Benemérita Universidad Autónoma de Puebla

GENÉTICA MICROBIANA

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

TEMA: TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

Alumno: José Alberto García Orozco

Índice Definición de ADN

recombinanteClonación GenéticaVectores de clonación

Definición de ADN recombinante

Es una molécula de ADN formada por la unión de dos moléculas de diferente origen.

unión in vitro de ADN

Dos organismos diferentes que no se encuentran juntos

Introducir ADN

recombinante

Modificación genética

Adición de un nuevo AND

Modificación de rasgos existentes

ADN RECOMBINANTE

HERRAMIENTAS

ADN cromosómico

COPIA DE PLÁSMIDO RECOMBINANTE

LINEARICEN LOS

VECTORES MULTIPLICARSE

BACTERIA

DIVISIÓN Y FORMACIÓN DE UN

CLON

APLICACIONES

Industria farmacéutica y química: se

usan bacterias para producir

sustancias de interés para el

hombre, como por ejemplo insulina

Industria alimentaria: se usan

bacterias para producir colorantes

alimenticios.

Agricultura y ganadería: producción de plantas y animales transgénicos.Medicina: técnicas de diagnostico

molecular y terapia génica.

CLONACIÓN GENÉTICA

Tipos de clonación

Clonación molecular Clonación celular Clonación de organismos Clonación de organismos de

manera artificial

Es el procedimiento de obtener una población de varios individuos genéticamente homogéneos a partir de uno solo mediante reproducción asexuada.

CLONACIÓN

Clonación molecular

Método mas

conocido

Extraer una parte del

ANDInstarlo

donde sea conveniente

clonación fragmentación ligación

Transfecciónselección

Clonación celular

De una sola célula se

forma una cierta

población

Su uso a partir de aros o cilindros de

clonación

Agente mutagénico

Clonación de organismos

amebas

Característica fundamental

Se produce una copia de un organismo ya existente

Misma información

genética

Reproducción asexuada

CLONACIÓN DE ORGANISMOS DE MANERA ARTIFICIAL

encontramos don tipos de células las cuales participan activamente en la clonación de manera artificial

La primera de ellas es la que dona su material genético (ADN)

la segunda esla que lo recibe

Se basa en que el citoplasma del ovocito receptor tenga las cualidades necesarias para reorientar el control genético de la célula donadora para poder crear el nuevo organismo.

electrochoques se fusionanambas células

son los encargados de incitar al desarrollo de lanueva célula formada

injertada en el útero de la hembra donde se le permite un ambiente apto para su crecimiento.

VECTORES DE CLONACIÓN

PlásmidosFagosCósmidosBACPACYAC

Vectores de clonación Aquellos que permiten mantener el ADN exógeno en la célula hospedadora.

DIFIEREN

especificidad de la célula huésped

tamaño de los insertos que pueden transportar

número de copias que producen

número y tipo de genes marcadores que contienen

PLÁSMIDOS

CARACTERISTICAS

primeros vectores que se desarrollaron

proceden de moléculas de ADN de

doble cadena extracromosómicas

se replican autónomamente

dentro de las células bacterianas

Portan fragmentos pequeños de ADN pasajero, de entre

0,1 y 8 kb

pBR322, pUC18, pBluescript

Tienen un origen de replicación (ORI).

Se sirven de las enzimas de la célula bacteriana para replicarse, pero contienen genes reguladores de la replicación

Pueden transferirse por conjugación de una bacteria a otra, puesto que poseen genes tra (transferencia) y genes mob (movilidad)

Éstos no están presentes en los plásmidos usados como vectores, pues no interesa que se transfieran de una célula a otra

primer plásmido utilizado en biotecnología

Diseñado en 1977 por Bolívar y Rodríguez

un gen de resistencia a la ampicilina (ampr) y otro de resistencia a la tetraciclina (tetr)

Dianas de restricción: EcoRI, PstI y BamHI

Fagos Bacteriófago O Fago lambda

virus complejo de ADN lineal bicatenarioSe conoce la secuencia completa de sus48.502 pares de nucleótidos y la función desus genes

El tercio central del cromosoma contiene genes que son requeridos para lalisogenia

ciclo lítico

Parte central (de aproximadamente15 kb) del cromosoma puede ser cortada con enzimas de restricción y substituida por un fragmento de ADN foráneo

Molécula resultante de ADN recombinante puede ser empaquetada en las cabezas del fago in vitro.

ciclo lisogénicovirus se inserta en un puntoconcreto del genoma de labacteria. virus se replica cuando lo

hace la bacteria

su genoma a las réplicas deE. coli.

ciclo lítico

se producenpartículas virales

liberadas al medioBacteria hospedadora eslisada

Genoma del fago lambda

Cartografiado y secuenciado completamen

te

Eliminar partes no útiles del genoma

Introducir el ADN exógeno

Vector

Cápside sólo hay hueco para 50 kb,

ADN vírico

ADN pasajero

Dos tipos de vectores

vectores de inserción vectores de sustitución

vector de inserción λgt10

vectores de sustitución se sustituye toda la región prescindible del genoma del fago por el ADN de interés

moléculas exógenas de mayor tamaño (de hasta 20-25 kb).Dos sitios de restricción

Flanquean el segmento de ADN que es sustituido por el ADN que se va a clonar.

Genoma del fago enzima de restricción

Tres fragmentos

brazo izquierdo, brazo derecho y región stuffer

Cósmidos

Permiten la introducción de insertos de ADN de hasta 45 kb

un plásmido segmentos del genoma de un bacteriófago como el fago λ

¿QUÉ CONTIENE UN CÓSMIDO?

El origen de replicación y genes marcadores de resistencia a antibióticos

plásmido

Gen lacZOrígenes de replicación para fagos como el M13

Fago λ

Extremos Cos

Emplean para la recircularización del mismo

SuperCosDos sitios cos, entre los cuales se sitúa la diana de restricción Xba I

Un origen de replicación (ori).

Un sitio de clonaje múltiple (MCS), es un polylinker que no interrumpe ningún gen marcador, incluye la diana de restricción BamH I.

Dos genes marcadores: uno de resistencia a ampicilina y otro de resistencia a neomicina

SV40 ori: origen de replicación del virus animal SV40, usado para replicar el vector cuando se introduce en células animales.

¿CÓMO SE PRODUCEN LOS CÓSMIDOS RECOMBINANTES?

Enzima de restricción

BamHI

Hidroliza los grupos P de los extremos

5'

Cortar el vector y

linealizarlo

Extremos 5' OH

Emplea la enzima

fosfatasa alcalina

Evita que el plásmido se circularice de nuevo

BAC cromosoma artificial bacteriano

Usado para clonar fragmentos de ADN de 300 kb de tamaño medio

BAC

PACs BACs

Plásmido factor-F

Escherichia coli

Integrarse en el cromosoma bacteriano y es responsable de la conjugación bacteriana.

BAC(factor de fertilidad)

Genes

oriS: origen de replicación

rep: control de la replicación del plásmido

parA, parB, parC: genes implicados en el mantenimiento de un número bajo de copias (1 o 2) del plásmido en la bacteria.

No proceden del factor-F

gen de resistencia al cloranfenicol

Minigen lacZ con un polylinker (MCS) en su interior.

sitio reconocido por la enzima recombinasa, permite linealizar el vector

PAC Cromosomas artificiales

bacterianos derivados del fago P1

Alojan menos cantidad de ADN pasajero

permiten el empaquetamiento in vitro

Intervienen en la circularización del vector

Un origen de replicación

Gen marcador de resistencia a la canamicina

Gen marcador sac implicado en el metabolismo de la sacarosa

sitio de clonaje múltiple

YAC cromosoma artificial de levaduras

mayor capacidad (hasta 2 Mb) Son utilizados en construcción de genotecas genómicas

son más inestables ADN que se inserta puede proceder de dos regiones distintas del genoma

CARACTERISTICAS

BACTERIAS

LEVADURA

Origen de replicación (ori) de tipo plasmídico.

Gen marcador de resistencia a ampicilina (ampr).

Secuencia de replicación de levaduras (SRA).

Genes marcadores de selección

TRP

URA

metabolismo

Gen marcador de inserción sup adenina

Centrómero permite la segregación durante la división celular

Dos secuencias teloméricas (TEL), procedentes de un ciliado del género Tetrahymena