Revisar Es de Clonacion

7/26/2019 Revisar Es de Clonacion

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Clonacin. Despus de la exitosa clonacin de ovinos, bovinos y caprinosnumerosos laboratorios intentaron clonar cerdos. A pesar de los esfuerzos,en esta especie los resultados no fueron buenos inicialmente. Esto motivoque numerosos grupos hayan continuado con la produccin de cerdostransgnicos por microinyeccin pronuclear. As se han generado cerdos con

un incremento de la conversin alimenticia, originados por la introduccinde la construccin compuesta por metalotioneina ! hormona delcrecimiento "#ottle et al,.$%%%&. 'ecientemente tambin se han obtenidocerdos destinados a aumentar la asimilacin del fsforo y reducir laconcentracin de este elemento en las heces, mediante la expresin de la(tasa bacteriana en la gl)ndula salivar de cerdos, esto tendra bene(cios alreducir la polucin ambiental. *a (tasa es una enzima que desdobla el )cidoftico liberando el fsforo del mismo "+olovan et al., --$&. ambin se haalterado la leche de los cerdos para incrementar la salud y el desarrollo delos lechones esto se ha logrado sobreexpresando alfa/globulina bovina"0heeler et al --$&. Estas tcnicas de modi(cacin gentica se realizaron

en estos traba1os basadas en la introduccin del D#A for)neo pormicroinyeccin en la cigotas. Esta metodologa es altamente ine(ciente "$/2 de insercin estable& y produce un alto grado de mosaiquismo debido ala insercin tarda durante el desarrollo embrionario temprano.

El primer cerdo producido por clonacin de clulas som)ticas fue producidoen el a3o --- "4ole1aeva et al& desde esta fecha se han hecho importantesprogresos. Entre ellos la produccin de los primeros cerdos porincorporacin de genes al azar "4ar5 et al., ---6 *ai et al., --$ y --&. 7ibien esta modi(cacin aumenta la e(ciencia en la obtencin de animalestransgnicos, la integracin del transgen contin8a siendo al azar, por lo cual

la expresin del mismo es esencialmente impredecible. 4ara solucionar esteproblema se han estado reclonando los animales con expresin adecuada"7alamone et al., --9& para tener animales de produccin predecible, peroa8n son necesarias futuras me1oras.

*a tcnica de recombinacin homloga permite la modi(cacin precisa delos genes existentes, evita los problemas derivados de los efectosposicinales y de inactivacin por insercin y permite adem)s lainactivacin de genes espec(cos as como el reemplazo de un gen por otro.*a utilizacin de la tcnica de recombinacin homloga permite aplicacionessumamente atractivas en el campo de la produccin animal "4iedrahita,

---&. En cerdos la transgnesis en sitio especi(co o recombinacinhomologa ha sido lograda exitosamente "Day et al., --6 *ai et al., --6'amsoondar et al., --:6 7harma et al., --:&.

*os cerdos son (siolgicamente similares a humanos y ha habido intensointers en utilizarlo para transplante de rganos, as como, para modelo deenfermedades. *a produccin de rganos y te1idos animales humanizadospara ser utilizados en transplante ha despertado tambin un intersenorme. Esto implicar) la expresin de ciertas protenas humanas y elsilenciamiento de algunas protenas de origen animal. Esto puede lograrsecreando cerdos por recombinacin homologa mediante el llamado ;5noc5outde la alfa/$,:/ galactosiltransferasa


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*a expresin de protenas de valor biolgico especialmente de intersfarmacolgico usando como biorreactores animales transgnicos, hademostrado ser un sistema muy e(ciente de produccin en numerosasespecies. *as limitaciones han sido el nivel de expresin, modi(cacionespost/transcripcionales y el efecto biolgico de las protenas exgenas sobre

el animal que las produce. =na vez que el animal fundador ha sido obtenidotambin es una limitante llegar a tener un buen n8mero de animales aescala comercial. En el porcino se ha seleccionado las vesculas seminalescomo rgano de expresin de dichas molculas. *as venta1as que tienendichas gl)ndulas incluyen el hecho que el semen luego de producida lapubertad, es generado constantemente y por lo tanto tambin el >uidoseminal, adem)s se puede colectar en una forma no invasiva, no dolorosa yque no requiere gran entrenamiento. =n cerdo transgnico puede producirpor muchos a3os y ser reemplazado por reproduccin simple en forma nomuy costosa. El plasma seminal es una secrecin externa y una vezproducida no es reabsorbida, es mas, el exceso de secrecin prost)tica es

eliminada por uretra a travs de la orina. Esto permitira expresar molculascon fuerte actividad biolgica y estara ofreciendo venta1as frente a lagl)ndula mamaria donde ya se ha observado la reabsorcin linf)tica deprotenas secretadas. 4or otro lado ha sido demostrado que en ratones a losque se le incorporo el transgen de la hormona del crecimiento para serexpresado en vesculas seminales, no se incrementan los niveles en sangrede dicha hormona cuando se llega a la pubertad. ?ncluso cuando seexpresan niveles de @-- ugml en el >uido seminal "7irad et al., --&.Adem)s los espermatozoides son muy sensibles a cambios de pB y a lasproteasas y el >uido seminal esta preparado para proteger a losespermatozoides a travs de anti/proteasas, esto es interesante porque

probablemente sera posible aprovechar esta caracterstica para preservarprotenas fr)giles. *as protenas est)n en el plasma seminal en formasoluble y no forman micelas como en la leche donde las protenas puedenser atrapadas en las mismas. *os espermatozoides pueden sercentrifugados y el plasma seminal diluido y puri(cado usando todo tipo decolumnas sin problemas de formacin de co)gulos.

*os cerdos son una especie con una e(ciencia reproductiva importante, unmacho heterocigoto puede inseminar unas @- cerdas por mes utilizandoinseminacin arti(cial y cada una de estas puede dar origen a $- lechones,@ de los cuales ser)n machos y /: transgnicos, originando un grupo de

$@- lechones en @ meses, por lo que al a3o habra un numero su(ciente demachos para empezar a producir a escala industrial.

A la pregunta Ccuales ser)n sus aplicaciones agropecuarias en nuestrosistema de produccin *a respuesta es que nuestra capacidad deimaginacin e innovacin es insu(ciente. *a aplicacin m)s inmediata ser)la multiplicacin de animales de elite. *a utilizacin de animales clonadosfacilitara la produccin y difusin de animales transgnicos. 4or e1emplo,existe inters en Europa en reemplazar el gen 4r4 que torna a los bovinossusceptibles al virus de la vaca loca por otro que le otorgue mayorresistencia. #umerosas compa3as ya han producidos animales transgnicos

y clonados especialmente expresando nuevas protenas en leche de valorfarmacutico "aguisi et al., $%%%, 7alamone et al. --@&. Bay proyectos


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que intentan producir cerdos modi(cados genticamente para producirsemen de un solo sexo, o utilizar cerdos como modelo para enfermedadeshumanas como la arteriosclerosis, etc. "Forsberg, --@&. odo esto indica laenorme potencialidad de esta tcnica y el futuro desarrollo que puedaalcanzar en la especie porcina.

/ cnicas de clonacin de embriones. Gon base en los conceptos de laclonacin descritos anteriormente, se observa que existen tres tcnicas quehan sido utilizadas en animales de gran1a o de laboratorio para producirembriones genticamente idnticos. Dos de ellas cabran en el concepto dela clonacin en un sentido horizontalH la particin o divisin de embrionespor microciruga, y la separacin y cultivo de blastmeros aislados pormtodos enzim)ticos o mec)nicos "Agca y col $%%I6 'exroad y 4oJell$%%K&. *a tercera entra en el concepto de la clonacin en un sentidoverticalH la transferencia nuclear a partir de clulas som)ticas de adulto oembrionarias "Gampbell y col $%%L& o de blastmeros de embriones "4rather

y col $%IK6 7avoir y col $%%K6 ana5a y col $%%K& entre otras clulas "abla@&.

/ 4articin o divisin de embriones. En la dcada de los K- se pensaba quelos embriones en fases tempranas de la segmentacin no sobrevivirandespus de una microciruga. Fue en los a3os ochenta cuando se demostrque las mrulas y blastocistos de los animales domsticos eran capaces dedesarrollarse despus de una particin y producir nacimientos viables "'oriey +od5e $%IK&. Actualmente la particin de embriones permite la

produccin de gemelos idnticos al dividir el embrin original por mtodosmicroquir8rgicos. *as evidencias experimentales indican que existe una


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relacin inversa entre el n8mero de secciones que se le hagan al embrin yel porcenta1e de xito. *as tasas de produccin de gemelos monocigticosvan desde poco mas de :-2 en bovinos y ovinos "EdJards y eard $%%I6Berman y col $%%I6 0illiams y col $%I:& siendo hasta casi K-2 en bovinos,con porcenta1es de gestacin superiores a L-2 "$9& e incluso, en algunos

casos, equivalentes a $--2 "0illiams y col $%I:&.

El n8mero de clulas que tenga el embrin no solo limita el n8mero desegmentos en que pueda dividirse, sino que tambin tiene incidencia sobreotros aspectos. picamente se utilizan embriones en etapa de mrula oblastocisto "a5er $%I@6 7eidel $%%:&. Esta estrategia permite utilizar unade las secciones para otros (nes experimentales como la determinacin delsexo del embrin, mientras que el resto se cultiva o congela para despustransferirse a hembras receptoras previamente sincronizadas paramantener la gestacin "Ming y col $%%6 7chmidt y col $%%6 4alma y col$%%@&.

*os embriones en etapa de blastocisto son seccionados de manera que sedividan en dos partes iguales tanto la masa celular interna "NG? como eltrofoectodermo&. Es recomendable emplear soluciones que deshidratenligeramente al embrin "por e1emplo, sacarosa --mN&, con lo que sereduce el da3o al trofoectodermo durante su particin. =na vez cortadas, lasmrulas compactas y los blastocistos no necesariamente deben serintroducidos a zonas pel8cidas, teniendo una sobrevivencia aceptable al sertransferidas en hembras receptoras6 aunque existen informes que indicantasas de supervivencia de $@2 en medios embriones "demi/embriones& sinzona pel8cida y de :@2 cuando se trans(eren con zona pel8cida. En este8ltimo caso las tasas de gestacin van de @@2 a L@2 en bovinos "a5er$%I@&. 0illadsen y +od5e en $%%@, obtuvieron tasas de gestacin de I-2 enbisecciones de embriones de ovino indistintamente si tenan zona pel8cida ono. En la tabla L se muestran algunos de los factores principales queafectan las tasas de xito con esta tcnica.

/ 7eparacin y cultivo de blastmeros aislados. En algunas especies, comolos equinos, se ha utilizado la separacin de blastmeros de embrionesprevios a su implantacin para efectuar estudios de diagnstico deenfermedades genticas. En ellos se ha determinado la viabilidad de losembriones analizados despus de su transferencia en hembras receptoras,encontr)ndose tasas de gestacin de $2 "Buhtinen y col $%%K&.

En humanos la separacin y cultivo de blastmeros aislados tambin hansido utilizados en estudios de biopsias de embriones en diferentes etapas desegmentacin con la (nalidad de dar alternativas a los estudios dediagnstico prenatal, evaluando a su vez el desarrollo embrionario in vitrocon el propsito de que se seleccionen los me1ores embriones capaces dedesarrollarse en blastocistos y congelarlos mientras se eval8an susblastmeros aislados "+eber y col $%%@6 4ierce y col $%%K6 +eber y 7ampaio$%%%&.

*a tcnica de separacin de los blastmeros implica la remocin de la zona

pel8cida, ya sea por mtodos qumicos, mec)nicos o enzim)ticos, paraposteriormente obtener los blastmeros mediante aspiracin, extrusin o


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disminucin de sus interacciones en soluciones libres de Ga! y Ng!"7avoir y col $%%K6 7aito y #iemann $%%$6 Gheong y col $%%:6 'eicheit y#iemann $%%9&. *os blastmeros de rata aislados en la etapa de dos clulas,son capaces de formar embriones completos "Natsumoto y col $%I%&. En elratn se han obtenido gemelos idnticos removiendo la zona pel8cida de

embriones de dos clulas y cultiv)ndolos separadamente previo a sutransferencia "0illiams y col $%I9&. En otras especies, el xito delexperimento se ha determinado como dependiente de diversos factores. As,por e1emplo, en porcinos y ovinos la ba1a e(ciencia en la obtencin de fetosse debe a la ba1a sobrevivencia in vivo.

En embriones libres de zona pel8cida en fases previas a la compactacin"0illiams y col $%I9&. Esta tasa de nacimientos puede aumentarse si seutilizan embriones encapsulados en gel de azarosa "Berman y col $%%I6*ehn/1ensen y col $%I:&. De manera que algunas estrategias para suplir a lazona pel8cida son el empleo de capsulas arti(ciales de azarosa "0illadsen

$%K%& o de alginato de sodio "Eaton y col $%%-6 Adaniya y col $%%:&, omatrices extracelulares como la (bronectina y laminina "7aito y niemann$%%$6 0ilton y rounson $%I%&.

E? n8mero de clulas que forman al embrin separado constituye otro factorimportante en la probabilidad de xito. 0illadsen en $%I%, demostr que latasa de gestacin en ovinos y bovinos se reduca conforme se hacan gruposde clulas de n8meros menores. *a mayor tasa de gestacin que obtuvoeste autor fue del LL2 al utilizar embriones de dos clulas o dos grupos declulas provenientes de embriones de hasta ocho clulas. Guando utilizembriones de cuatro clulas o pares de clulas de embriones de ochoclulas, la tasa de gestacin se redu1o a @-2. Guando se utilizaron losblastmeros individuales provenientes de embriones de ocho clulas, la tasade gestacin fue de slo @2. En todos los casos en los que se separaron lasclulas embrionarias, el n8mero de clulas formando el blastocisto sereduca linealmente con el n8mero de OdivisionesO a la que era sometido elembrin. =n dato importante de este estudio es que cuando se utilizaron lasclulas individuales de los embriones de ocho clulas, el desarrollo de la NG?se vea fuertemente comprometido al extremo de formarse slo vesculassin la presencia de este grupo de clulas.


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Aparentemente, en los blastmeros aislados se promueve m)s f)cilmente laapoptosis y se afecta preferentemente a las clulas de la NG?. Este proceso

contribuye a la incidencia de abortos debido a que la poca cantidad declulas de la NG? reduce la viabilidad fetal "Ghan y col ---&.

En monos esta misma tcnica ha sido aplicada a partir de embriones deocho clulas, en la que se separan los blastmeros mientras son mantenidosen medio libre de Ga! y Ng! ,y luego se reagrupan por pares que seintroducen en zonas pel8cidas para que puedan desarrollarse hasta la fasede compactacin y as transferirlos a hembras receptoras. El I2 de losembriones tratados brindaron cras vivas "Ghan y col ---&.

/ ransferencia nuclear. =na tcnica que incrementa el potencial dedesarrollo de los blastmeros aislados de embriones de ocho clulas o de

etapas mas tardas de la segmentacin es la transferencia nuclear"0illadsen $%I%&. Esta tcnica permite la produccin de individuos


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genticamente idnticos originados a partir de un solo donador de n8cleos"'omo $%%9&. ?mplica la insercin por mtodos qumicos, fsicos, biolgicos omec)nicos del n8cleo de una clula donadora que puede ser tomada devarios te1idos a la cual se le llama carioplasto, con un ovocito activado ycarente de n8cleo, o con un huevo fertilizado al que se le hayan extrado los

pron8cleos "EdJards $%%I6 0lladsen $%I%6 Neng y col $%%K6 romhall$%K@&. Gontrariamente a lo que pudiera pensarse, el desarrollo de estametodologa es m)s bien antiguo, si bien hasta hace poco ha acaparado elinters no slo de la comunidad cient(ca, sino del p8blico en general. En latabla K se muestra una cronologa de los eventos m)s importantes en laobtencin de organismos clonados por transferencia nuclear.

Es importante destacar que tanto el citoplasma que recibir) al n8cleotransferido como el propio n8cleo deben tener caractersticas (siolgicasespec(cas para que se realice con xito tanto la transferencia nuclear comoel desarrollo posterior de la clula reconstituida y, eventualmente, el

desarrollo del nuevo organismo. *a clula que contiene al n8cleo que ser)transferido "carioplasto& debe tener caractersticas particulares quepermitan cierto porcenta1e de xito antes de ser colocado en el espacioperivitelino adyacente a la membrana del ovocito "citoplasto& y se fusione.Experimentalmente el uso de citocalacina para bloquear la polimerizacinde micro(lamentos, y de colchicina para la de los microt8bulos, permitencontrolar los movimientos del citoesqueleto en el carioplasto, provocar unaelasticidad de la membrana plasm)tica y favorecer as la enucleacinmediante el uso de micropipetas, sin romper la membrana plasm)tica"EdJards $%%I6 4rather y col $%IK6 Gheong y col $%%:6 Nc+rath $%I:64rather $%%-6 Pong $%%I&.

7i se utiliza un embrin en segmentacin como carioplasto, tambinrequerir) de la micromanipulacin para obtener sus blastmeros. =no deestos 8ltimos se trans(ere dentro del ovocito en metafase ?? desprovistopreviamente de su n8cleo, y se fusiona con l. Nediante este proceso, elovocito se activa y da inicio a su desarrollo como un nuevo embrin. Enalgunas especies la sola transferencia del carioplasto inicia la activacin delovocito "EdJards $%%I6 4rather $%%-6 romhall $%K@6 Nc*aren $%I9&


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*a primera etapa de esta metodologa es la obtencin del citoplasmaadecuado para que sirva de aceptor del n8cleo. A los ovocitos en metafase ??se les retira el n8cleo, en el caso de huevos fertilizados, se les extraen lospron8cleos en microscopa de contraste de fases. 4ara con(rmar que elmaterial cromosmico haya sido totalmente extrado, se aplican tincionesde AD# en el citoplasma del ovocito. El colorante m)s utilizado para estaetapa es el Boechst ::@I para visualizar la ausencia de contenido nuclearen los ovocitos enucleados, ba1o luz ultravioleta durante perodos de menos

de diez segundos, sin efectos negativos en el desarrollo de los embrionesreconstituidos "Pong $%%I6 7tice y col $%%:6 *e ourhis y col $%%I&.

'especto a las caractersticas del carioplasto, entre mas diferenciada est laclula som)tica, menor ser) la probabilidad de xito en la transferencianuclear. 4ara que una clula sea totipotencial requiere que su n8cleo seacapaz de desarrollarse en un nuevo embrin "7olter $%%L&. 4ara ello losgenes que dan lugar al desarrollo de un organismo completo deben estarpresentes a8n cuando no todos sean expresados "Gasas y col $%%I&.Algunos de los genes que deben expresar las clulas totipotentes son el gen

nap, los factores de transcripcin, los genes Qct :9, el proto/oncogen c5it,

y la AD# metiltransferasa Nt "=rven y col $%%:&.


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*a experiencia con m8ltiples tipos celulares tanto embrionarios como dete1idos diferenciados ha demostrado que el uso de n8cleos de blastmerosobtenidos de embriones de dos clulas es mas e(ciente que los de ochoclulas6 asimismo, los n8cleos de blastmeros de las clulas de la NG? sonmas e(cientes que los de las clulas de la granulosa, por ende, las clulas

embrionarias son mas efectivas que las clulas de individuos adultos"EdJards $%%I&. A su vez, los n8cleos de las clulas de la NG? son m)sefectivos que los de las clulas del trofoectodermo "Nc*aren $%I9&. Gheonget al "$%%:& encontraron que al utilizar n8cleos de blastmeros deembriones de dos, cuatro y ocho clulas que se hallaran en la fasetemprana del ciclo celular "fase + $ de la segunda divisin&, comodonadores de n8cleos para ser transferidos, los de dos clulas daban KI2de blastocistos y %2 de ratones nacidos vivos a partir de los embrionesreconstituidos, mientras que los de cuatro clulas daban K$2 deblastocistos y 2 de ratones nacidos vivos, y los de ocho clulas daban9L2 y $K2 respectivamente. En resumen, los n8cleos obtenidos de

embriones en las fases tempranas de la segmentacin tienen la venta1asobre los provenientes de clulas diferenciadas en que los primerosrevierten con facilidad los cambios que sufren previo a su diferenciacin6mientras que los 8ltimos deben revertir los cambios que ya han sufridodurante m)s de :- ciclos de divisiones celulares.

Es por ello que una transferencia nuclear e(ciente, con un desarrollo atrmino del huevo manipulado, depender) de la reprogramacin adecuadadel n8cleo donador. *as macromolculas del tipo del A'# mensa1ero y lasprotenas almacenadas en el ovocito slo soportan el desarrollo embrionariodurante un tiempo relativamente corto. Entre m)s corto sea este perodo, se

requerir) menor tiempo para la reprogramacin. Gonforme el embrin sufrecambios mayores y crece, sus clulas requerir)n mayor tiempo y ser)probable que esta reprogramacin no se lleve a cabo adecuadamente. Enalgunas especies, la activacin de la transcripcin del genoma reintroducidoocurre hasta el estado previo al blastocisto, por $- que depende de latranscripcin del A'# materno. En embriones productos de una fertilizacinnormal, este proceso se lleva a cabo a diferentes tiempos en diferentesespeciesH a partir del estado de dos clulas en ratones y caprinos6 de cuatroclulas en porcinos6 y en el paso de ocho a diecisis clulas en embrionesde ovinos y bovinos "4rather y col $%IK&. En la transferencia nuclear, lacompatibilidad entre el citoplasma recipiente y el n8cleo donador, es poco

entendida a8n y toma parte en la reprogramacin del n8cleo donado "7olter$%%L&.

Dentro de los cambios que deben revertir los n8cleos de las clulas deadulto durante la transferencia nuclear est) la metilacin del AD# que esesencial para el desarrollo embrionario. El genoma del ovocito est) pocometilado, mientras que en el embrin comienza a incrementarse estametilacin. Esto ultimo afecta la expresin de los genes, la inactivacin delcromosoma R, la diferenciacin celular, y el imprinting "Mo5al1/So5ac $%%I&.Qtros cambios asociados son la activacin de las histonas y modi(cacionesen otras protenas nucleares. 7i estos cambios no se revierten, durante el

crecimiento ocurriran modi(caciones genticas de los n8cleos adultos, tales


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como la mutagnesis som)tica, los errores mitticos, las deleciones ytrisomas "EdJards $%%I&.

Gon el propsito de revertir los cambios en las clulas diferenciadas y asincrementar las tasas de xito en la fusin y en el desarrollo de embrionesreconstituidos por medio de la transferencia nuclear, es importante lasincronizacin de los ciclos celulares de las clulas donadoras de n8cleos yde los ovocitos receptores "Neng y col $%%K6 7olter $%%L6 7errano y col$%%K&. Nerchant en $%%L, le llama a este proceso sincronizacinnucleocitopl)smica. Gomo es ampliamente conocido, durante la vida fetal yhasta la pubertad, el ovocito de los mamferos se encuentra detenido en laetapa de diploteno de la profase de la meiosis ? y sus cromosomas secondensan poco antes de que ocurra la ovulacin por accin de lasgonadotropinas. Este estmulo promueve que el ovocito reasuma suprograma de divisin form)ndose el ovocito secundario con su primercuerpo polar, eliminando as la mitad de su material gentico. En los

mamferos adultos, el crecimiento del ovocito es continuo y termina en laovulacin, cuando es depositado en el oviducto en donde madura e inicia susegunda divisin meitica "meiosis ??&, en la cual se vuelve a detener, soloque esta vez hace en la metafase ??. El ovocito arrestado en metafase ??continuar) su divisin 8nicamente si es activado por el espermatozoidedurante la fertilizacin, en cuyo caso culminar) su segunda divisin meiticay formar) el segundo cuerpo polar "Nerchant $%%K6 *oi y col $%%I60assarman $%%%&.

Durante la maduracin y la activacin, el citoplasma del ovocito modi(casus propiedades en la medida en que la clula es liberada del arresto en lametafase ?? y es activada con la fertilizacin mediante una serie dedescargas de calcio que promueven la reaccin cortical. =na vez ocurrida lafertilizacin, la transcripcin del A'# materno comienza a controlar eldesarrollo en las primeras divisiones mitticas hasta la activacin delgenoma embrionario. Guando se efect8a una transferencia nuclear, latranscripcin del genoma materno del ovocito dirige al n8cleo donadomientras que ste es capaz de asumir el control de las fases embrionariastempranas por s mismo "EdJards $%%I&.

A? igual que en las clulas que se dividen, el ciclo celular del ovocito seencuentra controlado mediante dos factores protenicosH el factor promotorde la mitosis de la maduracin "N4F& formado por una ciclina y la cinasa

dependiente de ciclina, y el factor citost)tico "G7F& que es esencialmente elmismo N4F pero asociado a una protena que inhibe la accin de la cinasa.Guando la protena inhibidora de la ciclina se degrada, la clula es capaz desintetizar AD#, si el inhibidor no se degrada, la clula primeramente esincapaz de entrar a la fase 7 del ciclo y, en consecuencia, puede condensarde manera prematura su material gentico. Guando las concentraciones delN4F se elevan, se inducen algunas alteraciones, tales como ladesintegracin o rompimiento de la envoltura nuclear "DE#&, lacondensacin prematura de los cromosomas "G4G& y la reorganizacin delcitoesqueleto "Gampbell y col $%%L6 Neng y col $%%K&.

4ara que los eventos ocurran apropiadamente despus de la transferencianuclear, los niveles de N4F deben descender o ser ba1os. De otro modo la


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incidencia de da3o cromosmico y aneuploidas puede ser alta "Neng y col$%%K6 Pong $%%I&. 7i la transferencia nuclear se hace cuando el ovocitotiene ba1os niveles de N4F "siete a diez horas despus de su activacin&, noslo se presentar)n menos problemas de aneuploidas, sino que adem)s semantendr) intacta la envoltura nuclear y los cromosomas no se

condensar)n prematuramente, por lo que continuar)n su ciclo dereplicacin/condensacin de manera normal, favoreciendo la sincronizacinnucleocitopl)smica y con ello el desarrollo del cigoto as reconstituido"Nerchant $%%K&.

7i se fusionan clulas en + con clulas en +, el material gentico de estas8ltimas sufre una condensacin prematura como si estuviera lista a iniciarlos movimientos cl)sicos de la divisin celular "mitosis&. 7i la fusin es entreclulas en etapa 7 y +, la sntesis del material gentico se completa y elcontenido de cromosomas en el producto es aberrante, pues no slo haym)s sino que incluso las clulas hi1as sufren la falta de uno o varios de ellos,

mientras que la otra presenta m)s de un par de copias de un cromosoma"trisomas& "7errano y col $%%K&. *os n8cleos donadores que se encuentrenen la fase del ciclo + resultan en un me1or desarrollo que los que est)n enfases 7 o +, ya que es m)s sencillo reprogramar un genoma que est)abierto para sufrir una replicacin, adem)s de que los factores citopl)smicostienen mayor acceso al genoma cuando las clulas donadoras est)n endichas fases "0ilmut y col $%%K&. *os n8cleos se inducen a entrar en unestado de quiescencia "+& cultivando las clulas donadoras o en medios concantidades reducidas de suero. De esta manera se coordinan los cicloscelulares del carioplasto y citoplasto.

Ahora bien, para la fusin de carioplastos y citoplastos se han utilizadoestmulos elctricos, virales y qumicos. *a fusin elctrica y la fusin viralse han utilizado en roedores, lepridos y ovinos. *a fusin elctrica se hausado adem)s en bovinos y en monos rhesus "Neng y col $%%K6 4rather$%%-&. *a fusin inducida por el virus 7endai tiene el inconveniente de quelos n8cleos transferidos no sobreviven o los embriones reconstituidos nologran segmentarse. *as tasas de xito en la fusin por virus son de :-2 enovinos, siendo de tan solo I2 en bovinos "4rather $%%-6 romhall $%K@&, porque este tipo de estmulo ya no se utiliza. =na vez efectuada la fusin, losfactores presentes en el citoplasma del ovocito enucleado y activado ser)nlos que reprogramen al n8cleo, con(rindole la habilidad para regular el

desarrollo embrionario hasta que llegue a trmino "EdJarsd $%%I6 Nc*aren$%I9&. Este desarrollo embrionario puede llevarse a cabo in vitro, o in vivoen oviductos de ovino "0lladsen $%I%6 4rather $%%-&.

odava existe gran variabilidad de resultados con estas tcnicas, con tasasde xito en la electrofusin de blastmeros obtenidos a partir de embrionesde ocho clulas del %-2 en ovinos, K92 en bovinos, I92 en lepridos yIK2 en porcinos "4rather $%%-&, y tasas de gestacin de -2 a @92 "$& ohasta de KI2 en bovinos. En esta 8ltima especie, las tasas de segmentacinde los embriones reconstituidos varan seg8n el sexo de los mismosH K:2para embriones hembras, L:2 para embriones machos "*e ourhis y col$%%I&.


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Existe un informe interesante en bovinos que describe la transferencianuclear utilizando ovocitos de vacas Bolstein "os taurus& con n8cleos declulas aisladas de embriones rangus "@I Angus, os taurus y :Irahman, os indicus&.En otra etapa del estudio, utilizaron blastmeros deembriones de ocho a diecisis clulas de ovino que se fusionaron con

ovocitos enucleados de caprino, desarroll)ndose hasta el estado de ochoclulas al ser cultivados in vivo en oviducto de ovino. *o anterior demuestraque es factible obtener un clon a partir de dos clulas provenientes dediferentes especies animales y cultivarlo in vivo en el aparato reproductorde una especie no homloga "0illadsen $%I%&.

/ Senta1as y desventa1as de las tcnicas de clonacin. *a clonacin a partirde clulas de animales adultos tiene algunas venta1as y desventa1asdependiendo de la tcnica que se trate "Guadros 9 y @&, aunque en generaltodas tendran la venta1a de que al conocerse las caractersticas deldonador permitiran seleccionar a los individuos con alto valor biolgico o

productivo si las caractersticas seleccionadas dependen solo de factoresgenticos, lo que no es tan probable por el efecto de las condicionesambientales, de manera que se desconoce hasta qu grado es un clonrealmente idntico a su donador "*is5er y apia $%%K&.

=na de las consideraciones que deben hacerse cuando se planea laclonacin por transferencia de n8cleos tornados de clulas de adultos, esque stos re>e1an la edad biolgica del donador. Esto 8ltimo parece sertrivial, sin embargo tiene importancia si se analiza lo ocurrido con lasregiones terminales de los cromosomas. En estas regiones se encuentra

AD# de secuencia altamente repetida y en forma general, por tripletes ottradas de nucletidos repetidos, dichas secuencias se conocen comomicrosatlites. Experimentalmente se ha determinado que el n8mero derepeticiones que debe tener es importante para la funcin celular. Duranteel enve1ecimiento, cada vez que la clula se divide el n8mero de estasrepeticiones se hacen menores y permiten que se desarrollen enfermedadespropias de la edad adulta a8n en organismos O1venesO "Narshall ---&.

7in embargo, *anza et al. "---&, observaron que en bovinos clonados portransferencia nuclear a partir de clulas som)ticas enve1ecidas in vitro,ocurra un aumento en la duracin de la vida replicativa de la clula ascomo en la longitud de sus teloneros. As mismo, las clulas som)ticas quehan estado expuestas a carcingenos qumicos y radiaciones duranteperodos prolongados, en este sentido, es posible que hayan acumulado


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mutaciones que pueden manifestarse durante la gestacin, comomalformaciones congnitas o predisposiciones a diversas enfermedades enlos recin nacidos "*is5er y tapia $%%K&

Gon la clonacin queda todava un buen n8mero de problemas a resolver,

como son la e(ciencia de la tcnica de transferencia nuclear, queactualmente es muy ba1a y demasiado costosa para aplicarlacomercialmente de manera rutinaria, ya que a8n en el estudio masconocido de esta tcnica se obtuvo una e(ciencia de -.:L2 "0ilmut y col$%%K&. Gonsiderando que el patrn de desarrollo de los cigotos es muydiverso, la adaptacin de las tcnicas a otras especies precisa a8n de unaextensa investigacin para cada una de ellas "Nerchant $%%K&.

/ Aplicaciones de la clonacin de embriones. En el )mbito cient(co, laclonacin ha abierto un nuevo campo de experimentacin para abordarproblemas fundamentales sobre los mecanismos que controlan la

diferenciacin celular en el inicio del desarrollo "Nerchant $%%K&. ambin es8til en los estudios de (siologa, embriologa, gentica y crianza animal"Berman y col $%%I6 0illiams y col $%I9&.

*os individuos genticamente idnticos pueden ser de sumo valor para losexperimentos controlados en los que se eval8en los efectos ambientales,tales como nutricin, instalaciones y medicamentos. *a transferencia degenomas idnticos en diferentes tipos de citoplastos permitira evaluar lasinteracciones entre citoplasma y n8cleo "0illiams y col $%I:6 4rather $%%-&.

*os clones transgnicos y los derivados de clulas primordiales pueden serincluidos en la investigacin de terapias celulares o genticas,

principalmente si se traba1a con primates no humanos, ya que esto 8ltimosalvara la distancia existente entre las especies de roedores com8nmente


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utilizadas en los laboratorios para desarrollo y prueba de f)rmacos de usoen humanos. En enero de --$, el grupo de +erald 7chatten dio a conocerel nacimiento de un simio que tiene insertado el gene de la protena verde>uorescente "+F4&, de tal suerte que sus clulas pueden ser utilizadas conrelativa facilidad para estudios encaminados a determinar los efectos

nocivos de f)rmacos que puedan ser seme1antes a los obtenidos enhumanos, por lo que los estudios de fases terminales pueden ser masr)pidos y con un modelo mas cercano evolutivamente, en lugar del riesgoque implica hacer la extrapolacin del modelo de roedor o cone1o,com8nmente usado en la investigacin farmacolgica.

Asimismo, los clones con fechas distintas de nacimiento "considerando quede un mismo grupo de clones unos sean transferidos directamente y otrossean congelados para transferirlos con posterioridad& tienen aplicacin en elan)lisis fenotpico de los individuos clonados antes de que sean propagadosy en la transferencia seriada de clulas totipotentes para dirigir la edad

celular mas all) de las expectativas de vida "Nclaren $%I9&. Adem)s, losclones implantados en una misma hembra subrogada podran probar losefectos epigenticos que incluyan el ambiente materno "Ghan y col ---&.

/ Glonacin de embriones por generacin m8ltiple. *a 8ltima meta de losproyectos de clonacin de embriones es producir gran n8mero o un n8meroilimitado de individuos idnticos a partir de un individuo original. *o anteriorha sido llevado a cabo a travs de la clonacin por generacin m8ltipletambin conocido como reclonacin, que utiliza embriones clonados portransferencia nuclear como donadores de n8cleos para producir la prximageneracin de embriones idnticos. De manera que si el primer ciclo detransferencia nuclear produce $- embriones clonados viables, el siguienteciclo posiblemente resultara en $-- embriones clonados en la segundageneracin "7ingla y col $%%K6 7tice y col $%%:&.

A este respecto, desde la dcada de los I-, se han reportado resultadosexitosos en los procedimientos de reclonacin, pudindose obtener seisgeneraciones de embriones "0illadsen $%I%& y terneros de tercerageneracin a partir de embriones en diferentes estados de segmentacin,obtenidos por transferencia nuclear. Asimismo, la multiplicacin en serie deembriones mediante la clonacin ha incrementado el n8mero de progenieproducida de un embrin donador determinado. Nediante ciclos repetidosde transferencia nuclear, se han obtenido gestaciones de clones de tercera

generacin y se han producido embriones en etapa de blastocisto de clonesde quinta generacin. *os lmites de la clonacin en serie a8n no han sidode(nidos. *as tasas de gestacin de los embriones en estado de mrula oblastocisto producidos por clonacin en serie no di(eren de las tasas degestacin de los clones derivados de embriones frescos "7ingla y col $%%K67tice y col $%%:&.

7e ha visto que los blastmeros provenientes de embriones clonados portransferencia nuclear en etapas mas tempranas de la segmentacin, tienenmayores probabilidades de fusionarse a los citoplastos que los provenientesde embriones clonados en etapas mas tardas de la segmentacin, y que

esto va relacionado con el tama3o del blastmero que se va a transferir. *astasas de xito en la reclonacin di(eren con relacin en el tiempo de cultivo


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y el n8mero generacional del clon6 por e1emplo, cuatro das de cultivo invivo en oviductos de ovino da lugar a tasas de fusin de LI2 en embrionesreconstituidos de bovino, respecto del @K2 obtenidos tras cinco das decultivo in vivo. 7in embargo, los clones de cinco das de cultivo puedenproducir 9.@ generaciones de clones, mientras que los de cuatro das solo

:.L. *a tasa de xito en la fusin se reduce de una generacin a otra, ya quede una lnea clonada se han obtenido $$ clones en la primera generacin,$L en la segunda, - en la tercera y solo K clones en la cuarta generacin"7tice y col $%%:&.

Pong y Puqiang "$%%I&, lograron obtener cras de caprino de la primera a lasexta generaciones, de las cuales tres pares fueron gemelos monocigticos,tres series fueron de triples monocigticos, dos series de cu)druplesmonocigticos, tres series de quntuples y una serie de heptaplesmonocigticos.

*os abortos y las tasas de gestacin pueden diferir entre reclines y la

primera generacin de embriones clonados por transferencia nuclear.0illadsen "$%I%&, informa que la segunda o posteriores generaciones debovinos y ovinos, tienen tasas de gestacin mas ba1as que la primerageneracin de embriones clonados, y que las tasas de aborto seincrementan a partir de la segunda generacin.

Gon el estudio profundo y el adecuado control de las de(ciencias actualesde la clonacin, en un futuro la clonacin en serie permitir) a su vez, laclonacin de animales transgnicos que contengan genes selectos. De ahse deduce que la clonacin ofrece una enorme oportunidad para la gananciagentica, el incremento en la e(ciencia de la produccin de alimentos de

origen animal y los programas de investigacin "7ingla y col $%%K&.

/ Aspectos comerciales de la clonacin de embriones. Guando la clonacinse aplica a los embriones de alto valor, la habilidad para producir variosnacimientos por cada embrin ofrece su(ciente venta1a econmica pararecuperar los costos involucrados, sobre todo si se utilizan procedimientosde sexado de embriones, de manera que los nacimientos de individuosclonados sean de sexo predeterminado. Esto pondra un limite en el n8merode embriones de sexo masculino transferidos, lo cual reducira el n8mero detransferencias requeridas o permitira obtener una poblacin de pie de craefectiva con el mismo n8mero total de transferencias "#icholas $%I:&. 7in

embargo, la e(ciencia con la que se cuenta actualmente a8n no permite unaproduccin de embriones en masa a un costo accesible para la produccinde animales comerciales "7ingla y col $%%K&. Es necesario que seincrementen signi(cativamente las tasas de xito para que el mercado delos embriones clonados pueda hacerse realidad. Actualmente en el mundoexiste un laboratorio que ofrece la clonacin de embriones por transferencianuclear, a la cual los ganaderos pueden enviar sus embriones para recibirclones por $-- dlares cada uno "'omo $%%9&.

Qtra limitante es que los pesos de los individuos clonados al nacimiento sonanormales. Estos procedimientos dan lugar a una mayor incidencia de

distocias, aunque posterior al nacimiento las tasas de crecimiento no seafectan por este procedimiento. #o se conoce explicacin biolgica sobre


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este aspecto "7ingla y col $%%K&. Es necesario incrementar la e(ciencia deeste procedimiento para eliminar el problema de gigantismo fetal que se haencontrado en algunos becerros producidos por transferencia nuclear "'oma$%%9&. En ovinos no se ha observado alteracin en los pesos al nacimientode los individuos clonados, pero s un alargamiento en la duracin de la

gestacin que es in>uenciado por el genotipo fetal "0ilmut y col $%%K&.

Es clara la necesidad de investigacin b)sica, utilizando especies de las quese tenga un conocimiento adecuado para los (nes de la investigacin. Estetipo de estrategias, por su accesibilidad y ba1o costo, podran ser llevadas acabo en animales de laboratorio, explorando mas la tcnica en los )mbitoscelular y molecular, de manera que la solucin a los problemas de las tasasde gestacin y pesos al nacimiento podra obtenerse de los experimentos apartir de estas especies "7ingla y col $%%K&.

/ Aplicacin de la clonacin en la conservacin de especies. *a recientedemostracin de la capacidad para clonar mamferos adultos, ha propiciado

una variedad de nuevas ideas de investigacin para los interesados en lasespecies en peligro de extincin.

*a clonacin tiene el potencial de minimizar la prdida de recursosgenticos, al igual que rescatar la prdida de material gentico6 por lo quepermitira expandir el n8mero de tasas incluidos en los programas desupervivencia de especies, porque hara posible la criopreservacin deembriones clonados6 aunque habra que pensar con cuidado, en las especiesanimales que podran ser utilizadas como las receptoras de los embrionesde especies en peligro de extincin que vayan a ser clonados, yconsiderandoH que los tipos de placentacin son diferentes para cada

especie6 que la transferencia embrionaria interespec(ca slo funciona enlas especies en las que es posible crear hbridos6 que hay especies silvestresque no se reproducen en cautiverio, y tambin que el comportamientomaterno de las hembras receptoras hacia las cras nacidas a partir deembriones clonados de especies no homlogas a ellas, podra afectar lasupervivencia de los clones, etctera "'yder $%%K&.

El grupo *anza et al. "---& efectuaron la primera clonacin de una especieen peligro de extincinH un gaur asi)tico a quien llamaron T#oU, obtenidopor la transferencia de n8cleos utilizando clulas de piel "(broblastos& degaur macho y ovocito enucleado de vaca domstica, y cuyo embrin

reconstituido fue transferido en una vaca domstica. Actualmente esperanel nacimiento del gaur clonado y se3alan que est)n en planes de serclonadas especies tales como el antlope bongo, el tigre de 7umatra y elpanda gigante. Asimismo, se cuenta con clulas preservadas de una especieya extinta, la cabra bucardo de monta3a, de Espa3a, en la que se estapensando aplicar la clonacin.

Gonsideraciones ticas de la clonacin. Basta ahora se ha hablado sobre

algunas consideraciones que deben ser cuidadosamente estudiadas conrespecto ala clonacin de animales, tanto para el abasto como para laconservacin de especies en peligro de extincin6 queda solamente

mencionar las probables consecuencias que esta tcnica tendra si fueraaplicada a los seres humanos.


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En $%I9 Nc*aren consideraba que la transferencia nuclear podra seraplicada en los seres humanos6 se3alaba que para las pare1as que tuvieranel riesgo de transmitir defectos genticos a su progenie, si se recuperaranvarios ovocitos de una mu1er, se enuclearan y se les trans(riera un n8cleode la NG? de alguno de sus propios embriones6 unos cuantos podran ser

congelados mientras que los remanentes genticamente idnticos podranser evaluados para defectos genticos por an)lisis cromosmico, an)lisis deAD# - por mtodos bioqumicos. De esta forma se asegurara a la pare1aque cualquier embrin transferido al 8tero materno del stoc5 que fueracongelado, estara libre de defectos genticos.

A este respecto existen opiniones tanto en favor como en contra. 4ore1emplo, en $%%K el Gonse1o iotico de Estados =nidos de Amrica"#acional ioethics Advisory Gomisin $%%K&, se3al la preocupacinexistente acerca del posible da3o fsico provocado por la manipulacin delovocito, n8cleo y embriones, as como del da3o psicolgico en cuanto al

sentido de la individualidad y la autonoma personal de los individuosclonados. Nencionan la preocupacin tica sobre la degradacin de lacalidad de la familia y el parentesco en el caso de que los padres quisierantener un control excesivo sobre las caractersticas de sus hi1os.

*is5er y apia "$%%K& opinan que la clonacin de embriones humanos tendrautilidad en la investigacin siempre y cuando los embriones no fueranimplantados en el 8tero de mu1eres, y que tuviera la (nalidad deincrementar el conocimiento en biologa celular y los mecanismos deexpresin gentica, ya que no deben ponerse obst)culos al avance en lainvestigacin cient(ca. Aunque hacen hincapi en la importancia de discutiry resolver todos los problemas ticos y legales que plantea la clonacin denuestra especie.

A (nales del --- las autoridades inglesas aceptaron la aplicacin de laclonacin por transferencia nuclear en humanos, pero con una temporalidad(nita de solo semanas y con una idea de aplicacin exclusiva para laobtencin de te1idos que puedan ser utilizados para transplante. =naalternativa en este sentido es la estrategia de(nida por los traba1os deQnishi et al. "---&, y de 4ola1aeva et al. "---& en los cuales se obtuvieroncerdos clonados por transferencia nuclear y cuya similitud en cuanto atama3o de rganos y capacidades de aspecto inmunolgico son muysimilares a la de los humanos.

Bottois "$%%I& considera que se le est) dando mayor prioridad alasreacciones simblicas de la clonacin que al an)lisis de sus tcnicas. Qpinaque no hay razn para en1uiciar la clonacin, ya que desde el punto de vistade una pare1a con problemas de esterilidad total, - que hayan perdido a unhi1o, - de una pare1a en la que ambos cargan genes letales, la clonacin noimplicara la reproduccin en masa de clones sino de tan solo uno - quiz)sdos, y que ello no afectara la autonoma de los clones. Adem)s, recuerdaque la identidad biolgica entre los clones, y entre ellos y su donador nosera total, ya que existen diferencias ligadas al AD# mitocondrial "quepermanece en los ovocitos receptores& y alas la seleccin natural, son

reintegrados al 1uego con lo que eventualmente pueden obtenerse


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individuos en cuyos embarazos se mani(esten nuevamente estos genesletales.

4or otro lado, ryan "$%%I& trata de aproximar el que sera el sentir de loshumanos como individuos clonados con el de los gemelos monocigticosque nacen de manera natural. Explica que en virtud de que aun cuandoestos 8ltimos son idnticos genticamente, siempre hay uno que naceprimero que el otro y que, por $- tanto los medios uterino y extrauterinoin>uyen para producir no solo apariencias sino tambin personalidadesdiferentes en cada uno. En el aspecto psicolgico, se3ala como venta1a quelos gemelos monocigticos tienen facilidad para relacionarse ycomprenderse mutuamente dada su identidad biolgica6 pero comodesventa1as, que tienen mayores riesgos de nacer prematuramente - detener altas tasas de muerte perinatal.

4or 8ltimo, EdJards y eard "$%%I& se3alan que la biseccin - separacinde embriones y la transferencia nuclear actualmente aplicadas en animales,

podran considerarse para su aplicacin en humanos en la prxima dcada

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