24 Daymara I. Vaillant Flores et al.: Medio de cultivo para Phytophthora nicotianae

Rev. Cieñe. Tecnol. Año 15 / N° 19 / 2013 / 24-27

Propuesta de medio de cultivo para el estudio de Phytophthora Nicotianae Breda de Haan Proposal of a culture médium for the study of Phytophthora Nicotianae breda de haan

Daymara I. Vaillant Flores, Marleny González García, Rebeca Ramírez Ochoa

Resumen

El género Phytophthora representa un grupo difícil de aislar y conservar. Por lo que se han desarrollado varios medios de cultivo para su estudio. Se propone al medio Agar-tabaco como alternativa para el crecimiento y desarrollo de P. nicotianae. Para realizar este trabajo se emplearon dos cepas: Pp1 y Pp6 aislados de tabaco y piña respectivamente. Ambas se sembraron en discos en agar-tabaco, y se comparó con agar tomate y agar harina de maíz. Se determinó el crecimiento lineal del hongo, las características del micelio y estructuras formadas en cada medio. El crecimiento micelial fue graficado y analizado estadísticamente, los datos restantes fueron tabulados. Pp1 creció aceleradamente en el medio agar tabaco mostrando diferencias significativas con el resto. Pp6 tuvo un crecimiento lento en agar tabaco con diferencias significativas. Ambas cepas mostraron un micelio no algodonoso, pobre y con bordes irregulares; formaron estructuras reproductivas como clamidosporas y esporangios. Se considera el medio agar tabaco alternativo para el crecimiento de P. nicotianae aislado de diferentes hospederos.

Palabras clave: Medio cultivo, agar tabaco, Phytophthora nicotianae.

Abstract

Phytophthora genus has been a group whose isolation and conservation is laborious. For this reason, several culture medium have been developed for their study. This paper proposes the tobacco-agar medium as alternative for the growth and development of P. nicotianae. In this work the strains Pp1 and Pp 6 isolated of tobacco and pineapple respectively, were used. The isolates were placed individually in Petri dishes with tobacco-agar medium, tomato-agar flour medium and cornmeal-agar medium. The cultural and morphological characteristics were described and the lineal growth of the fungus was measured and graphed. Pp1 grew rapidly in tobacco-agar medium, showing significant differences with the rest of the media tried. Pp6 showed a significantly minor growth in tobacco-agar medium. Both strains showed a weak, fluffy micelia with irregular borders; they formed reproductive structures as chlamydospore and sporangia. The tobacco-agar medium was considered effective for growth of P. nicotianae isolated from different hosts.

Key words: Cultive medium, Tobacco-agar, Phytophthora nicotianae.

Introducción

La pata prieta es la enfermedad causada por Phytoph-thora nicotianae Breda de Haan; esta provoca grandes afectaciones en el cultivo del tabaco en Cuba. Fue descrita por Breda de Haan en 1896 en semilleros de tabaco en Java (Fernández et al., 1998).

En Cuba fue referida por primera vez en 1905, pero no fue hasta 1957 que fue aislado e identifcado el agente causal por Roseñada (1962). Además del tabaco, P. nico-tianae afecta otros cultivos de importancia económica para el país.

Esta especie al igual que otras del género, resulta difícil su aislamiento y conservación. Varios investigadores han desarrollado medios de cultivo selectivos para este grupo. La base nutritiva que se utiliza en la preparación de dichos

medios debe ser preferiblemente natural (papa, tomate y ha­rina de cereales) ya que permiten un crecimiento acelerado y constante del hongo. También pueden emplearse una base totalmente artificial con la condición de que contenga tiamina; esta base nutritiva sea natural o artifcial, se le adicionan inhibidores para eliminar las bacterias y hongos no deseados (Gilchrist-Saavedra et al., 2005).

Los medios naturales además de permitir el crecimiento micelial; también proporcionan la formación de estructuras reproductivas mucho más rápido que los sintéticos, esto se debe fundamentalmente a la presencia del sitosterol (Erwin y Ribeiro, 1996).

Por esta razón el objetivo de este trabajo es probar el medio agar tabaco como medio natural alternativo para el crecimiento y desarrollo de Phytophthora nicotianae aislado de diferentes hospedantes.

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Materiales y métodos

Se emplearon dos cepas de P. nicotianae: Pp1 (aislada de tabaco) y Pp6 (aislado de piña), pertenecientes a la colección del Laboratorio de Micología del Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal (INISAV). Las mismas se encontraban conservadas en agar tomate a 4 ºC. Para el ensayo se utilizaron placas de Petri de 5 cm de diámetro con medio agar tabaco que se preparó con 35 g de hojas de tabaco, las cuales se hirvieron por 15 minutos en 1 L de agua destilada y se le agregó 15 g de agar y se esterilizó en autoclave por 20 minutos. Además del agar tabaco (ATb) se emplearon los siguientes medios: agar tomate (ATm) y agar harina de maíz (AHm), descritos como medios de cultivo idóneos para el crecimiento P. nicotianae (Bruna y Tober, 2004; Pérez et al., 2004) y los cuales sirvieron como patrones para observar el comportamiento de este patógeno en el agar tabaco. Para este estudio se tomaron tres réplicas por medio.

Se sembraron en el centro de las placas con los difer­entes medios, discos de 1 mm de diámetro del hongo. Se incubaron 25 + 1 ºC y se chequearon diariamente mi­diendo el diámetro del crecimiento de la colonia durante siete días. Además; se describieron las características del micelio en cada medio. Se realizaron preparaciones al microscopio óptico para observar las estructuras formadas. Los datos sobre el crecimiento micelial se grafcaron y se analizaron estadísticamente, por un análisis de varianza simple (ANOVA). Los datos sobre la descripción de la colonia y las estructuras formadas fueron tabulados.

Resultados y discusión

Trascurrido el tiempo previsto para el crecimiento de las cepas, ambas crecieron en el medio ATb y en los medios patrones. La cepa Pp1 mantuvo un crecimiento acelerado en el medio ATb, mostrando diferencias significativas con los medios ATm y AHm, y estos a su vez, tuvieron diferencias signifcativas entre sí (Figura 1).

La cepa Pp6 mostró un comportamiento diferente a la cepa anterior, su desarrollo en el medio de estudio fue el más rezagado con respecto a los demás (Figura 2), con diferencias. El medio agar harina de maíz resultó ser el de mayor crecimiento para la cepa.

Se puede teorizar que este comportamiento diferente de ambas cepas en el medio agar tabaco se deba en gran medida a la procedencia de cada una de ellas, sí se tiene en cuenta que la cepa Pp1 fue aislada de tabaco esto podría favorecerle el crecimiento en un medio de cultivo con este sustrato; no ocurriendo así con la cepa Pp6 que es un aislado de piña, el cual debe adaptarse primeramente a las propiedades nutritivas que le brinda este medio para crecer. No obstante para afrmar este comportamiento se debe trabajar con un número mayor de aislados en diferentes hospedantes.

Figura 1 : Crecimiento micelial de Pp1 en los diferentes medios.

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M. 1-i:

Harina maíz Tomate Tabaco

Figura 2: Crecimiento micelial de Pp6 en los diferentes medios.

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Harina maíz Tomate Tabaco

Muchos han sido los autores que han empleado los me­dios agar harina de maíz y agar tomate para el crecimiento de especies de Phytophthora. Bruna y Tober (2004), obtuvieron aislados de P. nicotianae en plantas de chile, empleando medio harina de maíz con antibióticos. También se ha utilizado para el crecimiento de otras especies como P. capsici utilizando medio agar jugo de tomate (Pérez et al., 2004).

En la literatura consultada, no se informa acerca del empleo de medio agar tabaco para el crecimiento de Phyto-phthora spp. Se conoce que este medio ha sido empleado en el estudio de levaduras como es el caso de Candida albicans. Khan et al., (2004) propusieron este medio para la diferenciación de C. albicans con C. dubliniensis, pero con cantidades de tabaco mayores a las utilizadas en este estudio. También se emplea para incentivar la producción de pigmentos en la identifcación de la bacteria Cryptococ-cus neoformans causante de las caries dentarias (Tendolkar et al., 2003).

En cuanto a las características del micelio de cada una de las cepas en los diferentes medios se remite a la tabla 1. En cada uno de los medios de cultivo las colonias tuvieron características diferentes; se destaca el medio agar tabaco en el cual la colonia tuvo una forma aracnoides; esta forma es característica de P. nicotianae en agar papa dextrosa (PDA) que la distingue de otras especies como el caso de P. citrophthora cuya colonia es de forma petaloide (Erwin y Ribeiro, 1996); por lo cual esta podría ser una característica que favorecería su identifcación.

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Tabla 1 : Características del micelio en cada uno de los medios para las cepas Pp1 y Pp6.

ATb Medio ATm Medio AHm

Micelio ralo. Micelio algodonoso. Micelio ralo Micelio poco abundante. Micelio abundante. Micelio poco

Bordes de la colonia Bordes de la colonia abundante. irregulares. irregulares. Bordes regulares.

Por otra parte la cepa Pp1 formó clamidosporas (fgura 3a) y esporangios papilados en el medio ATb culminados los siete días de incubación; en los medios a AHm y ATm solamente formó esporangios. La cepa Pp6 formó en medio ATb esporangios papilados (figura 3b); al igual que en los restantes medios de cultivo con diferentes dimensiones (tabla 2).

Figura 3: a) Clamidosporas formadas en medio ATm por Pp1 (100x)

b) Esporangios formados en ATm por Pp6 (100x)

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Tabla 2: Dimensiones de las estructuras formadas por las cepas Pp1 y Pp6 en cada medio de cultivo

Cepas Medio de cultivo Esporangios Clamidosporas

Agar tabaco 17- 24 µm x 15 a 17 µm de 15 - 18 µm diamétro

Agar tomate 23- 25 µm x No formó

Pp1 15- 20 µm clamidosporas

Agar harina 20 -24 µm x No formó de maíz. 15 - 19 µm clamidosporas

Agar tabaco 15-23 µm x 12-17 µm

Agar tomate 15-20 µm x No formó en ninguno Pp6 13-18 µm de los medios

Agar harina 21-25 µm x de maíz 16-19 µm

Kumar y Menon (2006) obtuvieron clamidosporas de un aislado de Candida albicans en medio agar tabaco. Los medios ATm y AHm han sido empleados por muchos autores para la obtención de estructuras reproductivas con el fn de identifcar y estudiar la biología de esta especie y de otras de este género (Bruna y Tober, 2004; Fernández y Wong 1997). En cuanto las dimensiones de las estructuras formadas en el ATb se encuentra en el rango planteado por Hall 1993 (Erwin y Ribeiro, 1996), el cual establece que los esporangios de P. nicotiane pueden estar en un rango de 11 a 60 µm de largo por 20 a 45 de ancho y las clamidosporas se encuentran en un rango de 13 a 60 µm de diámetro.

Conclusiones

Podemos concluir que el medio de cultivo agar tabaco resultó satisfactorio para el crecimiento de ambas cepas y permitió la formación de estructuras como clamidosporas y esporangios, necesarias para la identifcación de las espe­cies. Estas estructuras biológicas formadas fueron similares en sus dimensiones a las que se obtienen en los medios tradicionales (agar tomate y harina de maíz). Por esta razón se puede emplear el medio agar tabaco como alternativo para el estudio de diferentes aislados de P. nicotianae.

agradecimientos

Los autores agradecen al Laboratorio Provincial de Sanidad de Vegetal (LAPROSAV) de Ciego de Ávila, Cuba por la donación de la cepa Pp6.

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Recibido: 21/06/2012 Aprobado: 22/10/2012

• Daymara Idonay Vaillant Flores1

Licenciada en Microbiología (Universidad de La Habana). Trabajo en el Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal en el área de Fitopatología, en el departamento de micología. Ostento la categoría de Aspirante a Investigador, actualmente trabajo en tres proyectos de Investigación ligados a la ftopato-logía y al uso de sustancias naturales como fungicidas, curso la Maestría en Ciencias Botánicas (Universidad de La Habana). dvaillant@inisav.cu

• Marleny González García1

Máster en Ciencias Botánicas (Universidad de La Habana) y Máster en Biotecnología Molecular Celular y Genética (Universidad de Córdoba, España). Trabajo en el Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal en el área de Fitopatolo­gía, en el departamento de micología. Ostento la categoría de Investigador Agregado, actualmente trabajo en .proyectos de Investigación ligados a la ftopatología y a la caracterización molecular de géneros de hongos ftopatógeno. mgonzalez@ inisav.cu

• Rebeca Ramírez Ochoa1

Técnico de Laboratorio en Microbiología. Trabajo en el Institu­to de Investigaciones de Sanidad Vegetal en el área de Fitopa­tología, en el departamento de micología. Ostento la categoría de Técnico en Ciencia e Innovación y está vinculada a proyec­tos de investigación y a trabajos de servicio técnico.

1. Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal, 110 # 514 e/ 5ta B y

5ta F, Playa, La Habana, Cuba.

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