadas fundamen-talmente por crustáceos, especial-mente langostinos y gambas (Gráfica2). En contraste con el aumento de lasimportaciones de productos de lapesca a la UE, las proporciones deleche y productos lácteos han sufridoun descenso. Dentro de estos produc-tos, la mantequilla y el queso son losproductos más significativos de lasimportaciones de lácteos representan-do el 50 % en 2010. Respecto a susorígenes, más del 53% de los produc-tos lácteos proceden de la vecinaConfederación Suiza, mientras queCroacia, Noruega, y Albania forman

parte de los diez principales socioscomerciales de estos productos. Elsegundo y tercer lugar quedan ocupa-dos por Nueva Zelanda y EstadosUnidos respectivamente (Gráfica 3).Ante esta diversidad de orígenes a lapar que sistemas de producción, los

países importadores deben estableceruna serie de medidas de control enfronteras como ya ha sido comenta-do. Pero aquí la cuestión no es soloaplicar medidas sanitarias de protec-ción, sino de cómo deben éstas seraplicadas. Es decir, dentro del marco

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80 • .0*/+1�-1,1.1�)0�(1/�-0,-1/�*0+0.,1.1/ - Número 8

45,8%

14,1%

14%

6,3%

4%

3%2,2%

10,7%

Brasil

Nueva Zelanda

Tailandia

Argentina

Uruguay

Chile

Australia

Otros

Gráfica 1. Principales importaciones UE de carne y productos cárnicos de terce-ros países. Fuente: Modificado de Eurostat pocket book. Food: From farm to forkstatistic. 2011 edition.

21%

40,9%

10,8%

7,1%

4,6%

4,5%

4,2%3,7%

3,3%

Noruega

Otros

China

Vietnam

Islandia

Tailandia

EEUU

Ecuador

Argentina

Gráfica 2. Principales importaciones UE de productos de la pesca de terceros paí-ses. Fuente: Modificado de Eurostat pocket book. Food: From farm to fork statistic.2011 edition.

del comercio internacional es necesa-rio discernir entre protección y pro-teccionismo no justificado. Una res-tricción sanitaria a la importación queno esté realmente justificada pormotivos diversos puede ser un instru-mento proteccionista muy eficazdebido a su complejidad técnica, ypor consiguiente un obstáculo espe-cialmente engañoso y difícil deimpugnar, pudiendo esto suponer eldesarrollo de barreras injustificadasal comercio internacional, bajo unfalaz amparo sanitario. En este senti-do queda más que justificado el de-sarrollo de normas y reglas de carác-ter internacional emanadas entorno aun acuerdo global, y bajo la tutela deorganismos internacionales con com-petencias en comercio (4). La conclu-sión de la Ronda Uruguay deNegociaciones Comerciales Multilate-rales en Marrakech dio lugar al esta-blecimiento de la OrganizaciónMundial del Comercio (OMC) el 1 deenero de 1995, y a la entrada en vigordel Acuerdo sobre la Aplicación deMedidas Sanitarias y Fitosanitarias(MSF), y el Acuerdo sobre Obstácu-los Técnicos al Comercio (OTC). Cen-trándonos en los derechos estableci-dos en el Acuerdo MSF, los paísesmiembros de la OMC pueden adoptarlas medidas sanitarias necesarias paraproteger la salud y la vida de las per-sonas y de los animales, siempre quetales medidas no sean incompatiblescon las disposiciones de dicho acuer-do. Estas medidas no podrán discri-minar de manera arbitraria o injustifi-cable el comercio entre miembros dela OMC, evitándose que estas se con-viertan en una restricción encubiertadel comercio internacional. Por otrolado, el citado acuerdo establece ensu artículo 3 la necesidad de imple-mentar las medias sanitarias bajo unanormativa armonizada en directricesy recomendaciones de organismosinternacionales en materia. En estesentido destacamos dentro del marcode los controles veterinarios en fron-teras a la Organización Mundial de laSanidad Animal (OIE), laOrganización de las Naciones Unidas

para la Agricultura y la Alimentación(FAO) y la Organización Mundial dela Salud (OMS). En base al artículo 6del mencionado acuerdo, las medidassanitarias adoptadas deberán funda-mentarse en un previo análisis delriesgo mediante todos sus elementosvertebrados en una evaluación cientí-fica cuantitativa y cualitativa.Durante todo el proceso, el principiode transparencia recogido en el artí-culo 7 debe estar presente con la fina-lidad de divulgar al resto de los paísesmiembros de la OMC las modifica-ciones realizadas en sus medidassanitarias, incluso tras previa peticiónrazonable por otro miembro. Asímismo, el principio de equivalenciaqueda incluido en el articulado delAcuerdo MSF presentando comoobjetivo el alcanzar el mismo nivel deprotección sanitaria pero con medidasdiferentes. Es decir, el país exporta-dor debe convencer al país importa-dor acerca de la similitud de susmedidas sanitarias, que aunque pue-dan ser distintas, cumplen con losrequisitos sanitarios del país importa-dor. A fin de facilitar la evaluación dela equivalencia, los Miembros expor-tadores están obligados a conceder un

acceso razonable al importador pararealizar inspecciones, evaluaciones ydemás procedimientos pertinentes.La mayoría de las determinaciones deequivalencia tienen carácter bilateral.Sin embargo, el Acuerdo insta a losMiembros a realizar consultas con elobjetivo de lograr también acuerdosde equivalencia multilaterales. Esteacceso consentido se fundamenta enel principio de transparencia tambiéndesarrollado por el Acuerdo (47).

Controles veterinarios en lasfronteras europeas: los Puestosde Inspección Fronterizos

La importancia de los controles vete-rinarios en las fronteras es un hechoclave en las políticas internacionalesy comunitarias de sanidad animal ysalud pública, con un claro anclajehistórico. No podemos olvidar eldesastre que ocasionó en 1920 laintroducción de la peste bovina enBélgica desde la India a través delcomercio, y la creación de la OIEcuatro años más tarde (45). Con laapertura del mercado único a princi-pio de los años 90, las distintas fron-teras comunitarias pasaron a formar

Número 8 - .0*/+1�-1,1.1�)0�(1/�-0,-1/�*0+0.,1.1/ • 81

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53,2%

26,7%

6,3%

2,8%1,8%

5,6%

3,7%Suiza

Nueva Zelanda

EEUU

Noruega

Croacia

Australia

Otros

Gráfica 3. Principales importaciones UE de productos lácteos de terceros países.Fuente: Modificado de Eurostat pocket book. Food: From farm to fork statistic.2011 edition.

una única frontera europea con crite-rios de control e inspección homoge-neizados, produciéndose para ello eldesarrollo y la modificación de unabase legal no actualizada a los nuevostiempos y por tanto, a las nuevas cri-sis sanitarias (7). En este sentido, ydesde el punto de vista de la vigilan-cia veterinaria en frontera, los pues-tos de inspección fronterizos adquie-ren mayor importancia en sus proce-dimientos acorde a un previo análisisdel riesgo realizado por los veterina-rios expertos de la ComisiónEuropea. Los requisitos de sanidadanimal y salud pública de los paísesterceros exportadores previamentesometidos a control in situ por laOficina Alimentaria y Veterinaria(FVO) de la Comisión, son sometidosa un ejercicio de verificación delcumplimiento de la legislación veteri-naria en base a un principio de certi-ficación veterinaria (13,47). En estesentido, el anclaje legal al respectoqueda representado por la Directiva97/78 del Consejo, de 18 de diciem-bre de 1997, por la que se establecenlos principios relativos a la organiza-ción de controles veterinarios de losproductos que se introduzcan en laComunidad procedentes de paísesterceros, y por la que se deroga la

Directiva 90/675/CEE (13), y sutransposición a nuestro ordenamientojurídico nacional mediante el RealDecreto 1977/1999, de 23 de diciem-bre, por el que se establecen los prin-cipios relativos a la organización delos controles veterinarios sobre losproductos procedentes de países ter-ceros (25). De forma paralela, yrespecto a los controles a realizar enanimales vivos, el marco legal sedesarrolla en la Directiva 91/496/CEEdel Consejo, de 15 de julio de 1991,por la que se establecen los principiosrelativos a la organización de contro-les veterinarios de los animales quese introduzcan en la Comunidad pro-cedentes de países terceros (11).Según el artículo 3 del citado RealDecreto, la introducción de las parti-das de productos de origen animalprocedentes de países terceros en elterritorio español, se efectuará exclu-sivamente a través de un puesto deinspección fronterizo autorizado.Según la Directiva 97/78/CE, estos sedefinen como cualquier puesto deinspección, designado y autorizadopor la Comisión Europea, para reali-zar los controles veterinarios de losproductos que lleguen a la frontera deuno de los 27 territorios comunitariosprocedentes de países terceros. De

forma paralela, existen un marcolegal que establece que los puestos deinspección fronterizos se compon-drán de instalaciones destinadas a loscontroles veterinarios, bajo responsa-bilidad del veterinario oficial, o, en elcaso de los productos de la pesca, delveterinario oficial o del agente ofi-cial, y en donde se desarrollan losrequisitos de infraestructuras, equipotécnico, procedimientos, registros,etc, necesarios para su autorización(9). En virtud de las comentadas nor-mas, los controles veterinarios a rea-lizar sobre animales y productos deorigen animal son los siguientes:Control documental: consistente enverificar que los datos que aparecenen los certificados o documentosveterinarios u otros documentosexpedidos en el país tercero, cumplencon la normativa que resulte aplica-ble, y que la información previacomunicada por el interesado en lacarga coincida con dicha documenta-ción.

• Control de identidad: donde losdatos que figuran en los certifica-dos o documentos veterinarios uotros documentos que acompañena las partidas, deben concordarcon los productos o animales pre-sentados en la inspección.

• Control físico: los productos yanimales presentados en la ins-pección deben cumplir con losrequisitos de la legislación comu-nitaria o en su defecto nacional yse hallan en condiciones de serutilizados para los fines que seespecifiquen en el certificado odocumento veterinario u otrosdocumentos de acompañamiento.

El control documental se fundamentaen el principio de certificación veteri-naria establecido en el Título 5 deCódigo Sanitario de los AnimalesTerrestres, en adelante el CódigoTerrestre (46). Los certificados veteri-narios deben recoger el cumplimientoavalado por las autoridades veterina-rias del país tercero exportador, de losrequisitos de sanidad animal y de saludpública establecidos en la legislacióncomunitaria (31). Desde el punto de


82 • .0*/+1�-1,1.1�)0�(1/�-0,-1/�*0+0.,1.1/ - Número 8

Tabla 1. Requisitos zoosanitarios europeos básicos de importación para animalesvivos, y sus carnes y productos cárnicos parcialmente tratados. Fuente: modifica-do de Batho et al, (2008).

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vista zoosanitario, las exigencias sebasan en la probación por parte del paísexportador de su estatus sanitario conrespecto a las principales enfermeda-des animales de la lista de la OIE, porsu libre estatus de enfermedad y la novacunación durante un período varia-ble según las enfermedades (Tabla 1).Respecto a la vertiente de salud públi-ca, para los productos de origen animallos requisitos que deben cumplir lospaíses terceros exportadores se redu-cen al cumplimiento de las respectivassecciones y anexos de los reglamentosque forman el paquete de higiene, a lapar que del cumplimiento del artículo29 de la Directiva 96/23 respecto a lapresentación de planes de vigilancia deresiduos zoosanitarios actualizados(2,12). En materia de higiene general,destacar aquí el Reglamento (CE) Nº852/2004, relativo a la higiene de losproductos alimenticios, y en materia derequisitos específicos de higiene y decontrol oficial, los Reglamentos (CE)Nº 853/2004, por el que se establecennormas específicas de higiene de losalimentos de origen animal y854/2004, por el que se establecen nor-mas específicas para la organizaciónde controles oficiales de los productosde origen animal destinados al consu-mo humano. Finalmente, es necesariala inclusión del país exportador o par-tes del mismo, así como de los estable-cimientos de origen de los productosen listas autorizadas por la ComisiónEuropea en virtud de los artículos 11 y12 del Reglamento (CE) Nº 854/2004(30, 31, 32). Respecto a los planes devigilancia de residuos, la Decisión2011/163/UE establece el listado depaíses cuyos planes de residuos hansido aprobados en base al mencionadoartículo 29 de la Directiva 96/23 (10).Además, en función de las especiessusceptibles a determinadas enferme-dades infecciosas o parasitarias, seincluyen requisitos de salud públicaadicionales, siendo este el caso particu-lar de la carne de rumiantes por lasencefalopatías transmisibles o la deporcino por la triquinosis dada laimportancia zoonósica de ambas enfer-medades (2). Dentro del control docu-

mental, es necesaria la verificación porparte de los servicios veterinarios delPIF de una serie de garantías anejas alos certificados y a las propias partidasque los amparan. Se incluyen aquíentre otras, la verificación de alertasdel RASFF (Rapid Alert System forFood and Feed) de la ComisiónEuropea, de las características de segu-ridad de certificación implantadas pordeterminados países como medida delucha contra la falsificación (hologra-mas 3D, marcas de agua, nº de serie,microtexto…) y la comprobación de laexistencia de medidas de emergencia ocláusulas de salvaguardia asociadas altercer país exportador, establecimientode origen, producto o partida. En cuan-to al control de identidad, el artículo4 del Real Decreto 1977/1999 incluyela verificación de los precintos cuandolos productos de origen animal lleguenen contenedores, debiendo coincidircon la documentación de origen si asílo exige la legislación comunitaria onacional en su defecto. Además, esnecesaria la comprobación de la pre-sencia de los sellos o marcas oficialeso de salubridad, de identificación delpaís tercero y del establecimiento deorigen, y de su concordancia con losque aparezcan en el certificado o docu-mento veterinario u otros documentosque acompañen a la partida.Finalmente, el control físico a realizarsobre los productos de origen animalse resume principalmente en el anexoIV del Real Decreto 1977/1999. Con lafinalidad de verificar las garantías deorigen certificadas por el país tercero yconfirmar que no se han alteradodichas condiciones durante el transpor-te, se procede a realizar exámenesorganolépticos o sensoriales, pruebasfísico-químicas simples y determina-ciones de laboratorio centradas en ladetección de residuos, agentes patóge-nos, contaminantes y pruebas de altera-ción. Para ello, y a efectos de comprobarel correcto mantenimiento de la cadenade frío durante el transporte, se verificala temperatura de los productos y delmedio de transporte, así como la formade estiba, comprobando además posi-bles pérdidas de fluidos o materias

contumaces. La comprobación de losmateriales empleados para entrar encontacto con los alimentos se incluyedentro del control físico, verificándoselos requisitos establecidos en la legisla-ción europea y nacional al respecto. Lainspección organoléptica del productose basa en la comprobación de lascaracterísticas de olor, color, consisten-cia, sabor, textura, transparencia, y tur-bidez del producto con el fin de detec-tar cualquier alteración en el mismo(13). Respecto a los animales vivos, elartículo 4 de la Directiva 91/496, inclu-ye como control físico el examen clíni-co de los animales, pruebas de labora-torio, extracciones de muestras oficia-les para la detección de residuos y laverificación del cumplimiento de losrequisitos mínimos de bienestar animaldurante el transporte establecidos en elReglamento (CE) Nº 1/2005, relativo ala protección de los animales durante eltransporte y las operaciones conexas(29).

Importancia del análisis del ries-go en sanidad exterior

Desde un punto de vista aduanero, elReglamento (CE) nº 450/2008 por elque se establece el código aduanerocomunitario modernizado (35), defineriesgo como la probabilidad de que seproduzca un hecho en relación con laentrada, salida, tránsito, transferenciao destino final de las mercancías quecirculen entre el territorio aduanero dela Comunidad y otros países o territo-rios situados fuera de aquel, o con lapresencia de mercancías que no tenganestatuto comunitario, que puedan, enotros, constituir una amenaza para laseguridad y protección de la Comunidady de sus residentes, para la salud públi-ca, la sanidad animal o la fitosanidad,para el medio ambiente o para los con-sumidores. Desde un punto de vistasanitario, el análisis de dicho riesgo sedefine como la ponderación de la pro-babilidad de un efecto perjudicial parala salud y de la gravedad de ese efec-to, como consecuencia de un factor depeligro, siendo un proceso dinámicobasado en su determinación, gestión y

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comunicación (34,42). Según elCapítulo 2.1. del Código Terrestre,entre los factores que contribuyen alos posibles riesgos en los alimentosde origen animal se incluyen las prác-ticas ganaderas inadecuadas, las defi-ciencias de higiene en todas las fasesde la cadena alimentaria, la utilizacióninapropiada de medicamentos veteri-narios, la contaminación química oambiental durante el procesado oextracción del producto o de sus mate-rias primas,… La preocupación con-creta sobre los riesgos alimentarios secentran en la actualidad en los riesgosmicrobiológicos, residuos zoosanita-rios, utilización prohibida o descontro-lada de aditivos por encima de loslímites máximos legalmente permiti-dos, contaminantes químicos, inclui-das las toxinas biológicas, y otros resi-duos con impacto en la salud públicafruto de intentos de adulteración frau-dulenta de productos, destacando eseste sentido como ejemplo la melami-na detectada en productos lácteos ori-ginarios de China (1,26). Lo cierto, esque la lista al respecto ha seguidoaumentando para incluir organismosmodificados genéticamente, hormonasy alérgenos, fruto de las nuevas inves-tigaciones prospectivas (41,45). Alrespecto, la principal finalidad delanálisis del riesgo asociado a lasimportaciones según el CódigoTerrestre es proporcionar a los paísesimportadores un método objetivo yjustificable para evaluar los riesgos deenfermedad asociados a cualquierimportación de animales, productos deorigen animal, material genético ani-mal, alimentos para animales, produc-tos biológicos y material patológico(36,37,44). Este se vertebra entorno atres elementos fundamentales, ladeterminación del riesgo, su gestión yfinalmente su comunicación (42).Dicho análisis en el ámbito de lospuestos de inspección fronterizos, segestiona en base a la información dis-ponible del país exportador y de lasinspecciones realizadas por expertosveterinarios de la Unidad F de laComisión Europea, que a su vezcomunica a los estados miembros

cualquier incidencia (comunicaciones,notificaciones RASFF, alertas,…) res-pecto a la importación de animalesvivos y sus productos (2). Dentro de laevaluación del riesgo, puesto que parala mayoría de las enfermedades figu-rantes en el Código Terrestre existennormas difundidas y reconocidasinternacionalmente, existiendo unamplio consenso sobre los riesgosposibles, una evaluación cualitativaserá probablemente suficiente (44).Aunque si bien, ningún método deevaluación del riesgo asociado a lasimportaciones es aplicable a todas lassituaciones y, según las circunstancias,un método puede convenir más queotro (42,45). En este sentido, la eva-luación cuantitativa es también nece-saria para estudios epidemiológicossobre la cabaña ganadera (8,21,36,37),o en la determinación de analitos con-taminantes en productos de origen ani-mal originarios del país tercero expor-tador (1). En cualquiera de los casos elanálisis del riesgo se desarrolla deforma transparente en base a la expe-riencia adquirida por las misiones dela FVO, los propios estados miembrosa través de sus puestos de inspecciónfronterizos, y los resultados de la tomade muestra derivada de las alertas delRASFF respecto al país de origen,establecimiento exportador e importa-dor ubicado en la UE (33). La falta deesa transparencia vulneraría estemismo principio establecido en alAcuerdo MSF de la OMC, evitando lafluidez de los intercambios comercia-les por trabas sanitarias carentes denitidez (47).

Canarias como plataforma logís-tica del comercio internacional:un desafío sanitario y veterinario

El archipiélago canario se encuentra enuna situación geográfica privilegiadacomo un espacio de encuentro interme-dio entre Europa, África y América.Más allá de una región ultraperiférica,el posicionamiento de canarias comonodo de intercambio tricontinental esun hecho tácito en las políticas de coo-peración internacional, económica y de

vecindad de las instituciones públicas yprivadas, que se vertebran en ampliosintereses comerciales y logísticos (39).Este hecho supone una oportunidadpara fomentar la diversificación de laeconomía del Archipiélago, no debien-do dejar de lado por ello la vigilanciasanitaria. Canarias cuenta aproximada-mente con 11 puertos de interés generaldependientes de Puertos del Estado, y 8aeropuertos integrados en AENA.Dentro de estos recintos existen en fun-cionamiento más de 20 InstalacionesFronterizas de Control Sanitario deMercancías, de los cuales 4 son Puestosde Inspección Fronterizos, quedandoampliada esta cifra en un futuro próxi-mo en las islas orientales. La justifica-ción de estas instalaciones y sus futurasampliaciones responden a unas clarasdemandas de expansión de negocio enmateria de logística comercial en cana-rias apaciguada hasta la fecha por laactual crisis económica. No debemosolvidar que desde el punto de vista mer-cantil y financiero, la demanda de pro-ductos de origen animal, y especial-mente los pesqueros con nuestros veci-nos africanos, así como el consumo deestos productos por el canal HORECAcanario, es de gran relevancia en unaeconomía local respaldada por los sec-tores turístico y de servicio, y en dondela salud pública juega un papel de vitalimportancia (39). Por otro lado, la sani-dad animal es la otra pieza integrantedentro de este gran puzle. La insulari-dad es una variable de gran considera-ción dentro del análisis del riesgo alintroducir animales o productos de ori-gen animal procedentes de terceros paí-ses (45). El ecosistema canario se des-arrolla entorno a una homeostasis endonde las condiciones climatológicas,el control sanitario de las poblacioneshumana y animal, y sus actividades, asícomo el control de mercancías jueganun papel de vital importancia. El aisla-miento geográfico sin embargo ha pro-piciado el no desarrollo de las enferme-dades animales de gran impacto econó-mico y sanitario que acontecen en elresto de Europa, y que ha impulsado lacalificación sanitaria de indemnidadpara muchas de ellas por la Comisión


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Europea. Pero cierto es que la introduc-ción de algunas de estas enfermedades(Fiebre Aftosa, Pestes Porcinas,Encefalopatía Espongiforme Bovina,enfermedad de Newcastle...) provoca-ría un desastre a todos los niveles (23).En este sentido, los controles veterina-rios en los PIF de las islas se hacenindispensables para garantizar la sani-dad animal y la salud pública en losintercambios comerciales con paísesterceros que utilizan canarias como pla-taforma europea de logística, prote-giendo así la cabaña ganadera y la saludde los consumidores mediante la vigi-lancia, el seguimiento y el control delas importaciones de partidas confor-mes, y de las partidas transbordadasconformes o no conformes destinadasal territorio peninsular, a otros EstadosMiembros o a otros países terceros (45).

Perspectivas futuras de los con-troles veterinarios en fronteras

Las nuevas tecnologías aplicadas enel sector primario junto con las bue-nas prácticas agroganaderas presen-tan como objetivo primordial no soloabastecer los mercados de proteínasde origen animal, sino además queesta actividad sea rentable. El naci-miento de estos productos surge enexplotaciones de países terceros y ensus industrias alimentarias bajo elcontrol de distintos sistemas sanita-rios que deben cumplir los estándareseuropeos (6,7). Este hecho otorgadopor la globalización de los mercadosgenera la necesidad por parte de losestados de fortalecer sus serviciosveterinarios oficiales para promovery proteger la salud animal y humanay, al mismo tiempo, facilitar elcomercio internacional en el marcodel Acuerdo de la OrganizaciónMundial del Comercio sobre MedidasSanitarias y Fitosanitarias. Fruto deesta dinámica global surgen riesgossanitarios con un carácter reemergen-te o emergente, para los que los servi-cios de inspección veterinaria debenestar preparados (40). En base a esosnuevos peligros, o frente al cambiode la situación epidemiológica cono-

cida para un peligro en cuestión, esnecesaria la modificación de los siste-mas de inspección. Ya no hablamossolo de auditar toda una cadena agro-alimentaria desde la granja a la mesa,ni de únicamente pasar de un solocontrol oficial al autocontrol (33,40).Los controles veterinarios tienden enla actualidad a dirigirse hacia peligrosmenos tangibles y evidentes querequieren de un apoyo laboratorialavanzado y acreditado. Es el caso delos residuos zoosanitarios que hanhecho aflorar problemas de saludpública como la antibioresistencia(17), los contaminantes ambientales,destacando aquí el refuerzo de loscontroles sobre determinados produc-tos japoneses tras el reciente acciden-te nuclear de Fukushima (27), o laincertidumbre científica respecto adeterminados organismos modifica-dos genéticamente (19). Es por elloque los controles en fronteras debenser sometidos a una revisión con lafinalidad de reforzarlos, destacandoaquí el trabajo realizado al respectopor la Directora de General of Healthand Consumer Protection de laComisión Europea en cuanto a homo-geneizar en un único marco legal losrequisitos para los animales vivos ysus productos en línea con el paquetede higiene y la nueva Estrategia deSalud Animal (2007-2013). De formaanáloga, la modificación de otrosprocedimientos aduaneros y para-aduaneros conlleva la necesidad deadaptar los procedimientos de loscontroles veterinarios sobre animalesy sus productos procedentes de paísesterceros con la finalidad de detectareficazmente las partidas sujetas adichos controles, así como agilizar eltiempo de almacenamiento duranteun control rutinario o inmovilización(4,44). En cualquier caso, como con-secuencia de la expansión de la eco-nomía mundial, de la liberalizacióndel comercio de alimentos, de la cre-ciente demanda de consumo, de losavances de la ciencia y tecnología, yde las mejoras del transporte y lascomunicaciones, el comercio interna-cional de alimentos frescos y elabora-

dos continuará aumentando, y elacceso de los países a los mercadosde exportación de los alimentos, con-tinuará dependiendo de su capacidadde cumplir los requisitos reglamenta-rios de los países importadores enbase a los estándares fijados por losorganismos internacionales en juego.La aparición de nuevos riesgos sinduda seguirá modificando los proce-dimientos sobre los que sustentan loscontroles veterinarios tras un previoanálisis del riesgo, en donde la comu-nicación entre autoridades y organis-mos sanitarios y veterinarios jugaránun papel fundamental en las actuacio-nes de contención, siendo una mues-tra de ello en la actualidad, la rápidamovilización técnico-científca conrespecto a la enfermedad deSchmallenberg realizada por los ser-vicios veterinarios en Europa, y enparticular en España, con la notifica-ción del primer caso de esta enferme-dad en la provincia de Córdoba elpasado 13 de marzo de este año (7,27, 29).

Conclusión

La revisión acerca de la intervenciónde la profesión veterinaria en elcampo multidisciplinar de la saludpública es histórica, y demuestra cla-ramente la veracidad de nuestraemblemática profesional “higia peco-ris, salus populi”. La interrelaciónentre humanos, animales y medioam-biente nunca había adquirido el nivelde importancia asignada en la actuali-dad. La apertura comercial y la globa-lización de mercados han aceleradolos procesos de intercambio de ani-males y de productos alimenticiosfrescos y procesados de origen ani-mal entre diversos países y bloqueseconómicos. Es por ello que los siste-mas nacionales de control estén basa-dos en directrices científicas recogi-das en reglamentos de organismosinternacionales como FAO, la OMS yla OIE, para armonizar las normassanitarias evitando que estas supon-gan trabas injustificadas para el flujocomercial. Puesto que las barreras

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entre enfermedades animales y huma-nas son ficticias, estas mercancías nosolo acarrean beneficios económicos,sino también posibles peligros para lasanidad animal y la salud pública quedeben ser controlados en base a unprevio análisis del riesgo. Es por ello,que la actuación del veterinario en lospuestos de inspección fronterizos esindispensable para salvaguardar lacabaña ganadera europea y la saludde la población de los 27.

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10.-Decisión 2011/163/UE de laComisión, de 16 de marzo de2011, relativa a la aprobación delos planes enviados por tercerospaíses de conformidad con elartículo 29 de la Directiva96/23/CE del Consejo.

11.-Directiva 91/496/CEE delConsejo, de 15 de julio de 1991,por la que se establecen los prin-cipios relativos a la organizaciónde controles veterinarios de losanimales que se introduzcan en laComunidad procedentes de paí-ses terceros y por la que se modi-fican las Directivas 89/662/CEE,90/425/CEE y 90/675/CEE.

12.- Directiva 96/23/CE del Consejo, de29 de abril de 1996, relativa a lasmedidas de control aplicables res-pecto de determinadas sustancias ysus residuos en los animales vivos ysus productos y por la que se dero-gan las Directivas 85/358/CEE y86/469/CEE y las Decisiones89/187/CEE y 91/664/CEE.

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26.-Reglamento (CE) Nº 1135/2009de la Comisión de 25 de noviem-bre de 2009 por el que se estable-cen las condiciones particularesde importación de determinadosproductos originarios o proce-dentes de China y se deroga laDecisión 2008/798/CE.

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28.-Reglamento (UE) nº 1006/2011de la Comisión, de 27 de sep-tiembre de 2011, por el que semodifica el anexo I del Regla-mento (CEE) n o 2658/87 delConsejo, relativo a la nomencla-tura arancelaria y estadística y alarancel aduanero común.

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30.-Reglamento (CE) nº 853/2004del Parlamento Europeo y del

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revista Canaria de las Ciencias Veterinarias, nº 8 - gi.ulpgc.es · 4 • - Número 8 La tristeza...

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