RESUMEN grupo 2 laboratorio de microbiología

Microscopia

La microscopía es la técnica de producir imágenes visibles de estructuras o

detalles demasiado pequeños para ser percibidos a simple vista. En la

microscopía se evidencia los grandes aportes que la física ha hecho a la

biología.

Microscopio óptico de campo claro: El microscopio óptico convencional es

compuesto porque posee dos sistemas principales de lentes convergentes

(ocular y objetivo), en cambio los microscopios simples o lupas, de menor

aumento, presentan un solo sistema de lentes biconvexas o plano-convexas

montadas en una armadura metálica. La mayoría de los modelos actuales son

binoculares, aunque también los hay monoculares. El microscopio compuesto

convencional se denomina "de campo claro" o "de campo brillante" porque todo

el campo se ilumina con una lente condensador común, a diferencia de

variedades que utilizan luz difractada, de fondo obscuro. Las muestras que

utiliza el microscopio compuesto convencional deben ser traslúcidas y estar

teñidas para entregar contraste.

Microscopio de contraste de fases: Se basa en la propiedad de los rayos

luminosos de modificar su longitud de onda al atravesar un medio de refracción

distinto. Este desfase de las ondas es imperceptible a la vista, pero el

microscopio lo transforma en diferencias visibles de amplitud, y por lo tanto de

intensidad. Tiene un condensador especial (condensador de Zernike) y placas

de retardo o láminas de desfasado. si hay pequeñas diferencias en el índice de

refracción en el objeto, los rayos luminosos se retardan o adelantan respecto al

haz original. Las distintas densidades originan diferencias de fase entre las

ondas luminosas emergentes, que se transforman en diferencias de intensidad

luminosa. Permite observar detalles en células vivas, provenientes de cultivos o

de animales vivos, y observar material fijado que no puede colorearse. Tiene la

desventaja de producir halos y es difícil obtener una alta resolución. Las

muestras deben ser muy delgadas y no deben abarcar todo el campo de

observación. La fuente luminosa debe ser muy intensa.

Microscopio de campo obscuro: Se basa en que substancias con distinto

índice de refracción desvían de distinta manera los rayos luminosos, lo cual

proporciona contraste a material no teñido, permitiendo visualizar muestras

vivas. Un condensador especial bloquea los rayos centrales y deja pasar los

periféricos, que se reflejan en la cara interna del condensador, iluminando con

rayos laterales que se reflejan o refractan sobre el objeto, el que aparece

fuertemente iluminado sobre fondo obscuro. Para evitar que penetren en el

objetivo los rayos que emergen del condensador, utiliza un diafragma en el

objetivo o un objetivo de abertura numérica inferior a 1,1. Es útil para observar

límites y movimientos de pequeños objetos transparentes, tales como

quilomicrones, bacterias o espermios, y partículas ultramicroscópicas, pero sin

entregar detalles. Requiere una fuente luminosa puntiforme muy intensa, lo

cual no siempre es fácil si el material es un ser vivo.

Microscopio de fluorescencia: Su fuente luminosa es una lámpara de rayos

ultravioleta (UV), los que son invisibles al ojo humano pero se tornan visibles al

chocar con un objeto fluorescente. Posee dispositivos que permiten transmitir

radiación UV a muestras que la absorben y emiten radiación de longitud más

larga. Un filtro impide que los rayos blancos producidos juntos con los UV

enmascaren la fluorescencia, otro filtro bloquea la luz UV que podría dañar los

ojos del observador y deja pasar la fluorescencia. Sirve para observar

estructuras fluorescentes o teñidas con colorantes fluorescentes

(fluorocromos). Entrega imágenes de gran contraste y especificidad. Se utiliza

para moléculas orgánicas, microorganismos, reacciones antígeno-anticuerpo y

diagnóstico de cáncer. Inyectando a un animal una substancia fluorescente

permite estudiar procesos metabólicos, tales como formación de orina o

secreción biliar. Con inyección directa a nivel celular facilita el estudio de

uniones intercelulares y vías nerviosas. Con el método de epifluorescencia, el

objeto, previamente marcado con fluorocromo, se ilumina desde arriba por

reflexión, de manera que la luz excitadora no atraviesa el espesor del corte y la

fluorescencia ocurre en la superficie, dando una mayor nitidez.

Microscopio electrónico de transmisión: De disposición general similar al

óptico, utiliza electrones para formar la imagen. Como los electrones tienen

longitud de onda entre mil y cien mil veces inferior a la luz visible, posee mayor

poder de resolución que los microscopios ópticos. Debido a las aberraciones de

las lentes electromagnéticas y al contraste de las muestras su limite de

resolución en la práctica no es tan bueno como el teórico, llegando hasta 0,2

nm en redes cristalinas. tiene un filamento de tungsteno incandescente, una

bomba de vacío de alto rendimiento, bobinas electromagnéticas que rodean al

haz de electrones a diferentes niveles y un sistema traductor de imágenes con

pantalla fluorescente o placa fotográfica. El filamento de tungsteno calentado

emite un haz de electrones en el vacío, logrado mediante la bomba. Los

electrones se aceleran entre el filamento y un ánodo por diferencia de potencial

de alta tensión de 40.000 a 100.000 voltios y se desplazan en línea recta, pero

se desvían y concentran por efecto de los campos electromagnéticos formados

por las bobinas. Los modelos modernos disponen de dos lentes condensadores

y cuatro que forman la imagen, cuya distancia focal se modifica ajustando la

corriente que pasa por los enrollamientos, lo cual permite variar el aumento

desde pocos cientos de veces hasta cerca del millón de diámetros. La

preparación de los objetos requiere ultramicrótomos de alta velocidad y

técnicas especiales de fijación (generalmente con glutaraldehido) y de inclusión

(con resinas epóxicas). Las secciones, ultradelgadas (típicamente de 0,1 um de

grosor) se tiñen mediante inmersión en soluciones de un metal pesado (uranio

o plomo).

Microscopio electrónico de transmisión: utiliza un haz fijo de electrones y en

la formación de la imagen ocupa los electrones primarios, transmitidos por el

espécimen, por eso los cortes deben ser muy delgados, menores de un

micrómetro, y no puede utilizarse en el estudio de células vivas.

Microscopio electrónico de barrido: La lente condensadora produce un haz

fino de electrones, de sólo 0,0015 micrómetros, que barre sistemáticamente la

superficie de una preparación previamente recubierta por metal pesado. el haz

electrónico excita la emisión de un haz secundario de electrones de menor

energía desde la preparación, el que es recogido por un detector de centelleo,

que convierte los impactos de los electrones en destellos de luz. Cada destello

se amplifica electrónicamente en un tubo fotomultiplicador que barre

sincrónicamente con el haz, formándose con la señal resultante una imagen

sobre una pantalla de rayos catódicos. Tiene alto poder de penetración, su

resolución es de entre 1 y 20 nanómetros y su aumento entre 15 y 50.000

diámetros, según el material, voltaje y distancia de trabajo. Su gran profundidad

de foco da a la imagen un impresionante aspecto tridimensional. No se

necesitan cortes ultrafinos, utiliza fragmentos sólidos de tejido. Permite

observar muestras frágiles por deshidratación controlada.

Partes Del Microscopio

* Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se

coloca la preparación, que permite el paso de los rayos procedentes de la

fuente de iluminación situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el

portaobjetos sobre la platina y un sistema de cremallera guiado por dos tornillos

de desplazamiento permite mover la preparación de delante hacia atrás o de

izquierda a derecha y viceversa. En la parte posterior de uno de los laterales se

encuentra un nonius que permite fijar las coordenadas de cualquier campo

óptico; de esta forma se puede acudir a el cuando interesa.

* Revolver: Es un sistema que coge los objetivos, y que rueda para utilizar un

objetivo u otro.

* Tornillos Macro Y Micrométrico: Son tornillos de enfoque, mueven la platina

hacia arriba y hacia abajo. El macrométrico lo hace de forma rápida y el

micrométrico de forma lenta. Llevan incorporado un mando de bloqueo que fija

la platina a una determinada altura.

* Foco: Se trata de una lámpara halógena de intensidad graduable. Esta

situada en el pie del microscopio. Se enciende y se apaga con un interruptor y

en su superficie externa puede tener una especie de anillo para colocar filtros

que facilitan la visualización.

* Condensador Y Diafragma: El condensador es un sistema de lentes

situadas bajo la platina su función es la de concentrar la luz generada por la

fuente de iluminación hacia la preparación. En el interior del condensador

existe un diafragma (iris) cuya función es limitar el haz de rayos que atraviesa

el sistema de lentes eliminando los rayos demasiado desviados (regula la

cantidad de luz y ajusta la Apertura Numérica).

* Oculares: Están colocados en la parte superior del tubo. Se denominan así,

porque están muy cercanos al ojo. Su función es la de captar y ampliar la

imagen formada en los objetivos. En los modernos microscopios hay dos

oculares (microscopios binoculares) que están unidos mediante un mecanismo

que permite ajustar la distancia interpupilar. En general los mas utilizados son

los de 10X (producen un aumento de 10 veces).

* Objetivos: Están colocados en la parte inferior del tubo insertados en una

pieza metálica, denominada revolver, que permite cambiarlos fácilmente.

Generan una imagen real, invertida y aumentada. Los mas frecuentes son los

de 4, 10, 40, y 100 aumentos. Este último se llama de inmersión ya que para su

utilización se necesita utilizar aceite de cedro sobre la preparación. En la

superficie de cada objetivo se indican sus características principales, aumento,

apertura numérica, y llevan dibujado un anillo coloreado que indica el número

de aumentos (rojo 4X, amarillo 10X, azul 40X y blanco 100X).

Manejo y Uso Del Microscopio

1- Colocar el objetivo de menor aumento

2- Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.

3- Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o

colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias. Para realizar

el enfoque:

4- Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada. El

objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación

6- Empleo del objetivo de inmersión:

- Bajar totalmente la platina.

a. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que

nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.

b. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino

entre éste y el de x40.

c. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.

d. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de

inmersión.

e. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la

lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota

ascendiera y se adosara a la lente.

f. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre

el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de

40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.

Clasificación bacteriana

Fenotípica: Las bacterias pueden clasificarse según su capacidad de retención

de la tinción de gram positivos y negativos. Por su forma peculiar ( cocos,

bacilos, espirilos). Por su aspecto macroscópico ( propiedades hemolíticas en

un medio de agar sangre, la pigmentación, el tamaño y la forma de colonias.

Genotípica: El método más preciso de la clasificación de las bacterias es el

análisis del material genético. Mediante el empleo de sondas moleculares, se

extrae el ADN del microorganismo a identificarse.

Analítica: Se las clasifica en género especie y subespecie. El patrón cromatográfico de los ácidos micólicos de la pared celular. Análisis de los lípidos presentes de la célula. Análisis de las proteínas de la célula y de las enzimas.