REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA DE LA NORMATIVIDAD Y …

REVISION BIBLIOGRAFICA DE LA NORMATIVIDAD Y LEGISLACION VIGENTE EN ASPECTOS DE CALIDAD MICROBIOLOGICA PARA LA INDUSTRIA COSMETICA EN COLOMBIA. 1

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA DE LA NORMATIVIDAD Y LEGISLACION VIGENTE EN ASPECTOS DE CALIDAD MICROBIOLOGICA PARA LA

INDUSTRIA COSMÉTICA EN COLOMBIA. UNIVERSIDAD JAVERIANA BOGOTÁ

MAYRA LORENA RODRIGUEZ TOVAR

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

BOGOTÁ, D.C. 2012


REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA DE LA NORMATIVIDAD Y LEGISLACION VIGENTE EN ASPECTOS DE CALIDAD MICROBIOLOGICA PARA LA

INDUSTRIA COSMETICA EN COLOMBIA.


APROBADO

____________________________ _____________________________ Ingrid Schuler, Phd. Janet Arias Palacios Bacterióloga Decana académica M.Sc M.Ed Directora Facultad de Ciencias Carrera de Microbiología Industrial


REVISION BIBLIOGRAFICA DE LA NORMATIVIDAD Y LEGISLACION VIGENTE EN ASPECTOS DE CALIDAD MICROBIOLOGICA PARA LA

INDUSTRIA COSMETICA EN COLOMBIA.


APROBADO

__________________________ ___________________________ Director Jurado Ana Milena Heins Tinoco Janet Arias Palacios Químico Farmacéutico M.Sc M.Ed


NOTA DE ADVERTENCIA

Articulo 23 de la resolución No. 13 de julio de 1946

“ la universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”


DEDICATORIAS

Nadie puede llegar a la cima armado sólo de talento. Dios da el talento; el trabajo transforma el talento en genio.

Esta tesis se la quiero dedicar a Dios mi mas gran amigo y confidente, a ese ser maravilloso que hace parte de mi vida, que me toma de su mano y me levanta victoriosa; del que siempre recibiré el mas grande y sincero amor; con el que muchas veces sufrí, con el que he construido mi camino como mujer y como profesional; a él le doy gracias por haberme regalado la oportunidad de culminar mi carrera profesional y de ofrecerme su apoyo incondicional, pese a mi ingratitud y errores.

También quiero dedicársela a mis padres ANA LUCIA TOVAR y JORGE RODRIGUEZ NARVAEZ, por su apoyo incondicional, sus palabras de aliento y sus consejos, que me fortalecieron y me llenaron de fuerza y de empuje para llegar a cumplir las metas que hoy son de alegría; gracias a ellos hoy soy una mujer con principios y metas claras y definidas.

Quiero dedicársela a mis amigos, con los que compartí amargos y felices momentos (pochis, diego, edi, pedro), que siempre estuvieron conmigo durante todo mi proceso profesional, que se convirtieron en mis mejores amigos, porque siempre me escucharon, me hicieron reír, tuvieron una voz de aliento y de fortaleza; a ellos porque sé que comparten conmigo y se alegran de este gran triunfo, siendo tan de ellos como mio. Por ultimo se lo quiero dedicar a mi amiga Deisy, que aunque ha sido pocos los años de compartir, en el corto tiempo vivido, he podido sentir lo que es un amiga sincera e incondicional; de la que le doy gracias a Dios por ponerla en mi camino. A todos mis amigos a Diana Vergara, yesmith, Liz entre otras personas que llevo en mi corazón y que construyeron conmigo esta escuela de vida que fue para mí la universidad, muchos de ellos se fueron y otros siguen irradiando mi vida con su presencia; a ellos también quiero agradecerles su grata compañía.

A todos ustedes les digo que en nombre de Dios esta será una de tantas victorias, porque la vida sigue y la meta final esta en cumplir nuestra misión y dejar huella de nuestro paso por este mundo.

AGRADECIMIENTOS

A la Pontificia Universidad Javeriana, porque en ella recibí mi integra formación profesional y humana; a Janet arias, porque en ella encontré un ser humano lleno de mucho apoyo y comprensión; y Ana milena porque es un ángel que Dios puso en mi camino, gracias por tu ayuda sincera y desinteresada.


1. RESUMEN

El aseguramiento de la calidad, en especial de la calidad microbiológica de los cosméticos, es de relevante importancia, debido a que se ha demostrado que microorganismos contaminantes como Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, salmonella y Candida albicans, ocasionan diferentes tipos de patologías en la piel de sus consumidores; por tanto afectando el prestigio del país productor y sus industrias. Mediante la normatividad y legislación, los productores, países de interés, o agremiaciones, entre otros; estandarizan los parámetros de cumplimiento, de acuerdo a sus intereses de calidad y en general de desarrollo de los productos; facilitando la apertura y gestión de mercados a nivel local e internacional. En Colombia el Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos INVIMA, es el encargado de decretar y hacer cumplir la normatividad y legislación, concerniente para el desarrollo de la producción de los cosméticos; por todo lo anteriormente expuesto el objetivo general de este proyecto de grado fue, realizar un análisis descriptivo mediante una revisión y análisis de la normatividad y legislación vigente en aspectos de calidad microbiológica para la industria cosmética en Colombia, necesarios para obtener el registro sanitario; esto comparado frente a parámetros y procedimientos establecidos en la normatividad de entidades como la FDA, La European Cosmetics Toiletry and Perfumery Association (COLIPA), La Comisión de La Unión Europea; líderes internacionales en regulación de productos cosméticos. Así mismo se desarrollo una propuesta de guía para la evaluación de la calidad microbiológica de los cosméticos, que pretende informar a los productores en interesados sobre los parámetros y procedimientos, de más altos estándares de calidad, necesarios para la aprobación del registro sanitario y comercialización internacional de los cosméticos. Por tanto con el cumplimiento de los objetivos desarrollados en el presente proyecto de grado, se pretenderá inicialmente crear conciencia, en las entidades, instituciones y personas que manejen o estén a cargo del progreso en la producción de cosméticos en Colombia, sobre los vacíos y brechas de los parámetros y procedimientos decretados en las normas; así mismo se pretenderá reunir y facilitar el acceso de la información, acerca de los más altos estándares de calidad microbiológica, para aquellos productores e interesados que quieran desarrollar este tipo de requisitos en sus procesos de producción.

2. INTRODUCCIÓN

Se define como producto cosmético a toda formulación de aplicación local que puede ser usada en diversas partes superficiales del cuerpo humano con el fin de limpiarlos, perfumarlos, modificar su aspecto y protegerlos o mantenerlos en buen estado y prevenir o corregir los olores corporales. Entre este tipo de productos se encuentran aquellos


destinados al área de los ojos, la piel, los labios, el cabello, las uñas, el área bucal y dental; así mismo aquellos utilizados para el aseo e higiene corporal, depilatorios, desodorantes y antitranspirantes, perfumes, productos para afeitar, broncear, protectores solares y auto bronceadores, así como productos para niños (1).

Este tipo de productos se han impulsado con mayor impacto sobre el mercado, ofreciendo novedad y múltiples beneficios para sus consumidores; convirtiéndose Colombia en una plaza de gran interés para la ubicación de plantas productivas multinacionales como es el caso de Belcorp, Henkel, Procter & Gamble, Avon, Unilever y Yanbal las cuales han realizado inversiones cercanas a los USD 200 millones en la expansión de sus plantas (2). Otras de ellas como es el caso de Colgate Palmolive y Johnson & Johnson, que llevan más de 40 años en el mercado reconocidas como líderes nacionales (2). Por otro lado nuestro país cuenta con una gran variedad de empresas de cosméticos como prebel, Capill’france, S.A., laboratorios de cosméticos Vogue S.A., Laboratorios Ghem de Colombia, Ltda, Varela, S.A entre otras; Con menos experiencia a la competencia extranjera (3).

Es por ello que Colombia decidió a partir de 1993 mediante la Ley 100, en el articulo 245 establecer la creación del Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos INVIMA (4), como aquella institución encargada del cumplimiento de la normatividad que regula el sistema de seguridad social; dentro de las funciones designadas a este establecimiento público del orden nacional, de carácter científico y tecnológico, con personería jurídica, autonomía administrativa y patrimonio independiente; son las de proponer, desarrollar, divulgar y actualizar las normas científicas y técnicas aplicables en los procedimientos de inspección, vigilancia sanitaria, control de calidad, evaluación y sanción, de los registros sanitarios, para las industrias de alimentos, medicamentos y cosméticos; Esto en Coordinación con otras entidades especializadas en la materia de acuerdo a las competencias otorgadas por la ley (5).

No obstante pese a decretarse la regulación de la normatividad en cosméticos por medio del INVIMA, la industria colombiana, con el objeto de mejorar sus procesos industriales, se unió para formar la Asociación Nacional de Empresarios de Colombia (ANDI), como agremiación sin ánimo de lucro, que busca atraer la inversión y consumo, dentro de un marco legal, que promueve la responsabilidad social, eliminando las restricciones y obstáculos en los campos legales, comerciales, de infraestructura, innovación y desarrollo tecnológico, logístico, financiero, económico y publicitario, a través de la vocería y la capacidad de influir en los entes de decisión . Esta agremiación se ha enfocado en el desarrollo de productos y procesos de calidad, vigilados y regulados por la normatividad (6). Buscando implementar industrialmente las normas y demás acuerdos estipulados internacionalmente por la COMUNIDAD ANDINA (CAN), entre otros; encaminando a sus


industrias a mer cados altamente competentes en calidad, como los ofrecidos por las industrias extranjeras (6).

Pese a todos los intentos por mejorar Colombia dispone de un arduo acceso a la documentación legislativa en cosméticos, siendo un obstáculo para muchas empresas que no tienen el suficiente conocimiento de la producción de cosméticos de calidad, restringiendo la competencia frente a mercados internacionales, quienes se encuentran guiados bajo la normatividad de entidades como la FDA, La European Cosmetics Toiletry and Perfumery Association (COLIPA); La Comisión De La Unión Europea; lideres en regulación de productos cosméticos.

Es por esto que en el presente proyecto de grado, se realizo una revisión y análisis bibliográfico de la normatividad y legislación nacional vigente, decretada en parámetros y procedimientos de calidad microbiológica para cosméticos, comparado frente a los requerimientos exigidos en la normatividad internacional

Así mismo se desarrollo una guía para la evaluación de la calidad microbiológica de los cosméticos, con los parámetros y procedimientos necesarios para la aprobación del registro sanitario y comercialización internacional de los cosméticos; con el objeto de facilitar el acceso a la información de los parámetros y procedimientos, con los más altos estándares de calidad microbiológica para este tipo de productos.

3. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.

¿Puede garantizarse la calidad microbiológica de los cosméticos, mediante los parámetros de análisis decretados en la legislación y normatividad Colombiana vigente?

El presente proyecto de grado es de gran importancia, debido al impacto que la normatividad en cosméticos ha tomado durante los últimos tiempos en los exigentes procesos de globalización que benefician la apertura de nuevos mercados de alta calidad. Según un estudio realizado por el Ministerio de Comercio, Industria y Turismo de la Republica de Colombia, se aspira para el año 2032 el país sea reconocido como un líder mundial en la producción y exportación de cosméticos de alta calidad a base de ingredientes naturales (7). Por tanto se estima un incremento del sector al menos 2.3 veces, generando US$ 8.9 mil millones en ventas, multiplicando sus exportaciones al menos 4.0 veces para exportar el 27% de su producción (7).

Sin embargo para lograr esto el país deberá generar cambios importantes en lo que respecta a sus recursos humanos, marco normativo, el fortalecimiento y promoción de la industria mediante el crecimiento en infraestructura (7).

En lo que respecta al marco normativo, este contribuirá principalmente en el desarrollo y control de calidad de nuevos cosméticos registrados, a base de materias primas para


productos naturales como son el bálsamo de Tolú, el borojó, el gualanday, la muña, el prontoalivio o melisa, la jagua, el añil, el achiote, elarazá, el dividivi y el seje entre otros (2) y empaques biodegradables, obtenidos gracias a la biodiversidad de flora y fauna nacional (7).

Siendo este tipo de productos de gran importancia, por su innovación y por el posible riego de contaminación (8) con microorganismos que pueden ocasionar enfermedades de piel (9).

Dentro de los productos más susceptibles a la contaminación son aquellos que presentan en su formulación agua en emulsiones, geles, suspensiones o soluciones, este tipo de productos son afectados en la estructura de sus agentes conservantes y por tanto en la estabilidad del producto (8).

Dentro de los microorganismos más frecuentes por contaminación en cosméticos se encuentra, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, salmonella y Candida albicans (9). Para el caso de Staphylococcus aureus, se considera responsable de ocasionar infecciones cutáneas como la foliculitis, que se caracteriza por la infección de los folículos pilosos y las infecciones de las glándulas sudoríparas.

En general la posible presencia de estos microorganismos en los cosméticos aumenta los riesgos en la salud del consumidor, debido a las deficiencias en el control de calidad realizado a estos productos (10).

Por otro lado se ha demostrado que no solo el control de calidad de microorganismos en este tipo de productos es de relevante importancia; debido a que muchos cosméticos, están compuestos por sustancias químicas como detergentes agresivos, urea en altas concentraciones, alfa-hidroxiácidos, ácidos y álcalis (11). Que ocasionan afecciones de piel manifestadas en edemas, descamación, sensación de calor y prurito.

En conclusión la normatividad determinara a través de la vigilancia y control el acceso o exclusión de materias primas, suministros y tecnologías con costos competitivos de alta calidad; abarcando todas las fases de producción de los cosméticos (7), Facilitando la gestión en comercios exteriores, simplificando los trámites aduaneros, técnicos y tributarios (12). Este gran número de aspectos influirán de manera directa, benéficamente en el desarrollo y crecimiento de la nación en todos los aspectos intrínsecos y extrínsecos que implican a la industria de cosméticos y sus exportaciones.

Con el presente proyecto de grado, los industriales en cosméticos e interesado; encontraran la información de los más altos estándares de parámetros y procedimientos de calidad microbiológica, necesarios tanto para asegurar la salud de los consumidores, como para cumplir con uno de los requisitos para obtener el registro sanitario; facilitando los procesos de comercialización nacional y exportación de los cosméticos.


4. MARCO TEÓRICO

4.1 EXPECTATIVAS DE LA INDUSTRIA DE COSMÉTICOS EN COLOMBIA:

Colombia se considera como el segundo país en el mundo con mayor diversidad florística gracias entre otros factores, a su gran variedad de ecosistemas, reportándose cerca de 50.000 especies de flora, de las cuales aproximadamente 6.000 cuentan con algún tipo de característica medicinal. Adicionalmente, 18.000 de ellas se consideran endémicas, es decir, sólo se ubican en Colombia; encontrándose en los últimos 5 años, 30 nuevas especies para la humanidad (2);

Esto representa una nueva fuente de explotación, para la innovación de cosméticos a base de ingredientes naturales, debido a la importancia que los productos naturales han ido tomando en el ámbito económico nacional e internacional (2), sin embargo muchos de estos cosméticos elaborados a base de sustancias autóctonas no están en los listados en la Cosmetic Toiletry and Fragance Associaton Inc (CTFA), Personal Products Care Council (PCPC), European Commission Health Consumers (Cosing), listados reconocidos a nivel mundial, en los que se consignan los ingredientes que pueden utilizarse en productos cosméticos (2), lo cual representa un inconveniente para aquellas empresas que quieren registrar a nivel de la CAN, sus productos a base de sustancias naturales propias del país.

Pese a estas adversidades, Colombia ha evidenciado con el trascurrir del tiempo una gran demanda de productos cosméticos; en especial de las mujeres que habitan las grandes ciudades quienes destinan mucho de su dinero a productos de belleza, pudiendo llegar a duplicarse el porcentaje de demanda en cosméticos, frente al mercado de mujeres europeas (2). Todo esto representando en la generación aproximada de 17.000 empleos directos y más de 80.000 empleos indirectos, convirtiéndolo en un sector impulsador de la economía, de credibilidad de la industria nacional y por tanto facilitador en la articulación con el mercado internacional (2)

4.2 SITUACIÓN DE LA INDUSTRIA DE COSMÉTICOS EN LA COMUNIDAD ANDINA:

la comunidad andina (CAN), en su ejemplo de armonización de legislaciones más importante del continente, desde el año 1998, mediante reuniones realizadas con los representantes de los ministerios de salud de 33 países del mundo; estableció los principios de Florencia. De acuerdo a estos la responsabilidad en la seguridad del producto es del fabricante o importador. Por tanto se debe propender por la implementación de sistemas de registros simplificados de notificación, una definición universal de cosmético, un listado de ingredientes de cosméticos, así como el establecimiento uniforme de requisitos de etiquetado de los productos. (13).


En cumplimiento a esto, el 8 marzo del 2002, la CAN, mediante la decisión de 516, estableció un marco normativo supranacional, con el fin de armonizar las legislaciones internas de los países miembros; debido a las necesidades económicas y tecnológicas que implican los productos de riesgo sanitario como son los cosméticos (2); en el 2008 América latina abarcaba el 16% de las exportaciones a nivel mundial, con ingresos cercanos a los USD 51.944 en el año 2008 mil millones de dólares. Siendo Brasil, México, Venezuela, Argentina y Colombia quienes encabezan las exportaciones de cosméticos en Latinoamérica (2).

4.3 SITUACIÓN DE LA INDUSTRIA DE COSMÉTICOS EN COLOMBIA.

En Colombia, la exportación de cosméticos se ha vuelto prometedora, debido a que esta se duplico en seis años, por tanto desde el 2002 el crecimiento promedio anual fue de 6,4% produciendo USD 1.265 millones, pasando a producir USD 2.082 millones en el 2009 (2), evidenciándose un crecimiento acumulado del 65%. No siendo suficiente, los objetivos se centran en la conquista de nuevos mercados que les exigirán cambios en lo que respecta a sus recursos humanos, marco normativo, fortalecimiento de la industria, promoción e infraestructura; para de esta manera superar los problemas evidenciados en las exigencias implantadas por los países de exportación (2).

4.4 PROBLEMÁTICA DE LA INDUSTRIA DE COSMÉTICOS EN COLOMBIA.

Muchas de las causas de estos problemas se presenta, por los altos costos de manufactura, debido a los elevados precios de las materias primas importadas para la elaboración de productos y empaques; esto a consecuencia de los altos costos arancelarios, a comparación de potencias como EE.UU (2).

Otra tipo de problemática se presenta, con los entes que regulan la industria de cosméticos en Colombia, quienes no cuentan la tecnología e infraestructura suficiente para realizar un muestreo total de sus productores; por tanto optan como medida de control o vigilancia en dar credibilidad a lo que sus fabricantes notifican. Caso contrario acontece en potencias como EE.UU quienes regulan el sector de cosméticos atreves de visitas a las fábricas y muestreos aleatorios (2).

Por otro lado la insuficiente inversión, desarrollo e innovación, es otro tipo de problema que se evidencia en este tipo de industria, que en muchas ocasiones lanzan al mercado productos a base de fórmulas elaboradas por terceros en otros países obstaculizándose los procesos de innovación, esto debido a los insuficientes recursos humanos capacitados y las deficientes tecnologías e infraestructura que presenta este tipo de industria (2).

4.5 PROBLEMÁTICA EN LA NORMATIVIDAD DE COSMÉTICOS ACORDADA POR LA COMUNIDAD ANDINA:


4.5.1 Problemas que se evidencian en los países andinos.

Los países andinos conformados por Bolivia, Colombia, Ecuador y Perú, presentan problemas en cuanto a la unificación de las exigencias de los estudios clínicos sobre los cosméticos aprobados y que sustenten los claims, debido a que para algunos productos se exige que se realicen las pruebas sobre animales y otras sobre humanos, esto dependiendo del país en donde se estén realizando sin embargo esto ha mejorado dado a las armonizaciones normativas que se han realizado a lo largo del tiempo; reflejado en el acta expedida el 3 de agosto de 2011, por la CAN (13). Pese a lo anteriormente mencionado Colombia ha sido de los países miembros que mejor acogido dentro de su legislación interna y funcionamiento cotidiano, la decisión 516, sin embargo se continúa trabajando para mejorar la utilización de la norma supranacional (1).

4.5.2 Problemas que presenta Colombia.

Para el caso de Colombia, esta presenta adicionalmente otro tipos de problemas, como el incumplimiento de los acuerdos establecidos internacionalmente, entre ellos la decisión 516 del 2002 por la CAN, obstaculizando las exportaciones hacia los países andinos. Esto se ha evidenciado debido a que la notificación sanitaria Colombiana, no incluye los tonos del grupo cosmético autorizado, motivo por el cual los países de exportación, exigen la presentación de certificado libre incrementando el tiempo y costos por la exigencia del nuevo trámite (14).

Por tanto, de acuerdo a los argumentos anteriormente mencionados el presente proyecto de grado, análisis y propuesta de guía que consigna los más altos estándares de calidad microbiológica, información necesaria para los empresarios e interesados, en obtener el registro sanitario y en la exportación de cosméticos.

Así mismo apoyara el proceso de concientización de las entidades reguladoras Colombianas, sobre las brechas y vacíos que se deben llenar, para lograr mejores controles, sobre los parámetros que aseguran la calidad microbiológica de los cosméticos y de esta manera logrando el beneficio en la salud de sus consumidores; ya que este es el objeto de la normatividad; pese a que estas se hayan diseñado con otros propósitos, como es el de explorar nuevos mercados de alta calidad, como es el caso de Europa y Estados Unidos.


5. OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GENERAL

Realizar una revisión y análisis de la normatividad y legislación vigente en aspectos de calidad microbiológica para la industria cosmética en Colombia, necesarios para obtener el registro sanitario.

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Recopilar la normatividad y legislación gubernamental nacional, vigente en parámetros y procedimientos de calidad y calidad microbiológica para la industria cosméticos, necesarios para adquirir el registro sanitario en Colombia.

• Analizar y discutir los parámetros y procedimientos para evaluar la calidad microbiológica establecida en la normatividad Colombiana vigente.

• Elaborar una guía para la evaluación de la calidad microbiológica que reúna los más altos parámetros y procedimientos, necesarios para obtener el registro sanitario nacional y comercialización internacional de los productos cosméticos.

6. METODOLOGÍA

Realizar una revisión y análisis de la normatividad y legislación vigente en aspectos de calidad microbiológica para la industria cosmética en Colombia, necesarios para obtener el registro sanitario.

Mediante un análisis descriptivo, se realizó una revisión bibliográfica y análisis de la normatividad vigente en aspectos de calidad microbiológica para Colombia; estos fueron comparados frente a los parámetros y procedimientos decretados en la normatividad internacional de entes reguladores como FDA, La European Cosmetics Toiletry and Perfumery Association (COLIPA), La Comisión De la Unión Europea; líderes en el aseguramiento de la calidad de cosméticos.

Recopilar la normatividad y legislación gubernamental nacional, vigente en parámetros de calidad y calidad microbiológica para la industria cosméticos, necesarios para adquirir el registro sanitario.

Para llevar a cabo este objetivo, se recopiló, las Decisiones, Leyes, Decretos, Resoluciones, Acuerdos, Circulares, concernientes a calidad y calidad microbiológica de cosméticos; esta información se obtuvo mediante consulta electrónica y visita a cada una de las entidades estatales encargadas en el proceso de normalización y desarrollo de la industria de cosméticos en Colombia, entre las dicientes se encuentra el Ministerio de Protección Social, INVIMA, Proexport, Belcorp.


Analizar y discutir los parámetros de calidad microbiológica establecidos en la normatividad Colombiana vigente.

Se tomó la normatividad y documentos legislativos especificados en el objetivo anterior y se analizó la información que en ella se decreta, en lo referente a parámetros y procedimientos de calidad microbiológica; así mismo esta información se comparó, con los parámetros y procedimientos decretados en la normatividad de entes internacionales como FDA,), La European Cosmetics Toiletry and Perfumery Association (COLIPA), La Comisión De La Unión Europea.

Elaborar una guía para la evaluación de la calidad microbiológica que reúna los más altos parámetros y procedimientos, necesarios para la aprobación del registro sanitario y comercialización nacional e internacional de los productos cosméticos.

La propuesta de guía realizada, reúne los más altos estándares de parámetros y procedimientos en calidad microbiológica para cosméticos; información tomada de entes internacionales como FDA, La European Cosmetics Toiletry and Perfumery Association (COLIPA) La Comisión De la Unión Europea; que facilitaran la adquisición del registro sanitario y por tanto la gestión de comercio nacional e internacional.

7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN TABLA 1:

NORMATIVIDAD DE COSMETICOS EN COLOMBIA Documento normativo

y/o legislativo

Preámbulo Titulo Capitulo Artículo (s) Contenido

LEYES

Ley 9 de

1979 (enero 24)

Por el cual se dictan medidas sanitarias

VI N/A 428

Se establecen las disposiciones sanitarias sobre la elaboración, envase o empaque, almacenamiento, transporte y expendio

de cosméticos.

VI N/A

440, 441, 443

Se les prohíbe a las farmacias y depósitos de cosméticos, la elaboración, transformación o reenvase de cualquier cosmético, así mismo estos deben tener la infraestructura y equipos necesarios

para el almacenamiento de los cosméticos

VI N/A

448, 449

El envase debe estar fabricado con materiales que no produzcan reacciones

químicas y físicas con el producto, alterando su potencia y calidad;

protegiéndolo de agentes atmosféricos.

VI N/A 455

Es de responsabilidad de los fabricantes, por medio de ensayos garantizar las

condiciones de estabilidad de los productos.

Ley 100 de 1993

(diciembre 23)

Por el cual se crea el sistema de seguridad social integral y se dictan otras disposiciones

VI N/A 245

Se decreta la creación de el Instituto de Vigilancia de medicamentos y alimentos,

cuyo objeto es la ejecución de las políticas en materia de vigilancia sanitaria y de control de calidad de medicamentos,


productos biológicos, cosméticos, etc.

Ley 399 de 1997

(agosto 19)

Por el cual se crea una tasa, se fijan unas tarifas y se

autoriza al Instituto nacional de medicamentos y

alimentos INVIMA, su cobro.

N/A N/A 1

Se establece una tasa para recuperar los costos del INVIMA, en la expedición del

registro sanitario, necesario para la producción, importación o

comercialización.

N/A N/A 4

Acerca de la expedición, modificación, ampliación o renovación del registro

sanitario. DECRETOS

Decreto 219 de 1998

(Enero 30)

Se reglamentan parcialmente los regímenes sanitarios de

control y calidad, de vigilancia de los productos

cosméticos, y se dictan otras disposiciones

I N/A 6,7,9, 10,11,12

Se establece el cumplimiento de las BPMC (buenas practicas de manufactura

en cosméticos), las visitas de certificación, las visitas de inspección; se especifica la vigencia de la certificación

de las BPMC (5 años).

I N/A

8,9

El certificado de capacidad de producción (CCP), que hará constar que la

infraestructura y los equipos se ajustan a los requerimientos técnicos y locativos

para iniciación de fabricación.

II II

14, 15, 16

Acerca de la clasificación de los tipos de cosméticos, las modalidades de registro

sanitario y se dispone sobre casos especiales en los que él se difiere el

concepto de un cosmético hacia el país que se exporta, con relación a Colombia.

II II

17

La presentación de los requisitos legales, de forma técnica (cualitativa y

cuantitativa), (nomenclatura internacional o genérica de los ingredientes),

(certificación de BPMC o CCP) (los protocolos de análisis o especificaciones

organolépticas, fisicoquímicas y microbiológicas del producto terminado),

para otorgar el registro sanitario.

III VI

37

Se establece que la calidad se evaluará, mediante la verificación de las

instalaciones y la información técnica presentada, confrontándola con la

documentación del fabricante de cada lote piloto o lote industrial.

III VI 38 Las características de producto alterado.

III VII 42

Se establece acerca de las medidas sanitarias, procedimientos y sanciones en

incumplimiento a los requisitos por los que se otorgo el registro sanitario.

Decreto 612 del 2000 (abril 5)

Por el cual se reglamenta parcialmente el régimen de

registros sanitarios automáticos o inmediatos y

se dictan otras disposiciones.

N/A N/A

2, 3 5

Posteriormente a la concesión del registro sanitario automático, la autoridad podrá

verificar en cualquier momento los requisitos certificados (pudiendo contratar

estudios, investigaciones y análisis técnicos), en caso de encontrar inconsistencias el titular realizar

aclaraciones en 10 días hábiles; de lo contrario se suspenderá el registro. el

régimen automático tendrá duración de 10 años

RESOLUCIONESResolución 002511 (11 de julio de

1995)

Por el cual se adopta el manual de normas técnicas de calidad-guías técnicas de análisis para medicamentos,

N/A N/A

1

Se adopta el MANUAL DE NORMAS TECNICAS DE CALIDAD-GUIAS TECNICAS DE ANALISIS, tercera

edición. Expedido por el instituto nacional


N/A: no especifica la norma- no aplica

materiales médicos quirúrgicos, cosméticos.

de salud, para el control de calidad de los medicamentos, cosméticos, etc.

Resolución 02800 de

1998

Por el cual se establece el cumplimiento de las Buenas Prácticas de Manufacturas

para los productos Cosméticos importados en

los casos en que las autoridades sanitarias no emitan el certificado de

cumplimiento de las BPMC

N/A N/A

1

Cuando las Autoridades sanitarias del país origen no emitan el certificado de

cumplimiento de las BPMC, este requisito se surtirá ante el INVIMA, con la presentación del certificado ISO-9002 del

país de origen, de los contrario el importador declarara bajo gravedad de

juramento de acuerdo a su normatividad el cumplimiento de las BPMC.

Resolución 2003024596

de 12/12/2003

Por el cual se UNIFICA el sistema de codificación de los productos cosméticos

N/A N/A 1, 2

Se unifica el sistema de codificación de los países miembros de la Comunidad

Andina, para identificar los productos que cuentan con el Registro Sanitario,

estableció la codificación NSC –AÑO (de concesión del Registro Sanitario) – CO-

CONSECUTIVO INTERNO.

Resolución 003773

10/11/2004

Por el cual se adopta la Guía de Capacidad para la

Fabricación de productos Cosméticos.

N/A N/A 1

La Guía de Capacidad Para la Fabricación de Productos Cosméticos

(anexo1), es requisito necesario para el cumplimiento y certificación de la

Capacidad de Fabricación ( señalado en el artículo 29 de la decisión 516)

Resolución 003774

10/11/2004

Por el cual se adopta la Norma Técnica Armonizada

de Buenas Prácticas de Manufactura Cosmética y la guía de la verificación de las

BPMC.

N/A N/A

1, 2

Se adopta en el anexo 1 la Norma técnica Armonizada de Buenas Prácticas de

Manufactura cosmética; así mismo en el anexo 2 se adopta la Guía de Verificación

de BPMC

CIRCULARES

Circular Externa 100-

00138-04

Se establece acerca de la información acerca de la

fecha de vencimiento de los productos Cosméticos.

N/A N/A N/A

No es obligatorio indicar en los textos de etiquetas y empaques la vida útil o fecha

de vencimiento; sin eximir que el laboratorio fabricante en la visita

efectuada por el INVIMA, debe reportar el análisis de producto terminado realizado por un periodo determinado (lote piloto),

garantizando su conservación de las propiedades del producto desde su

fabricación.

Circular Externa DG-100-0167-09

Se expone el trámite necesario para la

Notificación Sanitaria Obligatoria ante el INVIMA.

N/A N/A N/A

La presentación de los requisitos legales, de forma técnica (organoléptica,

fisicoquímica, lote, forma de presentación, material de envase, instrucciones de uso, formula cuantitativa, cualitativa, IUPAC,

bondades del producto). Circular

Externa DG 3001866

Iniciar la implementación de sistema de codificación armonizado la NSO, para cosméticos

N/A

N/A

N/A

Se explica en una tabla la codificación de la NSO; con variables como, tipo de producto, numero de la NSO, AÑO Y

PAIS


TABLA 2

NORMATIVIDAD DE COSMETICOS DE LA COMUNIDAD ANDINA, TAMBIEN ADOPTADA POR COLOMBIADECISIÓN

Decisión 516 (15 de marzo de

2002)

Armonización de las Legislaciones en materia de

cosméticos

N/A I

3, 4

Los productos cosméticos que se comercialicen el la subregión Andina ,

deben cumplir los requisitos para adquirir la NSO, así mismo sus ingredientes

pueden o no incorporarse a su formulación, de acuerdo a los listados

internacionales establecidos por (FDA, CTFA, COLIPA y Unión Europea), no obstante las Autoridades Sanitarias

Competentes podrán hacer estudios , para incluir o excluir un ingredientes.

N/A II

6, 16

La Notificación Sanitaria Obligatoria (NSO), es la comunicación de las

Autoridades Nacionales Competentes, que el cosmético, será comercializado a

partir de determinada fecha por el interesado, esta no tendrá vigencia inferior

de 7 años.

N/A II

7

Para adquirir la NSO se debe cumplir los requisitos legales, requisitos técnicos

(cualitativa, cuantitativa, organoléptica y fisicoquímicas, microbiológicas, bondades,

etiqueta y rotulado, materiales, nomenclatura internacional, genérica de

los ingredientes) (certificado de venta libre).

N/A II

10, 14

Los productos con la misma composición básica cuali-cuantitativa con diferentes propiedades organolépticas (color, olor, sabor, tonos), serán considerados en un

mismo grupo cosmético. Si se decide incluir nuevas propiedades organolépticas, se entenderá como ampliación de la NSO.

N/A II

12, 13, 15

Las reformulaciones en componentes secundarios no requieren nueva NSO,

solo documentar los cambios. Ocurriendo lo contrario en las reformulaciones

sustanciales. De lo contrario será causal de sanciones.

N/A V

29

Los países miembros adoptaran la Norma técnica Armonizada de BPMC; las

Autoridades Nacionales Competentes exigirán un nivel básico de cumplimiento de las BPMC, para otorgar la licencia de

funcionamiento, esta será indefinida y necesaria para acceder a la NSO.

N/A VI 30

Las Autoridades Nacionales Competentes de los países miembros, se prestaran

asistencia mutua y cooperación e intercambiaran información para

desarrollar la decisión 516.

Resolución 797

Reglamento de la Decisión 516 sobre control y vigilancia

sanitaria de productos cosméticos.

N/A III

3, 4 5, 7

El control y vigilancia de los productos cosméticos se llevara a cabo mediante la

verificación en los establecimientos destinados a elaborar, almacenar,

distribuir y comercializar; estas visitas se llevaran a cabo mediante un programa anual de visitas, teniendo en cuenta los casos prioritarios, de acuerdo a l posible riesgo sanitario según la naturaleza del producto. Las Autoridades Nacionales

Competentes, podrán tomar muestras en cualquiera de las etapas de fabricación,


N/A: no especifica la norma- no aplica

Existe diversidad de normas decretadas que regulan la industria de cosméticos en Colombia, muchas de ellas acogidas de Comunidad Andina (CAN). En su gran mayoría este tipo de documentos nacionales se establecen con el objeto de dar cumplimiento a normas supranacionales; como lo es la decisión 516 de la CAN. En esta decisión los países miembros armonizaron los requisitos para la industria cosmética, necesarios para otorgar la Notificación Sanitaria Obligatoria (NSO) que equivale para efectos de control y vigilancia al Registro Sanitario. Dentro de los requisitos generales se encuentran (nombre del representante legal, nombre del producto o grupo cosmético, forma cosmética, entre otros), los requisitos técnicos (descripción del producto con su formula cualitativa, declaración cuantitativa, nomenclatura internacional o genérica, especificaciones organolépticas, fisicoquímicas y microbiológicas, entre otras), se decreta la certificación

procesamiento, envase expendio, transporte o comercialización.

N/A IV 10 Acerca de las medidas sanitarias, como inmovilización y suspensión temporal.

N/A V 13, 14

Las causas de sanciones administrativas (amonestación, multa, decomiso,

suspensión o cancelación), en el caso que no se cumpla la decisión 516, falsedad de la información, riegos sanitarios o peligro

para la salud en el uso del cosmético.

N/A VI 16

Cuando se adopte una medida de sanción o seguridad a los productos, se informara

a la Secretaria General y países miembros en un tiempo no inferior a 5 días hábiles.

N/A VII 18, 19, 20

Las Autoridades Nacionales Competentes, deberán llevar un registro sistematizado de la información de los resultados de

control y vigilancia sanitaria de los establecimientos, esta será informada a

países miembros para prevenir, investigar y combatir los riesgos sanitarios de los

cosméticos

Resolución 1333 (30 de junio 2010)

Adiciones a la resolución 797-criterios de

homologación de la codificación en materia de

cosméticos. Formatos para la NSO, de productos

cosméticos, su renovación, reconocimientos y cambios.

N/A N/A

2

Se adoptan los formatos para, presentar notificaciones sanitarias obligatorias,

solicitudes de reconocimiento, renovaciones del código de identificación e información sobre cambios de NSO, dar

respuesta a interesados sobre las notificaciones sanitarias obligatorias.

Resolución 1418 (9 de

junio de 2011)

Adiciones a la Resolución 797- limites de contenido

microbiológico de productos cosméticos.

N/A N/A

1

Se anexa en el cuadro 1 se informa los parámetros de control microbiológico para

cosméticos; en el cuadro 2 condiciones para cosméticos en los que se presumirán

libres de contaminación microbiológica.

ACTA

Acta V Reunión

2011 N/A N/A N/A N/A

Se armoniza la decisión 516 y resoluciones 797 y 1333. En cuanto a los ingredientes

autóctonos y los destinados a hoteles, restaurantes entre otros; así mismo se

establece sobre la renovación e información de cambios de la NSO.


TABLA 3

de las buenas practicas de manufactura para cosméticos (BPMC) entre otros requisitos. Además se establecen estrategias y acuerdos de comunicación entre los miembros, como medida de transparencia y apoyo frente a los posibles interferentes en los procesos de producción de cosméticos; para mayor información remitirse a la norma.

Para dar cumplimiento a los requisitos establecidos en la decisión 516, Colombia ha decretado diversas normas (tabla 1 y 2), sin embargo frente a los requisitos microbiológicos estas son poco explicitas, solo señala el cumplimiento de los requisitos microbiológicos, como se menciona en el Decreto 219, Titulo II, capitulo II, articulo 17 (tabla 1); es el mismo caso de la Resolución 02511, en el que se establece un MANUAL DE NORMAS TECNICAS DE CALIDAD- GUIAS TECNICAS DE ANALISIS (tabla 1); sin embargo estos documentos no son específicos en cuanto a los parámetros y procedimientos para la evaluación microbiológica de los cosméticos, dándole la opción al industrial de guiarse para obtener resultados de calidad microbiológica bajo su criterio y/o adoptando los requisitos internacionales de interés como complemento a la información nacional.

Es por ello que la CAN, al encontrar estos vacíos, el 9 de junio de 2011, estableció la Resolución 1418, documento acogido por Colombia; en el cual se decreta acerca de los parámetros microbiológicos que debe cumplir un cosmético comercializado en los países miembros. Dentro de los criterios establecidos se encuentra la clasificación de los cosméticos de acuerdo a la fase etaria y zona de aplicación; especificándose los limites de recuentos y los �microorganismos de evaluación (mesófilos aerobios totales, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans y Coliformes totales); dejando un faltante de información sobre los procedimientos y resultados necesarios para la evaluación de cada uno de los �microorganismos exigidos. Así mismo se establece las condiciones en las que un producto se presume libre de contaminación microbiológica. Por tanto a continuación se analiza los parámetros y procedimientos decretados por la normatividad internacional (FDA; COLIPA; UNION EUROPEA), con el objeto de identificar los faltantes de la normatividad nacional necesarios para asegurar la calidad microbiológica de los cosméticos.

ANALISIS COMPARATIVO DE LOS PARAMETROS Y PROCEDIMIENTOS PARA LA EVALUACION MICROBIOLOGICA DE LOS COSMETICOS

REQUISITOS COLOMBIA COLIPA UNION EUROPEA FDAAnálisis de

microrganismos aerobios mesófilos

Parámetros Cosméticos área

de ojos, bebe, mucosas (102 UFC/

g o mL) Demás productos (103 UFC/ g o mL)

Parámetros Cosméticos área de ojos y bebe (5*102 UFC/ g o

mL) Demás productos ( 5*

103 UFC/ g o mL)


de ojos y mucosas (102 UFC/ 0.5 g o

mL) Demás productos ( 103UFC/ 0.1 g o

mL)

Parámetros Cosméticos área de ojos

(5*102 UFC/g o mL) Demás productos ( 1* 103

UFC/ g o mL)


Procedimientos No se especifica

Procedimientos Filtración por membrana:

se especifica el procedimiento y los

materiales, (TI) Y (TE)

Recuento en placa: se especifica el

procedimiento y los materiales, (TI) y (TE) iguales a la anterior

técnica


Procedimientos Recuento en placa: se

especifica el procedimiento y los materiales (TI) y (TE)

Resultados No se especifica

Resultados Se especifica como

calcular


Resultados Se especifica como calcular

Análisis para hongos y levaduras (Candida Albicans)

Parámetros Hongos y

levaduras: No se especifica

Candida albicans: Productos a ser utilizados en los

órganos genitales externos (ausencia

total)

Parámetros Hongos y levaduras: Los mismos establecidos en

mesófilos aerobios.

C. albicans: Para cualquier tipo de

cosmético ausencia en 0.1 g o mL

Parámetros Hongos y

levaduras: No se especifica.

C. albicans:

Cosméticos área de ojos y mucosas ( Ausencia 0.5 g o

mL) Demás productos (Ausencia 0.1 g o

mL)

Parámetros

Hongos, levaduras y C.albicans : No se especifica

Procedimientos

Hongos, levaduras y C albicans : No

se especifica

Procedimientos Los mismos establecidos para mesófilos aerobios.

C.albicans: Se

mencionan los métodos para evaluación ( siembra en agar

dextrosa saboraud, examinación

microscópica, tubo germinativo y formación

de clamidiosporas)

Procedimientos Hongos, levaduras y C.albicans : No

se especifica

Hongos, levaduras y C.albicans : No

se especifica

Procedimientos Hongos y levaduras: Se

mencionan la técnica en placa con medios agar extracto de

malta (MEA) o agar papa dextrosa (PDA), (TI) y (TE) y método de enriquecimiento,

caldo saboraud dextrosa (opcional)

C.albicans : No se especifica

Resultados Hongos , levaduras C.albicans: No se

especifica

Resultados Hongos y levaduras: Los

mismos establecidos para mesófilos aerobios C.albicans: Se menciona los resultados para los métodos propuestos

Resultados Hongos, levaduras y C.albicans : No

se especifica

Resultados Hongos y levaduras: para

tecnica en placa, como realizar los cálculos.

C.albicans : No se especifica

Análisis para bacilos Gram

positivos

Parámetros No se especifica







Procedimientos se menciona el procedimiento y materiales para estimular la

formación de espora, tinción para posición y

morfología de endospora y movilidad (examinación

microscópica y en medio de cultivo)

Resultados

No se especifica Resultados



Se especifica la interpretación


de los procedimientos propuestos

Análisis para cocos Gram

positivos (Staphylococcus

aureus y/o Enterococcus

Spp , Streptococcus

Spp, S. epidermidis , s

hemolítico y micrococcus )

Parámetros Cualquier tipo de

cosmético ausencia de S.aureus 1 g o

mL

Demás Cocos Gram positivos No

se especifica

Parámetros Cualquier tipo de

cosmético ausencia de S.aureus 0.1g o mL

Demás Cocos Gram

positivos No se especifica


de ojos y mucosas (ausencia S.aureus

0.5 g o mL) Demás productos

( ausencia S.aureus 0.1 g o

mL)

Demás Cocos Gram positivos No

se especifica

Parámetros Cualquier tipo de cosmético

Ausencia de cualquier patógeno y patógeno

oportunista

Procedimientos

S. aureus ni demás cocos Gram


Procedimientos

S.aureus: Se mencionan los métodos para

evaluación (Baird parker, prueba de Gram,

catalasa y coagulasa)

Demás Cocos Gram positivos No se

especifica

Procedimientos



Procedimientos Para todos los cocos Gram

(+): Se menciona los procedimiento y materiales

(TI) y (TE)para siembra (agar Baird-parker y Vogel-

jonhnson) Pruebas confirmatorias:

coagulasa, Catalasa Bilis esculina, caldo tripticasa de soja, agar sangre de ovejo

5% Confirmatoria de catalasa

(agar manitol salado y oxido fermentación con dextrosa

OF). Resultados



Resultados S.aureus: Se menciona los resultados para los métodos propuestos

Demás Cocos Gram


Resultados



Resultados

Para todos los cocos Gram (+) Se especifica la interpretación


Calculo de resultados para S.

aureus. Análisis para bacilos Gram

negativos (Pseudomonas Aeruginosa y

Enterobacterias y coliformes

totales)

Parámetros Ausencia de P.

aeruginosa en 1 g o mL para

cualquier tipo de cosmético

Ausencia de

Coliformes totales en 1g o mL

No se especifica

para Enterobacterias

Parámetros Ausencia de

P.aeruginosa en 0.1g o mL para cualquier tipo

Coliformes totales y

Enterobacterias: No se especifica


de ojos y mucosas (ausencia de P.

aeruginosa 0.5 g o mL)

Demás productos ( ausencia de

P.aeruginosa 0.1 g o mL)



Parámetros

P. aeruginosa: Ausencia para cualquier tipo de cosmético



Procedimientos

P.aeruginosa Coliformes totales y

Enterobacterias: No se especifica.

Procedimientos

P.aeruginosa: Se mencionan los métodos

para evaluación ( siembra en agar

centrimide, prueba Gram, prueba oxidasa, movilidad, crecimiento a

Procedimientos

P.aeruginosa, Enterobacterias y Coliformes totales: No se especifica

Procedimientos P. aeruginosa: se mencionan procedimientos, materiales,

(TI) y (TE) para identificación presuntiva ( agar cetrimide y

hierro triple azúcar (TSI)), prueba de la oxidasa

Y pruebas bioquímicas: agar YE ; caldo citrato Koser’s y),


42°C)

Coliformes y Enterobacterias: No se

especifica

caldo malonato nitrato motilidad arginina

descarboxilasa, luefacion de la gelatina, agar

Pseudomonas F Y P, Tincion de flagelos

No se especifica para

Coliformes totales

Se menciona para Enterobacterias la tecnica de siembra en agar MacConkey y pruebas confirmatorias en

TSI

Resultados

P. aeruginosa, Coliformes totales y


Resultados P. aeruginosa: Se

menciona los resultados para los métodos

propuestos

Coliformes totales, Enterobacterias: No se

especifica

Resultados

P.aeruginosa, Enterobacterias y Coliformes totales: No se especifica

Resultados

P. aeruginosa: Se especifica la interpretación de los

procedimientos propuestos

Coliformes totales: No se especifica

Enterobacterias:

interpretación de pruebas confirmatorias

Análisis de Clostridium

tetani




Parámetros Ausencia para cualquier tipo

de cosmético Procedimientos No se especifica



Procedimientos Se describe procedimientos y materiales, (TI) y (TE) ( agar

Letheen, agar anaerobio y sangre modificado)

( condiciones anaeróbicas) Prueba de esporas: (caldo

carne cocida); Tinción de esporas

resultados No se especifica

resultados No se especifica


Resultados Se especifica la interpretación


La prueba de desafío (para

producto terminado)







Procedimientos Se dan

generalidades del procedimiento y los microorganismos




Resultados Se dan resultados

generales de procedimiento

propuesto


Tabla 3: tiempo se define como (TI) y temperatura (TE)

De acuerdo a la información de la tabla 3, se puede determinar que los mas altos estándares de parámetros para la evaluación microbiológica de aerobios mesofilos y


patógenos se decretan en la normatividad de la UNION EUROPEA seguido por la normatividad Colombiana; la diferencia de ambos parámetros se especifica en la concentración de la muestra examinada; por otro lado se puede analizar que los parámetros mas flexibles para mesofilos aerobios los presenta la FDA. No obstante la UNION EUROPEA, demuestra al igual que la normatividad Colombiana faltantes en la descripción de los procedimientos y resultados para los microorganismos exigidos en sus documentos; ventaja que se evidencia en la normatividad de la FDA, ya que esta profundiza y establece los mejores procedimientos e interpretación de resultados, necesarios para la evaluación de aerobios mesofilos, Cocos Gram Positivos y Bacilos Gram positivos y Gram negativos así como Clostridium tetani, para mayor información remitirse al anexo 2 o a las normas. Sin embargo esta norma presenta vacíos en cuanto a la interpretación de los resultados establecidos para mesofilos aerobios; información que se encuentra mejor detallada en la normatividad de COLIPA; otras de las desventajas de la FDA se analiza frente al faltante de los requerimientos de parámetros y procedimientos para el análisis de Candida albicans; Ventaja que se determina en la norma de COLIPA, debido a que esta es la mas explicita en lo requerido para los métodos de evaluación; así mismo la normatividad Colombiana es la mas exigente en cuanto a los parámetros establecidos para este tipo de microrganismo. Por otro lado para el análisis de hongos y levaduras, se puede analizar que la normatividad de la FDA, es la única que establece la evaluación de este tipo de microorganismos, sin embargo presenta deficiencia en el establecimiento de los parámetros e interpretación de resultados al igual que el resto de las normas nacionales e internacionales. En cuanto a la prueba de desafío la normatividad de la UNION EUROPEA, es la única que establece generalidades para el desarrollo del procedimiento e interpretación de resultados, siendo este factor de ventaja frente a la normatividad nacional e internacional analizada. De esta manera de acuerdo a todo lo anteriormente expuesto se puede determinar que la normatividad de la FDA es la mas completa, sin embargo presenta faltantes para el análisis de otros tipos de microorganismos; por tanto se recomienda que para cumplir los requisitos de comercialización nacional e internacional; el industrial tome como referencia tanto la norma nacionales, ya que en esta se establecen los mejores parámetros de análisis; como las internacionales (UNION EUROPEA, COLIPA y FDA); ya que todas complementan la información de los procedimientos e interpretación de resultados. Esto con el objetivo de mejorar la calidad microbiológica de los cosméticos, representándose en el aseguramiento de la salud de los consumidores, la apretura de nuevos mercados y facilitación de los procesos de tratado de libre comercio entre los países.


Conclusiones

• La normatividad Colombiana presenta vacíos frente a los procedimientos para el análisis de los microorganismos exigidos.

• La UNION EUROPEA establece los más altos estándares en cuanto a los parámetros de microorganismos mesofilos aerobios.

• La FDA, exige los mas altos parámetros para evaluación de patógenos y

patógenos oportunistas.

• La UNION EUROPEA, es la única normatividad que establece el desarrollo de la prueba de desafío frente a la normatividad nacional e internacional analizada.

• La FDA decreta los mejores procedimientos para mesófilos aerobios, Cocos Gram

Positivos, Bacilos Gram positivos y Gram negativos así como Clostridium tetani.

• COLIPA propone la mejor información para el análisis de Candida albicans.

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(15) COMUNIDAD ANDINA. Resolución 797 (16) COMUNIDAD ANDINA. Decisión 516. 15 de marzo de 2002 (17) COMUNIDAD ANDINA. Resolución 1333. 30 de junio 2010. (18) COMUNIDAD ANDINA. Resolución 1418. 9 de junio de 2011 (19) COMUNIDAD ANDINA. Acta v Reunión 2011 (20) COMUNIDAD ANDINA. Regulación de cosméticos en la Comunidad

Andina. (21) CONGRESO DE LA REPUBLICA DE COLOMBIA. Ley 9 de 1979 (22) CONGRESO DE LA REPUBLICA DE COLOMBIA. Ley 399 DE 1997 (23) COLOMBIA, El sector del cosmético y aseo personal en Colombia, jun

2004. (24) INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIA DE MEDICAMENTOS Y

ALIMENTOS INVIMA. Circular Externa DG 3001866. (25) INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIA DE MEDICAMENTOS Y

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ALIMENTOS INVIMA. Circular Externa 100-00138-04 (27) INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIA DE MEDICAMENTOS Y

ALIMENTOS INVIMA. Circular Externa DG-100-0167-09 (28) MINISTRO DE GOBIERNO DE LA REPUBLICA DE COLOMBIA. Decreto

1290 de 1994. (29) MINISTERIO DE PROTECCIÓN SOCIAL. Resolución 003774 (30) MINISTERIO DE PROTECCIÓN SOCIAL. Resolución numero 003773 del

2004 (31) MINISTERIO DE SALUD. Resolución numero 002511 de 1995 (32) MINISTERIO DE SALUD. Decreto numero 219 DE 1998. (33) MINISTERIO DE SALUD. Resolución numero 02800 de 1999 (34) MINISTERIO DE SALUD. Decreto numero 612 de 2000.


ANEXO 1. Normatividad en calidad microbiológica de los cosméticos en Colombia

1. NORMATIVIDAD COLOMBIANA

1.1 Resolución 1418

9 de junio del 2011

Adiciones a la Resolución 797 – Límites de contenido microbiológico de productos cosméticos

RESUELVE Artículo 1: Añadir al artículo 4 de la Resolución 797 los siguientes párrafos:

• Los productos cosméticos que se comercialicen en la subregión deberán cumplir

los parámetros de control microbiológico señalados en el Cuadro I del Anexo I de la presente Resolución.

• Asimismo, los productos cosméticos que cumplan con alguna de las condiciones establecidas en el Cuadro II del Anexo I de la presente Resolución, se presumirá que están libres de contaminación microbiológica”.

• Artículo 2: Incorporar como Anexo I de la Resolución 797 los siguientes cuadros:

ÁREA DE APLICACIÓN Y FASE ETARIA LÍMITES DE ACEPTABILIDAD

• Productos para uso infantil. • Productos para Área de ojos. • Productos que entran en contacto

con las membranas mucosas.

a. Recuento de microorganismos mesófilos aerobios totales. Límite máximo 1 x 102 UFC/g o ml.

b. Ausencia de Pseudomonas aeruginosa en 1g o ml.

c. Ausencia de Staphylococcus aureus en 1g o ml.

d. Ausencia de Coliformes totales, en 1g o ml.

• Demás productos cosméticos susceptibles de contaminación microbiológica.

a. Recuento de microorganismos mesófilos aerobios totales. Límite máximo 1 x 103 UFC/g o ml.

b. Ausencia de Pseudomonas aeruginosa en 1g o ml.

c. Ausencia de Staphylococcus aureus en 1g o ml.

d. Ausencia de Coliformes totales, en 1g o ml.

• Productos a ser utilizados en los a. Ausencia total de Candida Albicans.


órganos genitales externos

CONDICION LIMITE pH ácido ≤ 3,0

pH alcalino ≥ 10,0 Soluciones hidroalcoholicas ≥ 20 %

Temperatura ≥ 65,0 °C Actividad del agua (aw) ≤ 0,75

Productos de base solvente Sin límite Producto oxidantes Sin limite

Clorhidrato de aluminio y sales relacionadas 15% al 25 %

Anexo 2: Normatividad en calidad microbiológica de los cosméticos a nivel Internacional.

2. COLIPA GUIDELINES

2.2 Introducción:

Las concentraciones de agua en los productos cosméticos y de tocador pueden permitir el crecimiento y desarrollo de microorganismos que contaminan este tipo de productos.

Es por ello que este tipo de productos se compongan de conservantes, en unidad o en mezcla, con un alto espectro de inhibición de microorganismos.

Así mismo se ha demostrado que otros factores como la temperatura, la luz, el bajo pH; afectan e influyen en la prolongada estabilidad del producto en especial en el control y/o desarrollo de microorganismos.

El paquete o embalaje del producto es importante debido a que este puede proteger al producto del ingreso de contaminación y la condensación de agua en las partes internas donde se encuentra el producto.

2.2.1 Especificaciones de los ensayos de calidad microbiológica del cosmético:

2.2.1.1 Generalidades:

a) La identificación de las muestras para:

• Tipo de producto • Marca


• Numero de lote • Manufactura • Fecha y lugar de muestreo • Los métodos de identificación y condiciones de almacenamiento

b) Las condiciones del ensayo:

• Fecha • Técnica • Neutralización del medio

c) Los resultados del ensayo:

• Deben registrar una conclusión y el responsable del ensayo

2.2.1.2 Limites propuestos :

a. Especificaciones cuantitativas: (para 1g o 1 mL de producto)

• Productos de categoría 1: aquellos cosméticos para bebe y área de ojos Microrganismos mesofilicos: no mayor a 102 UFC/g o mL.

• Productos de categoría 2: el resto de productos cosméticos No mayor a 103 UFC/g o mL Es importante tener en cuenta la interpretación de los resultados, para ello se debe interpretar de la siguiente manera: 102 límite máximo o de aceptación es 5 * 102

103 límite máximo o de aceptación es 5 *103

b. Especificaciones cualitativas:

No se debe detectar microrganismos en 0.1 g o mL

• Pseudomonas aeruginosa • Staphylococcus aureus • Candida albicans

2.2.1.3 Método propuesto para el análisis microbiológico de los cosméticos:


Observaciones:

Determinación de los microorganismos mesofílicos aeróbicos totales de acuerdo a los siguientes factores:

• Como medida de precaución para evitar la contaminación de estos microrganismos a este tipo de productos

• Debido a que se pierden las propiedades antimicrobianas por procesos como filtración, neutralización o filtración.

• Evaluación de microrganismos mesofilicos aeróbicos mediante técnicas como recuento en placa o filtración; no es necesario los métodos de enriquecimiento.

• La identificación de estos microorganismos se debe hacer en medios selectivos.

2.2.1.3.1 Materiales y reactivos: Preparación de muestras:

Observaciones: • Para ello se debe tomar mínimo 1mL o g de muestra del producto analizar. • Para los productos en los que su peso es 1g o mL, se debe recoger varias

muestras del producto analizar. • Tomar 1g o mL del producto en 10 mL de diluyente neutralizado validado, para el

caso de sustancias poco humectables, se deberá utilizar 0,1% p/v de un agente tensioactivo, polisorbato 80.

• Si es necesario posteriormente realizar diluciones que pueden utilizarse de una suspensión stock, utilizando el mismo diluyente para saciar las actividades antimicrobianas del producto y de manera que un recuento de colonias de 10 a 100 sea fácil.

EVALUACION DE NUMEROS DE MICROORGANISMOS AEROBICOS MESOFILICOS Filtración por membrana:

• Use dos filtros de membrana con un poro de 0,45 µm (efectivos para retener bacterias estabilizadas, para este método se supone que las membrana deben tener un diámetro de 50 mm.

• Tomar 0,1 g de muestra para cada membrana y filtrar inmediatamente, posterior enjuague con una solución estéril de lavado, que puede ser una ventaja en la distribución de los organismos

• Transferir la membrana a la superficie del medio de cultivo adecuado; (para bacterias 30-35°C por 3 días, para hongos 20-25°C por 5 días), realizando el conteo en el menor tiempo, luego de pasados los días de incubación.


• El conteo de número de colonias desarrolladas se realizara número de microrganismos por g o mL analizados.

Procedimiento conteo en placa:

• Utilice cajas de Petri de dimensiones de 9-10 cm, adicione a cada caja de Petri 1 ml de la muestra preparada que representa 0,1 g del producto y aproximadamente 15 ml de medio de agar fundido a uno temperatura no superior a 45 °C. mezclando luego mantener sobre una superficie hasta enfriar el medio servido.

• Adicionalmente, difundir el producto diluido (0,1 mL por caja representado 0,01 g de producto) en la superficie total de la caja de Petri.

• Incubar para bacterias 30-35°C por 3 días, para hongos de 20-25°C por 5 días, realizando el conteo en el menor tiempo posible, después del tiempo de incubación.

• Calcular el número de colonias no mayor a 300 para bacterias y para hongos no mayor a 100.

Expresión de los resultados: Se cuentan el número de colonias UFC por caja y multiplicarlo por el número de la dilución obtenida, el resultado se da UFC por g o ml de producto examinado.

DETECCION ESPECÍFICA DE ORGANISMOS:

• Pseudomonas aeruginosa: en el medio centrimide las colonias se visualizan planas, translucidas y pueden verse de color amarillo verde azulosas.

Así mismo se debe realizar como mínimo las siguientes pruebas confirmatorias:

• Prueba de Gram. • Prueba de oxidasa • Movilidad • Crecimiento a 42 °C

Resultados: son bacilos Gram (-), móviles, oxidasa (-), crecen a 42°C.

Otras pruebas confirmatorias pueden ser utilizadas para identificar el microrganismo

• Staphylococcus aureus: en el medio baird-parker, las colonias típicas de este microrganismo se visualizan de color negro brillante, convexas y alrededor de ellas una zona clara, las cuales pueden ser parcialmente opacas.

Dentro de las pruebas mínimas confirmatorias se encuentran:

• Prueba de Gram • Prueba de catalasa


• Prueba de coagulasa Resultados: cocos Gram (-), catalasa (+), coagulasa (+)

Otras pruebas confirmatorias pueden ser utilizadas para identificar el microrganismo.

• Candida albicans: en medio dextrosa sabouraud, se visualizan colonias de color blanco, crema o beige y convexas.

Dentro de las pruebas mínimas confirmatorias se encuentran:

• Examinación microscópica • Prueba del tubo germinativo • Formación de clamidiosporas

Resultados: tubo germinativo (+), productores de clamidiosporas.

EXPRESION DE RESULTADOS:

Los resultados se reportan ausencia o presencia de Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus o Candida albicans.

APÉNDICE:

• Solución buffer de cloruro de potasio pH 7.0

equivalente a 0,067 M

Composición Concentración

Potasio dihidrogeno fosfato 3.56g

Disodio hidrogeno fosfato deshidratado 7,23g

Cloruro de sodio 4,30g

Peptona (carne o caseína) 1,0g

Esterilización en autoclave a 121°C por 15 minutos

Neutralizantes adecuados polisorbato 20 o 80 lecitina tiosulfato

• Medio para el recuento en placa de microorganismos aerobios mesofilicos:

Agar caseína de soya digerida:



Digerido pancreático de caseína 15,0g

Digerido papaico de la soja 5,0g

Cloruro de sodio 5,0g

Agar 15,0g

Agua purificada 1000mL

Ajustar el pH a 7,3 +/- 0,2 después de la esterilización en autoclave 121°C por 15 minutos.

• Medio para el conteo de hongos:

Agar dextrosa sabouraud



Dextrosa monohidratada 40,0g

Agar 15,0g


Ajustar el pH 5,6 +/- 0,2 después de la esterilización en autoclave a 121°C por 15 minutos.

• Medio para aislamiento de Pseudomonas areuginosa:

Agar centrimide:


Digerido pancreático de gelatina 20,0g

Extracto de carne de res 5,0g

Extracto de levadura 1,0g

Cloruro de litio 5,0g

Agar 20,0g


Glicina 12,0g

Piruvato de sodio 10,0g


Glicerol 10,0mL

Ajustar el pH 7,2 +/- después de la esterilización en autoclave a 121°C por 15 minutos.

• Medio para aislamiento de Staphylococcus aureus:

Agar baird-parker:


Digerido pancreático de caseína 10,0g

Extracto de carne de res 5g

Extracto de levadura 1g

Cloruro de litio 5g

Agar 20g

Glicina 12,0g

Piruvato de sodio 10,0g


Ajustar el pH 6,8 +/- después de la esterilización en autoclave a 121°C por 15 minutos, dejar enfriar de 45°C a 50°C y agregar 10mL de la solución de telurito de potasio al 1% m/v y 50mL de emulsión de yema de huevo.

• Medio para el aislamiento de Candida albicans:

Agar dextrosa sabouraud:



Dextrosa monohidratada 40,0g


Agar 15,0g


Ajustar el pH 5,6 +/- 0,2 después de la esterilización en autoclave a 121°C por 15 minutos.

3. NOTAS GUÍAS PARA LA EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE PRODUCTOS COSMÉTICOS

TERCERA EDICIÓN UNIÓN EUROPEA.

ANEXO 8: guía para la evaluación de la calidad microbiológica en el producto terminado.

Introducción:

La piel y las mucosas se encuentran normalmente protegidas al ataque microbiano, sin embargo muchos productos cosméticos al entrar en contacto con este tipo de piel, pueden alterar y dañar esas barreras, facilitando la infección microbiana; esto ocurre especialmente con aquellos productos que tienen contacto sobre las zonas de los ojos, membranas mucosas, en piel dañada o inmunocomprometida como ocurre en el caso de niños menores de 3 años, personas mayores, entre otras. Siendo estas razones argumentables para definir dos categorías de productos cosméticos, evaluados bajo controles de calidad con limites microbiológicos establecidos.

Aunque pocos son los casos de patologías por infecciones microbianas por cosméticos; se conocen que estos pueden ocasionar foliculitis infecciosas, reportadas por dermatólogos. Frente a la contaminación de las manos otros tipos de microrganismos pueden afectar la calidad de los productos cosméticos, haciéndose necesario un control microbiológico sobre los cosméticos, como garantía de calidad para los consumidores.

Categorías de cosméticos para el control de calidad microbiológico

Se define dos categorías:

• Categoría 1: son aquellos productos usados para niños de 3 años, área de ojos y membranas mucosas

• Categoría 2: otros productos

Límites cuantitativos:


El límite de los cosméticos se clasifica en:

Categoría 1: recuento total de microorganismos aerobios mesófilos no mayor a 102UFC/ en 0,5 g o mL de producto.

Categoría 2: recuento total de microorganismos aerobios mesófilos no mayor a 103UFC/ en 0,1 g o mL de producto.

Limites cualitativos:

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Candida albicans, son considerados patógenos potenciales para este tipo de productos cosméticos.

Para la categoría 1: deben estar ausentes en 0,5 g o mL, de producto analizado.

Para la categoría 2: deben estar ausentes en 0,1 g o mL, de producto analizado.

Conservación del producto:

Los contaminantes microbianos tienen dos orígenes: durante la producción y llenado, y durante el uso del cosmético por el cliente. Desde el momento en que se abre la unidad estética hasta que el consumidor termina el producto, existe una variable de contaminación microbiana permanente, causada por el entorno doméstico y el cuerpo del consumidor (manos y la piel del cuerpo). Por tanto las razones de preservación microbiana en cosméticos son los siguientes:

• Para garantizar la seguridad microbiológica de los cosméticos usados por los consumidores.

• Para mantener la calidad y las especificaciones destinadas para el producto. • Para conservar las condiciones higiénicas y de manipulación como garantía de

calidad.

La prueba de desafío:

La eficacia de la conservación ha de ser evaluada experimentalmente durante el proceso de desarrollo para asegurar la estabilidad microbiana y preservación, mediante ensayos de ataque.

La prueba de provocación es obligatoria para todos aquellos productos que en condiciones normales de almacenamiento y uso; con el objeto de disminuir el riesgo de infección para el consumidor o un deterioro del producto.


La prueba de provocación consiste en una contaminación artificial del producto acabado, para posteriormente realizarse una evaluación que garantice la disminución de los niveles de contaminación hasta los límites permitidos para la categoría 1 y 2.

Los microorganismos utilizados en la prueba serán aislados a partir de cepas de la colección oficial de cualquier estado de la UE para asegurar la reproducibilidad de la prueba y serán los siguientes: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Candida albicans. Bacterias y hongos adicionales podrían ser utilizados para otros fines específicos de la prueba de provocación.

La actividad microbicidas de los conservantes o cualquier otro compuesto en el producto cosmético final, debe ser descartada de la prueba por dilución, filtración, neutralizadores o cualquier otro medio. El rendimiento experimental de los controles microbianos y las pruebas de provocación debe ser establecido y validado por un microbiólogo.

4. US. FDA: FOODS AND DRUGS ADMINISTRATION METODOS MICROBIOLOGICOS PARA COSMETICOS

MANUAL BACTERIOLOGICO ANALITICO CAPITULO 23

AGOSTO DEL 2001

Dentro de los métodos para el aislamiento de microorganismos de productos cosméticos; se encuentran aquellos que requieren de enriquecimiento y otros recuentos directos de las colonias. Los productos que no son solubles en agua son inicialmente tratados para hacerlos miscibles a los procedimientos de aislamiento que se llevan a cabo.

Por otro lado otros de los métodos utilizados para la evaluación microbiológica de los cosméticos, incluyen aquellos que implican diluciones y medios en placa, utilizados para inactivar parcialmente los sistemas de conservación que se encuentran comúnmente en los productos cosméticos. Los microorganismos aislados son identificados por los métodos microbiológicos de rutina o por equipos de identificación comercial.

Equipos y materiales:

• Pipetas estériles, 1.5, y 10 ml, se graduó • Gasas estériles, de 4 x 4 pulgadas • Instrumentos estériles: pinzas, tijeras, bisturís y cuchillas, espátulas, y

microespatulas. • Tubos de ensayo, con tapa de rosca, 13 x 100, 16 x 125, y 20 x 150 mm • Botellas de dilución, con tapa de rosca • Balanza, sensibilidad de 0,01 g • Cajas de Petri, estériles, de plástico, 15 x 100 mm


• Rastrillos • Incubadoras, 30 ± 2 ° C y 35 ± 2 ° C • Sobres que generan atmosfera anaeróbica atmósfera, las tiras indicadoras, y

frascos (BBL o Oxoid), o incubadora anaeróbica, 35 ± 2 ° C, cámara anaeróbica, 35 ± 2 ° C.

• Frascos para vela o incubadora de CO2, 35 ± 2 °C. • Campana de flujo laminar con filtro HEPA, si está disponible • Vitek o sistema computarizado automático de identificación • Medios para la identificación y recuento de bacterias Gram-positivas y hongos • Agar Anaerobios (M11) • Agar bilis esculina (M18) • Agar y caldo Infusión de cerebro y corazón (BHI) (M24) • Agar extracto de malta (MEA) (M93) • Agar papa dextrosa (PDA) (M127) • Agar manitol salado (M97) • Agar modificado Letheen (MLA) (M78) y el caldo (MLB) (M79) • Medio para la prueba Oxidativo-fermentativa (OF) (M117) • Caldo saboraud dextrosa (M133) • Agar base de sangre (M20A) • Agar de Almidón(M143) • Agar tripticasa (tríptico) de soja (TSA) (M152) y el caldo (TSB) (M154) • Agar baird-Parker (BP) (M17) • Prueba de la catalasa (R12) • Agar vogel-Johnson (VJ) (opcional) (M176) • Kit comercial de identificación bacteriana (API o equivalente).

Aislamiento e identificación de los microorganismos en cosméticos:

• Preparar la muestra • Diluir las muestras preparadas en MLB. • Sembrar por duplicado 0.1 ml en:

a) b) c) d)

MLA 48h, 30°C

PDA (o MEA) con clorotetraciclina

7 días, 30°C

Agar BP (o VJ) 48h, 35°C (opcional)

Agar Anaeróbico MLA

2-4 días, 35°C Fig.1. abreviaciones: MLB caldo modificado Letheen; MLA agar modificado Letheen, PDA agar papa dextrosa; MEA agar extracto de malta; BP Baird-Parker; VJ Vogel-Johnson.


• Enriquecer diluciones MLB durante 7 días, a 30 °C. Purificar el crecimiento sólo si no hay colonias en la MLA.

• Contar las colonias y otros tipos de colonias diferentes en MLA y agar MacConkey (y agares BP o VJ si). Para aislamientos de hongos, se especificara mas adelante.

• Realizar tinción Gram, determinar forma de la célula, y la producción de catalasa purificada de aislamientos.

• Procederá a la identificación del aislamiento bacteriano, como se describe mas adelante.

Medios para la identificación de Enterobacterias:

• Caldo de carbohidratos Andrade's y el indicador (M13) para probar el metabolismo ramnosa, manitol, sorbitol, arabinosa

• Agar lisina hierro (M89) • Caldo Malonato (M92) o caldo Malonato fenilalanina (Difco) • Medio motilidad-indol ornitina (M99) • Caldo MR-VP (M104) • Agar citrato Simmons (M138) • Agar hierro triple azúcar (TSI) (M149) • Agar urea de Christensen´s (M40) • Agar MacConkey (M91) • Medio descarboxilasa lisina para bacterias Gram-negativas no fermentadores

(M88) • Agar fenilalanina desaminasa (M123) • API 20E, Roche enterotube, u otros equipos de identificación equivalente • Incubar todas las pruebas bioquímicas utilizando medios en B y C, descritos en el

cuadro, a 35-37 ° C durante 18-24 h, excepto caldo malonato (48 h) y caldo MR-VP (48 h o más).

Medios y reactivos para la identificación de bacterias Gram-negativos, bacilos no fermentadores (NF).

• Medio acetamida (M2) • Clark flagelar stain (R14) • Agar esculina, modificada (CDC) (M53) • Nutrientes gelatina (CDC) (M115) • Indol medio (M64) y el indol medio (CDC) (M65) • Medio King B (M69) • Lisina descarboxilasa (PMA) medio para bacterias Gram-negativas NF (M88) • Medio de nitrato, movilidad (M101) • Caldo de nitrato, enriquecido (CDC) (M109)


• Medio basal King O/F (M70) para probar el metabolismo, sacarosa, lactosa, fructosa, esculina, xilosa, glucosa (dextrosa), manitol, salicina, sorbitol y maltosa

• Tiras para la prueba oxidasa • Agar urea de Christensen´s (M40) • Base de medio descarboxilasa (de arginina descarboxilasa) (M44) • Extracto de levadura (YE) agar (M181) • Agares de Pseudomonas F (M128 y P (M129) (Difco) • Agar cetrimida (PseudoselTM, BBL, Difco), o equivalente (M37) • Glicerol, estéril (Difco), o equivalente • API, NFT, u otro sistema equivalente identificación comercial • Caldo citrato de Koser (M72)

Otros medios y reactivos: • Solución acuosa de etanol al 70% y 1% de HCl (v / v) o 4% de yodo en solución de

etanol al 70% o 2% de glutaraldehído en solución. • Tween 80 (Polysorb 80) • Etanol, 95% (v / v) • Plasma liofilizado de conejo con EDTA • Solución acuosa con 3% (v / v) de peróxido de hidrógeno • Tinción de Gram (R32) y tinción de endospora (R32a) • Medio de carne cocida (M42)

Manejo de las muestras cosméticas para el análisis microbiológico

Analizar las muestras tan pronto como sea posible después de su llegada. Si las muestras lo requieren, guárdelas a temperatura ambiente. No incube, refrigere o congele las muestras antes o después del análisis. Inspeccione cuidadosamente las muestras antes de la apertura y tomar nota de las irregularidades del empaque de las muestras. Antes de abrir el cosmético desinfecte superficie del recipiente de la muestra con etanol al 70% (v / v) y 1% de HCl u otro desinfectante. Use campana de flujo laminar, si es posible. Seque la superficie con una gasa estéril antes de la apertura. Utilizar una porción representativa de la muestra, por ejemplo, 1 g (ml) porción de la muestra.

Para los productos que pesan menos de 1 g (ml), analizar todo el contenido. Si sólo hay disponible y se solicitan varios análisis (es decir, microbiano, toxicológicos y de química), tomar una submuestra para análisis microbiológico, antes que los de otros análisis. En esta situación, la cantidad de submuestra utilizada para el análisis microbiano dependerá de otros análisis a realizar. Por ejemplo, si el contenido total de la muestra es de 5 ml, utilizar 1 o 2 ml para los análisis microbiológicos.

Preparación preliminar de la muestra:


Ajustar la cantidad de muestra y diluyente dependiendo de la cantidad de muestra disponible.

• Líquidos: Decimalmente diluir 1 ml de líquido directamente en 9 ml de caldo de modificación Letheen (MLB) en un tubo de ensayo de 20 x 150 mm , con tapa de rosca, esto para la dilución 10-1.

• Sólidos y en polvo: Retirar de forma aséptica y pesar 1 g de muestra, suspenderla en un tubo de ensayo de 20 x 150 mm, con tapa de rosca que contiene 1 ml de agua estéril de Tween 80. Mezclar el producto en Tween 80 con una espátula estéril. Añadir 8 ml de agua estéril MLB y mezclar bien. Esto para la dilución 10-1.

• Crema y productos a base de aceite: Retirar de forma aséptica y pesar 1 g de muestra, suspenderla en un tubo de 20 x 150 mm con tapa de rosca del tubo que contiene 1 ml de agua estéril de Tween 80, más de cinco a siete de 5 mm perlas de vidrio (o de diez a quince de 3 mm de perlas de vidrio). Mezcle el contenido total con mezclador Vortex. Ajustar el volumen total a 10 ml con estéril MLB (8 ml) esto para la dilución 10-1.

• Los aerosoles de polvo, jabones, líquidos y otros materiales: Descontaminar boquilla de pulverización, con un algodón con gasa humedecido con etanol al 70% (v / v). Expulsar porción del producto, por ejemplo, 1 g de producto en 9 ml de MLB estéril. Mezclar bien los productos y el caldo, y se vuelve a pesar. Esta será una dilución 10-1 si exactamente 1 g de muestra se obtuvo.

• Materiales anhidros: Se realiza de la misma forma como para productos cosméticos solidos, en polvo, Crema y productos a base de aceite.

Evaluaciones microbiológicas:

No todos los análisis que se describen a continuación se llevarán a cabo necesariamente, sin embargo, el recuento de microorganismos aerobios mesófilos, enriquecimiento de la cepa y el recuento de hongos se debe realizar de forma rutinaria.

Recuento en placa aerobio (APC). Utilice una técnica de difusión en placa, para facilitar el reconocimiento de los diferentes tipos de colonias, se puede utilizar agares como Baird-Parker (BP) o Vogel-Johnson (VJ), para el reconocimiento de Staphylococcus spp.

Tome entre 5 o 10 ml o g de la preparación cosmética y añadirla en 45 o 90 mL de MLB, realizar diluciones de 10-1 a 10-6, y sembrar por duplicado en agar Letheen modificado. Diluir las muestras decimalmente en MLB (NOTA: conservar las diluciones para la etapa de enriquecimiento) para obtener diluciones en serie de 10-1 a 10-6. (Comience con 10-2 si la dilución 10-1 se agota.) Mezclar bien las diluciones y con una pipeta tomar 0,1 mL y agregarla en sobre la caja de Petri y con un rastrillo (esterilizarlo por inmersión en etanol al 95%) esparcir la muestra sobre toda la superficie del medio, incubar durante 48 horas a


30 ± 2 ° C (35 ° C para las placas de BP). Para la absorción eficaz del inóculo, se debe dejar solidificar el agar en seco a (30 min a 35 ° C) cuando está recién hecho de agar.

Realizar los recuentos de las placas que contienen entre 25-250 colonias. El resultado del recuento se multiplica por inverso de la dilución (10-1 – 10-2). Informar los resultados como APC / g (ml) de la muestra. Si en las placas no contienen colonias 25-250, informar que no se encontraron colonias.

Para placas con medio BP, cuente las colonias bien distribuidas que son convexas, negras brillantes, incluyendo aquellas que tengan o no una zona clara alrededor de la colonia. (NOTA: las coagulasa positiva producen zonas de aclaramiento, pero las colonias coagulasa negativos pueden o no producir zonas de aclaramiento. Si la coagulasa-negativos tiene zonas de aclaramiento, su forma irregular, las hace distinguir de las colonias coagulasa positivos.) Seleccionar las placas que tienen más de 250 colonias, cuando la dilución mayor no contiene los tipos coloniales descritos anteriormente. Así mismo se puede utilizar las siembras de diluciones, en las que se tienen menos de 25 colonias. De cada caja de BP, escoja una o más colonias típicas para confirmar su reacción coagulasa. Siembre muestra de la colonia en cualquier tipo de agar inclinado por ejemplo, agar tripticasa (tríptico) de soja (TSA), agar infusión de cerebro-corazón (BHI). Incubar de forma inclinada hasta que el crecimiento sea evidente.

Calcular el número de microorganismos coagulasa positiva. Multiplique esta fracción por el número promedio de colonias contadas de Staphylococcus en el medio BP. Multiplicar el número obtenido por el factor de dilución correspondiente y el informe como el número de S. aureus / g (ml) de la muestra.

Si no se obtienen colonias, se preparan las diluciones enriquecidas de MLB y se incuba 30 ± 2 ° C durante 7 días. Examinar el crecimiento diario en los enriquecimientos. Después de 7 días de incubación, o cuando el crecimiento se sospecha, se siembran todos los enriquecimientos en placas de agar MacConkey. Incubar las placas 48 horas a 30 ± 2 ° C.

Recuento de hongos y levaduras:

Tomar 0,1 ml de las diluciones seriadas y sembrar por duplicado en agar extracto de malta (MEA) o agar papa dextrosa (PDA), con 40 ppm de clorotetraciclina. Extender el inóculo sobre la superficie del medio con el rastrillo. Incubar a 30 ± 2 ° C, y observar todos los días durante 7 días. El promedio de los recuentos obtenidos de el duplicado de las cajas sembradas para cada dilución, se multiplican por 10 para permitir el volumen plateado (0,1 ml), se multiplica por el factor de dilución, informándose el recuento de hongos levaduras / g (ml) de la muestra. Para enriquecimientos fúngicos (opcional), diluir la muestra preparada en caldo Sabouraud dextrosa e incubar como se describió


anteriormente para las diluciones de MLB. Evaluar si se produce el crecimiento, en agar glucosado de Sabouraud, MEA, o PDA. Los últimos dos agares debe contener 40 ppm de clorotetraciclina.

Recuento de microorganismos anaerobios (solo para talcos y polvos).

El propósito principal de este procedimiento consiste en detectar el bacilo tetánico (Clostridium tetani), que puede ocurrir en estos productos. Realizar el procedimiento como se describió anteriormente para APC, usando agar MLA, agar anaerobio pre-reducido, y 5% de agar sangre desfibrinada de oveja. Incubar las placas de agar sangre en atmósfera de dióxido de carbono (10.5% frasco de vela o incubadora de CO2), y las cajas de agar anaerobio en frascos de anaerobios. Incubar durante 48 horas; Re incubar durante 2 días más si no aparecen colonias a las 48 h.

Pre-reducir las cajas de agar anaerobias antes de la inoculación, colocándolas en una atmósfera anaerobia durante la noche (12-16 h). Incubar las placas de agar anaerobias en la atmósfera anaeróbica (recipiente de anaerobios, incubadora, o en la cámara) durante 2 días a 35 ± 2 ° C; Incubar las placas aeróbicamente MLA durante 2 días a 35 ± 2 ° C como el control de aeróbica.

Los anaerobios estrictos que sólo crecen en los frascos de anaerobios. Se recomienda que una pequeña cantidad (0,1 ml) de inóculo, para sembrar sobre el medio disminuir el tiempo en expandir la muestra, este procedimiento se realizara en cámara anaerobia para disminuir la exposición al oxigeno. Compruebe si hay esporas germinales sembrando en caldo de carne cocida, incubándose a 35 °C durante 2 días. El uso la tinción de esporas es obligatoria. Otros métodos para detectar esporas pueden ser utilizados.

Identificación de microorganismos

Los hongos y las levaduras deben ser purificados, las levaduras identificadas en la medida de lo posible mediante el uso de kits, por ejemplo, tarjetas de levaduras Vitek y las tiras de asimilación API para levaduras. Si es necesario, enviar los hongos aislados a Valerie H. Tournas, FDA, Washington, DC 20204, para la especiación. Para bacterias, examinar todas las placas, y extender las colonias de tipo morfológicamente diferentes en medio MacConkey y MLA. Preparar una tinción de Gram de todos los tipos de colonias morfológicamente diferentes obtenidos en cultivos puros. Con los métodos dados aquí, los aislamientos pueden ser identificados a nivel de género; las pruebas para especiación se muestran cuando es necesario. Los resultados del ensayo deben ser evaluados usando el manual de Bergey o los métodos de Madden. Los Kits de identificación comercial, por ejemplo, API, Roche, Vitek, Hewlett-Packard entre otros.


Métodos de identificación

• Bacilos Gram-positivos: Informe bacilos Gram-positivos aeróbicos ya sean formadores de esporas o no formadores de esporas. Para estimular la esporulación, inocular el aislado en placa de agar almidón e incubar a 48 horas a temperatura ambiente. Preparar tinción de Gram o tinción de endospora de la colonia aislada y notar la posición de la endospora dentro de la célula vegetativa (central, terminal, o subterminal), la forma de la endospora (redonda o elipsoidal), y la morfología de esporulación de las células del esporangio (hinchadas o no hinchadas). Probar todos los bastones formadores de espora para movilidad por uno de los dos métodos:

a. Método de cultivo: Inoculación de tubo por punzada de la prueba de motilidad o medio de motilidad indol-ornitina. Incubar aeróbicamente 18-24 h en cuarto temperado. El crecimiento de la línea de punción (indicado por turbidez del medio alrededor de la punzada) constituye una prueba positiva.

b. Examinación microscópica: Inocular la colonia aislada en caldo adecuado. Incubar aeróbicamente 18-24 horas en cuarto temperado. Poner una gota del caldo de cultivo en portaobjetos limpio y cubrir con cubreobjetos. La motilidad es indicada por células bacterianas individuales moviéndose en direcciones al azar. Observe a 400X o bajo aceite de inmersión. La caracterización adicional de bacilos Gram-positivos es generalmente innecesaria. Consulte las referencias 7 y 12 si se requiere una caracterización adicional de estos microorganismos.

• Cocos Gram-positivos. Rayar placas MLA de medios APC (MLA o BP). Incubar a 18-24 h a 35 ± 2°C, y pruebe el crecimiento resultante por la actividad de la catalasa y producción de coagulasa (si catalasa –positivo).

a. Prueba de la catalasa. Adicionar una gota de H2O2 a 3%, en la colonia aislada con un asa en el portaobjetos. La reacción es positiva si el oxigeno evoluciona rápidamente (formación de burbujas). (Asas de cromo níquel metálicas pueden dar falsas de reacciones positivas). Cuando el H2O2 se pone directamente en la colonia las bacterias morirán. El control positivo (Staphylococcus o una bacteria entérica) y control negativo (Streptococcus) debe estudiarse a la vez para asegurar la calidad de la solución de H2O2.

b. Prueba de la Coagulasa: Se inocula una pequeña cantidad del crecimiento por inclinación de mantenimiento de cepa en 13 mm x 100 mm en un tubo que contiene 0,2 ml de caldo BHI. Incubar 18-24 h a 35 ± 2°C, luego adicionar 0,5 ml de liofilizado reconstituido de plasma coagulasa de conejo (con EDTA) y mezclar bien. Incubar a 35 ± 2 ° C durante 6 h y examinar la coagulación. Cepas débiles


para la producción de coagulasa pueden requerir incubación durante toda la noche para evidenciar la coagulación. Incluir cepas conocidas de coagulasa-positiva y coagulasa-negativa con cada conjunto de muestras. Considere todas las cepas que producen una reacción coagulasa-positiva como S. Aureus.

c. Si no se produce catalasa, inocular agar bilis esculina inclinado, un tubo de TSB que contenga 6,5 % de NaCl, y en una placa de agar sangre de ovejo al 5%. Incubar 18 – 24 h a 35 ± 2 ° C. Si el organismo ennegrece el medio bilis esculina y crece en presencia de NaCl 6,5 %, se reporta como “enterococcus Grupo D” (Enterococcus spp.) Si se oscurece el medio bilis esculina, pero no crece en presencia de NaCl 6,5%, se reporta como “Streptococcus grupo D, no Enterococcus”. Si no se oscurece el medio bilis esculina, reportarlo como alpha, beta o gamma Streptococcus hemolítico. Si no esta disponible el agar sangre de ovejo al 5%, reportarlo como “Streptococcus, no grupo D”. Realizar especiación adicional de Estreptococos, si es necesario, utilizando los procedimientos descritos en la ref. 7 o kits serológicos disponibles comercialmente para este propósito, por ejemplo, Phadebact (Pharmacia Diagnostics, Piscataway, NJ).

d. Si se produce catalasa, inocular los siguientes medios con la colonia recién aislada: agar sal manitol, tubos por duplicado de medio oxidación-fermentación (OF) con dextrosa (superposición de un tubo con vaspar estéril o aceite mineral, dejar un tubo sin un límite sin recubrimiento) y agar enriquecido inclinado para su uso en la prueba de coagulasa.

Reportar organismos como S. aureus si es coagulasa-positivos y / o fermentan manitol; S. epidermidis si es fermentativo así como oxidante sobre dextrosa OF, es coagulasa-negativos, y no fermentan manitol: O especies de Micrococcus si sólo es oxidativo sobre la dextrosa OF.

• Bacilos Gram-negativos. Inocular en agar TSI inclinado, en placa de agar MacConkey, agar cetrimida, y placa de MLA con todos los bacilos Gram-negativos. Incubar 18-24 horas a 35 ± 2 ° C. TSI inclinado/reacciones de cola de A/A o K/A (A = ácido; K = alcalina) + H2S indican un aislamiento de Enterobacteriaceae. Reacciones K/K, K/NC (NC = sin cambio), las reacciones NC / NC indica bacilos Gram-negativos no fermentadores (NF). Si las reacciones del TSI están enmascaradas por la producción de sulfuro de hidrógeno, inocular caldos de hidratos de carbono de lactosa y la glucosa e incubar 18-24 horas a 35 ± 2 ° C. Para un aislamiento de Enterobacteriaceae, revisar las siguientes pruebas y referencias de uso. 3, 6, 11-13 para interpretar los resultados. La API 20E o kit comercial equivalente puede ser utilizado para identificar a nivel de especie. Medios necesarios para las pruebas se muestran en C, más arriba. Si un organismo crece en agar cetrimida o se identifica como un bacilo gram-negativo NF, determinar la producción de pigmentos fluorescentes y no fluorescentes, la producción aeróbica de ácido a partir de cualquier carbohidrato, tales como glucosa, sacarosa, xilosa,


manitol; y la producción de nitrógeno gas a partir de una fuente de nitrógeno inorgánica, llevar a cabo otras pruebas necesarias con los medios figuran en el D.

El uso de acetamida, para el crecimiento a 42 ° C, y la licuefacción de gelatina son pruebas importantes para distinguir las tres especies de Pseudomonas, p. Aeruginosa, p. Fluorescens y P. putida Para interpretar los resultados de estas pruebas, se recomienda usar el kit API no fermentadores.

Método para la identificación de Pseudomonas aeruginosa

La identificación de P. Aeruginosa es de particular interés porque este organismo sobrevive en cosméticos para el área de los ojos y ha sido implicada en infecciones de los ojos. Son patógenos oportunistas para los seres humanos y altamente resistentes a los agentes antibacterianos tales como compuestos de amonio cuaternario, penicilina y muchos antibióticos de amplio espectro.

Identificación presuntiva

Agar TSI inclinado. Trasladar colonias bien aisladas típicas de las placas de agar cetrimida, al agar inclinado de TSI. Incubar a 35 ° C durante 24 ± 2 h. Todos los cultivos inclinados que tienen el crecimiento y una inclinación alcalina (rojo) y cola alcalina (rojo) deben ser considerados como un resultado positivo presuntivo de Pseudomonas spp. Y la prueba de oxidasa y otras reacciones bioquímicas. Algunas pseudomonas puede producir sulfuro de hidrógeno ligero en TSI, pero esto puede ser confundido con pigmentos solubles producidos por algunas especies.

Prueba de la oxidasa

Tiras de prueba de la oxidasa (por Pseudomonas spp.)

Tetrametil-p-fenilendiamina-dihidrocloruro 1,0 g

Ácido ascórbico 0,1 g

Agua destilada 100 ml

Corte el papel de filtro (Whatman N º 40) en pequeñas tiras de unos 10 x 40 mm. Sumerja en el reactivo. Escurrir. Extender las tiras sobre toallas de papel en una bandeja. Tape con toallas de papel, porque la luz se degrada el reactivo, secar en incubadora 35 ° C. (Reactivo también se degrada a temperatura más altas.) Cuando este seco, almacenar en


botella marrón a temperatura ambiente. Las tiras deben ser protegidos de la luz y la humedad, esta debe ser de color blanco. Las tiras son estables indefinidamente.

Usar bucle de platino para extender el frotis de las células sobre la porción de tira. (Alambre de nicromo da falsos positivos.) Leer en 10 s, no más. Positivo está indicado por un color púrpura intenso; negativa se indica por la ausencia de color o un color púrpura cuando aparece después de 10 s Pseudomonas spp. Son oxidasa-positivos.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS

A partir de cada resultado positivo en agar TSI, inocular por duplicado en agar inclinado YE, en caldo de Koser citrato, caldo de malonato, medio basal que contenga arginina descarboxilasa, agar nitrato de la motilidad, la gelatina de nutrientes (CDC), F agar Pseudomonas, y Pseudomonas Agar P.

Agar YE agar inclinado: Inocular por duplicado, uno de ellos se incuba a 35 ° C durante 24 ± 2 h, y el otro a 42 ° C durante 24 ± 2 h. (NOTA: se inclina el agar Eq a 42 ° C antes de la inoculación, ya que otras especies de Pseudomonas puede crecer ligeramente a 42 ° C en los medios que no se han pre incubado, pero no va a crecer en tubos inclinados pre incubados.) Pocas Pseudomonas spp., diferente de P. aeruginosa podrán crecer 42 °C; que además produce un olor a pescado, en trimetilamina o en agar YE. Aproximadamente el 4% de todas las cepas que se encuentran habitualmente no producen pigmento. Confundiéndose con Alcaligenes spp., Achromobacter spp., entre otras especies no pigmentadas, por tal razón debe probarse antes de ser descartadas las bioquímicas analizadas de la muestra.

Caldo citrato Koser’s: Inocular el caldo e incubar a 35 °C durante 24 y 48 h. utilizar citrato como indicador de turbidez.

Caldo malonato: Inocular el caldo malonato. Incubar a 35 °C durante 24 ± 2 h. Una prueba positiva que indica el uso del malonato como única fuente de carbono, se determina mediante el cambio de color del indicador de verde a azul (alcalino)-

Agar nitrato motilidad: Para inocular haga una punción recta, en dirección vertical desde la superficie hasta la profundidad. Incubar a 35 °C durante 24 ± 2 h. Añadir unas gotas de ácido sulfanílico y naftilamina. Un resultado de color rosa oscuro o rojo indica la reducción de nitrato a nitrito. Un color negativo junto con la presencia de burbujas de gas o grietas en el medio se considera una reacción positiva e indica la reducción de nitrato a nitrito a nitrógeno libre. (NOTA: Se debe comprobar siempre que el tubo de control se incubó bajo las mismas condiciones.)

Caldo de arginina descarboxilasa: Inocular en el medio. Asegure la tapa de rosca para evitar la aireación. Incubar a 35 °C durante 24 ± 2 h. Examinar el crecimiento. Una


reacción positiva para la descarboxilación de arginina, se determina por el cambio en el color del medio a púrpura. Una reacción negativa se indica mediante un cambio de color amarillo (ácido).

Licuefacción de la gelatina: Inocular los tubos de gelatina por punción e incubar a 25 ° C durante al menos 72 h. Enfriar antes de examinar la licuefacción. Incubar los tubos negativos 1 semana, estos se mantienen normalmente hasta 6 semanas antes de desecharlos, pero claramente esto no es práctico. Sin embargo, P. aeruginosa por lo general se licua la gelatina con rapidez.

Agar Pseudomonas F y agar Pseudomonas P: inocular por aislamiento, en el agar F y P. Incubar a 25 °C durante al menos 3 días. Examine el agar F con luz negra (UV). Evaluar la presencia de los pigmentos fluorescentes solubles en agua (pioverdine), que se difundirá sobre la superficie que se haya aislado Pseudomonas spp.

Romper el agar P con una varilla de vidrio en una cantidad aproximadamente igual de agua destilada y agitar vigorosamente hasta que el agua ha eliminado como pigmento tanto como sea posible. Decantar para separar, en una cámara de química, añadir 5-10 mL de cloroformo en agua para separar y agitar-

El color azul piocianina desaparece el cloroformo. Extraer la capa de cloroformo en un tubo de ensayo. Añadir alrededor de 3 ml de agua destilada. Añadir 1 gota de NH2SO4, la piocianina se pone roja y migra del agua. Desechar en una botella el solvente en especial el cloroformo.

Tinción de flagelos: si la cepa reúne los requisitos de P. aeruginosa, incluyendo los pigmentos, la tinción de los flagelos no se hace necesario.

En el caso de hacer la tinción se recomienda utilizar los métodos Clark o los siguientes métodos por ejemplo, Leifson o Bailey. O un método de rápido montaje húmedo, como es la tinción Ryu.

Se ha reportado que P. aeruginosa tiene un flagelo polar único. Otras especies de Pseudomonas fluorescentes, tienen varios flagelos.

Tabla 1. Resultados de las bioquímicas

TSI Ácido extremo, alcalino inclinación + gas - Negativo P. aeruginosa Ácido extremo, ácido inclinación + gas - Negativo P. aeruginosa

Alcalino extreme, ácido inclinación + gas - Probablemente P. aeruginosa Agar YE

No crecimiento a 42°C - Negative P. aeruginosa Crecimiento a 42°C - Probablemente P. aeruginosa


Arginina descarboxilasa Negativo - Probablemente no es P. aeruginosa Positivo - Probablemente es P. aeruginosa

Citrato Koser’s No crecimiento - Probablemente no es P. aeruginosa

Crecimiento - Probablemente P. aeruginosa Utilización de malonato

Negativo - Probablemente no es P. aeruginosa Positivo - Probablemente P. aeruginosa

Reducción del nitrato Negativo, no gas - Probablemente no es P. aeruginosa

Positivo - Probablemente P. aeruginosa Motilidad

Negativo - Probablemente no es P. aeruginosa Positivo - Probablemente P. aeruginosa

Flagelación Flagelo polar - Probablemente P. aeruginosa

Algunos otros flagelos - Probablemente no es P. aeruginosa Agar Pseudomonas F

No pigmento fluorescente - Negativo P. aeruginosa Pigmento soluble en agua (pioverdina) - P. aeruginosa

Agar Pseudomonas P No pigmento - Negativo P. aeruginosa

Si el pigmento es presente, confirmar procianine. - P. aeruginosa

Interpretación: De los productos cosméticos no se espera que estos sean asépticos, sin embargo, deben estar completamente libre de patógenos microbianos de alta virulencia, y el número total de microorganismos aerobios por gramo debe ser bajo.

De tal manera:

• Para los productos de área de los ojos: 500 UFC / g • Para los productos que no son del área de los ojos: 1000 UFC / g.

La presencia de patógenos es inaceptable en cosméticos, en especial para aquellos usados en la zona de los ojos. Tipos de microorganismos de interés:

• Los microorganismos patógenos o patógenos oportunistas, de particular interés, especialmente para aquellos cosméticos utilizados en el área de los ojos incluyen S. aureus, Streptococcus pyogenes, P. aeruginosa y otras especies, y Klebsiella pneumoniae.


GUIA PARA LA EVALUACION DE LA CALIDAD MICROBIOLOGICA DE LOS COSMETICOS

INTRODUCCION:

La piel y las mucosas se encuentran normalmente protegidas al ataque microbiano, sin embargo muchos productos cosméticos al entrar en contacto con este tipo de piel, pueden alterar y dañar esas barreras, facilitando la infección microbiana; esto ocurre especialmente con aquellos productos que tienen contacto sobre las zonas de los ojos, membranas mucosas, en piel dañada o inmunocomprometida, como en el caso de niños menores de 3 años y adultos mayores.

Este tipo contaminación en cosméticos ocurre por las concentraciones de agua en sus formulaciones, que favorece el crecimiento y desarrollo de microorganismos. Es por ello de gran importancia que este tipo de productos se componga de conservantes, en unidad o en mezcla, con un alto espectro de inhibición de microorganismos.

Así mismo se ha demostrado que otros factores como la temperatura, la luz, los bajos pH; afectan e influyen en la estabilidad del producto, en especial en el control y/o desarrollo de microorganismos.

Dentro de los factores físicos, el embalaje o empaque es otro de los factores importantes de protección al producto, ya que estos pueden evitar el ingreso de la contaminación y la condensación de agua donde se encuentra el producto.

Por todo lo anteriormente expuesto, se hace necesario un control microbiológico sobre los cosméticos como garantía de calidad para los consumidores; a continuación se mencionan algunos parámetros y procedimientos que facilitaran el control microbiológico, que se producen en su planta de cosméticos.

EQUIPOS Y MATERIALES:

• Pipetas estériles, 1.5, y 10 ml, se graduó • Gasas estériles, de 4 x 4 pulgadas • Instrumentos estériles: pinzas, tijeras, bisturís y cuchillas, espátulas, y

microespatulas. • Tubos de ensayo, con tapa de rosca, 13 x 100, 16 x 125, y 20 x 150 mm • Botellas de dilución, con tapa de rosca • Balanza, sensibilidad de 0,01 g • Cajas de Petri, estériles, de plástico, 15 x 100 mm • Rastrillos • Incubadoras, 30 ± 2 ° C y 35 ± 2 ° C


• Sobres que generan atmosfera anaeróbica atmósfera, las tiras indicadoras, y frascos (BBL o Oxoid), o incubadora anaeróbica, 35 ± 2 ° C, cámara anaeróbica, 35 ± 2 ° C.

• Frascos para vela o incubadora de CO2, 35 ± 2 °C. • Campana de flujo laminar con filtro HEPA, si está disponible • Vitek o sistema computarizado automático de identificación • Medios para la identificación y recuento de bacterias Gram-positivas y hongos • Agar Anaerobios (M11) • Agar bilis esculina (M18) • Agar y caldo Infusión de cerebro y corazón (BHI) (M24) • Agar extracto de malta (MEA) (M93) • Agar papa dextrosa (PDA) (M127) • Agar manitol salado (M97) • Agar Letheen modificado (MLA) (M78) y el caldo (MLB) (M79) • Medio para la prueba Oxidativo-fermentativa (OF) (M117) • Caldo saboraud dextrosa (M133) • Agar base de sangre (M20A) • Agar de Almidón(M143) • Agar tripticasa (tríptico) de soja (TSA) (M152) y el caldo (TSB) (M154) • Agar baird-Parker (BP) (M17) • Prueba de la catalasa (R12) • Agar vogel-Johnson (VJ) (opcional) (M176) • Kit comercial de identificación bacteriana (API o equivalente).

Medios para la identificación de Enterobacterias:

• Caldo de carbohidratos Andrade's y el indicador (M13) para probar el metabolismo ramnosa, manitol, sorbitol, arabinosa

• Agar lisina hierro (M89) • Caldo Malonato (M92) o caldo Malonato fenilalanina (Difco) • Medio motilidad-indol ornitina (M99) • Caldo MR-VP (M104) • Agar citrato Simmons (M138) • Agar hierro triple azúcar (TSI) (M149) • Agar urea de Christensen´s (M40) • Agar MacConkey (M91) • Medio descarboxilasa lisina para bacterias Gram-negativas no fermentadores

(M88) • Agar fenilalanina desaminasa (M123)


• API 20E, Roche enterotube, u otros equipos de identificación equivalente • Incubar todas las pruebas bioquímicas utilizando medios en B y C, descritos en el

cuadro, a 35-37 ° C durante 18-24 h, excepto caldo malonato (48 h) y caldo MR-VP (48 h o más).

Medios y reactivos para la identificación de bacterias Gram-negativos, bacilos no fermentadores (NF).

• Medio acetamida (M2) • Clark flagelar stain (R14) • Agar esculina, modificada (CDC) (M53) • Nutrientes gelatina (CDC) (M115) • Indol medio (M64) y el indol medio (CDC) (M65) • Medio King B (M69) • Lisina descarboxilasa (PMA) medio para bacterias Gram-negativas NF (M88) • Medio de nitrato, movilidad (M101) • Caldo de nitrato, enriquecido (CDC) (M109) • Medio basal King O/F (M70) para probar el metabolismo, sacarosa, lactosa,

fructosa, esculina, xilosa, glucosa (dextrosa), manitol, salicina, sorbitol y maltosa • Tiras para la prueba oxidasa • Agar urea de Christensen´s (M40) • Base de medio descarboxilasa (de arginina descarboxilasa) (M44) • Extracto de levadura (YE) agar (M181) • Agares de Pseudomonas F (M128 y P (M129) (Difco) • Agar cetrimida (PseudoselTM, BBL, Difco), o equivalente (M37) • Glicerol, estéril (Difco), o equivalente • API, NFT, u otro sistema equivalente identificación comercial • Caldo citrato de Koser (M72)

Otros medios y reactivos: • Solución acuosa de etanol al 70% y 1% de HCl (v / v) o 4% de yodo en solución de

etanol al 70% o 2% de glutaraldehído en solución. • Tween 80 (Polysorb 80) • Etanol, 95% (v / v) • Plasma liofilizado de conejo con EDTA • Solución acuosa con 3% (v / v) de peróxido de hidrógeno • Tinción de Gram (R32) y tinción de endospora (R32a) • Medio de carne cocida (M42)


MANEJO DE LAS MUESTRAS COSMETICAS PARA EL ANALISIS MICROBIOLOGICO:

Observaciones:

• Analizar las muestras tan pronto como sea posible después de su llegada. • Si las muestras lo requieren, guárdelas a temperatura ambiente. • No incubar, refrigerar o congelar las muestras antes o después del análisis. • Inspeccionar cuidadosamente las muestras antes de la apertura y tomar nota de

las irregularidades del empaque de las muestras. • Antes de abrir el cosmético desinfectar la superficie del recipiente de la muestra

con etanol al 70% (v / v) y 1% de HCl u otro desinfectante. Usando campana de flujo laminar, si es posible. Secar la superficie con una gasa estéril antes de la apertura.

• Utilizar una porción representativa de la muestra, por ejemplo, 1 g (ml) porción de la muestra; para los productos en los que su peso es de 1g o 1mL, se debe recoger varias muestras del producto analizar.

• Para los productos que pesan menos de 1 g (ml), analizar todo el contenido. Si sólo hay disponible y se solicitan varios análisis (es decir, microbiano, toxicológicos y de química), tomar una submuestra para análisis microbiológico, antes que los de otros análisis. En esta situación, la cantidad de submuestra utilizada para el análisis microbiano dependerá de otros análisis a realizar. Por ejemplo, si el contenido total de la muestra es de 5 ml, utilizar 1 o 2 ml para los análisis microbiológicos.

• Tomar 1g o ml del producto en 10 mL de diluyente neutralizado validado, para el caso de las sustancias poco humectables, se deberá utilizar 0,1 % p/v de un paquete tensoactivo, polisorbato 80.

Preparación preliminar de la muestra: Realizar los siguientes procedimientos que le permitirán ajustar la cantidad de muestra y diluyente dependiendo de la cantidad de muestra disponible.

• Líquidos: Diluir 1 ml de líquido directamente en 9 ml de caldo de modificación Letheen (MLB) en un tubo de ensayo de 20 x 150 mm , con tapa de rosca, esto para la dilución 10-1.

• Sólidos y en polvo: Retirar de forma aséptica y pesar 1 g de muestra, suspenderla en un tubo de ensayo de 20 x 150 mm, con tapa de rosca que contiene 1 ml de agua estéril de Tween 80. Mezclar el producto en Tween 80 con una espátula estéril. Añadir 8 ml de agua estéril MLB y mezclar bien. Esto para la dilución 10-1.

• Crema y productos a base de aceite: Retirar de forma aséptica y pesar 1 g de muestra, suspenderla en un tubo de 20 x 150 mm con tapa de rosca del tubo que contiene 1 ml de agua estéril de Tween 80, más de cinco a siete de 5 mm perlas de vidrio (o de diez a quince de 3 mm de perlas de vidrio). Mezcle el contenido


total con mezclador Vortex. Ajustar el volumen total a 10 ml con estéril MLB (8 ml) esto para la dilución 10-1.

• Los aerosoles de polvo, jabones, líquidos y otros materiales: Descontaminar boquilla de pulverización, con un algodón con gasa humedecido con etanol al 70% (v / v). Expulsar porción del producto, por ejemplo, 1 g de producto en 9 ml de MLB estéril. Mezclar bien los productos y el caldo, y se vuelve a pesar. Esta será una dilución 10-1 si exactamente 1 g de muestra se obtuvo.

• Materiales anhidros: Realizar de la misma forma como para productos cosméticos solidos, en polvo, Crema y productos a base de aceite

EVALUACION DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS

Observaciones: Determinar los microorganismos mesofílicos aeróbicos totales de acuerdo a los siguientes factores:

• Como medida de precaución para evitar la contaminación de estos microrganismos a este tipo de productos

• Debido a que se pierden las propiedades antimicrobianas por procesos como filtración, neutralización o filtración.

• La identificación de estos microorganismos se debe hacer en medios selectivos. • Sembrar por duplicado en agar Letheen modificado. Diluir las muestras

decimalmente en MLB (NOTA: conservar las diluciones para la etapa de enriquecimiento) para obtener diluciones en serie de 10-1 a 10-6. (Comience con 102 si la dilución 10-1 se agota.)

• El rastrillo utilizado para la siembra debe esterilizarse (inmersión en etanol al 95%).

• Para la solidificación del agar, cuando esta recién hecho (dejar en seco durante 30 minutos a 35°C.

Procedimientos para la evaluación de microorganismos aerobios mesófilos: Procedimiento conteo en placa: (método propuesto)

• Tomar entre 5 o 10 ml o g de la preparación cosmética y añadirla en 45 o 90 mL de caldo Letheen modificado (MLB), realizar diluciones de 10-1 a 10-6.

• Mezclar bien las diluciones y con una pipeta tomar 0,1 mL y agregarla en sobre la caja de Petri y con un rastrillo esparcir la muestra sobre toda la superficie del medio agar Letheen modificado (MLA).

• Incubar durante 48 horas a 30 ± 2 ° C.

Filtración por membrana: (método alternativo)


Usar dos filtros de membrana con un poro de 0,45 µm y un diámetro de 50 mm.

• Tomar 0,1 g de muestra para cada membrana y filtrar inmediatamente, posteriormente enjuaguar con una solución estéril de lavado, que puede ser una ventaja en la distribución de los microorganismos

• Transferir la membrana a la superficie del medio de cultivo adecuado; incubar (para bacterias 30-35°C por 3 días, para hongos 20-25°C por 5 días), realizando el conteo en el menor tiempo, luego de pasados los días de incubación.

• El conteo de número de colonias desarrolladas será número de microorganismos por g o mL analizados.

Resultados:

• Realizar los recuentos de las placas que contienen entre 25-250 colonias.

• El resultado del recuento se multiplica por inverso de la dilución (10-1 – 10-2). Informar los resultados como UFC / g (ml) de la muestra.

• Si en las placas no contienen colonias 25-250, informar que no se encontraron colonias.

Limites cuantitativos:

• Productos para uso infantil, área de ojos, productos que entran en contacto con las mucosas: 102 UFC/ en 1 g o mL de producto.

• Demás productos cosméticos: 103 UFC/ en 1 g o mL de producto.

EVALUACION DE HONGOS Y LEVADURAS:

Observaciones:

• Para enriquecimientos fúngicos (opcional), diluir la muestra preparada en caldo Sabouraud dextrosa e incubar como se describió anteriormente para las diluciones de MLB. Evaluar si se produce el crecimiento, en agar glucosado de Sabouraud, MEA, o PDA. Los últimos dos agares debe contener 40 ppm de clorotetraciclina.

Procedimiento para la evaluación de hongos y levaduras:

Procedimiento conteo en placa: (método propuesto)

• Tomar 0,1 ml de las diluciones seriadas y sembrar por duplicado en agar extracto de malta (MEA) o agar papa dextrosa (PDA), con 40 ppm de clorotetraciclina.


• Extender el inóculo sobre la superficie del medio con el rastrillo. Incubar a 30 ± 2 °C, y observar todos los días durante 7 días.

Método opcional:

• Los hongos y levaduras deben ser purificados, las levaduras identificadas en la medida de lo posible mediante el uso de kits, por ejemplo tarjetas de levadura vitek y las tiras de asimilación API para levaduras.

Resultados:

• El promedio de los recuentos obtenidos de el duplicado de las cajas sembradas para cada dilución, se multiplican por 10 para permitir el volumen planteado (0,1 ml), se multiplica por el factor de dilución, informándose el recuento de hongos levaduras / g (ml) de la muestra.

Procedimiento para la detección de Candida albicans:

• Se realiza el procedimiento de siembra para hongos y levaduras, descrito anteriormente; pero sobre medio saboraud.

• Dentro de la pruebas mínimas confirmatorias se encuentran: examinación microscópica, prueba de tubo germinativo, formación de clamidiosporas.

Resultados:

• Para el medio de cultivo saboraud: Se visualizan colonias de color blanco, crema o beige y convexas.

• Los resultados para las pruebas confirmatorias: tubo germinativo (+), productores de clamidiosporas.

• Se debe reportar ausencia de cándida albicans.

Limites cuantitativos:

• Ausencia de cándida albicans.

METODO PARA LA EVALUACION DE BACILOS GRAM-POSITIVOS

Observaciones:

Prueba para la evaluación de bacilos Gram-positivos


• Inocular el aislado en placa de agar almidón e incubar a 48 horas a temperatura ambiente, para estimular la formación de esporas.

• Preparar tinción de Gram o tinción de endospora de la colonia aislada evaluar la posición y morfología de la endospora.

• Para evaluar la movilidad desarrollar los siguientes métodos: a) Método de cultivo: Inocular el tubo por punzada en el medio indol-ornitina. Incubar

aeróbicamente 18-24 h en cuarto temperado. b) Examinación microscópica: Inocular la colonia aislada en un caldo adecuado.

Incubar aeróbicamente 18-24 horas en cuarto temperado. Poner una gota del caldo de cultivo en portaobjetos limpio y cubrir con cubreobjetos.

Resultados:

• Para la formación de esporas: Informar bacilos Gram-positivos aeróbicos ya sean formadores de esporas o no formadores de esporas.

• Para evaluación de posición y morfología de espora: notar la posición de la endospora dentro de la célula vegetativa (central, terminal, o subterminal), la forma de la endospora (redonda o elipsoidal), y la morfología de esporulación de las células del esporangio (hinchadas o no hinchadas).

• Para la evaluación de movilidad por siembra en medio de cultivo: El crecimiento de la línea de punción (indicado por turbidez del medio alrededor de la punzada) constituye una prueba positiva.

• Para la evaluación de movilidad por evaluación microscópica: La motilidad es indicada por células bacterianas individuales moviéndose en direcciones al azar. Observe a 400X o bajo aceite de inmersión.

METODO PARA LA EVALUACION DE COCOS GRAM-POSITIVOS

Observaciones:

• En el caso de agotarse la dilución 10-1, comenzar la siembra con la dilución 10-2.

• Los rastrillos utilizados, deben esterilizarse (por ejemplo por inmersión en etanol al 95%).

• Para la absorción eficaz del inóculo, sobre el agar; se debe dejar solidificar el agar durante 30 minutos a 35ºC, cuando esta recién hecho el agar.

Procedimiento para la evaluación de Staphylococcus aureus


• Tomar entre 5 o 10 mL o g de la preparación cosmética y añadirla en 45 o 90 mL de caldo Letheen modificado,

• Realizar diluciones de 10-1 y 10-6, mezclar bien las diluciones.

• Con una pipeta tomar 0,1 mL y esparcirla con un rastrillo sobre la superficie de la caja de Petri con el agar Baird-Parker (BP) o Vogel-jonhnson.

• Incubar durante 48 horas a 35ºC.

Resultados

• Cuente las colonias bien distribuidas que son convexas, negras brillantes, incluyendo aquellas que tengan o no una zona clara alrededor de la colonia. (NOTA: las coagulasa positiva producen zonas de aclaramiento, pero las colonias coagulasa negativos pueden o no producir zonas de aclaramiento. Si la coagulasa-negativos tiene zonas de aclaramiento, su forma irregular, las hace distinguir de las colonias coagulasa positivos.)

• Seleccionar las placas que tienen más de 250 colonias, cuando la dilución mayor no contiene los tipos coloniales descritos anteriormente. Así mismo se puede utilizar las siembras de diluciones, en las que se tienen menos de 25 colonias.

• Calcular el número de microorganismos coagulasa positiva. Multiplique esta fracción por el número promedio de colonias contadas de Staphylococcus en el medio BP. Multiplicar el número obtenido por el factor de dilución correspondiente y el informe como el número de S. aureus / g (ml) de la muestra.

• Si no se obtienen colonias, se preparan las diluciones enriquecidas de MLB y se incuba 30 ± 2°C durante 7 días. Examinar el crecimiento diario en los enriquecimientos. Después de 7 días de incubación, o cuando el crecimiento se sospecha, se siembran todos los enriquecimientos en placas de agar MacConkey. Incubar las placas 48 horas a 30 ± 2 °C.

PRUEBAS CONFIRMATORIAS

Prueba de la coagulasa:

Observaciones

• Las cepas débiles para la producción de coagulasa pueden requerir incubación durante toda la noche para evidenciar la coagulación. Incluir cepas conocidas de coagulasa-positiva y coagulasa-negativa.


Procedimiento

• De cada caja de Baird-Parker escoja una o más colonias típicas para confirmar su reacción coagulasa, sembrando en cualquier tipo de agar inclinado por ejemplo agar tripticasa de soja (TSA), agar infusión de cerebro-corazón (BHI)

• Incubar 18-24 horas a 35 ± 2°C.

• Luego de la incubación adicionar 0,5 ml de liofilizado reconstituido de plasma coagulasa de conejo (con EDTA) y mezclar bien.

• Incubar a 35 ± 2 ° C durante 6 h y examinar la coagulación.

Resultados

• Todas las cepas que producen una reacción coagulasa-positiva como S. Aureus.

Prueba de la catalasa:

Observaciones

• Asas de cromo níquel metálicas pueden dar falsas de reacciones positivas.

• Como control positivo utilizar una cepa de (Staphylococcus o una bacteria entérica) y control negativo (Streptococcus); para estudiarse a la vez para asegurar la calidad de la solución de H2O2.

Procedimiento

• De una colonia aislada del agar Baird-Parker, escoger una colonia y aislarla con un asa en el portaobjetos y adicionarle una gota de H2O2 a 3%.

• Si no se produce catalasa, inocular agar bilis esculina inclinado, un tubo con caldo tripticasa de soja que contenga 6,5 % de NaCl, y en una placa de agar sangre de ovejo al 5%. Incubar 18 – 24 h a 35 ± 2 ° C.

• Si se produce catalasa, inocular los siguientes medios con la colonia recién aislada: agar sal manitol, tubos por duplicado de medio oxidación-fermentación (OF) con dextrosa.

Resultados

• Para la prueba de la catalasa: La reacción es positiva si el oxigeno evoluciona rápidamente (formación de burbujas).


• Prueba de la bilis esculina: Si el microorganismo ennegrece el medio bilis esculina y crece en presencia de NaCl 6,5 %, se reporta como “Enterococcus Grupo D” (Enterococcus spp.) Si se oscurece el medio bilis esculina, pero no crece en presencia de NaCl 6,5%, se reporta como “Streptococcus grupo D, no Enterococcus”. Si no se oscurece el medio bilis esculina, reportarlo como alpha, beta o gamma Streptococcus hemolítico. Si no esta disponible el agar sangre de ovejo al 5%, reportarlo como “Streptococcus, no grupo D”.

• Reportar organismos como S. aureus si es coagulasa-positivas y / o fermentan manitol;

• Reportar S. epidermidis si es fermentativo así como oxidante sobre dextrosa OF, es coagulasa-negativos, y no fermentan manitol.

• Reportar como especies de Micrococcus si sólo es oxidativo sobre la dextrosa OF.

METODO PARA LA EVALUACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS

Observaciones

• Para un aislamiento de Enterobacteriaceae, puede ser utilizado pruebas comerciales como API 20E o kit comercial equivalente puede ser utilizado para identificar a nivel de especie.

• Realizar las pruebas enlistadas para Enterobacterias, descritas en materiales y equipos, para obtener resultados más específicos de este género.

Procedimiento

• Inocular en agar hierro triple azúcar (TSI), en un tubo inclinado, en placa de agar MacConkey, agar cetrimide, y placa de agar modificado Letheen (MLA) con todos los bacilos Gram-negativos identificados mediante la tinción Gram.

• Incubar 18-24 horas a 35 ± 2 °C. • Si las reacciones del TSI, se evidencia la producción de sulfuro de hidrógeno,

inocular caldos de hidratos de carbono de lactosa y la glucosa e incubar 18-24 horas a 35 ± 2 °C.

Resultados

• Agar TSI inclinado/reacciones de cola de A/A o K/A (A = ácido; K = alcalina) + H2S indican un aislamiento de Enterobacteriaceae. Reacciones K/K, K/NC (NC = sin cambio), las reacciones NC / NC indica bacilos Gram-negativos no fermentadores (NF).


• Si un microorganismo crece en agar cetrimida o se identifica como un bacilo gram-negativo NF, determinar la producción de pigmentos fluorescentes y no fluorescentes, la producción aeróbica de ácido a partir de cualquier carbohidrato, tales como glucosa, sacarosa, xilosa, manitol; y la producción de nitrógeno gas a partir de una fuente de nitrógeno inorgánica.

• El uso de cetrimida, para el crecimiento a 42 ° C, y la licuefacción de gelatina son pruebas importantes para distinguir las tres especies de Pseudomonas, p. Aeruginosa, p. Fluorescens y P. putida Para interpretar los resultados de estas pruebas, se recomienda usar el kit API no fermentadores.

Método para la evaluación de Pseudomonas aeruginosa

Procedimiento

Identificación presuntiva

• Tomar las colonias bien aisladas típicas de las placas de agar cetrimide, y sembrarlas en agar inclinado de TSI.

• Incubar a 35 ° C durante 24 ± 2 h.

Resultados

• Un resultado alcalina (rojo) en la inclinación y en la cola alcalina (rojo) deben ser considerados como un resultado positivo presuntivo de Pseudomonas spp.

• Algunas pseudomonas puede producir sulfuro de hidrógeno en TSI, pero esto puede ser confundido con pigmentos solubles producidos por algunas especies.

Prueba de la oxidasa

Tiras de prueba de la oxidasa (por Pseudomonas spp.)

Tetrametil-p-fenilendiamina-dihidrocloruro 1,0 g

Ácido ascórbico 0,1 g

Agua destilada 100 ml

Observaciones

• Tape con toallas de papel, porque la luz se degrada el reactivo.


• Para el frotis de la célula sobre la porción de tira evitar el uso de nicromo para evitar falsos positivos.

Procedimiento

• Corte el papel de filtro (Whatman N º 40) en pequeñas tiras de unos 10 x 40 mm. Sumerja en el reactivo.

• Dejar escurrir y extender las tiras sobre toallas de papel en una bandeja.

• Secar en incubadora 35 ° C.

• Cuando este seco, almacenar en botella marrón a temperatura ambiente. Las tiras deben ser protegidos de la luz y la humedad, esta debe ser de color blanco. Las tiras son estables indefinidamente.

• Posteriormente usar bucle de platino para extender el frotis de las células sobre la porción de tira.

Resultados

• Leer en 10s, no más. Positivo está indicado por un color púrpura intenso; negativa se indica por la ausencia de color.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Observaciones

• Para el agar inclinado extracto de levadura (YE), este se debe inclinar el agar e incubar a 42°C, ya que otras especies de Pseudomonas pueden crecer ligeramente a 42°C en los medios antes en la pre-incubación

Procedimiento para bioquímicas

• A partir de cada resultado positivo en agar TSI, inocular por duplicado en agar inclinado de extracto de levadura (YE), en caldo de Koser citrato, caldo de malonato, medio basal que contenga arginina descarboxilasa, agar nitrato de la motilidad, la gelatina de nutrientes (CDC), F agar Pseudomonas, y Pseudomonas Agar P.

Procedimiento para agar inclinado extracto de levadura (YE):

• Inocular por duplicado, uno de ellos se incuba a 35 ° C durante 24 ± 2 h, y el otro a 42 ° C durante 24 ± 2 h.


Resultados

• Pocas Pseudomonas spp., diferente de P. aeruginosa podrán crecer 42°C; que además produce un olor a pescado, en trimetilamina o en agar YE.

• Aproximadamente el 4% de todas las cepas que se encuentran habitualmente no producen pigmento. Confundiéndose con Alcaligenes spp., Achromobacter spp., entre otras especies no pigmentadas, por tal razón debe probarse antes de ser descartadas las bioquímicas analizadas de la muestra.

Procedimiento para Caldo citrato Koser’s:

• Inocular el caldo e incubar a 35 °C durante 24 y 48 h. utilizar citrato como indicador de turbidez.

Procedimiento para caldo malonato:

• Inocular el caldo malonato. Incubar a 35 °C durante 24 ± 2 h.

Resultados

• Una prueba positiva que indica el uso del malonato como única fuente de carbono, se determina mediante el cambio de color del indicador de verde a azul (alcalino).

Procedimiento para agar nitrato motilidad:

• Para inocular haga una punción recta, en dirección vertical desde la superficie hasta la profundidad. Incubar a 35 °C durante 24 ± 2 h. Añadir unas gotas de ácido sulfanílico y naftilamina.

Resultados

• Un resultado de color rosa oscuro o rojo indica la reducción de nitrato a nitrito. Un color negativo junto con la presencia de burbujas de gas o grietas en el medio se considera una reacción positiva e indica la reducción de nitrato a nitrito a nitrógeno libre. (NOTA: Se debe comprobar siempre que el tubo de control se incubó bajo las mismas condiciones.)

Procedimiento para caldo de arginina descarboxilasa:


• Inocular en el medio. Asegure la tapa de rosca para evitar la aireación. Incubar a 35 °C durante 24 ± 2 h. Examinar el crecimiento.

Resultados

• Una reacción positiva para la descarboxilación de arginina, se determina por el cambio en el color del medio a púrpura. Una reacción negativa se indica mediante un cambio de color amarillo (ácido).

Procedimiento para licuefacción de la gelatina:

• Inocular los tubos de gelatina por punción e incubar a 25 ° C durante al menos 72 h. Enfriar antes de examinar la licuefacción.

• Incubar los tubos negativos 1 semana, estos se mantienen normalmente hasta 6 semanas antes de desecharlos, pero claramente esto no es práctico.

Resultados

• P. aeruginosa por lo general se licua la gelatina con rapidez.

Primera fase del procedimiento para agar Pseudomonas F y agar Pseudomonas P:

• Inocular las placas de agar Pseudomonas F y P. Incubar a 25 ° C durante al menos 3 días.

• Romper con una varilla de vidrio el agar P agar; y agregar una cantidad aproximadamente igual de agua destilada y agitar vigorosamente hasta que el agua ha eliminado como pigmento tanto como sea posible.

• Decantar en el separador.

• En una campana de química, añadir cloroformo 5-10 ml de agua en el separador y agitar.

• El azul piocianina migrará al cloroformo.

• Extraer una capa de cloroformo en un tubo de ensayo.

• Añadir alrededor de 3 ml de agua destilada.

• Añadir 1 gota 1 N de H2SO4. La piocianina se pone roja y migra al agua. Deseche solvente en especial de los residuos de cloroformo-botella.


Resultados

• Examinar el agar F con luz negra (UV de onda larga). Los pigmentos Fluorescentes solubles en agua (pioverdines) se difundirá en agar si este en el aislamiento contiene Pseudomonas spp.

Procedimiento tinción de flagelos:

Observaciones

• Si la cepa reúne los requisitos de P. aeruginosa, incluyendo los pigmentos, la tinción de los flagelos no se hace necesario.

Procedimiento

• En el caso de hacer la tinción se recomienda utilizar los métodos Clark o los siguientes métodos por ejemplo, Leifson o Bailey. O un método de rápido montaje húmedo, como es la tinción Ryu.

Resultados

• Se ha reportado que P. aeruginosa tiene un flagelo polar único. Otras especies de Pseudomonas fluorescentes, tienen varios flagelos.

Resultados de las bioquímicas

TSI Ácido extremo, alcalino inclinación + gas - Negativo P. aeruginosa Ácido extremo, ácido inclinación + gas - Negativo P. aeruginosa Alcalino extreme, ácido inclinación + gas - Probablemente P. aeruginosa Agar YE No crecimiento a 42°C - Negative P.aeruginosa Crecimiento a 42°C - Probablemente P. aeruginosa Arginina descarboxilasa Negativo - Probablemente no es P. aeruginosa Positivo - Probablemente no es P. aeruginosa Citrato Koser’s No crecimiento - Probablemente no es P. aeruginosa Crecimiento - Probablemente P. aeruginosa Utilización de malonato Negativo - Probablemente no es P. aeruginosa


Positivo - Probablemente P. aeruginosa Reducción del nitrato Negativo, no gas - Probablemente no es P. aeruginosa Positivo - Probablemente P. aeruginosa Motilidad Negativo - Probablemente no es P. aeruginosa Positivo - Probablemente P. aeruginosa Flagelación Flagelo polar - Probablemente P. aeruginosa Algunos otros flagelos - Probablemente no es P. aeruginosa Agar Pseudomonas F No pigmento fluorescente - Negativo P. aeruginosa Pigmento soluble en agua (pioverdina) - P. aeruginosa Agar Pseudomonas P No pigmento - Negativo P. aeruginosa Si el pigmento es presente, confirmar procianine.

- P. aeruginosa

METODO PARA LA EVALUACION DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS (solo para talcos y polvos) Observaciones

• Pre-reducir las cajas de agar anaerobias antes de la inoculación, colocándolas en una atmósfera anaerobia durante la noche (12-16 h). Incubar las placas de agar anaerobias en la atmósfera anaeróbica (recipiente de anaerobios, incubadora, o en la cámara) durante 2 días a 35 ± 2 ° C; Incubar las placas aeróbicamente MLA durante 2 días a 35 ± 2 ° C como el control de aeróbica.

• Los anaerobios estrictos que sólo crecen en los frascos de anaerobios. Se recomienda que una pequeña cantidad (0,1 ml) de inóculo, para sembrar sobre el medio disminuir el tiempo en expandir la muestra, este procedimiento se realizara en cámara anaerobia para disminuir la exposición al oxigeno.

Procedimiento

• Realizar el procedimiento como se describió anteriormente para microorganismos aerobios mesofilos.

• Agar anaerobio (MLA) pre-reducido, y 5% de agar sangre desfibrinada de oveja

• Incubar las placas de agar sangre en atmósfera de dióxido de carbono (10.5% frasco de vela o incubadora de CO2), y las cajas de agar anaerobio en frascos de anaerobios.


• Incubar durante 48 horas.

• Reincubar durante 2 días más si no aparecen colonias a las 48 h.

• Compruebe si hay esporas germinales sembrando en caldo de carne cocida, incubándose a 35 °C durante 2 días. El uso la tinción de esporas es obligatoria.

Interpretación de los resultados

De los productos cosméticos no se espera que estos sean asépticos, sin embargo, deben estar completamente libre de patógenos microbianos de alta virulencia.

De tal manera que la presencia de patógenos (Pseudomonas aeruginosa, Candida albican y Staphylococcus aureus) y microrganismos oportunistas, es inaceptable en cosméticos, en especial para aquellos usados en la zona de los ojos.

PRUEBA DE DESAFIO

La eficacia de la conservación ha de ser evaluada experimentalmente durante el proceso de desarrollo para asegurar la estabilidad microbiana y preservación, mediante ensayos de ataque.

La prueba de provocación es obligatoria para todos aquellos productos que en condiciones normales de almacenamiento y uso; con el objeto de disminuir el riesgo de infección para el consumidor o un deterioro del producto.

Procedimiento:

Consiste en una contaminación artificial del producto acabado, para posteriormente realizarse una evaluación que garantice la disminución de los niveles de contaminación hasta los límites permitidos para microorganismos mesofilicos y patógenos.

Los microorganismos utilizados en la prueba serán aislados a partir de cepas de la colección oficial y serán los siguientes: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Candida albicans. Bacterias y hongos adicionales podrían ser utilizados para otros fines específicos de la prueba de provocación.

La actividad microbicidas de los conservantes o cualquier otro compuesto en el producto cosmético final, debe ser descartada de la prueba por dilución, filtración, neutralizadores o cualquier otro medio. El rendimiento experimental de los controles microbianos y las pruebas de provocación debe ser establecido y validado por un microbiólogo.


The quality assurance, especially of the microbiological quality of cosmetics, is of special importance because it has been shown that contaminating organisms such as Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella and Candida albicans, cause different types of pathologies in the skin of their consumers, therefore affecting the prestige of the producing country and its industries. Through regulation and legislation, producers, countries of interest, or guilds, among others; standardize compliance parameters, according to their interests and overall quality of product development, facilitating the opening and management of markets at locally and internationally. In Colombia, the National Institute of Food and Drug Monitoring INVIMA, is responsible for enacting and enforcing regulations and legislation concerning the development of the production of cosmetics, for all the above the overall objective of this project grade was descriptive analysis through a review and analysis of regulations and legislation on microbiological quality aspects for the cosmetics industry in Colombia, for obtaining sanitary registration, this compared against parameters and procedures established in regulations from entities such as FDA, the European Cosmetics Toiletry and Perfumery Association (COLIPA), the European Union Commission, leading international cosmetics regulation. It also is developing a proposal to guide the evaluation of the microbiological quality of cosmetics, which aims to inform interested producers on the parameters and procedures, higher quality standards necessary for approval of veterinary and international marketing cosmetics. Thus the fulfillment of the objectives developed in this project grade will be sought initially to raise awareness in the institutions and persons who hold or are dependent on the progress in the production of cosmetics in Colombia, on the gaps and gaps parameters and procedures enacted in the rules, likewise we will try to collect and provide access to information about the highest standards of microbiological quality for producers and stakeholders who want to develop such requirements in their production processes .

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA DE LA NORMATIVIDAD Y …

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