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REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA

FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS

MAESTRÍA EN MICROBIOLOGÍA

Relación entre la Producción de Betalactamasas de Espectro Expandido (BLEE) y la Resistencia a Fluoroquinolonas en Cepas de Enterobacterias

Provenientes de Centros Hospitalarios de Venezuela

Trabajo de Grado presentado ante la División de Estudios para Graduados para optar al Grado de Magíster Scientiarum en Microbiología

Autor: Lic. Daniel Marcano Zamora C.I. 14.775.231

Tutor: Dr. Carlos D. Ramírez C.I. 82.233.808

Co-tutor: Msc. Jorge Guiñez-Ortega C.I. 81.255.143

Maracaibo, Marzo 2011

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AGRADECIMIENTOS

A Dios, ya que sin El no estaría aquí A mi novia Andreína, por no sólo motivarme a culminar este trabajo y darme apoyo emocional, sino también por ayudarme en la revisión y corrección del manuscrito. A las profesoras Lorena Atencio, Irene Zabala y Marynés Montiel, por todo su estímulo y paciencia para ayudarnos a culminar con éxito esta estapa académica de nuestras vidas. A todo el personal del Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”, en particular al adscrito a la Gerencia de Docencia e Investigación y a la Gerencia Sectorial de Diagnóstico y Epidemiología por su indiscutible apoyo en distintas etapas de esta maestría. A la Licenciada Omaira Da Mata por su ayuda en la optimización de ciertas técnicas moleculares A los Técnicos Eidha Moreno y Samari Torres y los Bachilleres Jeisybeth Luque, Patricia Bohorquez, José Angel Rodríguez y Richard Aparicio por su ayuda en distintos puntos clave de la fase experimental. A todos mis compañeros del Laboratorio de Aislamiento e Identificación Bacteriana por su apoyo y estímulo durante la fase experimental. A la Doctora Clara Martínez y todo su equipo del Laboratorio de Biología Molecular de Protozoarios del Instituto de Medicina Tropical de la UCV por su invaluable apoyo para la secuenciación de los productos de amplificación de este trabajo. Al personal del Servicio de Antimicrobianos del INEI ANLIS “Dr. Carlos Malbrán” de Argentina por su asesoría contínua durante la estandarización de las técnicas moleculares. A mis tutores, que siempre estuvieron allí para orientarme en todas las fases del trabajo.

A todo aquel que no haya mencionado en este espacio tan corto y que me haya ayudado,

Muchas gracias

Daniel Marcano Zamora

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TABLA DE CONTENIDOS

INDICE DE TABLAS ........................................................................................................ 6

INDICE DE FIGURAS ...................................................................................................... 7

RESUMEN ....................................................................................................................... 8

ABSTRACT ...................................................................................................................... 9

INTRODUCCION ........................................................................................................... 10

JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................ 14

OBJETIVO GENERAL ................................................................................................... 15

OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................................... 15

MARCO TEÓRICO ......................................................................................................... 16

Terapia antimicrobiana y resistencia bacteriana ......................................................... 16

Antibióticos B- lactámicos. ........................................................................................... 16

Mecanismo de acción de las Quinolonas: ................................................................... 18

Resistencia enzimática a los antibióticos betalactámicos ........................................... 20

Resistencia a las Quinolonas ...................................................................................... 25

Relevancia de la transmisión de la resistencia bacteriana .......................................... 30

Caracterización de mecanismos de resistencia en el laboratorio de microbiología ..... 35

MARCO METODOLÓGICO ........................................................................................... 38

Tipo de estudio ............................................................................................................ 38

Muestra ....................................................................................................................... 38

Metodología de laboratorio .......................................................................................... 39

RESULTADOS ............................................................................................................... 48

Estudio fenotípico y de susceptibilidad. ....................................................................... 48

Detección fenotípica de la producción de enzimas mediante el método de Hodge. .... 54

Determinación de Punto Isoeléctrico mediante ensayos de Isoelectroenfoque........... 55

Ensayos de Conjugación ............................................................................................. 57

Estudio molecular ........................................................................................................ 58

Estudio de integrones .................................................................................................. 60

Secuenciación ............................................................................................................. 63

DISCUSIÓN ................................................................................................................... 66

CONCLUSIONES ........................................................................................................... 74

RECOMENDACIONES .................................................................................................. 77

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 78

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INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Clasificación de las Quinolonas ........................................................................ 18

Tabla 2. Esquema de Clasificación de Betalactamasas Bacterianas ............................. 21

Tabla 3. Iniciadores empleados en el estudio ................................................................ 42

Tabla 4. Perfil de Resistencia a Betalactámicos de cepas de Enterobacterias BLEE positivas seleccionadas para el estudio. ........................................................................ 52

Tabla 5. Perfil de Resistencia a Quinolonas de cepas de Enterobacterias BLEE positivas seleccionadas para el estudio. ........................................................................ 52

Tabla 6. Resultados obtenidos al aplicar el método de Hodge comparado con el método de difusión del disco para detección de BLEE ............................................................... 55

Tabla 7. Valores de pI obtenidos para las cepas en estudio. ......................................... 56

Tabla 8. Ensayos de Conjugación en aislados de Enterobacterias BLEE positivas que presentaron integrones de clase 1 ................................................................................. 57

Tabla 9. Resultados de amplificación de genes de betalactamasas. ............................. 59

Tabla 10. Resultados de amplificación de genes codificantes para resistencia plasmídica a quinolonas. ................................................................................................ 60

Tabla 11. Resultados de amplificación por PCR de genes de integrasa de clase 1....... 61

Tabla 12. Resultados de amplificación de la región variable de integrones clase 1 ....... 62

Tabla 13. Tamaño de amplicones obtenidos durante el mapeo de integrones clase 1 con distintas combinaciones de iniciadores. .................................................................. 62

Tabla 14. Detección de mutaciones en gyrA .................................................................. 64

Tabla 15. Variantes de TEM y SHV encontradas en el estudio. ..................................... 64

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INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Anillo Betalactámico ................................................................................... 17

Figura 2. Núcleo central de las Quinolonas ............................................................... 19

Figura 3. Mecanismo de acción de las quinolonas .................................................... 20

Figura 4. Esquema del proceso de Conjugación bacteriana ..................................... 33

Figura 5. Distribución de aislados de Enterobacterias en estudio ............................. 48

Figura 6. Porcentajes de resistencia y sensibilidad de las cepas en estudio productoras de Betalactamasas de espectro expandido ............................................................... 49

Figura 7. Correlación entre los resultados de susceptibilidad para Cefotaxima y Ciprofloxacina de las cepas en estudio ..................................................................... 50

Figura 8. Correlación entre los resultados de susceptibilidad para Cefotaxima y Acido Nalidíxico de las cepas en estudio ............................................................................ 50

Figura 9. Distribución de halos obtenidos para betalactámicos y quinolonas en cepas BLEE positivas y evaluación de la Concentración Mínima Inhibitoria a Ciprofloxacina por la técnica de E-test. ................................................................................................... 53

Figura 10. Algunos perfiles fenotípicos de BLEE clásicas encontrados. ................... 53

Figura 11. Resultados de prueba de Concentración Inhibitoria Mínima a Ciprofloxacina por E-test. .................................................................................................................. 54

Figura 12. Prueba de Hodge de las cepas en estudio. .............................................. 55

Figura 13. Gel de isoelectroenfoque. ........................................................................ 56

Figura 14. Ensayo de conjugación. ........................................................................... 58

Figura 15. Amplificación de genes TEM, CTX-M, SHV y gyrA de las cepas en estudio. .................................................................................................................................. 58

Figura 16. Amplificación de Integrasa clase 1 de las cepas en estudio. ................... 61

Figura 17. Estructura teórica propuesta de la región variable de integrones encontrados en las cepas en estudio. ............................................................................................ 63

Figura 18. Electroferograma de TEM-150 ................................................................. 65

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Marcano Z, Daniel. Relación entre la producción de Betalactamasas de Espectro Expandido y la resistencia a Fluoroquinolonas en cepas de Enterobacterias provenientes de centros hospitalarios de Venezuela. Proyecto de Trabajo de Grado. La Universidad del Zulia, Facultad Experimental de Ciencias, División de Estudios para Graduados, Maestría en Microbiología, Maracaibo, Venezuela 2011. 86 p

RESUMEN

Existen reportes de cepas en las cuales parece haber asociación entre mecanismos de resistencia a antibióticos, por lo que el objetivo de este estudio fue determinar la relación entre la producción de Betalactamasas de Espectro Expandido (BLEE) y la resistencia a fluoroquinolonas en Enterobacterias provenientes de centros hospitalarios de Venezuela. La identificación de las cepas se realizó mediante pruebas bioquímicas convencionales, y la resistencia se determinó mediante antibiograma y concentración mínima inhibitoria. La caracterización de resistencia se realizó mediante Hodge, isoelectroenfoque, conjugación y PCR. Escherichia coli fue la cepa BLEE aislada con mayor frecuencia. Se encontró alto nivel de resistencia a betalactámicos y quinolonas. Se observó que las cepas BLEE presentaron un resultado Hodge positivo con Cefotaxima o Ceftazidima, y negativo empleando Ciprofloxacina. Se demostró por conjugación la presencia de genes BLEE en elementos genéticos transferibles en 4 de 8 cepas ensayadas. Se detectó mediante PCR la presencia de los genes SHV, TEM, PER, CTX-M grupo 2, QnrB y AAC(6’)Ib-cr. Se demostró la presencia de integrones clase 1, y que los genes BLEE y de resistencia plasmídica a quinolonas se encontraban en estos elementos transferibles. Se propone la coexistencia de genes BLEE y de resistencia plasmídica a quinolonas en el mismo integrón, lo cual explicaría la asociación entre estos mecanismos. La secuenciación del gen gyrA permitió encontrar dos mutaciones codificantes para el aminoácido 83, lo cual es consistente con la CIM para Ciprofloxacina de dichas cepas. Se encontró relación estadísticamente significativa (p<0,05) entre la producción de BLEE y la resistencia a quinolonas; producción de BLEE y presencia de mecanismos cromosomales de resistencia a quinolonas; y producción de BLEE y presencia de mecanismos plasmídicos de resistencia a quinolonas. La asociación encontrada entre los mecanismos de resistencia a betalactámicos y quinolonas refleja la necesidad de explorar alternativas terapéuticas para el tratamiento de este tipo de cepas.

Palabras Clave: Betalactamasas de Espectro Expandido, Fluoroquinolonas, Enterobacterias

Correo electrónico: danielmarcano2000@yahoo.com

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Marcano Z, Daniel. Relación entre la producción de Betalactamasas de Espectro Expandido y la resistencia a Fluoroquinolonas en cepas de Enterobacterias provenientes de centros hospitalarios de Venezuela. Proyecto de Trabajo de Grado. La Universidad del Zulia, Facultad Experimental de Ciencias, División de Estudios para Graduados, Maestría en Microbiología, Maracaibo, Venezuela 2011. 86 p

ABSTRACT

There are reports of strains which apparent association between mechanisms of resistance to antibiotics, sothe objective of this study is to determine the relationship between the production of Extended Spectrum Betalactamases (ESBL) and resistance to fluoroquinolones in enterobacteria from hospitals of Venezuela. Identification was performed using conventional biochemical tests and resistance was determined by minimum inhibitory concentration and antibiogram. Resistance characterization was performed using Hodge, isoelectric focusing, conjugation and PCR. Escherichia coli were the ESBL strain isolated more frequently. We found high levels of beta-lactam and quinolone resistance. ESBL strains presented a positive Hodge result with Cefotaxime or Ceftazidime, and a negative result using Ciprofloxacin. Conjugation demonstrated the presence of ESBL genes in transferable genetic elements in 4 of 8 strains tested. SHV, TEM, PER, Group 2 CTX-M, QnrB and AAC(6') Ib-cr genes were detected by PCR. The presence of class 1 integrons was detected, and the presence of ESBL and quinolone plasmidic resistance genes in these transferable elements. The coexistence of ESBL and quinolone plasmidic resistance genes in a single integron is proposed, which would explain the association between these mechanisms. The sequencing of gyrA enabled the finding of two mutations coding for the amino acid in position 83, which is consistent with the Ciprofloxacin MIC for these strains. We found a statistically significant relationship (p <0.05) between ESLB production and quinolone resistance, ESLB production and chromosomal quinolone resistance mechanisms, and ESLB production and plasmidic quinolone resistance mechanisms. The association found between Beta-lactam and quinolone resistance mechanisms reflects the need to explore alternative therapies for the treatment of this type of strains. Keywords: Extended Spectrum Betalactamases, Fluoroquinolones, Enterobacteria

E-mail: danielmarcano2000@yahoo.com

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INTRODUCCION

Un antimicrobiano es “cualquier agente químico que evita o destruye

microorganismos o inhibe su proliferación”. Un antibiótico puede definirse como “un

fármaco empleado para el tratamiento de las enfermedades infecciosas producidas por

bacterias” (Jehl y col., 2004). Los agentes quimioterapeuticos son compuestos

elaborados en forma total o parcial por síntesis química, ambos compuestos tienen la

capacidad de inhibir o destruir el desarrollo de otros microorganismos a bajas

concentraciones (Joklik y col., 1998).

La clasificación más empleada de los antibióticos está basada en su diferenciación

según el lugar de actuación en la bacteria o los procesos fisiológicos con los que

interactúa; a su vez, dentro de cada uno de estos grupos la clasificación por familias se

basa en la estructura química de las diferentes moléculas y a cada familia le

corresponde un mecanismo molecular específico, encontrando así los siguientes grupos

(Jehl y col., 2004):

- Antibióticos activos sobre la pared bacteriana: betalactámicos, glicopéptidos y

fosfonopéptidos.

- Antibióticos activos sobre la membrana citoplasmática: gramicidinas y

polimixinas.

- Antibióticos activos sobre la síntesis proteica: aminoglicósidos, tetraciclinas,

macrólidos, lincosamidas, estreptograminas, rifampicina, cloramfenicol, ácido

fusídico.

- Antibióticos activos sobre la replicación del ADN: fluoroquinolonas.

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- Antibióticos inhibidores de vías metabólicas: sulfonamidas,

trimetroprim.Inhibidores de betalactamasas: ácido clavulánico, sulbactam,

tazobactam.

Entre los antibióticos inhibidores de la pared celular bacteriana están los

antibióticos β – lactámicos, los cuales incluyen las penicilinas, cefalosporinas,

carbapenemas, monobactamas y los inhibidores de betalactamasas, y actúan como

agentes bactericidas. La resistencia bacteriana a los antibióticos β – lactámicos se

puede atribuir a cuatro mecanismos diferentes:

a) Inactivación de la droga

b) Alteración del sitio blanco

c) Bloqueo del transporte de la droga al interior de la célula

d) Eflujo activo

De estos, el mecanismo más importante de resistencia a los antibióticos

betalactámicos es la inactivación producida por las β – lactamasas, las cuales abren el

anillo β – lactámico del antibiótico. Las β – lactamasas procedentes de los

microorganismos Gram negativos difieren en muchos aspectos de las enzimas de las

especies Gram positivas. En general son constitutivas y están unidas a la célula, y

pueden estar codificadas en plásmidos o en el cromosoma. Se producen en cantidades

menores que en las Gram positivas y tienen una afinidad mucho más baja por sus

sustratos. Las betalactamasas, dependiendo de su espectro de acción, pueden tener

como sustrato penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, monobactamas e incluso

carbapenemas, pero no son activos contra otras familias de antibióticos (Joklik y col.,

1998).

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Las β – lactamasas de espectro expandido (BLEE) son enzimas que expanden su

espectro de acción a los β – lactámicos anti β – lactamasas como las oximino –

cefalosporinas, cefamicinas, carbapenemas y monobactámicos, confiriendo resistencia

a una amplia variedad de β–lactámicos (Iyobe, 1997). Estas enzimas fueron descritas

por primera vez en Alemania en 1983 (Knothe y col., 1983), y desde entonces su

número ha aumentado rápidamente y ahora su distribución es mundial (Lucet y

Regnier, 1998); a pesar del amplio uso internacional de los antibióticos betalactámicos,

la distribución de las BLEE no es uniforme en todos los países: algunos hospitales en

los Estados Unidos no presentan BLEE, mientras que otros presentan hasta 40% de

cepas de Klebsiella pneumoniae productoras de estas enzimas. Las BLEE se

encuentran con más frecuencia en especies de Klebsiella pneumoniae y Escherichia

coli, pero se pueden encontrar en otras enterobacterias y bacilos no fermentadores; la

presencia de estas enzimas pareciera ser mayor en Latinoamérica que en Estados

Unidos y Europa, y sus distintos genotipos (SHV, TEM, CTX-M, PER) varían de región a

región (Jacoby y Muñoz-Price, 2005).

En lo que respecta a la epidemiología de estas enzimas hay que tomar en cuenta

que los genes que codifican las BLEE se encuentran en elementos genéticos móviles

(plásmidos, transposones), por lo cual dicha resistencia puede ser transferida a otras

bacterias mediante conjugación o transposición y aumentar el número de cepas

resistentes. En un estudio realizado en 1998 con 502 cepas bacterianas aisladas de

siete hospitales venezolanos se determinó que el 30% de las cepas de K. pneumoniae

aisladas producían BLEE (Pfaller y col., 1998) y al determinar los mecanismos

moleculares y genéticos involucrados en la resistencia antimicrobiana de bacilos Gram-

negativos de origen nosocomial (entre ellos 4 cepas de K. pneumoniae) se observó la

presencia de plásmidos transferibles que codificaban betalactamasas pertenecientes al

grupo TEM. Cabe destacar que la mayoría de estas bacterias multirresistentes se aíslan

en el ambiente intrahospitalario, ya que es en dicho ambiente donde se generan

mecanismos de transmisión tanto vertical como horizontal de genes plasmídicos y

transposones que codifican para determinantes de resistencia antimicrobiana, esto trae

como consecuencia el establecimiento y diseminación de dichos determinantes de

resistencia.

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Lo anteriormente expuesto demuestra la relevancia epidemiológica de la posible

diseminación intranosocomial de las mencionadas cepas multirresistentes. Según los

datos del Programa Venezolano de Vigilancia de la Resistencia Bacteriana a los

Antimicrobianos (en el cual participan 29 laboratorios de microbiología de distintas

áreas del país, incluida el área metropolitana) en 1998 el 61% de las cepas de E. coli

presentaron resistencia a ampicilina, el 50% a trimetoprim-sulfametoxazol, el 6% a

amikacina y el 10% a gentamicina, y se observa con preocupación el ascenso de la

resistencia a fluoroquinolonas y cefalosporinas de tercera generación; esto último

sugiere que estamos en presencia de cepas productoras de Betalactamasas de

Espectro Expandido.

En el caso de Klebsiella pneumoniae un porcentaje mayor del 90% es resistente

a ampicilina, situación que se reduce a una tercera parte (30%) con la combinación de

ampicilina/sulbactam, lo que hace pensar que la producción de betalactamasas es uno

de los mecanismos de resistencia implicados, pero no el único. Por otra parte, en el año

1999 se aprecia un aumento en la resistencia a cefalosporinas de tercera generación:

29% a ceftazidima y 39% a ceftriaxona, lo que indica la presencia de Betalactamasas

de Espectro Expandido (Comegna y col., 2000).

Es frecuente encontrar en las cepas productoras de Betalactamasas de Espectro

Expandido resistencia asociada a quinolonas como Ciprofloxacina y Norfloxacina

(Marcano, 2002; Martínez y col., 2002), aun cuando estas enzimas no confieren

resistencia a dichas familias de antibióticos; esto podría ser debido a algún tipo de

afinidad de los plásmidos codificantes para Betalactamasas de Espectro Expandido a

cepas con susceptibilidad disminuida a fluoroquinolonas o por diseminación conjunta de

ambos mecanismos.

El presente estudio tiene como objetivo conocer la relación entre la producción

de betalactamasas de espectro expandido y la resistencia a quinolonas en cepas de

enterobacterias aisladas de muestras clínicas provenientes de distintos centros

hospitalarios del área metropolitana de Caracas.

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JUSTIFICACIÓN

El gran número de especies dentro de la familia de las enterobacterias conlleva a

una gran variabilidad de patrones de sensibilidad natural. Esta diversidad se ve además

incrementada por la posibilidad de adquirir genes de resistencia, tanto de

microorganismos de la misma especie como de otras. . La resistencia antimicrobiana

aparece como parte del progreso de la infección en muchas personas y es letal en

algunos casos, pero no es un trastorno humano, es propio de las poblaciones

bacterianas, las cuales tienden a crear mecanismos de resistencia como una

información genética, luego de que el paciente es sometido por largo tiempo a un

tratamiento antibacteriano. La adquisición de multirresistencia puede llevar a la

ineficacia de la mayoría de los antimicrobianos utilizados en la práctica clínica (Navarro

y col., 2002), y existen cepas en las cuales pareciera existir asociación en la presencia

de diversos mecanismos de resistencia a antibióticos de distintas familias, por ejemplo

en el caso de Klebsiella pneumoniae se ha descrito que aquellas cepas que producen

betalactamasas de espectro expandido (cuyo sustrato son los betalactámicos)

presentan resistencia a fluoroquinolonas con más frecuencia que aquellas cepas de

Klebsiella pneumoniae que no expresan dichas enzimas (Martínez y col., 2002).

La importancia de este estudio radica en la gran diversidad genética que se

presenta en la familia de betalactamasas de espectro expandido y de la posible

asociación de enzimas particulares a otros mecanismos de resistencia a diversas

familias de antibióticos, por lo tanto se considera necesaria la detección y

caracterización de las Betalactamasas encontradas en cepas hospitalarias del área de

Caracas y sus mecanismos de resistencia acompañante. Estos datos aportarán

información epidemiológica valiosa para los profesionales de las ciencias de la salud

acerca de los mecanismos de resistencia y diseminación de estas bacterias en el país y

colaborará en las políticas de tratamiento antimicrobiano, además de alertar sobre la

posibilidad de diseminación horizontal de esta resistencia acompañante en conjunto con

las Betalactamasas de Espectro Expandido.

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OBJETIVO GENERAL

Determinar la relación existente entre la producción de betalactamasas de

espectro expandido (BLEE) y la resistencia a fluoroquinolonas, en cepas de

enterobacterias aisladas desde enero hasta junio del año 2006, de muestras clínicas

provenientes de distintos centros hospitalarios del área metropolitana de Venezuela.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar fenotípicamente los perfiles de resistencia in vitro de las cepas en

estudio.

Establecer las propiedades físico-químicas de las Betalactamasas de Espectro

Expandido aisladas.

Identificar las características genéticas de estas Betalactamasas de Espectro

Expandido.

Identificar los mecanismos de resistencia a Fluoroquinolonas en las cepas en

estudio.

Establecer si existe una relación entre la expresión de genes codificantes de

Betalactamasas de Espectro Expandido y la expresión de genes codificantes de

resistencia a Fluoroquinolonas.

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MARCO TEÓRICO

Terapia antimicrobiana y resistencia bacteriana Uno de los principales logros de la ciencia médica ha sido la casi total erradicación

de muchas enfermedades infecciosas gracias al uso de agentes antimicrobianos

específicos. Entre los descubrimientos de importancia que dan inicio a la “edad de oro”

de la terapéutica antimicrobiana, se encuentra el descubrimiento y el posterior

desarrollo de la penicilina a partir de filtrados de cultivos del hongo Penicillium notatum.

Si bien la penicilina había sido descubierta por Fleming en 1929, fueron Florey, Chain y

sus colaboradores en la Universidad de Oxford quienes en 1940 demostraron y

publicaron un informe sobre su enorme potencia y la posibilidad de su extracción de los

sobrenadantes del cultivo (Joklik y col., 1992).

Antibióticos B- lactámicos.

Los antibióticos betalactámicos son los antibióticos más variados y de uso más

extendido a nivel mundial. Desde 1940, se han descrito numerosos compuestos

naturales y sintéticos basados en el principio activo de la penicilina: el anillo

betalactámico. Los betalactámicos constituyen uno de los antibióticos que son más

usados de forma sistémica. El éxito se debe a la baja toxicidad y la biodisponibilidad de

una gran variedad de ellos. Apartando las micobacterias, los patógenos intracelulares y

las especies deficientes de pared, existen pocos organismos que puedan resistir a la

acción de todos los betalactámicos disponibles actualmente (Lorian, 1996). Los

antibióticos betalactámicos inhiben o detienen el crecimiento bacteriano por unión

covalente a las Proteínas Fijadoras de Penicilina (PBP, Protein Binding Penicillin)

presentes en la membrana citoplasmática. Estas proteínas blanco catalizan la síntesis

de peptidoglicano que forma la pared celular de las bacterias, y alteraciones en ellas

pueden llevar a la resistencia a los antibióticos betalactámicos (Mandell, 2002). Los B-

lactámicos son uno de los grupos de antibióticos más usados en la práctica médica,

poseen una gran eficacia terapéutica y no son tóxicos para el hombre; estas dos

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características hacen que estos antibióticos sean uno de los mejores grupos

terapéuticos bacterianos.

Los β-lactámicos son agentes bactericidas de efecto lento. La eficacia está

relacionada más con el tiempo de actuación que con las concentraciones del antibiótico

en el medio. Su mecanismo de acción consiste en el bloqueo de la actividad

transpeptidasa, carboxipeptidasa, endopeptidasa o transglucosilasa de las proteínas

fijadoras de penicilina (PBP) con la consiguiente inhibición o disminución de la síntesis

de la capa de peptidoglucano.

Figura 1. Anillo Betalactámico. Tomado de Goodman y Gilman’s. The pharmacological basis of

therapeutics. McGraw-hill

Los antibióticos que poseen en su estructura química el anillo β-lactámico (Figura

1) se comportan como agentes acilantes, que reaccionan para producir derivados

peniciloicos. Se ha propuesto que la penicilina actuaría como análogo del sustrato PBP,

acilando el sitio activo de la enzima con formación de un complejo inactivo bastante

estable. La similitud estereoquímica de estos antibióticos con la secuencia terminal del

pentapéptido de la mureína les permite interaccionar con las PBP situadas en la

superficie de la membrana plasmática bacteriana, moléculas encargadas de modelar la

configuración definitiva de la capa de peptidoglicano, además de guiar su

reorganización durante la división de las bacterias. La inhibición de las reacciones de

biosíntesis por antibióticos β- lactámicos está acompañada por cambios morfológicos

característicos. Las diferencias morfológicas observadas, se deben a la PBP que resulta

afectada. Cuando las bacterias se desarrollan en presencia de penicilina se acumulan

intermediarios de la síntesis de la pared celular, nucleótidos de uridina sin uniones

cruzadas, y las nuevas paredes no se pueden formar, muriendo así la bacteria por

efecto osmótico o digerida por enzimas auto líticas, que se activan como consecuencia

18

del bloqueo de la función de una varias PBP. Sin embargo el mecanismo exacto por el

cual los agentes sensibles son lisados aun no está muy dilucidado.

Mecanismo de acción de las Quinolonas: Las quinolonas actúan inhibiendo rápidamente la síntesis del ADN por inhibición

del ADN girasa y la topoisomerasa IV, siendo éstas el blanco de las quinolonas, lo cual

resulta en muerte bacteriana. Como regla general, la actividad en las bacterias Gram

negativas se correlacionan con la inhibición de la ADN girasa, y su actividad en Gram

positivos se corresponde con la inhibición de la topoisomerasa de ADN tipo IV. Las

Quinolonas penetran a la célula mediante un sistema de difusión pasiva, principalmente

atravesando la membrana, y a través de las porinas. Parece ser que las Quinolonas

mas hidrofóbicas penetrarían a través de la bicapa lipídica, mientras que las Quinolonas

más hidrofílicas utilizarían las porinas como puerta de entrada (Sierra, 2005). Al igual

que las Cefalosporinas, las Quinolonas pueden clasificarse en generaciones (Alós,

2009) según su momento de aparición en la historia (Tabla 1)

Tabla 1. Clasificación de las Quinolonas

GENERACIÓN COMPUESTO ESPECTRO

1ra Generación Ac. Nalidíxico

Ac. Pipemídico

Enterobacterias

2da Generación Norfloxacina

Enterobacterias,

P. aeruginosa

Moderado para

Grampositivos

Determinados patógenos

atípicos

3ra Generación Ciprofloxacina

Levofloxacina

Ofloxacina

Mejor actividad frente a

Grampositivos y patógenos

atípicos

4ta Generación Moxifloxacina Buena actividad frente a

Grampositivos y

Anaerobios

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Las Topoisomerasas son enzimas que participan en el proceso de síntesis del

ADN, por desenrollamientos y enrollamientos del ADN cromosómico. En

Gramnegativos, la Topoisomerasa que inhiben principalmente es la ADN girasa, que

tiene 2 subunidades A y 2 subunidades B (Alós, 2009) La ADN girasa es la única

enzima capaz de introducir un superenrollamiento negativo en la cadena de ADN,

facilitando la separación de la doble hélice de ADN para mantener la estructura de la

horquilla de replicación, mientras que la Topoisomerasa IV (diana principal en

Grampositivos) es responsable del desencadenamiento de las dos moléculas “hijas” al

finalizarse la replicación del ADN, permitiendo la segregación de dos nuevos

cromosomas bacterianos en dos nuevas células “hijas” (Drlica, 1999). Los genes que

codifican para estas enzimas son GyrA y GyrB (para la subunidad A y B

respectivamente) de la ADN girasa y los genes ParC y ParE (para la subunidad A y B

respectivamente) de la Topoisomerasa IV (Sierra, 2005)

El mecanismo de acción más aceptado en la actualidad es el propuesto por

Palumbo (Palumbo y col., 1993). En el mismo se establece la formación de un complejo

entre la Topoisomerasa – ADN – Quinolona, que se encarga de bloquear la acción de la

enzima, provocando de esta forma la muerte celular.

Figura 2. Núcleo central de las Quinolonas. Tomado de Goodman y Gilman’s. The pharmacological basis of therapeutics. McGraw-hill

En este modelo los radicales en posición 3 y 4 de la molécula de Quinolona

(Figura 2) producirían enlaces con un átomo de Mg2+ y éste a su vez se uniría al ADN

mediante enlaces con los grupos fosfato de los nucleótidos. Además, se produciría un

apilamiento entre una de las bases de la región monocatenaria de la cadena de ADN y

el anillo de la molécula de la Quinolona. También se postula que los radicales situados

20

en posición 1 y 7 son los responsables de la interacción con la ADN girasa o la

Topoisomerasa IV (Palumbo y col., 1993).

Resistencia enzimática a los antibióticos betalactámicos

Las betalactamasas son enzimas que destruyen las penicilinas y cefalosporinas

mediante hidrólisis y son el principal mecanismo de resistencia a estos antimicrobianos.

La mayoría de las betalactamasas actúan por un mecanismo serina-éster, pero algunas

pocas son dependientes de zinc. La diferencia fundamental entre la vía catalítica de una

serinobetalactamasa y una Proteína Fijadora de Penicilina (Protein Binding Peniciline, el

sitio de acción de los betalactámicos) es que el éster formado por la betalactamasa se

hidroliza rápidamente, regenerándose así la enzima, mientras que los que se forman

con la PBP son estables.

Figura 3. Mecanismo de acción de las quinolonas. Tomado de Goodman y Gilman’s. The pharmacological basis of therapeutics. McGraw-hill

Se han hecho muchos intentos para clasificar las betalactamasas, basándose la

mayoría en propiedades fenotípicas como su afinidad por sustratos (cefaloridina vs

bencilpenicilina), perfil de inhibición (inhibición con oxacilina, clavulanato, aztreonam o

Ácido Etilen Diamino Tetraacético, EDTA) y si la enzima está codificada en el

cromosoma o a nivel de un plásmido; sin embargo, la tendencia actual es clasificar las

betalactamasas por secuencia y no por sus propiedades fenotípicas, tal como fue

propuesto por Ambler (Ambler, 1980). Las clasificaciones basadas en secuencia

21

reflejan relaciones fundamentales y, a diferencia de las clasificaciones fenotípicas, no

pueden ser distorsionadas por mutaciones que alteren la especificidad de sustrato o el

perfil de inhibición. Actualmente sólo existen cuatro clases moleculares de

betalactamasas: las clases A, C y D (las cuales son serinoenzimas) y la clase B

(compuesta por enzimas dependientes de zinc) (Lorian, 1996).

Tabla 2. Esquema de Clasificación de Betalactamasas Bacterianas. Tomado de Bush y Jacoby, 2010

Entre los miembros de la familia Enterobacteriaceae, la producción de

Betalactamasas de Espectro Expandido ha emergido como un importante mecanismo

de resistencia a betalactámicos, los cuales constituyen aproximadamente el 50% del

consumo de antibióticos. Estas enzimas son enzimas plasmídicas de clase molecular A

que corresponden al subgrupo 2be de Bush y que son capaces de hidrolizar un amplio

rango de betalactámicos, incluidas las cefalosporinas de más reciente aparición, pero

no son activas frente a las cefamicinas y carbapenemas.

22

Al interpretar el fenotipo de las cepas productoras de BLEE en lo que se refiere a

los Betalactámicos, debe tenerse en cuenta que la resistencia a los antibióticos también

puede deberse a la actividad combinada de una BLEE específica con otras

betalactamasas (por ejemplo AmpC cromosomal). Entre las enterobacterias, las BLEE

se han encontrado principalmente en Klebsiella spp. y E. coli, pero también se han

encontrado en otros géneros como Citrobacter, Enterobacter, Morganella, Proteus,

Providencia, Salmonella, y Serratia. Las infecciones causadas por cepas BLEE

frecuentemente involucran a pacientes inmunocomprometidos, haciendo difícil su

erradicación en servicios de alto riesgo como las unidades de terapia intensiva (Spanu y

col., 2002). Las infecciones causadas por bacterias multirresistentes que expresan

BLEE presentan un reto para los médicos, debido a que son resistentes a la mayoría de

los betalactámicos, las infecciones causadas por estos microorganismos complican la

terapia antimicrobiana al limitar las opciones terapéuticas disponibles. Adicionalmente,

los pacientes infectados con bacterias productoras de BLEE pueden presentar una tasa

de mortalidad más alta y requerir tiempos de hospitalización más prolongados (Ramphal

y col., 2006). Los organismos que producen BLEE son, con frecuencia, resistentes a

otros agentes antimicrobianos como los aminoglicósidos, tetraciclina y trimetoprim-

sulfametoxasol, ya que muchos de estos genes de resistencia están codificados en el

mismo plásmido. La resistencia a fluoroquinolonas, la cual también está asociada

frecuentemente a la producción de BLEE es normalmente codificada a nivel

cromosomal, a diferencia de las otras resistencias asociadas; sin embargo

recientemente se ha descrito resistencia a quinolonas codificada en plásmidos. La

prevalencia de resistencia a fluoroquinolonas entre cepas productoras de BLEE varía

de acuerdo a las regiones geográficas, desde 13,7% en Canadá y 34,2% en Europa a

65,5% en la región del oeste del Pacífico (Branger y col., 2005).

Es posible clasificar las BLEE en tres grupos:

1. Las derivadas de enzimas TEM o SHV: Las enzimas TEM-1, TEM-2 y SHV-1

son enzimas plasmídicas que se encuentran frecuentemente en la

enterobacterias y que confieren resistencia a penicilinas y cefalosporinas de

espectro reducido pero no a las de espectro ampliado; sin embargo, las enzimas

23

derivadas de ellas proveen una resistencia variable a Cefotaxima, Ceftazidima y

Aztreonam. Ellas difieren de las enzimas TEM y SHV originales en cambios de

uno a cuatro aminoácidos por mutaciones puntuales que modifican su

especificidad de sustrato. Hay una gran variedad de estas enzimas (más de 20

tipos en la familia TEM).

2. Las no derivadas de enzimas TEM o SHV: tales como las enzimas MEN-1,

CTX-M1 y CTX-M2.

3. Cefalosporinasas mediadas por plásmidos: tales como FEC-1, MIR-1, CMY-1,

BIL-1, CMY-2, LAT-1, MOX-1. Ellas proveen resistencia a cefamicinas, oximino-

cefalosporinas y Aztreonam, y tienen una fuerte homología con genes ampC y

son de aparición más reciente que las derivadas de enzimas TEM o SHV

(Matsumoto y col., 1988).

En 1995, las combinaciones con inhibidores de betalactamasas reemplazaron las

cefalosporinas de tercera generación como terapia empírica en los Estados Unidos en

un esfuerzo por controlar la resistencia mediada por las BLEE. En un estudio publicado

en el año 2005, el grupo de Graffunder investigó la relación entre el uso de antibióticos

y la aparición de cepas productoras de BLEE desde 1994 hasta el año 2002 usando

análisis molecular y epidemiológico (Graffunder y col., 2005). Se realizó un estudio de

119 pacientes con cepas BLEE (+) y 132 pacientes con cepas BLEE (-). Mediante

análisis multivariado se determinó que el número de días con ventilación mecánica y el

uso previo de aminoglicósidos, cefalosporinas de tercera generación o

trimetoprim/sulfametoxasol estaban significativamente asociados con la producción de

BLEE, mientras que las combinaciones con inhibidores de betalactamasas no

estuvieron asociadas con las BLEE. La hibridación de los extractos plasmídicos

demostró que el 95% de los organismos BLEE (+) portaba int1, un elemento móvil de

ADN con un gen de resistencia a sulfonamidas y otros factores de resistencia. Se

encontraron genes específicos de resistencia a trimetoprim y aminoglicósidos en 26% y

40% de los extractos respectivamente. Estos datos indican que, aparte de los factores

de riesgo del paciente y el tratamiento con cefalosporinas de tercera generación, otros

24

antibióticos pueden proveer presión selectiva en el mantenimiento de cepas BLEE

debido a la presencia de múltiples genes de resistencia en los plásmidos. Las

combinaciones con inhibidores de betalactamasas parecen ser una opción terapéutica

aceptable para sustituir las cefalosporinas de tercera generación en las estrategias de

control de las BLEE (Graffunder y col., 2005).

Mendelson y colaboradores en el año 2005, publicaron un estudio cuyo propósito

fue determinar la prevalencia de BLEE entre cepas de Escherichia coli y Klebsiella

pneumoniae, obtenidas de muestras de orina de residentes de un centro hospitalario de

larga estadía y determinar los factores de riesgo para la adquisición de cepas

productoras de BLEE. La tasa promedio de BLEE entre las cepas de E. coli y K.

pneumoniae de este estudio fue de 25.6%. El análisis multivariado reveló tres factores

de riesgo independientes relacionados con la presencia de BLEE: anemia, sondas

urinarias permanentes y antibioticoterapia previa. El uso de fluoroquinolonas estuvo

fuertemente asociado con la presencia de cepas productoras de BLEE. La prevalencia

de cepas de E. coli y K. pneumoniae en centros hospitalarios de larga estadía fue

inesperadamente alta y corrobora la noción que los centros de larga estadía pudieran

ser reservorios importantes de bacterias resistentes.

En el año 2002 se realizó una encuesta a nivel nacional en Italia para determinar la

prevalencia y susceptibilidad antimicrobiana de miembros de la familia

Enterobacteriaceae que producian BLEE. En un período de 6 meses se obtuvieron

8015 aislamientos provenientes de pacientes hospitalizados y se les determinó la

resistencia a cefalosporinas de espectro expandido y monobactámicos. En base al

efecto sinergístico entre ácido clavulánico y ciertos betalactámicos (ceftazidima,

aztreonam, cefotaxima, cefepima y ceftriaxona) se determinó que 509 aislamientos

(6,3%) eran productores de BLEE. La hibridización de las colonias con sondas de ADN

para blaTEM y blaSHV permitió distinguir 4 genotipos distintos: positivo para TEM, positivo

para SHV, positivo para TEM y SHV y BLEEs que no eran TEM ni SHV. A todas las

cepas se les determinó la concentración mínima inhibitoria de betalactámicos,

combinaciones de betalactámicos con inhibidores, aminoglicósidos y quinolonas

mediante E-test. El 73.6% de los aislamientos correspondían a especies de Klebsiella

25

pneumoniae, Proteus mirabilis, y Escherichia coli. En general, prevalecieron las BLEE

tipo TEM con respecto a las tipo SHV (234 versus 173), mientras que la prevalencia de

las cepas que producían tanto TEM como SHV era similar a las que no producían ni

TEM ni SHV (55 y 38 respectivamente). In vitro, todos menos un aislamiento eran

susceptible a Imipenema. La susceptibilidad a otras drogras era variable:

piperacilina/tazobactam, 91%; amoxicilina/ac.clavulánico, 85%; cefoxitina, 78%;

amikacina, 76%; ampicilina-sulbactam, 61%; ciprofloxacina, 58%; y gentamicina, 56%.

Se observó con más frecuencia resistencia asociada a aminoglicósidos y quinolonas en

las cepas que producian BLEE tipo TEM (Spanu y col., 2002).

Resistencia a las Quinolonas Los mecanismos de resistencia a fluoroquinolonas incluyen mutaciones en las

topoisomerasas II y III. Estas modificaciones en la región determinante de resistencia a

quinolonas (QRDR) de los genes gyrA o gyrB y parC o parE pueden elevar los valores

de las Concentraciones Minimas Inhibitorias (CIM) hasta el rango de resistente; esta

disminución en la susceptibilidad a quinolonas se presenta principalmente en

Latinoamérica y el sur de Europa (Lorian, 1996).

La resistencia a quinolonas puede ser por diferentes mecanismos y esto tiene gran

impacto clínico. Las mutaciones pueden ocurrir durante la antibioticoterapia, y esto

constituye un factor limitante del uso de estos antimicrobianos. La resistencia a estos

antibióticos se ha relacionado con mutaciones en los genes gyrA o gyrB, como primer

paso que le confiere resistencia a ácido nalidíxico y una segunda mutación en el gen

parC o parE (los genes que codifican la topoisomerasa IV) le confieren resistencia a

Fluoroquinolonas. Adicionalmente se han observado bajos niveles de resistencia por

eflujo o impermeabilidad. La presencia de bombas de eflujo, así como alteraciones de

la permeabilidad por parte de la bacteria, normalmente conlleva a una resistencia de

bajo nivel. Ambos mecanismos pueden encontrarse asociados con mutaciones en las

topoisomerasas, incrementando el nivel de resistencia y contribuyendo, a su vez, a la

selección de la resistencia a lo largo del tratamiento (Lorian., 1996).

26

En el caso de las alteraciones del blanco de acción en microorganismos Gram

negativos, la ADN-girasa parece ser la primera diana para todas las quinolonas. Las

alteraciones en la diana se concentran en la región de la enzima denominada QRDR.

Alteraciones en las regiones QRDR, tanto de las dos subunidades de la ADN-girasa

como de la topoisomerasa IV van asociadas a un incremento de la CIM de todas las

quinolonas; de hecho, la resistencia a estos antibióticos parece ser la resultante de

varios escalones en cada uno de los cuales se produce una nueva mutación. De este

modo, la cepa, tras la primera mutación en QRDR (generalmente de gyrA), aparecerá

resistente al ácido nalidixico pero sensible a Fluoroquinolonas (solo incrementa

ligeramente la CIM) y posteriormente mutaciones en ese u otro QRDR harán que la

cepa pase a ser resistente a Fluoroquinolonas (aunque no a todas por igual).

Generalmente estas mutaciones sucesivas se asocian con otros mecanismos como las

bombas de eflujo. Por todo lo anteriormente expuesto se hace necesario informar la

presencia de estas cepas al clínico ya que están asociadas a fracaso terapéutico

(Lorian, 1996).

El aumento de la corresistencia a las fluoroquinolonas ha empezado a disminuir su

efectividad contra los patógenos productores de BLEE. Un estudio prospectivo de

infecciones sistémicas por Klebsiella pneumoniae realizado en 7 países encontró que el

18% de los aislamientos productores de BLEE también eran resistentes a

Ciprofloxacina, y que el 78% de los aislamientos de Klebsiella pneumoniae resistente a

Ciprofloxacina que causaban bacteriemia nosocomial también producían BLEE. En un

estudio realizado en Italia con enterobacterias productoras de BLEE sólo el 58%

resultaron susceptibles a Ciprofloxacina. La tasa de resistencia a Ciprofloxacina en Asia

entre cepas productoras de BLEE es muy alta; en Taiwán se ha encontrado resistencia

a Ciprofloxacina en casi el 20% de los aislamientos de Klebsiella pneumoniae

productoras de BLEE. Por otro lado, en el año 1999 en Brooklyn, Nueva York, un grupo

de 15 hospitales reportó que 34% de sus aislamientos de Klebsiella pneumoniae eran

posibles productores de BLEE, y que de estos sólo el 42% eran susceptibles a

Ciprofloxacina. Los factores de riesgo identificados para la resistencia a

27

fluoroquinolonas en E. coli y K. Pneumoniae productoras de BLEE incluyen el uso de

fluoroquinolonas, aminoglicósidos y una hospitalización larga (Ramphal y col.. 2006).

Recientemente se ha descrito que la resistencia a las Quinolonas también tiene un

origen plasmídico, contrario a lo que anteriormente se creía. En 1998 en un aislamiento

de K. pneumoniae en USA se identificó el primer gen de resistencia a las Quinolonas, el

gen QnrA transferible por plásmidos, el cual codifica para la proteína QnrA (Jiang y col.,

2008) Esta proteína interfiere con la acción de las Quinolonas sobre sus dianas,

confiriendo bajos niveles de resistencia a las Quinolonas (Minarini y col., 2008). Otros

dos genes plasmídicos han sido identificados como QnrB y QnrS cuyas proteínas solo

difieren en un 41% y un 60% de aminoácidos con respecto a QnrA respectivamente

(Cattoir y col., 2007) y que también codifican para proteínas protectoras de las dianas.

La expresión de estos genes induce a un bajo nivel de resistencia, observándose cepas

que presentan la proteína Qnr y son Ácido Nalidíxico sensibles, esto las hace reservorio

oculto para la propagación de genes plasmídicos tipo Qnr. Igualmente se ha descrito la

presencia de mecanismos de inactivación enzimática relacionados con una variante de

la enzima Acetilasa de Aminoglicósidos denominada AAC(6’)-Ib-cr, capaz de reducir los

halos de sensibilidad para Ciprofloxacina y Norfloxacina (Pitout y col., 2008).

Desde el punto de vista epidemiológico, la presencia de estos cinco genes

plasmídicos que confieren resistencia a las Quinolonas es alarmante, debido a la

posible transmisión horizontal a través de elementos génicos móviles a cepas

originalmente sensibles a las Quinolonas, hecho que en un futuro podría determinar la

aparición de brotes epidémicos difíciles de controlar. La presencia de mecanismos

plasmídicos de resistencia a las Quinolonas ligado a una mutación cromosómica

favorecería la aparición de cepas altamente resistentes a las Fluoroquinolonas.

La resistencia debida a Proteínas Qnr ha sido identificada en K. pneumoniae, K.

oxytoca, E. coli, C. freundii, C. koseri, E. cloacae, S. flexneri y Salmonella sp. (Szabó y

col., 2008; Cavaco y col., 2008; Rodríguez-Martínez y col., 2008) Esta proteína se une a

la DNA-girasa y se postula que esta unión ocurre antes del bloqueo de la enzima por

parte de la Quinolona, evitando que la misma se una a la DNA-girasa inactivándola.

28

(Sierra, 2005) La presencia de este gen de resistencia se ha descrito en diferentes

partes del mundo: China, USA, Alemania, Francia, Japón y Turquía, aunque con una

baja prevalencia (Jonas y col., 2005; Mammeri y col., 2005; Wang y col., 2003; Wang y

col., 2004). Este mecanismo de resistencia aumenta la CIM de las cepas que la

presentan de 4 a 8 veces (Rodríguez-Martínez, 2005; Tran y col., 2005) y complementa

a otros mecanismos de resistencia como la adquisición de mutaciones o a los sistemas

de expulsión activa (Tran y Jacoby., 2002). Se cree que estos mecanismos producen un

bajo nivel de resistencia a las Quinolonas (Nordmann y Poirel., 2005; Chen y col., 2006;

Wang y col., 2004; Alós, 2009), pero estudios realizados en Sevilla, España, revelaron

que la presencia de mecanismos de resistencia plasmídicos tipo QnrA1 junto a

mecanismos adicionales de resistencia (Alteración de las dianas, déficit de porinas o

bombas de eflujo) aumentan de forma significativa la CIM de Ciprofloxacina y

Levofloxacina (Rodríguez-Martínez y col., 2008) lo cual conduciría probablemente al

fracaso terapéutico cuando el tratamiento de elección son las quinolonas.

Las proteínas Qnr pertenecen a una familia de pentapéptidos que para la fecha

tiene 90 miembros conocidos, y que han sido bien descritos en las Cianobacterias,

donde forman parte de las membranas y están vinculadas al citoplasma. Ellas tienen

una estructura en alfa-hélice en su circunferencia externa y hojas beta-plegadas en su

circunferencia interna, característica que la hace una estructura apropiada para la

interacción con proteínas (Nordmann y Poirel., 2005).

El mecanismo de acción de las proteínas Qnr se basa en la unión de esta

proteína a la ADN girasa; esta unión no requiere la presencia del complejo ADN girasa-

Quinolona-ADN para su formación. Se postula que la formación del complejo Qnr-ADN

girasa ocurre antes del bloqueo de la ADN girasa por parte de la Quinolona. Además se

ha observado una disminución en la formación del complejo en presencia de Qnr (Tran

y Jacoby., 2002).

La proteína QnrA (la primera de estas proteínas en ser caracterizada) está

formada por 218 aminoácidos, y fue detectada en un aislado de K. pneumoniae en

USA en el año 1998 (Martínez-Martínez y col., 1998) A partir de esa fecha, hasta la

29

actualidad han sido descritas 6 variantes de la misma (QnrA1-QnrA6). Otras 2

proteínas, las QnrB y QnrS hasta el momento presentan 19 variantes y 3 variantes

respectivamente (Minarini y col., 2008) y difieren aproximadamente en un 41% (QnrB) y

un 60% (QnrS) de aminoácidos con respecto a QnrA (Cattoir y col., 2007).

La proteína QnrA y QnrB han sido descritas principalmente en especies como K.

pneumoniae, K. oxytoca, E. coli, C. freundii, C. koseri y E. cloacae, mientras que la

proteína QNRS fue descrita por primera vez en 2005 en un aislado de S. flexneri en

Japón (Hata y col., 2005).

Se cree que estos mecanismos producen un bajo nivel de resistencia a las

Quinolonas, pudiendo incrementar las CIMs de 8 a 12 veces para estos antibióticos

(Jiang y col., 2008). Algunos autores sugieren que las proteínas Qnr confieren

resistencia al Ácido Nalidíxico más no a las Fluoroquinolonas (Nordmann y Poirel.,

2005), mientras que otros autores, van más allá y aseguran que estas proteínas brindan

un bajo nivel de resistencia a las Fluoroquinolonas, efecto que se ve pronunciado si se

adiciona la presencia de alguno de los mecanismos clásicos de resistencia a

Quinolonas, como lo son las alteraciones de las dianas por mutaciones cromosómicas

(Rodríguez-Martínez, 2005). Igualmente se ha descrito que estos genes se transmiten

de forma conjunta, en la mayoría de los casos, con genes de resistencia codificantes

para BLEE (Chen y col., 2006; Wang y col., 2004).

En los procesos de adaptación de resistencia para los Aminoglicósidos, las

enzimas modificadoras de la estructura de la molécula estas sufrieron variaciones y una

de esas modificaciones condujo a la formación de la enzima aac(6´)-Ib-cr, la cual es

capaz de inactivar las Fluoroquinolonas que poseen un grupo piperacínico como radical

sustituyente, tal es el caso de Norfloxacina y Ciprofloxacina. Además, es capaz de

inactivar los Aminoglicósidos: Kanamicina, Tobramicina y Amikacina (Pitout y col.,

2008). Esto las hace reconocibles en los Antibiogramas. Estas enzimas son capaces de

reducir la actividad de Ciprofloxacina y Norfloxacina, lo cual aumentaría las CIM para

estos antibióticos. Por ser un mecanismo enzimático, depende del inóculo, a mayor

inóculo, mayor producción de la enzima, por lo tanto, la cantidad de antibiótico

30

inactivado será mayor. Se piensa que el gen aac(6´)-Ib-cr que codifica para esta

enzima, se transmite de forma conjunta con los genes Qnr y genes codificantes para

BLEE (Jiang y col., 2008).

Relevancia de la transmisión de la resistencia bacteriana La terapéutica de las infecciones nosocomiales y las adquiridas en la comunidad

está seriamente afectada por la evolución continua de la resistencia antimicrobiana. Se

estima que más del 60% de los dos millones de infecciones nosocomiales que ocurren

en los Estados Unidos cada año son causadas por bacterias resistentes a los

antibióticos, lo que resulta en un aumento de la morbilidad y mortalidad y altos costos

de salud. La emergencia y diseminación de los determinantes de resistencia

antimicrobiana continúa siendo un reto para el tratamiento de infecciones serias. A lo

largo de la última década, hemos sido testigos del feroz aumento de la resistencia

antimicrobiana en los ambientes nosocomiales y comunitarios; aun cuando en los

últimos años se han diseñado nuevos antibióticos para tratar los microorganismos

multirresistentes, la resistencia ha continuado emergiendo y diseminándose. Hemos

aprendido mucho en la última década sobre los mecanismos por los cuales estas

bacterias se hacen resistentes a múltiples antibióticos, y se espera que este

conocimiento sirva para implementar nuevas estrategias para el desarrollo de drogas y

a la vez limitar la morbilidad y mortalidad asociada de forma más eficiente.

La mayoría de los antibióticos usados en la actualidad son productos derivados de

hongos y bacterias; por lo tanto, es razonable pensar que aquella bacteria que

produzca antibióticos debe a su vez poseer mecanismos por los cuales pueda evitar la

acción letal del mismo. Por otro lado, en vista de que es raro encontrar en la naturaleza

cultivos puros, también es lógico razonar que las bacterias que comparten un nicho

ecológico con microorganismos productores de antibióticos deberían desarrollar

también mecanismos para sobrevivir en dicho ambiente, siendo el mecanismo más

directo en muchos casos la adquisición de los genes de resistencia que poseen los

microorganismos productores de antibióticos (Lorian, 1996). Es interesante señalar que

31

el genoma bacteriano es una entidad dinámica y cambiante, que no ha dejado de

evolucionar aunque mantiene un tamaño reducido y consiste en un mosaico de genes

con diferentes historias. Se ha sugerido que al menos 17% de los genes de E. coli son

adquisiciones foráneas relativamente recientes, con una tasa de transferencia

horizontal de aproximadamente 16kb cada millón de años.

Una notable importancia del genoma bacteriano consiste en que la información

genética esencial de la célula bacteriana está contenida en una única molécula de ADN

de doble cadena con un tamaño típico de unos pocos millones de bases; el cromosoma

de las bacterias contiene, en esencia, toda la información necesaria para la regulación

de la expresión de las vías metabólicas, para la duplicación de todos los componentes

celulares durante el crecimiento y para la diferenciación estructural que se presenta

durante procesos tales como la esporulación (Joklik y col., 1992). En vista de la

complejidad funcional del genoma bacteriano y de la capacidad de diseminación

horizontal de genes de resistencia entre las bacterias, muchos investigadores han

buscado estudiar dichas características genéticas y su interrelación; por ejemplo, en el

año 2005 el grupo de Branger y colaboradores (Branger y col., 2005), para determinar

la implicación del “trasfondo” genético de cepas de Escherichia coli en la emergencia de

BLEE y su capacidad de diseminación, estudiaron 55 cepas clínicas con BLEE tipo

TEM, 52 con BLEE tipo CTX-M y 22 con BLEE tipo SHV provenientes de muestras

extraintestinales en lo que respecta a sus grupos filogenéticos, contenido de factores de

virulencia (genes pap, sfa/foc, hly y aer) y resistencia a fluoroquinolonas. Un análisis

factorial de correspondencia demostró que las BLEE tipo SHV, y en menor grado las

TEM, se observaban principalmente en las cepas del grupo filogenético B2, las cuales

presentaban numerosos factores de virulencia pero eran susceptibles a

fluoroquinolonas, mientras que el tipo CTX-M estaba asociado con el grupo filogenético

D, que era deficiente- en factores de virulencia pero era resistente a fluoroquinolonas;

esto indica un claro intercambio entre la expresión de factores de virulencia y la

resistencia a fluoroquinolonas. Es importante destacar que el alto nivel de resistencia a

quinolonas en las cepas con CTX-M y su bajo nivel de virulencia les provee una gran

ventaja selectiva (en particular en ambientes donde se usen las fluoroquinolonas como

32

terapéutica) lo cual podría explicar la gran capacidad de diseminación que han

demostrado las cepas con este genotipo en los últimos años.

Por otro lado, la investigación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) de

los genes plasmídicos de resistencia a quinolonas qnr resultó negativa, lo cual permitió

deducir que la asociación entre ambas resistencias no fue debida a que los genes de

BLEE y la resistencia a quinolonas estuviesen codificados en el mismo elemento móvil;

en este estudio se determinó que existía una relación causal entre el uso de

fluoroquinolonas y la emergencia de BLEE. El grupo concluyó que las BLEE no se

distribuyen al azar entre la gran diversidad genética de las distintas E. coli, sino que su

captación, expresión y mantenimiento depende del tipo de BLEE, el trasfondo

filogenético de la cepa, la virulencia intrínseca de la misma y la presencia de resistencia

asociada a fluoroquinolonas, lo cual refleja la diversidad de los nichos ecológicos con

diferentes presiones selectivas (Branger y col., 2005). Es importante destacar que la

transferencia de genes entre especies bacterianas que no son naturalmente

competentes está mediada principalmente por elementos genéticos móviles como son

los plásmidos a través del proceso de conjugación, y éstos pueden a su vez contener

elementos como los integrones.

Los plásmidos son elementos genéticos compuestos de ADN que se replican

independientemente del cromosoma del hospedador, y que a diferencia de los virus no

tienen forma extracelular. Estos elementos pueden codificar fenotipos de resistencia a

varios antibióticos, varios iones metálicos (mercurio), radiación ultravioleta y bromuro de

etidio. Es posible diferenciar entre un plásmido y un cromosoma en los procariotas

porque los plásmidos no llevan genes que sean requeridos por el hospedador en todas

las condiciones (no transportan genes indispensables); sin embargo, esta característica

a veces es difícil de demostrar y por tanto, a veces es complicado distinguir entre

cromosomas y plásmidos muy grandes. Los plásmidos tienen la capacidad de

diseminarse epidémicamente de modo "horizontal" (es decir, entre células distintas de

la misma especie o de distintas especies) y pueden ser transferibles por sí mismos

(plásmidos conjugativos) o requerir de otros plásmidos para movilizarse (plásmidos no

conjugativos); cuando no existe presión selectiva, los plásmidos de resistencia pueden

33

perderse de la mayor parte de las bacterias de una determinada población, pero su

modo de transmisión "epidémica" los capacita para diseminarse rápidamente a la

mayoría de la población cuando la situación lo requiere (Madigan, 1998).

La conjugación es el intercambio unidireccional de información genética mediada

por plásmidos desde una bacteria donante a otra receptora mediante un contacto real

(Figura 4). La capacidad de conjugación depende de la presencia en la bacteria de

plásmidos conjugativos que contienen los genes necesarios para tal proceso. Los

genes que controlan la conjugación se encuentran localizados en la región tra del

plásmido, los cuales están relacionados con la síntesis de una estructura superficial

conocida como pilus sexual, que permite y establece el contacto físico entre la bacteria

donante y la receptora.

Figura 4. Esquema del proceso de Conjugación bacteriana. Tomado de

http://blog.evolutionibus.info

34

Se distinguen en la conjugación dos fases:

Primera fase (contactos entre células): Las células donantes de 1 a 10 pili. El Pili

interacciona con un receptor de la célula receptora. El pili se va despolimerizando

desde su base, lo cual provoca la apariencia de que se va retrayendo. En ese

movimiento de retracción, la cédula receptora se va acercando a la donante. Cuando el

Pili se termina de desintegrar, las células se ponen en contacto directo pared-pared. Se

forma un puente conjugativo que pone en contacto los citoplasmas de ambas cédulas y

se produce el paso de una hebra de ADN. Tras cierto tiempo de conjugación, el

agregado se desagrega de forma activa.

Segunda fase (transferencia de ADN): Esta transferencia representa un proceso

especial de replicación asimétrica por círculo rodante. Una de las dos cadenas

parentales del plásmidos pasa a la célula receptora, replicándose en ella. La otra

cadena parental se queda en el donador, sirviendo a su vez como molde para la

síntesis de una nueva cadena complementaria (Koneman y col., 1999).

La conjugación es uno de los procesos de transferencia de material genético mas

sofisticado, complejo y de mayor rango de acción, superando la barrera no solo de las

especies, sino también de los reinos, además de ser uno de los medios de

transferencia de genes de resistencia más efectivo y especifico que se conoce. La

conjugación es esencialmente un proceso de replicación, que permite que un plásmido

se replique más frecuentemente que los genes cromosomales, y además habilita la

transferencia alternativa de un hospedador bacteriano. Por consiguiente, una gran

proporción de varios tipos de plásmidos aislados de diferentes géneros bacterianos son

conjugativos (Madigan, 1998).

Los integrones son trozos de ADN de doble hebra que capturan genes de

resistencia del citoplasma celular y que contiene promotores fuertes para expresar esos

genes. Los genes que captan se denominan genes “casettes” y se insertan entre los

35

extremos 5’CS y 3’CS (secuencias conservadas) a través de una integrasa codificada

por el gen int. Cabe destacar que los genes que captan tienen en su extremo final una

secuencia de 59 pb, a través de las cuales se produce su inserción. Se han detectado

en integrones genes de resistencia a los aminoglucósidos (acetiltransferasas,

nucleotidiltransferasas o fosfotransferasas), genes de resistencia a trimetoprima,

cloranfenicol y betalactámicos. Los integrones mejor estudiados se sitúan sobre

transposones y requieren incorporarse a material genético capaz de replicarse para

poder dividirse y diseminarse (Madigan M., 1998).

Caracterización de mecanismos de resistencia en el laboratorio de microbiología

El papel primordial del laboratorio de microbiología clínica consiste en brindar

información con la cual los médicos puedan diagnosticar y tratar enfermedades

infecciosas, siendo una de las piezas de información más importante la que arroja un

cultivo, en cuanto a qué antimicrobiano servirá para un tratamiento adecuado y a cuales

será resistente la bacteria, siendo importante además determinar si dicha resistencia es

intrínseca de la bacteria o si por el contrario es adquirida y potencialmente transmisible

a otras cepas. A nivel del Laboratorio de Microbiología se pueden caracterizar los

mecanismos de resistencia de los antibióticos mediante el uso de técnicas accesibles,

como son:

Técnica de Hodge: Es un método microbiológico cualitativo y sensible que permite

determinar si la resistencia bacteriana es de naturaleza enzimática, el cual ha sido

aceptado como una herramienta útil en el Laboratorio.

Conjugación plasmídica: El método de conjugación permite detectar la transferencia

de un plásmido seleccionado que posee resistencia a un determinado antibiótico.

Para llevar a cabo tal experimento se requiere de una célula donadora (denominado

macho), que contiene un tipo particular de plásmido conjugativo que permite

transferir una copia de sí mismo a una célula receptora que carece de él

36

(denominado hembra), cuyo proceso de transferencia es llevado a cabo por el pili

sexual que posee la célula donadora.

Isoelectroenfoque: Esta técnica permite determinar el punto isoeléctrico de la enzima

o enzimas en estudio y es de gran ayuda para confirmar la interpretación fenotípica,

por cuanto permite detectar la presencia de una o más enzimas de resistencia y

aporta información fisicoquímica sobre su naturaleza. Esta técnica se basa en que

las cargas que tienen las proteínas dependen del número e hidratación de los

residuos de aminoácidos con cadenas laterales ionizables; si estos grupos están

cargados o no depende del pH. Si las proteínas se colocan en un gradiente de pH

generado eléctricamente ellas migrarán de acuerdo a su carga, y su carga variará

mientras se mueven a regiones de distinto pH; cuando la enzima alcance su punto

isoeléctrico su carga neta será 0, dejará de migrar y formará una banda definida en el

gel (Lorian, 1996).

PCR: es una técnica altamente sensible por medio de la cual secuencias de ADN que

se encuentran en cantidades muy pequeñas se pueden amplificar enzimáticamente

de un modo tal que es posible disponer de una cantidad suficiente para alcanzar una

señal umbral detectable. La técnica puede ser usada para detectar cantidades muy

pequeñas de ácido nucleico específico en muestras clínicas en las que se piensa que

agentes bacterianos, fúngicos o virales tienen un papel causal. La base fundamental

de esta tecnología es que cada agente infeccioso causante de una enfermedad

posee una secuencia característica propia en su composición de ADN o ARN por

medio de la cual puede ser identificado (Koneman y col., 1999). El PCR es un

proceso altamente sensible; aun cuando la mayoría de los análisis bioquímicos

(incluida la detección de ácidos nucleicos con radioisótopos) requieren el uso de

cantidades significativas de material biológico, para la PCR la cantidad de muestra

requerida es muy poca. Esta característica hace que la técnica sea extremadamente

útil, no sólo en investigación básica, sino también en usos comerciales como pruebas

de identificación genética, métodos forenses, control de calidad industrial y

diagnóstico in vitro. Tal como fue desarrollado originalmente (Mullis y Faloona, 1987),

el PCR amplifica segmentos cortos (de aproximadamente 100 a 500 pares de bases)

37

de una molécula de ADN más grande. Una amplificación típica incluye la muestra de

ADN blanco, una polimerasa de ADN termoestable, dos “iniciadores”,

desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), buffer de reacción, magnesio y aditivos

opcionales. Los componentes de esta reacción son mezclados y la reacción toma

lugar en un termociclador, el cual es un instrumento automatizado que lleva la

reacción a través de una serie de temperaturas diferentes por tiempos variables. Esta

serie de temperaturas y ajustes de tiempo son lo que se conocen como un ciclo de

amplificación. Cada ciclo de PCR teóricamente dobla la cantidad de ADN blanco

(amplicón) presente en la reacción. Diez ciclos teóricamente multiplican el amplicón

por un factor de mil; 20 ciclos por un factor de más de un millón en cuestión de horas.

Cada ciclo de amplificación por PCR consiste en un número de pasos que producen

dos hebras de ADN de cadena simple cebados por los “iniciadores”, inician la

reacción de polimerización, y sintetizan una copia de cada hebra del ADN blanco.

Estos pasos deben ser optimizados para cada combinación de iniciadores-ADN

blanco (Doyle, 1996).

Secuenciación: La técnica de secuenciación más utilizada es la desarrollada por

Frederick Sanger en 1975. En ella, se emplean dideoxinucleótidos trifosfato (ddNTP)

en la síntesis del ADN. Son moléculas que parecen nucleótidos normales excepto

por carecer de un grupo hidroxilo en posición 3’. Pueden añadirse al extremo en

crecimiento de la cadena, pero finalizan la síntesis catalizada por ADN polimerasa

porque no pueden añadirse más nucleótidos para ampliar la cadena. Se mezcla una

cadena sencilla del ADN que se va a secuenciar con un cebador, la ADN polimerasa

I, nucleósidos trifosfato normales (NTP) y una pequeña cantidad de los

desoxinucleótidos que han sido marcados con un colorante fluorescente (cada

ddNTP se marca con un colorante de distinto color). La síntesis del ADN se inicia con

el cebador y finaliza cuando se incorpora ddNTP en lugar de un NTP normal. El

resultado en una serie de fragmentos de longitudes diferentes. Se producen cuatro

reacciones, cada una con un ddNTP fluorescente diferente. La mezcla con ddATP

produce fragmentos con un A terminal, la mezcla con ddCTP produce fragmentos

con un C terminal y así sucesivamente. Los fragmentos fluorescentes se separan del

molde de ADN y se someten a electroforesis en gel de poliacrilamida para separarse

38

unos de otros según su tamaño. En los sistemas automatizados, los productos de las

cuatro reacciones se mezclan y se someten juntos a electroforesis; como cada

ddNTP presenta una fluorescencia de diferente color, puede comprobarse el gel con

un detector y determinar rápidamente la secuencia según el orden de los colores que

aparecen en las bandas (Prescott y col., 1999).

MARCO METODOLÓGICO

Tipo de estudio Según la metodología empleada este trabajo se inscribe dentro de la clasificación

de trabajo de campo experimental, ya que en él se determinó experimentalmente la

sensibilidad o resistencia de ciertas cepas de Enterobacterias frente a algunos

antibióticos predeterminados. Según los objetivos el trabajo es de tipo descriptivo, ya

que caracterizó el fenómeno de la producción de BLEE en las cepas de

Enterobacterias aisladas.

Muestra La muestra estuvo conformada por 50 cepas de Enterobacterias con

susceptibilidad disminuida a cefalosporinas aisladas de distintas fuentes biológicas.

El muestreo se obtuvo a partir de cepas con sospecha fenotípica de producción de

BLEE aisladas de los laboratorios de bacteriología desde enero hasta junio del año

2006 del Hospital Universitario de Caracas, Hospital J. M. de los Ríos, Hospital Dr.

Ricardo Baquero, Centro Policlínico Valencia, Laboratorio Cesar Sánchez Font,

Policlínica Santiago de León, Hospital Central Antonio María Pineda e Instituto

Nacional de Higiene, aceptándose cepas hasta alcanzar el número planteado. De

estas cepas, sólo se caracterizaron aquellas que fueron confirmadas como

productoras de Betalactamasas de Espectro Expandido.

39

Metodología de laboratorio Se realizó la identificación a nivel de género y especie de las cepas en estudio

mediante pruebas bioquímicas convencionales, evaluándose los siguientes

parámetros:

Fermentación de Glucosa y Lactosa a partir de Agar Kligler.

Determinación de la vía de utilización de la glucosa en caldo MRVP.

Utilización del Malonato como fuente de carbono en Caldo Malonato.

Utilización del Citrato como fuente de carbono en Agar Citrato.

Descarboxilacion de los Aminoácidos Lisina, Arginina y Ornitina en Caldos

Moeller Descarboxilasa.

Metabolismo de la Urea en agar Urea de Christensen.

Determinación de la presencia de la enzima Ortonitrofenilgalactosidasa

mediante el uso de taxo ONPG.

Fermentación de Arabinosa, Ramnosa e Inositol en Caldo Andrade.

Metabolismo de Fenilalanina en Agar Fenilalanina.

Determinación de motilidad en agar semisólido.

40

Para determinar el patrón fenotípico de resistencia de las enterobacterias se

usó la metodología de Kirby-Bauer recomendada por la CLSI 2010 y se determinó la

susceptibilidad a los siguientes antimicrobianos: Ceftazidima 30 µg, Cefotaxima 30

µg, Amoxicilina/Ac. Clavulánico 20/10 µg, Ciprofloxacina 5 µg, Levofloxacina 5 µg,

Ofloxacina 5 µg, Ac. Nalidíxico 30 µg, Trimetoprim/Sulfametoxasol, Cefepima 30 µg

y Aztreonam 30 µg de las cepas en estudio. Todos los discos empleados fueron

marca Oxoid. Adicionalmente se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria para

Ciprofloxacina por el método de E-test (Biomerieux)

La detección presuntiva las cepas productoras de BLEE fue determinada por dos

métodos:

1) El método de difusión en disco de Kirby-Bauer empleando en conjunción discos

de Amoxicilina/ácido Clavulánico con discos de Ceftazidima, Cefotaxima,

Cefepima y Aztreonam separados entre sí por 25 mm (difusión doble del disco),

en el cual una prolongación de la zona de inhibición mayor o igual a 4 mm

alrededor de un disco de un oximino -lactámico en dirección al disco de ácido

clavulánico sugirió la presencia de enzimas betalactamasas de espectro

expandido.

2) El método de difusión en disco de Kirby-Bauer comparando el halo de inhibición

(obtenido en un antibiograma realizado por el método de Kirby-Bauer) alrededor

de un disco de una cefalosporina de tercera generación (Cefpodozima,

Ceftazidima, Cefotaxima) con el halo de inhibición alrededor de un disco que

contiene una combinación de la misma Cefalosporina más Acido Clavulánico

(Ceftazidima/Clavulánico, Cefotaxima/Clavulánico); en este caso se consideró la

presencia de BLEE cuando existe una diferencia mayor o igual a 5 mm entre el

halo de inhibición de la cefalosporina y el de la cefalosporina más clavulánico.

La confirmación genotípica de la producción de las BLEE y resistencia a

quinolonas se realizó mediante la determinación de los genes que codifican para

dicha enzima al realizar ensayos de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

del tipo PCR simple usando iniciadores específicos para los genes que codifican

41

dichas enzimas (TEM, SHV, PER, CTX-M, gyrA, qnrA, qnrB, qnrS, aac(6’)ib-cr).

La mezcla de reacción empleada fue la misma para todos los genes: Vol. final: 50

μl; Buffer ADN Taq polimerasa: 1X; Primers: 50 pmoles de c/u.; ADN Taq

polimerasa: 1 U; dNTPs: 25 μM de cada uno; ADN molde: 5 μl; MgCl2: 1,5 mM. El

programa empleado en el ciclador térmico contempló un paso de

desnaturalización inicial de 5 min. a 94ºC, y la amplificación se llevó a cabo por 30

ciclos, con pasos de desnaturalización (30 seg. a 94ºC), alineación (30 seg a 55

ºC para TEM, CTX-M, GyrA y PER, a 54 ºC para Aac(Ib)cr y QnrB, a 57 ºC para

QnrA y QnrS y a 59 ºC para SHV) y extensión (30 seg. a 72ºC), y un paso final de

extensión de 5 min. a 72ºC (Galas y col., 2004). Se corrieron controles positivos

de extracción de ADN a cada cepa en estudio paralelamente a la amplificación de

detección, empleando iniciadores específicos para el cluster génico codificante

del ARNr 16S, un control positivo del gen a amplificar y un control negativo sin

ADN. Los productos finales de amplificación fueron detectados en geles de

agarosa al 1,2 %, teñidos con bromuro de etidio 0,5 μg/mL y se visualizaron bajo

luz ultravioleta mediante el equipo Gel Doc 2000 (Bio-Rad), empleando un

marcador de peso molecular de 100 pares de bases. Los iniciadores y los

controles positivos que se emplearon para el PCR se especifican en la tabla 3.

Una vez obtenidos los productos de amplificación, aquellos cuyos iniciadores

no permiten discriminar entre las múltiples variantes del gen o en los que se

requerían la detección de mutaciones (TEM, SHV, gyrA) se remitieron al servicio

de secuenciación del Laboratorio de Biología Molecular de Protozoarios del

Instituto de Medicina Tropical de la UCV, donde se utilizó un secuenciador de

ácidos nucléicos modelo ABI 3130XL (Applied Biosystems) de cuatro capilares.

En esta metodología, los fragmentos de ADN se marcan con cuatro fluoróforos,

de manera que cada nucleótido tiene un color diferente. Una vez obtenida la

secuencia se determinó, mediante la comparación de la secuencia obtenida con

la base de datos GeneBank empleando el programa BLAST de los Institutos

Nacionales de Salud de los Estados Unidos (NCBI/NIH), la variante del gen o la

mutación que se encuentraba presente en la cepa.

42

Tabla 3. Iniciadores empleados en el estudio

ENZIMA SECUENCIA AMPLICON

(pb) REFERENCIA

CONTROL POSITIVO

16S F

16S R

5’-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3’

5’-AACTGGAGGAAGGTGGGGAT-3’ 370 Greisen, 1994

Escherichia coli ATCC

35218

PER F

PER R

5’-GTAGTATCAGCCCAATCCCC-3’

5’-CCAATAAAGGCCGCCGTCCATCA-3’ 740

Melano R, 2005. Comunicación personal.

Instituto “Dr. Carlos Malbrán”. Argentina

Klebsiella pneumoniae INH 77915

OS(SHV) F OS(SHV) R

5’-TCGGGCCGCGTAGGCATGAT-3’ 5’- GCAGGGCGACAATCCCGCG-3’

620 Arlet y Philippon, 1991 Klebsiella

pneumoniae INH 77915

OT(TEM) F OT(TEM) R

5’-TTGGGTGCACGAGTGGGTTA-3’ 5’-TAATTGTTGCCGGGAAGCTA-3’

502 Arlet y Philippon, 1991 Klebsiella

pneumoniae INH 77915

CTX-M-2 F CTX-M-2 R

5’-CGGAATTCATGATGACTCAGAGCATTCG-3’ 5’-GCTCTAGATTATTGCATCAGAAACCGTG-3’

850

Melano R, 2005. Comunicación personal.

Instituto “Dr. Carlos Malbrán”. Argentina

Klebsiella pneumoniae INH 77915

GyrA 5´- CAACGAAATCGACCGTCTCTT-3´ 5´- ACGTATTGGGCAAYTACTGCA-3´

282

Melano R, 2005. Comunicación personal.

Instituto “Dr. Carlos Malbrán”. Argentina

Escherichia coli ATCC

35218

QnrA 5’- AGAGGATTTCTCACGCCAGG-3’ 5’- TGCCAGGCACAGATCTTGAC-3’

579 Cattoir y col., 2007 -

QnrB 5’-GATCGTGAAAGCCAGAAAGG-3’ 5’-ACGATGCCTGGTAGTTGTCC-3’

469 Pitout y col., 2008 Klebsiella

pneumoniae EB 083

QnrS 5’-GCAAGTTCATTGAACAGGGT-3’

5’-TCTAAACCGTCGAGTTCGGCG-3’ 427 Cattoir y col., 2007

Klebsiella pneumoniae

EB 024

Aac(Ib)cr 5’-TTGCGATGCTCTATGAGTGGCTA-3’

5’-CTCGAATGCCTGGCGTGTTT-3’ 482 Minarini y col., 2008

Klebsiella pneumoniae

EB 092

5’CS 3’CS

5’-GGCATCCAAGCAGCAAG-3’ 5’-AAGCAGACTTGACCTGA-3’

variable

Melano R, 2005. Comunicación personal.

Instituto “Dr. Carlos Malbrán”. Argentina

Klebsiella pneumoniae

KP13

Int1 5´- ATCATCGTCGTAGAGACGTCGG -3´ 5´- GTCAAGGTTCTGGACCAGTTGC -3´

893 Reyes y col, 2003

Salmonella sp. EB 2757/09

La caracterización fenotípica de la resistencia enzimática se efectuó mediante la

técnica de Hodge, la cual determina si la célula produce alguna enzima capaz de

hidrolizar el antibiótico en estudio (Sandra y col., 2009). Para realizar la técnica de

Hodge se hisopa una suspensión 0,5 McFarland de una cepa de referencia (E. coli

ATCC 25922) según la técnica de Kirby y Bauer en agar Mueller Hinton, se coloca un

taxo del antibiótico a evaluar y dentro del diámetro del halo de susceptibilidad esperado

para esa cepa de referencia/antibiótico se coloca una estría de la cepa en estudio

perpendicular al halo de susceptibilidad esperado sobrepasándolo. Una prueba positiva

está constituida por el crecimiento confluente de la cepa de referencia hacia la estría de

la cepa problema lo cual conlleva a la deformación del halo de susceptibilidad.

43

Figura 5. Prueba de Hodge positiva para Ertapenem. 1 Control positivo. 2 Control negativo. 3 Cepa problema (positiva). Fuente: Clinical and Laboratory Standards Institute. 2010. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. Documento M100-S20

Las características fisicoquímicas de las enzimas de resistencia presentes en las

cepas se determinaron mediante Isoelectroenfoque Analítico, el cual consiste en una

electroforesis en gel de poliacrilamida del contenido celular bacteriano (previamente

extraído mediante sonicación) a lo largo de un gradiente de pH que permite separar las

enzimas de acuerdo a sus respectivos puntos isoeléctricos, y que al revelar la corrida

con diferentes sustratos (p.ej. distintos betalactámicos) permite correlacionar la

presencia de una enzima de un pI determinado con su perfil de hidrólisis, y al comparar

este pI con patrones conocidos se puede determinar la familia a la cual pertenece dicha

enzima (Galas y col., 2004). Para realizar el isoelectroenfoque primero se realizó la

extracción del contenido celular por sonicación. Para realizar el sonicado se preparó un

cultivo bacteriano de la cepa en estudio en 10 mL de caldo BHI, se incuba 18hs a 35ºC

con agitación, se centrifugó el cultivo 20 min. a 10.000 rpm., se resuspendió en 300 μL

de buffer fosfato 10 mM, pH 7.0, se sometió a sonicación (2 pulsos de 40 seg., potencia

4, separados por intervalos de 30 seg.) y se centrifugó 10 min. a 17.000 x g, a 4ºC,

separando el sobrenadante. Posteriormente se preparó el gel de acrilamida para la

corrida pesando en erlenmeyer estéril 1,45 g de Acrilamida + 0,045 g de Bis-Acrilamida

44

y agregando 28,3 ml de agua destilada estéril, 1.75 ml de anfolitos, 36 microlitros de

persulfato y 176 microlitros de TEMED (Tetrametiletilendiamina). Inmediatamente

después del agregado de los reactivos, se volcó en el molde y se selló con butanol. Una

vez preparado el gel se colocó el mismo en la cámara electroforética refrigerada a 4˚C,

se impregnaron los electrodos de papel con H3PO4 1 M (electrodo positivo) y NaOH 1M

(electrodo negativo) y se colocaron encima del gel. Se colocaron los sembradores en el

gel y se sembraron 15 μL de las muestras y los patrones. Se corrió el gel con

condiciones iniciales de 15’ W= 6 W ( V=3000 V; Amp= >80 A y posteriormente a 120’

W=25 W. A la hora de corrida se sacaron los sembradores, y se secaron bien los

alambres de los electrodos. Una vez finalizada la corrida se removió el exceso de sales

con agua de chorro. El revelado de las ß-lactamasas se realizó cubriendo el gel de pI,

una vez finalizada la corrida, con un “sobregel” con el sistema yodo-almidón, que

inicialmente es azul. Para diferenciar entre las bandas producidas por actividades de

Betalactamasas de espectro ampliado (BLEA) o Betalactamasas de espectro extendido

(BLEE), se realizaron revelados diferenciales suplementando el sobregel de agar yodo-

almidón con los siguientes antibióticos como substratos: Penicilina (0,1 mg/mL) +

Cefaloridina (1mg/mL), que revela actividades de BLEA Y BLEE, y Ceftazidima

(1mg/mL) + Ceftriaxona (1mg/mL), que revela actividad de BLEE. La presencia de una

banda con actividad de ß-lactamasa quedó de manifiesto como una zona de

decoloración del sobregel al ser hidrolizado el antibiótico incorporado a él (Galas y col.,

2004).

Para determinar la capacidad de diseminación de los genes de resistencia se

efectuó conjugación de las cepas en estudio hacia una cepa de Salmonella sensible a

los antibióticos probados. El ensayo se llevó a cabo entre las cepas Donantes (CD)

resistentes a betalactámicos, lactosa positivo y negativas para la producción de

hidrógeno sulfurado, y se conjugaron con una cepa de Salmonella receptoras (CR)

sensible a todos los betalactámicos, lactosa negativo y productora de hidrógeno

sulfurado. Este proceso se llevó a cabo según el siguiente protocolo (modificado de

Lorian, 1996):

45

1. Aislamiento y purificación de cepas Donantes y Receptoras en placas de agar Mc

Conkey.

2. Se inoculó 4mL de caldo LB con la cepa receptora y donante respectivamente a

37 °C de 18-20h.

3. Se prepararon las siguientes mezclas en tubos separados:

a. Mezcla Test: 0,250 mL de la célula receptora, 0,250 mL de la cepa donante

en 2 mL de caldo LB

b. Control célula receptora: 0,500 mL de la célula receptora en 2 mL de caldo.

c. Control célula donante: 0,500 mL de la célula donante en 2 mL de caldo.

4. Se filtró la mezcla a través de un filtro estéril de 0,45µm. El filtro permite la

formación de pares estables. Se colocaron los filtros en placas de agar Mueller-

Hinton y se incubaron a 37 °C durante 18-20h.

5. Se colocó el filtro en 3 mL de PBS estéril a pH 7.2 y se resuspendió por agitación

en un vortex.

6. Se inocularon placas de agar SS conteniendo el agente selectivo con 100 µL de

diluciones 10-1 y 10-2 de la mezcla y controles. Las placas contenían Cefotaxima

a una concentración de 30 µg/mL de concentración (al cual la cepa donante es

resistente).

7. Se incubaron las placas a 37 °C durante 24-48 horas.

46

8. Se seleccionaron las colonias lactosa negativa con producción de hidrógeno

sulfurado (Salmonellas transconjugantes).

9. Se realizaron pruebas de identificación bioquímica y determinación del perfil de

resistencia de la cepa transconjugante.

Para determinar si un gen de resistencia se encuentra presente en un integrón se

determinó la presencia de las enzimas tipo Integrasa de clases 1 mediante PCR con

el iniciador Int1 (Reyes y col., 2003). Una vez que se determinó cuales cepas

presentaban integrones de clase 1, se procedió a amplificar por PCR la región

variable de éstos, y posteriormente se amplificaron los genes detectados

previamente en estas cepas empleando como templado únicamente la región

variable del integrón correspondiente. Posteriormente se efectuó un mapa genético

de la región variable mediante PCR con combinaciones de los iniciadores Int, 5’CS,

3’CS y los iniciadores de los genes detectados; el tamaño del producto de

amplificación obtenido permitió discernir la posición relativa del gen en estudio con

respecto a las regiones conservadas del integrón y por ende su posición relativa

dentro del mismo. La mezcla de reacción empleada fue: Vol. final: 50 μl; Buffer ADN

Taq polimerasa: 1X; Primers: 50 pmoles de c/u.; ADN Taq polimerasa: 1 U; dNTPs:

25 μM de cada uno; ADN molde: 5 μl; MgCl2: 1,5 mM. El programa empleado en el

termociclador contempló un paso de desnaturalización inicial de 5 min. a 94ºC, y la

amplificación se llevó a cabo por 35 ciclos, con pasos de desnaturalización (30 seg. a

94ºC), alineación (30 seg a 55 ºC para TEM, CTX-M, y PER y a 59 ºC para SHV) y

extensión (1 minuto 30 seg. a 72 ºC), y un paso final de extensión de 10 min. a 72ºC

(Galas y col., 2004). Los productos finales de amplificación fueron detectados en

geles de agarosa al 1,2 %, teñidos con bromuro de etidio 0,5 μg/mL y se visualizaron

bajo luz ultravioleta mediante el equipo Gel Doc 2000 (Bio-Rad), empleando un

marcador de peso molecular de 100 pares de bases.

Para determinar si existía una relación estadísticamente significativa entre la

producción de betalactamasas de espectro expandido y la resistencia a quinolonas,

47

así como con los diferentes genotipos de BLEE y los mecanismos de resistencia a

quinolonas hallados en las cepas se empleó del programa SPSS 12.0, usando como

herramienta estadística el método de chi-cuadrado. Mediante esta prueba no

paramétrica se midió la discrepancia entre una distribución observada y otra teórica,

indicando en qué medida las diferencias existentes entre ambas, se deben al azar en

el contraste de hipótesis (nos permite determinar si existe una relación entr dos

variables categóricas). Es necesario resaltar que esta prueba nos indica si existe o

no una relación entre las variables, pero no indica el grado o el tipo de relación; es

decir, no indica el porentaje de influencia de una variable sobre la otra o la variable

que causa la influencia. De esta forma se pudo contrastar si las frecuencias

observadas en cada una de las clases de las variables categóricas establecidas

varían de forma significativa de las frecuencias que se esperaría encontrar si la

muestra hubiese sido extraída de una población con una determinada distribución de

frecuencias.

48

RESULTADOS

Estudio fenotípico y de susceptibilidad. Se recolectaron 50 aislados de Enterobacterias provenientes de los centros

asistenciales Hospital Universitario de Caracas, Hospital J. M. de los Ríos, Hospital Dr.

Ricardo Baquero, Centro Policlínico Valencia, Laboratorio Cesar Sánchez Font,

Policlínica Santiago de León, Hospital Central Antonio María Pineda e Instituto Nacional

de Higiene “Rafael Rangel” durante el período Enero - Junio 2006, los cuales

presentaban susceptibilidad disminuída a cefalosporinas. Se les realizó confirmación

bioquímica de Género y Especie obteniéndose 19 (38%) aislados de E. cloacae, 16

(32%) aislados de E. aerogenes, 7 (14%) aislados de E. coli; 6 (12%) aislados de K.

pneumoniae y 2 (4%) aislados de K. oxytoca (Figura 5).

Figura 6. Distribución de aislados de Enterobacterias en estudio

De las 50 cepas de Enterobacterias con susceptibilidad disminuida a

cefalosporinas aisladas de distintas fuentes biológicas, sólo 20 fueron confirmadas

fenotípicamente como productoras de BLEE, cumpliendo realmente con los criterios de

selección establecidos para esta investigación. Aun cuando se realizó la confirmación

bioquímica de género y especie y detección de BLEE a las 50 cepas muestreadas, sólo

N=50

49

aquellas cepas BLEE positivas fueron consideradas para continuar el estudio; en la

Figura 6 se muestran los resultados de susceptibilidad de estas últimas para

Quinolonas y Betalactámicos. Al observar estos resultados se puede apreciar, en el

caso de los betalactámicos, niveles equivalentes de resistencia para las cefalosporinas

de tercera generación y Aztreonam, con una porcentaje de resistencia mucho menor

para Cefepime, y en el caso de quinolonas se aprecia un mayor porcentaje de

resistencia para Acido Nalidíxico que para las fluoroquinolonas, las cuales presentan

niveles de resistencia similares entre sí.

Figura 7. Porcentajes de resistencia y sensibilidad de las cepas en estudio productoras de Betalactamasas de espectro expandido

En las Figura 7 y Figura 8 y se muestra la correspondencia de la susceptibilidad

entre Cefotaxima / Ciprofloxacina y Acido Nalidíxico / Cefotaxima, respectivamente. Al

realizar el análisis estadístico se determinó que existe una relación estadísticamente

significativa (p<0.05) entre la producción de Betalactamasas de Espectro Expandido y

la resistencia a cualquier quinolona; igualmente se encontró una relación

estadísticamente significativa (p<0,05) al comparar individualmente la producción de

BLEE y la resistencia a cada quinolona (Acido Nalidíxico, Ciprofloxacina, Levofloxacina

y Ofloxacina).

N=20

50

Figura 8. Correlación entre los resultados de susceptibilidad para Cefotaxima y Ciprofloxacina de las cepas en estudio

Figura 9. Correlación entre los resultados de susceptibilidad para Cefotaxima y Acido Nalidixico

de las cepas en estudio

N=20

N=20

51

En la Tabla 4 y la Figura 10 se pueden observar los perfiles de resistencia

individuales a betalactámicos de cada cepa BLEE positiva. Vale la pena destacar la

presencia de cepas con un típico perfil cefotaximasa, en las cuales se aprecia reducción

significativa tanto de los halos de Cefotaxima como de Cefepima, cepas con perfil

ceftazidimasa, donde hay una marcada reducción de Ceftazidima en comparación a

Cefotaxima y Cefepime, y cepas donde puede evidenciarse fenotípicamente la

presencia simultánea de varias betalactamasas, ya que se ven afectados de forma

similar los tres antibióticos.

Al observar la distribución poblacional de los halos para Cefotaxima y

Ceftazidima (Figura 9), se puede apreciar que en ambos casos, los valores obtenidos

en la mayoría de las cepas pertenecen a la categoría resistente, independientemente

de cual perfil de resistencia expresaron, y adicionalmente se observa una población

importante que presenta halos completamente cerrados (6 mm) para Ceftazidima.

Con respecto a las quinolonas, en la Tabla 5 se puede observar los perfiles de

resistencia a quinolonas y betalactámicos de las mismas cepas; en este caso se

pueden apreciar igualmente varios perfiles de resistencia marcados: alto nivel de

resistencia (halos de 6 mm para todas las quinolonas), nivel intermedio de resistencia

(halos disminuidos para todas las quinolonas), alto nivel de resistencia al Acido

nalidíxico con halos disminuidos para el resto de las quinolonas, y el perfil sensible

(halos amplios en todos los antibióticos).

Al analizar la distribución poblacional de Ciprofloxacina (Figura 9) se puede

observar claramente la presencia de tres poblaciones: un importante número de cepas

con halos completamente cerrados (6 mm) o valores de MIC muy elevados (≥32 µg/ml),

una población en la categoría intermedia (correspondería a los perfiles de nivel

intermedio de resistencia), y la población sensible; ejemplos de estos perfiles se pueden

observar en la figura 11.

52

Tabla 4. Perfil de Resistencia a Betalactámicos de cepas de Enterobacterias BLEE positivas seleccionadas para el estudio.

Cepa Género-

Especie

CTX

(mm)

CAZ

(mm)

FEP

(mm)

FOX

(mm)

230477 E. cloacae 6 6 23 6 229268 K. pneumoniae 6 17 13 26 230056 E. coli 6 11 14 13 227131 E. coli 16 6 20 22 226102 E. coli 6 20 12 23 225377 E. aerogenes 8 6 14 6 223274 E. cloacae 28 12 26 6 222515 K. pneumoniae 23 6 26 24 222308 K. pneumoniae 11 6 16 24 220664 K. pneumoniae 15 6 22 23 220624 K. pneumoniae 18 6 23 23 219712 K. oxytoca 14 14 26 15 220666 E. coli 10 9 27 17 220667 E cloacae 20 13 27 13 220663 E. cloacae 12 6 26 6 221297 E. coli 11 14 28 6 221302 E. coli 16 12 22 23 222211 K. oxytoca 22 6 28 28 222220 E. coli 13 6 20 23 222448 K. pneumoniae 18 6 24 22

CTX = Cefotaxima; CAZ = Ceftazidima; FEP = Cefepime; FOX = Cefoxitin

Tabla 5. Perfil de Resistencia a Quinolonas de cepas de Enterobacterias BLEE positivas seleccionadas para el estudio.

Cepa Género-Especie NA

(mm)

CIP

(mm)

CIP

(ug/ml)

OFL

(mm)

LEV

(mm)

230477 E. cloacae 26 32 0,023 27 30 229268 K. pneumoniae 6 6 >32 6 6 230056 E. coli 6 6 >32 6 9 227131 E. coli 6 6 >32 6 9 226102 E. coli 26 34 0,008 29 30 225377 E. aerogenes 10 18 1 12 16 223274 E. cloacae 16 25 0,19 23 25 222515 K. pneumoniae 6 16 1 14 17 222308 K. pneumoniae 6 6 4 6 6 220664 K. pneumoniae 6 6 >32 6 6 220624 K. pneumoniae 6 6 >32 6 6 219712 K. oxytoca 24 24 0,012 25 26 220666 E. coli 27 35 0,12 33 35 220667 E cloacae 16 25 0,19 21 22 220663 E. cloacae 26 34 0,008 29 30 221297 E. coli 6 19 0,75 16 19 221302 E. coli 27 35 0,006 30 35 222211 K. oxytoca 25 29 0,19 26 28 222220 E. coli 6 6 32 6 6 222448 K. pneumoniae 6 16 1 14 16

NA = Acido Nalidíxico; CIP = Ciprofloxacina; OFL = Ofloxacina; LEV = Levofloxacina

53

Figura 10. Distribución de halos obtenidos para betalactámicos y quinolonas en cepas BLEE positivas y evaluación de la Concentración Mínima Inhibitoria a Ciprofloxacina por la técnica de E-test.

Figura 11. Algunos perfiles fenotípicos de BLEE clásicas encontrados. Izquierda: E. coli 226102,

perfil BLEE tipo Cefotaximasa. Derecha: K. Pneumoniae 222515 Perfil BLEE tipo Ceftazidimasa.

54

Figura 12. Resultados de prueba de Concentración Inhibitoria Mínima a Ciprofloxacina por E-test. Izquierda: E. coli 226102. Cepa sensible (CIM = 0.008 µg/mL). Centro: E. aerogenes 225377. Nivel intermedio de resistencia a quinolonas (CIM = 1 µg/mL). Derecha: K. pneumoniae 226268. Alto nivel de resistencia a quinolonas (CIM ≥ 32 µg/mL)

Detección fenotípica de la producción de enzimas mediante el método de Hodge.

Simultáneamente se realizó la determinación de la naturaleza enzimática de la

resistencia a un antibiótico mediante la pruebas de Hodge para las 50 cepas, y se

compararon los resultados obtenidos con el método de difusión del disco para detección

y confirmación de BLEE propuesto por Jarlier y col., 1988.

Del total de cepas estudiadas, 20 (40%) dieron positivas a la detección fenotípica

de BLEE por el método de difusión del disco y el 60% negativas, mientras que por el

método Hodge para betalactámicos la positividad fue del 60% y la negatividad del 40%,

indicando la presencia de un 20% de cepas con betalactamasas no inhibibles por ácido

clavulánico. Los resultados positivos por el método Hodge dieron un 70,0% para

Cefotaxima y un 85,0% para Ceftazidima. Todas las cepas con resistencia a quinolonas

arrojaron un resultado negativo para el método de Hodge empleando Ciprofloxacina,

indicando la ausencia de enzimas que hidrolicen quinolonas. En la figura 12 se pueden

apreciar los resultados de esta prueba.

55

Figura 13. Prueba de Hodge de las cepas en estudio. Izquierda: Resultados positivos para Cefotaxima (CTX) y Ceftazidima (CAZ). Derecha: Resultados negativos para Ciprofloxacina.

De los 20 resultados positivos por el método de difusión del disco, 10 cepas

(50%) presentaron efecto de sinergia con ácido clavulánico con Cefotaxima; 5 con

Ceftazidima (25%) y 5 con ambos antibióticos (25%). En los resultados negativos del

método de difusión del disco, hubo un 66% de coincidencia con los resultados

negativos del método Hodge; esto nos confirma nuevamente que el mejor antibiótico

detector resultó ser la Cefotaxima, tal como se observa en la tabla 6. Se estableció que

hubo una asociación significativa (P < 0,05) entre los resultados obtenidos por ambos

métodos (Difusión del disco para detección de BLEE y Hodge).

Tabla 6. Resultados obtenidos al aplicar el método de Hodge comparado con el método de difusión del disco para detección de BLEE

RESULTADOS DE HODGE

RESULTADOS DE BLEE

DIFUSIÓN DEL DISCO

CEPAS N

NEGATIVO N

CTX N

CAZ N

CTX / CAZ N

POSITIVA 20 30 10 5 5 NEGATIVA 30 20 0 0 10

CTX = Cefotaxima; CAZ = Ceftazidima.

Determinación de Punto Isoeléctrico mediante ensayos de Isoelectroenfoque.

Los resultados del Punto Isoeléctrico de las cepas BLEE positivas se reflejan en

la Tabla 7, donde se puede observar que, de las veinte cepas que se les detectó β-

lactamasas de espectro expandido (BLEE) por los otros métodos fenotípicos, sólo 15

(75%) dieron resultado por isoelectroenfoque. Los valores de pI se determinaron por

56

comparación con extractos de β-lactamasas de pI conocidos provenientes de las mismas

cepas controles empleadas para la caracterización de genes de betalactamasas por

PCR, y dependiendo del sustrato que hidrolizaba la enzima (penicilina + cefaloridina del

lado derecho del gel o ceftazidima + ceftriaxona del lado izquierdo del mismo) se

clasificó la banda como BLEA o BLEE (Figura 13). Al observar los datos de pI de las

bandas BLEE se puede apreciar que los valores predominantes son 5.6 y 7.6,

correspondientes a BLEE tipo TEM y SHV, respectivamente; las bandas de pI 5.4

corresponderían a BLEE tipo PER-2 y las de 7.9 a CTX-M-2.

Tabla 7. Valores de pI obtenidos para las cepas en estudio.

Cepa Género-Especie pI

BLEA

pI

BLEE 230477 E. cloacae 5.4 229268 K. pneumoniae 7.6 5.4; 7.6; 7.9 230056 E. coli 5.4 227131 E. coli 5.4 5.4; 8.2 226102 E. coli 5.4 5.4; 7.9 225377 E. aerogenes 5.6; 7.9; 8.2 223274 E. cloacae 5.6 222515 K. pneumoniae 5.6 222308 K. pneumoniae 7.6 5.6; 7.6 220624 K. pneumoniae 7.6 5.6; 7.6 220663 E. cloacae 8.2 221302 E. coli 5.4 5.4; 8.2 222211 K. oxytoca 5.6; 8.2 222220 E. coli 5.4 5.4; 8.2 222448 K. pneumoniae 5.6; 7.6

Figura 14. Gel de isoelectroenfoque. Obsérvese en el lado izquierdo de la foto las bandas correspondientes a enzimas tipo BLEE y en la parte derecha las correspondientes a BLEA.

57

Los valores de pI obtenidos en este estudio sugieren la producción de β-

lactamasas tipo TEM, SHV, PER-2 y CTX-M-2. Estos resultados guardan similitud con

los obtenidos por García y colaboradores en el 2005, quienes realizaron la

caracterización molecular de aislamientos de Enterobacter cloacae multirresistentes

productores de β-lactamasas provenientes de pacientes de un hospital de tercer nivel de

Bogotá, encontrando que todos los aislamientos fueron productores de β-lactamasas con

puntos isoeléctricos que podrían corresponder a BLEE del tipo SHV y TEM, que son las

β-lactamasas más frecuentemente informadas en enterobacterias (García y col., 2005).

Ensayos de Conjugación

Se realizó ensayos de conjugación para determinar la capacidad de transferencia

de resistencia a betalactámicos a los 8 aislados positivos para la presencia de genes

BLEE y que mostraron la presencia de integrones, aumentando de esta manera la

probabilidad de su transferencia debido a la alta frecuencia con la cual se encuentran

los integrones dentro de plásmidos (Alvarez-Fernández y col., 2003).

Los resultados del presente estudio señalan que, entre los 8 aislados utilizados

como donantes, 4 aislados fueron capaces de transferir plásmidos (Tabla 8),

representando el 50% de los aislados estudiados. En la figura 15 se puede apreciar la

placa selectora empleada y la transferencia del fenotipo de resistencia a

betalactámicos.

Tabla 8. Ensayos de Conjugación en aislados de Enterobacterias BLEE positivas que presentaron integrones de clase 1

Donante Resultado de Conjugación

Cepa Donante

Cepa Receptora

229268 + K. pneumoniae Salmonella sp. INH 604834 230056 - E. coli Salmonella sp. INH 604834

227131 - E. coli Salmonella sp. INH 604834

226102 + E. coli Salmonella sp. INH 604834

225377 + E. aerogenes Salmonella sp. INH 604834

223274 - E. cloacae Salmonella sp. INH 604834

220624 + K. pneumoniae Salmonella sp. INH 604834

220667 - E. cloacae Salmonella sp. INH 604834

58

Figura 15. Ensayo de conjugación. Izquierda: Placa selectora con 30 µg/ml de Cefotaxima. Las

colonias con punto negro son las Salmonellas transconjugantes. Derecha: Antibiograma de cepa transconjugante. Obsérvese como se tranfirió la resistencia a Amoxicilina/Acido Clavulánico (AMC), Cefotaxima (CTX), Ceftazidima (CAZ) y Cefepime (FEP).

Estudio molecular La caracterización de los fenotipos de betalactamasas observados dio como

resultado la presencia de 11 cepas con genotipo SHV (5 de ellas presuntamente SHV

tipo BLEA), 11 cepas TEM (4 de ellas presuntamente TEM tipo BLEA), 6 cepas tipo

PER y 3 cepas tipo CTX-M del grupo 2; de éstas, 5 cepas presentaron más de un

genotipo BLEE simultáneamente (cepas 229268, 227131, 226102, 225377 y 221302).

En la Figura 15 se muestra el gel correspondiente a algunos de estos hallazgos.

Figura 16. Amplificación de genes TEM, CTX-M, SHV y gyrA de las cepas en estudio. 1: Control positivo TEM; 2: 227131; 3: Control positivo CTX-M; 4: 229268; 5: Control positivo SHV; 6: 227131; 7: Control positivo gyrA; 8: 227131; 9: 226102; 10: 220624; 11: Control negativo; 12: DNA ladder 100 pb

59

Al evaluar cada uno de los mecanismos enzimáticos detectados en relación al

género y especie de los aislados (Tabla 9), se observa que la betalactamasa tipo SHV

se presenta con mayor frecuencia en Klebsiella, mientras que la betalactamasa tipo

TEM se encontró en la misma proporción entre Klebsiella y E. coli; sin embargo, al

analizar estos datos, hay que tomar en cuenta la presencia de BLEAs tipo SHV-1

asociadas con Klebsiella pneumoniae y TEM-1 asociadas con E. coli. Al realizar el

análisis estadístico entre la resistencia a quinolonas y la presencia de cada uno de los

genes BLEE por separado (Quinolona R / TEM; Quinolona R / SHV; Quinolona R / CTX-

M-2; Quinolona R / PER-2) se determinó que no existe una relación estadísticamente

significativa (p>0,05).

Tabla 9. Resultados de amplificación de genes de betalactamasas.

Cepa Género-Especie TEM SHV CTX-M-2 PER 230477 E. cloacae - - - + 229268 K. pneumoniae - + + + 230056 E. coli - - - + 227131 E. coli + + - + 226102 E. coli + - + + 225377 E. aerogenes + + + - 223274 E. cloacae + - - - 222515 K. pneumoniae + - - - 222308 K. pneumoniae + + - - 220664 K. pneumoniae - + - - 220624 K. pneumoniae + + - - 219712 K. oxytoca - - - - 220666 E. coli - - - - 220667 E cloacae - - - - 220663 E. cloacae - + - - 221297 E. coli - - - - 221302 E. coli + + - + 222211 K. oxytoca + + - - 222220 E. coli + + - - 222448 K. pneumoniae + + - -

Al analizar la Tabla 10 se puede observar que no se encontraron qnr de los tipos

A y S, y se encontraron 4 cepas con genotipo QnrB y 3 con Aac(6’)ibcr; una de las

cepas presentó simultáneamente ambos genes (220667). Al realizar el análisis

estadístico se determinó que existe una relación estadísticamente significativa (p<0,05)

entre la producción de Betalactamasas de Espectro Expandido y la presencia de

60

mecanismos plasmídicos de resistencia a quinolonas; sin embargo, no se encontró una

relación estadísticamente significativa (p>0,05) entre la producción de BLEE y la

presencia de cada uno de los mecanismos plasmídicos encontrados por separado

(BLEE / Aac(6’)ibcr o BLEE / QnrB).

Tabla 10. Resultados de amplificación de genes codificantes para resistencia plasmídica a

quinolonas.

Cepa Género-

Especie QnrA QnrB QnrS Aac(6’)ibcr

230477 E. cloacae - - - - 229268 K. pneumoniae - - - - 230056 E. coli - - - + 227131 E. coli - - - - 226102 E. coli - - - - 225377 E. aerogenes - + - - 223274 E. cloacae - - - - 222515 K. pneumoniae - - - + 222308 K. pneumoniae - + - - 220664 K. pneumoniae - + - - 220624 K. pneumoniae - - - - 219712 K. oxytoca - - - + 220666 E. coli - - - - 220667 E cloacae - + - + 220663 E. cloacae - - - - 221297 E. coli - - - - 221302 E. coli - - - - 222211 K. oxytoca - - - - 222220 E. coli - - - - 222448 K. pneumoniae - - - -

Estudio de integrones De las 20 cepas analizadas, 8 mostraron la presencia de integrones clase 1

(Tabla 11). La mayoría de los integrones clase 1 se encontrarion en E. coli, y en menor

número en K. pneumoniae. En la Figura 16 se puede observar el gel donde se

evidencia la amplificación de las integrasas clase 1, el cual fue el parámetro empleado

para la detección de esta clase de integrones.

61

Tabla 11. Resultados de amplificación por PCR de genes de integrasa de clase 1.

Cepa Género-Especie Integron Clase 1 230477 E. cloacae - 229268 K. pneumoniae + 230056 E. coli + 227131 E. coli + 226102 E. coli + 225377 E. aerogenes + 223274 E. cloacae + 222515 K. pneumoniae - 222308 K. pneumoniae - 220664 K. pneumoniae - 220624 K. pneumoniae + 219712 K. oxytoca - 220666 E. coli - 220667 E cloacae + 220663 E. cloacae - 221297 E. coli - 221302 E. coli - 222211 K. oxytoca - 222220 E. coli - 222448 K. pneumoniae -

Figura 17. Amplificación de Integrasa clase 1 de las cepas en estudio. 1: DNA ladder 100 pb; 2: 230477; 3: 229268; 4: 230056; 5: 227131; 6: 226102; 7: 225377; 8: 223274; 9:220624; 10: 222515; 11: 220667; 12: Control positivo; 13: Control negativo.

Una vez que se determinó cuales cepas presentaban integrones de clase 1, se

procedió a amplificar por PCR la región variable de éstos (cepas 229268, 230056,

227131, 226102, 225377 y 223274), y posteriormente se amplificaron los genes

detectados previamente en estas cepas empleando como templado únicamente la

región variable del integrón correspondiente. Los resultados de ambas amplificaciones

62

se muestran en la Tabla 12. Obsérvese que en todos los casos se encontró un integrón

único en cada cepa, con un peso igual o mayor a 1000 pares de bases; también es

importante el hecho de que en la mayoría de estos integrones se encontró más de un

gen de resistencia.

Tabla 12. Resultados de amplificación de la región variable de integrones clase 1.

Cepa Género-Especie

Tamaño

de la

región

variable

Genes amplificados

en la región variable

229268 K. pneumoniae 1000 CTXM-2 230056 E. coli 1500 PER, Aac(6')ib-cr 227131 E. coli 1200 TEM, SHV 226102 E. coli 1500 CTXM-2, TEM 225377 E. aerogenes 1000 TEM, QnrB 223274 E. cloacae 1000 TEM

El mapeo de los genes de resistencia en los integrones con los distintos juegos

de iniciadores permitió estimar la posición relativa de cada gen de resistencia en su

respectivo integrón (Levesque y col., 1995). En la Tabla 13 se muestran los tamaños de

los fragmentos obtenidos para cada combinación de iniciadores, y en la Figura 17 se

plantea la estructura teórica propuesta de la región variable de estos integrones,

basada en los tamaños de estos fragmentos.

Tabla 13. Tamaño de amplicones obtenidos durante el mapeo de integrones clase 1 con distintas combinaciones de iniciadores.

Par de Iniciadores 229268 230056 227131 226102 225377 223274

5'CS / TEM R 552 pb 1352 pb 502 pb 800 pb

3'CS / TEM F 1150 pb 650 pb 1000 pb 702 pb

5'CS / CTXM R 850 pb 850 pb

3'CS / CTXM F 1000 pb 1500 pb

5'CS / PER R 750 pb

3'CS / PER F 1500 pb

5'CS / SHV R 1172 pb

3'CS / SHV F 648 pb

5'CS / QnrB R 972 pb

3'CS / QnrB F 498 pb

5'CS / Aac(6’)ib-cr R 1230 pb

3'CS / Aac(6’)ib-cr F 750 pb

63

Figura 18. Estructura teórica propuesta de la región variable de integrones encontrados en las cepas en estudio.

Secuenciación

Se secuenciaron los productos de amplificación de gyrA de aquellas cepas que

presentaron resistencia a quinolonas, se compararon las secuencias obtenidas con

secuencias de cepas con mutaciones conocidas en gyrA (Números de acceso

Genebank EU430280 a EU430289) y con la de una cepa susceptible patrón K.

pneumoniae ATCC 13883 (Número de acceso Genebank DQ673325) empleando el

programa BLAST de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos, y se

dedujeron las secuencias de aminoácidos de las regiones mutadas (Fu y col.2008). En

la Tabla 14 se presentan las variaciones de aminoácidos deducidas respecto a la

secuencia tipo, encontrándose en la mayoría de las cepas mutaciones codificantes para

el aminoácido 83, observándose que el 15% de las cepas BLEE presentaron un cambio

de serina a leucina y el 35% de serina a isoleucina. Al realizar el análisis estadístico se

determinó que existe una relación estadísticamente significativa (p<0,05) entre la

producción de Betalactamasas de Espectro Expandido y la presencia de mecanismos

cromosomales de resistencia a quinolonas.

64

Tabla 14. Detección de mutaciones en gyrA

Cepa Género-Especie Ser83 a Leu Ser83 a Ile 229268 K. pneumoniae - + 230056 E. coli - + 227131 E. coli - + 225377 E. aerogenes - -

222515 K. pneumoniae + - 222308 K. pneumoniae - + 220664 K. pneumoniae - + 220624 K. pneumoniae - + 219712 K. oxytoca - -

220667 E cloacae - -

221297 E. coli + - 222220 E. coli - + 222448 K. pneumoniae + -

En la Tabla 15 se pueden apreciar las variantes TEM y SHV encontradas en este

estudio, las cuales fueron caracterizadas al comparar su producto de secuenciación con

la base de datos Genebank empleando el programa BLAST de los Institutos Nacionales

de Salud de los Estados Unidos; vale la pena destacar la presencia del genotipo TEM-

1, codificante para una BLEA, en varias cepas de E. coli, así como SHV-1 en K.

pneumoniae. Obsérvese que la BLEE tipo SHV predominante fue la SHV-5, y en el

caso de TEM la TEM-150 (Figura 18).

Tabla 15. Variantes de TEM y SHV encontradas en el estudio.

Cepa Género-Especie TEM SHV

229268 K. pneumoniae SHV-1 227131 E. coli TEM-1 SHV-5 226102 E. coli TEM-1 225377 E. aerogenes TEM-150 SHV-5 223274 E. cloacae TEM-150 222515 K. pneumoniae TEM-150 222308 K. pneumoniae TEM-150 SHV-1 220664 K. pneumoniae SHV-1 220624 K. pneumoniae TEM-150 SHV-1 220663 E. cloacae SHV-5 221302 E. coli TEM-150 SHV-5 222211 K. oxytoca TEM-150 SHV-5 222220 E. coli TEM-1 SHV-5 222448 K. pneumoniae TEM-150 SHV-1

65

Figura 19. Electroferograma de TEM-150

66

DISCUSIÓN

Los antibióticos betalactámicos son las drogas más usadas para el tratamiento

de infecciones bacterianas tanto a nivel de la comunidad como hospitalario (Walsh,

2003). El amplio espectro, la baja toxicidad y la actividad fuertemente bactericida sobre

la mayoría de los microorganismos son algunas de las causas de su amplia utilización;

sin embargo, prácticamente todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae se

caracterizan por poseer mecanismos enzimáticos naturales de resistencia a los

antibióticos betalactámicos, que les confieren a las enterobacterias fenotipos

particulares que en muchos casos son útiles como ayuda de identificación, y

adicionalmente, como resultado de la captación de los elementos de ADN móviles

(plásmidos, transposones, etc.) o a través de mutaciones cromosómicas, se han

presentado microorganismos multirresistentes.a esta familia (Pfaller y col., 2000). Con

respecto a las Quinolonas, éstas han sido usadas desde hace años para el tratamiento

de infecciones bacterianas, teniendo una utilidad clínica muy extensa, lo que se basa en

su efecto bactericida, su amplio espectro de actividad, buena absorción por vía

digestiva, amplia distribución en los tejidos, prolongada vida media y prolongado efecto

postantibiótico, de lo que resultan planes terapéuticos eficaces y cómodos (Errecalde,

2004); sin embargo, al igual que con los betalactámicos, en los últimos años se ha visto

una emergencia importante de cepas resistentes a estos antibióticos (Walsh, 2003), lo

que se traduce en fallo terapéutico.

Al realizar la identificación de las cepas con susceptibilidad disminuida a

cefalosporinas, llama la atención que las dos especies encontradas con mayor

frecuencia fueron Enterobacter cloacae y Enterobacter aerogenes, en vista de que, aun

cuando este género puede presentar Betalactamasas de Espectro Expandido,

tradicionalmente es Escherichia coli la descrita como la que presenta BLEE con mayor

frecuencia (Diestra y col., 2009). Sin embargo, al realizar la detección de BLEE a las

cepas que conformaron la muestra, se pudo apreciar que la mayoría (aun cuando no

todas) las cepas correspondientes al género Enterobacter fueron BLEE negativas, por

67

lo cual se podría explicar la disminución de la susceptibilidad a las cefalosporinas en

estas cepas por otro tipo de betalactamasas, como por ejemplo AmpC derreprimido o

cefalosporinasas no inhibibles por ácido clavulánico (Bush y Jacoby, 2010). Una vez

excluidas aquellas cepas BLEE negativas, se observó que Escherichia coli fue la

principal representante en el estudio, lo cual es compatible con la alta frecuencia con la

que se encuentran tradicionalmente este tipo de genes de resistencia en esta especie

(Diestra y col., 2009), y en segundo lugar se encuentra Klebsiella pneumoniae como

productor de BLEE, la cual también es considerada como una de las principales

productoras de este tipo de enzimas (Perozo y Castellano, 2009), hasta el punto que

hasta el año 2004 el manual de la CLSI recomendaba realizar el tamizaje de BLEE solo

para estos dos géneros de bacterias.

Al observar los resultados de las pruebas de susceptibilidad de las cepas BLEE

positivas, se puede apreciar un porcentaje alto (entre el 40 y el 60%, según el

antibiótico) de resistencia a quinolonas, en virtud de que las BLEE no afectan a las

quinolonas, y el mecanismo de resistencia de estas últimas es principalmente

cromosomal. La resistencia de las Enterobacterias a la Ciprofloxacina ha aumentado

aproximadamente en un 17% entre los años 2000 y 2008 según los datos

proporcionados por el Programa Venezolano de Vigilancia de la Resistencia Bacteriana

a los Antimicrobianos (PROVENRA). En este Estudio se observó una alta tasa de cepas

resistentes a las Quinolonas, siendo el Ácido Nalidíxico el representante que mayor

resistencia presentó en las pruebas de susceptibilidad. El análisis estadístico verificó la

presencia de una relación estadísticamente significativa (p<0.05) entre la producción de

BLEE y la resistencia a cualquier quinolona, así como entre la producción de BLEE y la

resistencia a cada quinolona individual, lo cual demuestra que debe existir alguna

asociación a nivel molecular entre los mecanismos que confieren resistencia a ambas

familias de antibióticos. Otro punto importante respecto a la susceptibilidad a las

quinolonas es la presencia de varios perfiles de resistencia varios perfiles de resistencia

marcados con poblaciones distintivas respecto a los halos de susceptibilidad y valores

de CIM para Ciprofloxacina, lo cual evidencia que la resistencia a esta familia de

antibióticos esta determinada por diferentes mecanismos moleculares en estas cepas.

68

En lo que respecta a los niveles de resistencia a los betalactámicos, se

encuentran niveles equivalentes de resistencia para las cefalosporinas de tercera

generación y Aztreonam, y niveles de resistencia menores para Cefepime. Este

hallazgo a primera vista pareciera demostrar la presencia de un genotipo de resistencia

que afectara de forma homogénea a Cefotaxima, Ceftazidima y Aztreonam,

hidrolizando de forma pobre a Cefepime; sin embargo, al analizar los perfiles de forma

individual por cepa, se encontraron perfiles tipo Ceftazidimasa, perfiles tipo

Cefotaximasa y perfiles de alto nivel de hidrólisis para ambas cefalosporinas. La

discrepancia entre el nivel de resistencia encontrado a Cefepime y a las otras

cefalosporinas podría ser explicado en parte por la baja eficiencia de ciertas enzimas

BLEE (como por ejemplo algunas variantes SHV y TEM) para hidrolizar este antibiótico

(Biedenbach y col., 1999), y en parte por el cambio en los lineamientos de reporte de

Betalactámicos para las cepas BLEE efectuado por la CLSI en el año 2010, ya que que

aun cuando varían los puntos de corte para Cefotaxime, Ceftazidime y Aztreonam,

mantienen los mismos puntos para el resto de los Betalactámicos (entre ellos Cefepime)

y recomiendan no hacer cambios de interpretación (CLSI M100-S20, 2010), lo cual

resulta en discrepancias en el reporte de betalactámicos como Cefepime en cepas

BLEE positivas.

La gran variabilidad observada en los perfiles fenotípicos obtenidos en el trabajo

puede ser debida a que la afinidad de hidrólisis por los antibióticos es diferente para

cada enzima betalactamasa, inclusive pueden observarse variaciones en el perfil

fenotípico dentro de subvariedades o subtipos de la misma enzima; esto se debe

principalmente a que microorganismos no relacionados genotípicamente pueden

producir la misma BLEE mediante transferencia plasmídica, y la misma BLEE puede ser

mediada por plásmidos distintos (Garza-Ramos y col., 2007).

Con respecto a la prueba de Hodge, se observa que todas las cepas

determinadas como BLEE positivas presentaron un resultado positivo empleando una

cefalosporina de tercera generación, y algunas de las cepas BLEE negativas (excluidas

del estudio) también presentaron una reacción positiva; esto es debido a que la prueba

de Hodge sólo permite determinar la presencia de una enzima que hidrolice el

69

antibiótico que se está evaluando, pero no es capaz de discriminar la naturaleza de esa

enzima (BLEE, AmpC u otro tipo de enzima). También es importante destacar que el

resultado negativo de la prueba de Hodge para Ciprofloxacina en todas las cepas es

debido a que las cepas no presentaron ningún mecanismo que hidrolizara esta familia

de antibióticos, sino que le conferían resistencia por otros mecanimos (Sandra y col.,

2009). Tradicionalmente la resistencia a las Quinolonas era debida a mutaciones en los

genes que codifican la ADN girasa y la Topoisomerasa IV dando lugar a las QRDR (del

inglés “Quinolone Resistance-Determining Region (Hata y col., 2005). Recientemente,

se han descrito mecanismos de resistencia plasmídicos a las Quinolonas (Wang y col.,

2004) que involucran la síntesis de proteínas protectoras de las dianas y enzimas

modificadoras de Quinolonas.

Respecto al Isoelectroenfoque (IEF), esta técnica permite conocer el punto

isoelectrico (pI) de las proteínas y fue un método de gran utilidad cuando existían pocas

BLEE descritas. En la actualidad, se utiliza poco debido a la descripción de diferentes

BLEE que comparten idéntico pI. Sin embargo, es muy útil si se combina con el análisis

del fenotipo de sensibilidad ya que puede orientar el tipo de BLEE para un análisis

posterior del perfil de substrato o estudio molecular. Las BLEE de tipo TEM descritas

hasta el momento tienen valores de pI que oscilan entre 5,4 y 6,4, las de tipo SHV entre

7,0 y 8,2 y las CTX-M entre 7,6 y 9,0. El perfil de sustrato es imprescindible para la

caracterización final de las BLEE (Oliver y Cantón, 2008).

Al observar los pI de las bandas BLEE obtenidas se puede apreciar que los

valores predominantes son 5.6 y 7.6, sugerentes de BLEE tipo TEM y SHV,

respectivamente; las bandas de pI 5.4 sugieren a BLEE tipo PER-2 y las de 7.9 a CTX-

M-2. Tomando en cuenta los resultados obtenidos en esta investigación, se puede

observar que la detección del Punto Isoeléctrico es una técnica sensible más no

específica, ya que muchas enzimas pueden tener el mismo punto isoeléctrico y esto

dificulta su clasificación y ubicación. Por lo tanto esta es una técnica que se puede

emplear como auxiliar o prueba piloto para tener una idea previa de cuales pueden ser

las enzimas que están presentes y de esta manera escoger los iniciadores que van a

ser usados para realizar la detección molecular. También es importante resaltar que la

70

detección del pI permite una comparación visual de los patrones de bandas de

diferentes enzimas, y que al ser una comparación visual, la lectura de las bandas puede

llevar implícito la subjetividad del observador.

Respecto a los ensayos de conjugación, se seleccionaron aquellas cepas

positivas para la presencia de genes BLEE y que mostraron la presencia de integrones,

aumentando de esta manera la probabilidad de su transferencia debido a la alta

frecuencia con la cual se encuentran los integrones dentro de plásmidos (Alvarez-

Fernández y col., 2003), sin embargo, se obtuvo transferencia del fenotipo de

resistencia sólo en la mitad de las cepas ensayadas; esto puede ser debido a

diferencias en las características de los plásmidos en los cuales se sospecha se

presentaban estos integrones (por ejemplo, plásmidos no conjugativos) o que

simplemente en esas cepas los integrones no se encontraran en plásmidos (Garza-

Ramos y col., 2007). Por otro lado, en las cepas en las que se obtuvo transferencia del

fenotipo de resistencia por conjugación se demostró la presencia de los genes

codificantes para BLEE en elementos genéticos transferibles.

En los ensayos moleculares se observa mediante la amplificación por PCR la

presencia de los genotipos SHV, TEM, PER y CTX-M del grupo 2, e incluso la presencia

de varios genotipos en la misma cepa; sin embargo, en el caso de SHV y TEM, hay que

tomar en cuenta la presencia de BLEAs en las cepas de K. pneumoniae y E. coli,

respectivamente. Para poder discriminar en estos casos las BLEA SHV y TEM de las

BLEE, deben interpretarse los resultados de IEF y secuenciación de dichas cepas. Al

realizar el análisis estadístico entre la resistencia a quinolonas y la presencia de cada

uno de los genes BLEE por separado (Quinolona R / TEM; Quinolona R / SHV;

Quinolona R / CTX-M-2; Quinolona R / PER-2) se determinó que no existe una relación

estadísticamente significativa (p>0,05).

En lo que respecta a la determinación de genes plasmídicos de resistencia a

quinolonas, se logró observar no solo la presencia individual del gen qnrB y aac(6’)Ib-cr

en el 20% de las cepas, sino que también se obtuvieron aislados con 2 mecanismos

plasmídicos (cepa 220667); además, se pudo observar que el género en el que se

71

presentaron con mayor frecuencia estos mecanismos fue Klebsiella sp (20%). Estudios

realizados en China indicaron, al igual que la presente investigación, que la prevalencia

de proteínas Qnr es más alta en aislados de K. pneumoniae que en otras

enterobacterias (Jiang y col., 2008), y se ha descrito que estos genes se transmiten de

forma conjunta, en la mayoría de los casos, con genes de resistencia codificantes para

BLEE (Pitout y col., 2008; Rodríguez-Martínez y col., 2008; Bouchakour y col., 2010). A

diferencia de investigaciones realizadas en Brasil, en donde solo se logró encontrar 6

aislados con determinantes tipo qnrB (Minarini y col., 2008) en Venezuela se comprobó

adicionalmente la presencia del determinante aac(6’)Ib-cr; pero al igual que el

mencionado estudio, no se lograron encontrar aislados que presentaran qnrA, a

diferencia de países como Canadá, China y Francia, en donde la mayor prevalencia la

tiene qnrA (Nordmann y Poirel, 2005). Cabe destacar que, de todas la aac (6’) descritas

la aac (6’)-Ib es la más prevalente entre los diversos microorganismos Gram negativos.

El gen de la aac (6’)-Ib se ha detectado en transposones e integrones. Es razonable

pensar que la ubicación del gen que codifica para la aac (6’)-Ib en elementos

genéticos móviles ha facilitado su rápida difusión entre una amplia gama de

microorganismos (Vakulenko y Mobashery, 2003), y a finales del año 2005 se publicó la

aac (6’)-Ib-cr, capaz de afectar la actividad de ciprofloxacina mediante la N-acetilación

del nitrógeno del grupo piperazinil. El gen de esta enzima se ha localizado en

plásmidos al igual que qnrA, y confiere bajo nivel de resistencia a quinolonas

(Rodríguez, 2006).

Al realizar el análisis estadístico se determinó que existe una relación

estadísticamente significativa (p<0,05) entre la producción de Betalactamasas de

Espectro Expandido y la presencia de mecanismos plasmídicos de resistencia a

quinolonas; sin embargo, no se encontró una relación estadísticamente significativa

(p>0,05) entre la producción de BLEE y la presencia de cada uno de los mecanismos

plasmídicos de resistencia a quinolonas encontrados por separado. Esto puede ser

debido a la presencia habitual de cassettes de resistencia plasmídica a quinolonas en

los mismos integrones y/o plásmidos que presentan genes codificantes para BLEE ya

que le proporciona una ventaja adicional para la supervivencia de la bacteria en

ambientes con alta concentración de antibióticos como lo son los pacientes

72

hospitalizados, pero sin embargo sólo pareciera estar asociada la presencia de ambos

tipos de resistencia transferible pero sin existir asociación con un genotipo específico.

Al estudiar los integrones, la amplificación del gen de integrasa clase 1 permitió

demostrar la presencia de estos elementos en 8 de las 20 cepas (40%), lo cual

representa un porcentaje importante. La amplificación de la región variable de los

integrones y la subsecuente amplificación de los genes de resistencia previamente

detectados en estas cepas empleando como templado únicamente la región variable

del integrón correspondiente permitió, por un lado, determinar en todos los casos la

presencia de un integrón único en cada cepa, con regiones variables con pesos de

1000, 1200 o 1500 pb, lo cual es consistente con reportes previos donde demuestran

que las regiones variables de integrones clase 1 encontrados con mayor frecuencia en

enterobacterias presentan pesos de 800, 1000 y 500 pares de bases (Fernández y col.,

2003), y por otro lado demostró que, en aquellas cepas que presentaron estos

integrones, los genes codificantes para BLEE y/o resistencia plasmídica a quinolonas

detectados se encontraban en estos elementos transferibles.

El mapeo de los genes de resistencia en los integrones con los distintos juegos

de iniciadores permitió estimar la posición relativa de cada gen de resistencia en su

respectivo integrón, y en base al tamaño de los amplicones obtenidos se propuso la

estructura teórica de la región variable de los mismos (Levesque y col., 1995). Un

hallazgo importante es que se propone, en algunos casos, la presencia de múltiples

cassettes de resistencia en el mismo integrón, existiendo algunos casos donde

coexistirían un gen BLEE y uno de resistencia plasmídica a quinolonas, lo cual

explicaría la relación estadística encontrada entre estos mecanismos de resistencia.

Los resultados de secuenciación de los productos de amplificación de SHV y

TEM permitió determinar la presencia del genotipo TEM-1, codificante para una BLEA,

en varias cepas de E. coli, así como SHV-1 en K. pneumoniae, verificando así los

resultados obtenidos por IEF. Con respecto a los genotipos BLEE encontrados, la

BLEE tipo SHV predominante fue la SHV-5, y en el caso de TEM la TEM-150. Los

resultados de la secuenciación de los productos de amplificación de gyrA de aquellas

73

cepas que presentaron resistencia a quinolonas, se compararon con las secuencias

patrones conocidas y se dedujeron las secuencias de aminoácidos de las regiones

mutadas, encontrándose en la mayoría de las cepas mutaciones codificantes para el

aminoácidos 83, el cual (serina) fue sustituído en algunos casos por leucina y otros por

isoleucina; cabe destacar que la CIM para Ciprofloxacina aumentó más en las cepas

donde la serina fue sustituída por isoleucina que en las que se sustituyó por leucina, lo

cual coincide con lo determinado por otros autores (Morgan-Linnell y Zechiedrich, 2007;

Fu y col., 2008). Al realizar el análisis estadístico se determinó que existe una relación

estadísticamente significativa (p<0.05) entre la producción de Betalactamasas de

Espectro Expandido y la presencia de mecanismos cromosomales de resistencia a

quinolonas, tal como se ha descrito previamente (Lagacé-Wiens y col., 2007). Esta

asociación podría ser explicada por el desarrollo de mutaciones que confieren alto nivel

de resistencia a quinolonas bajo presión selectiva debido al incremento de la

concentración de prevención de mutantes por algún elemento presente en el plásmido

en el cual se encuentra el gen codificante para la BLEE, o por otro lado pudiera deberse

a que las cepas con mutaciones que confieren alto nivel de resistencia a quinolonas

presenten alguna característica que permita captar de forma más eficiente los

plásmidos con BLEE bajo presión selectiva con respecto a otras células bacterianas.

74

CONCLUSIONES

- Escherichia coli fue la principal representante en el estudio, lo cual es compatible

con la alta frecuencia con la que se encuentran tradicionalmente este tipo de

genes de resistencia en esta especie, y en segundo lugar se encuentra Klebsiella

pneumoniae.

- Se puede apreciar un porcentaje alto de resistencia a quinolonas.

- El análisis estadístico verificó la presencia de una relación estadísticamente

significativa (p<0,05) entre la producción de BLEE y la resistencia a cualquier

quinolona, así como entre la producción de BLEE y la resistencia a cada

quinolona individual, lo cual demuestra que debe existir alguna asociación a nivel

molecular entre los mecanismos que confieren resistencia a ambas familias de

antibióticos.

- Se encontraron niveles equivalentes de resistencia para las cefalosporinas de

tercera generación y Aztreonam, y niveles de resistencia menores para

Cefepima, discrepancia que podría ser explicada por la diferencia en la eficiencia

de ciertas enzimas BLEE respecto a estos antibióticos y al cambio en los

lineamientos de reporte de Betalactámicos para las cepas BLEE efectuado por la

CLSI en el año 2010.

- Con respecto a la prueba de Hodge, se concluye que todas las cepas

determinadas como BLEE positivas presentaron un resultado positivo empleando

una cefalosporina de tercera generación, y el resultado negativo de esta prueba

para Ciprofloxacina en todas las cepas es debido a que no presentaron ningún

mecanismo que hidrolizara quinolonas.

75

- La detección del Punto Isoeléctrico es una técnica sensible más no específica, ya

que muchas enzimas pueden tener el mismo punto isoeléctrico y esto dificulta su

clasificación y ubicación.

- En las cepas en las que se obtuvo transferencia del fenotipo de resistencia por

conjugación se demostró la presencia de los genes codificantes para BLEE en

elementos genéticos transferibles.

- Se detectó la presencia de los genotipos SHV, TEM, PER y CTX-M del grupo 2, y

se determinó que no existe una relación estadísticamente significativa entre la

resistencia a quinolonas y la presencia de cada uno de los genes BLEE por

separado (p>0.05).

- Respecto a la determinación de genes plasmídicos de resistencia a quinolonas,

se logró observar no solo la presencia individual del gen qnrB y aac(6’)Ib-cr, sino

que también se obtuvieron aislados con 2 mecanismos plasmídicos.

- Al realizar el análisis estadístico se determinó que existe una relación

estadísticamente significativa (p<0.05) entre la producción de Betalactamasas de

Espectro Expandido y la presencia de mecanismos plasmídicos de resistencia a

quinolonas; sin embargo, no se encontró una relación estadísticamente

significativa (p>0.05) entre la producción de BLEE y la presencia de cada uno de

los mecanismos plasmídicos de resistencia a quinolonas encontrados por

separado.

- Se demostró la presencia de integrones de clase 1 en las cepas en estudio y la

presencia de genes codificantes para BLEE y/o resistencia plasmídica a

quinolonas en estos elementos transferibles.

- Se propone, en algunos casos, la presencia de múltiples cassettes de resistencia

en el mismo integrón, existiendo algunos casos donde coexistirían un gen BLEE

76

y uno de resistencia plasmídica a quinolonas, lo cual explicaría la relación

estadística encontrada entre estos mecanismos de resistencia.

- Los resultados de secuenciación de los productos de amplificación de SHV y

TEM permitió determinar la presencia del genotipo TEM-1, codificante para una

BLEA, en varias cepas de E. coli, así como SHV-1 en K. pneumoniae, verificando

así los resultados obtenidos por IEF. La BLEE tipo SHV predominante fue la

SHV-5, y en el caso de TEM la TEM-150.

- Se encontró en la mayoría de las cepas mutaciones en gyrA codificantes para el

aminoácidos 83, el cual (serina) fue sustituído en algunos casos por leucina y

otros por isoleucina; cabe destacar que la CIM para Ciprofloxacina aumentó más

en las cepas donde la serina fue sustituída por isoleucina que en las que se

sustituyó por leucina, lo cual coincide con lo determinado por otros autores

- Al realizar el análisis estadístico se determinó que existe una relación

estadísticamente significativa (p<0,05) entre la producción de Betalactamasas de

Espectro Expandido y la presencia de mecanismos cromosomales de resistencia

a quinolonas.

- La asociación encontrada entre los mecanismos de resistencia a betalactámicos

y quinolonas refleja la necesidad de explorar otras alternativas terapéuticas para

el tratamiento de cepas en el cual se le detecte alguno de estos mecanismos de

resistencia.

77

RECOMENDACIONES

- Ampliar el estudio a otras áreas geográficas del país para establecer una

comparación entre los mecanismos de resistencia observados en Caracas con

otras ciudades.

- Establecer por centro la participación del personal del laboratorio de

microbiología para seguir realizando estudios en esta área para mantener una

evaluación continua sobre la situación de cada uno de estos mecanismos de

resistencia en nuestro país.

- Se recomienda continuar trabajos de vigilancia epidemiológica, en los que se

pueda realizar un seguimiento al comportamiento de la resistencia bacteriana a

betalactámicos en los diferentes centros de Caracas, para así establecer

medidas de prevención de propagación de dichos mecanismos.

- Se invita a realizar un trabajo que incluya a otros miembros del área de la salud

como los médicos, para establecer una relación entre los patrones de resistencia

observados en cada centro y la antibioterapia utilizada en los mismos, y así

establecer medidas de control y prevención para reducir el desarrollo y

propagación de nuevas resistencias.

78

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Alós J. 2009. Quinolonas. Enferm Infec Microbiol Clin; 27(5): 290-297.

Alvarez-Fernández M.; Rodríguez-Sousa T.; Brey-Fernández E.; López-

Meléndez C.; Piñeiro L. 2003. Asociación entre Integrones de clase con

Resistencia a multiples antimicrobianos y plásmidos conjugativos en

Enterobacteriaceae. Rev. Esp. Quimioterap. 16(4):394-397.

Ambler, R. 1980. The structure of b-lactamases. Philos. Trans. R. Soc. Lond. (Biol.)

289:321–331.

Arlet G.; Philippon A. 1991. Construction by polymerase chain reaction and use of

intragenic DNA probes for three main types of transferable beta-lactamases (TEM,

SHV, CARB). FEMS Microbiol Lett. 15; 66(1):19–25.

Biedenbach D.; Johnson D.; Jones R. In vitro evaluation of cefepime and other

broad-spectrum beta-lactams in eight medical centers in Thailand. 1999. The

Thailand Antimicrobial Resistance Study Group. Diagn Microbiol Infect Dis; 35: 325-

331.

Bouchakour M.; Zerouali K.; Perrier J.; Claude G.; Amarouch H.; El Mdaghri N.;

Courvalin P.; Timinouni M. 2010. Plasmid-mediated quinolone resistance in

expanded spectrum beta lactamase producing enterobacteriaceae in Morocco. J

Infect Dev Ctries; 4(12):799-803.

Branger C.; Zamfir O.; Geoffroy S.; Laurans G.; Arlet G.; Thien H.; Gouriou S.;

Picard B.; Denamur E. 2005. Genetic background of Escherichia coli and Extended-

Spectrum Beta-Lactamase Type. Emerg Infect Dis. 11 (1): 54-61.

Bush K.; Jacoby G. 2010. Updated functional classification of β-lactamases.

Antimicrob Agents Chemother; 54:969-76.

79

Cattoir V.; Poirel L.; Rotimi V.; Soussy C.; Nordmann P. 2007. Multiplex PCR for

detection of plasmid-mediated quinolone resistance qnr genes in ESBL-producing

enterobacterial isolate. J Antimicrob Chemother; 60:394-397.

Cavaco L.; Korsgaard H.; Sorensen G.; Aarestrup F. 2008. Plasmid-mediated

quinolone resistance due to qnrB5 and qnrS1 genes in Salmonella enterica serovars

Newport, Hadar and Saintpaul isolated from Turkey meat in Denmark. J Antimicrob

Chemother 62(3): 632-634.

Chen Y.; Shu H.; Li L.; Liao T.; Wu K.; Shiau Y. 2006. Complete Nucleotide

Sequence of pk245, a 98-Kilobase Plasmid Conferring Quinolone Resistance and

Extended-Spectrum β-lactamase Activity in a Clinical Klebsiella pneumoniae isolate.

Antimicrob Agents Chemother 50(11): 3861-3866.

Clinical and Laboratory Standards Institute. 2010. Performance Standards for

Antimicrobial Susceptibility Testing. Documento M100-S20.

Comegna M.; Guzmán M.; Carmona O.; Molina M.; Grupo colaborativo del

Grupo Venezolano de Resistencia Bacteriana. 2000. Resistencia bacteriana a los

antimicrobianos en Venezuela-Nuevos hallazgos. Boletín SVM 20(1): 58-63

Diestra K.; Juan C.; Curiao T.; Moyá B.; Miró E.; Oteo J.; Coque T.; Pérez-

Vázquez M.; Campos J.; Cantón R.; Oliver A.; Navarro F.; Red Española de

Investigación en Patología Infecciosa. 2009. Characterization of plasmids

encoding blaESBL and surrounding genes in Spanish clinical isolates of Escherichia

coli and Klebsiella pneumoniae. J Antimicrob Chemother.63(1):60-6

Doyle, K. 1996. The source for discovery: protocols and applications guide. Catálogo

Promega Biologicals Research Products.

Drlica K. 1999. Mechanism of fluoroquinolone action. Curr Opin Microbio; 2: 504-

508.

80

Errecalde J. 2004. Uso de Antimicrobianos en Animales de consumo: Incidencia del

desarrollo de resistencias en Salud Pública. Estudios FAO Producción y Sanidad

Animal, p71.

Fernández A., Sousa R., Fernández B., Melendez L., Piñeiro L. 2003. Asociación

entre Integrones de clase I con Resistencia a multiples antimicrobianos y plásmidos

conjugativos en Enterobacteriaceae. Rev. Esp. Quimioterap. 16(4): 394-397

Fu Y.; Guo L.; Xu Y.; Zhang W.; Gu J.; Xu J.; Chen X.; Zhao Y.; Ma J.; Liu X.;

Zhang F. 2008. Alteration of GyrA amino acid required for Ciprofloxacin resistance in

Klebsiella pneumoniae isolates in China. Antimicrob Agents Chemother. 52(8): 2980-

2983

Galas M.; Melano R.; Petroni A.; Pasterán F.; Faccone D. 2004. Manual de

Procedimientos de Biología Molecular y Proteínas. Servicio de Antimicrobianos INEI

ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, Argentina.

García I.; Valenzuela E.; Saavedra C.; Leal A.; Eslava J.; Mantilla J. 2005.

Caracterización Molecular de aislamientos de Enterobacter cloacae multirresistentes

productores de B-lactamasas provenientes de pacientes de un hospital de tercer

nivel de Bogotá. Rev Fac Med Univ Nac Colombia.; 53(3): 148-159.

Garza-Ramos U.; Martínez-Romero E.; Silva-Sánchez J. 2007. SHV-type

extended-spectrum B-lactamase (ESBL) are encoded in related plasmids from

enterobacteria clinical isolates from Mexico. Salud pública Méx. 49(6): 415-421.

Goodman y Gilman. The pharmacological basis of therapeutics. McGraw-Hill. New

York. Chicago. 2001

Graffunder E.; Preston K.; Evans A.; Venezia R. 2005. Risk factors associated

with extended-spectrum beta-lactamase-producing organisms at a tertiary care

hospital. J Antimicrob Chemother; 56(1):139-45.

81

Greisen K.; Loeffelholz M.; Purohit A.; Leong D. 1994. PCR primers and probes

for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria

found in cerebrospinal fluid. JCM 32: 335-351;

Grinsted, J.; Bennett, P. 1998. Plasmid Technology. 2nd Edition. Academic Press

Limited.

Hata M.; Suzuki M.; Matsumoto M.; Takahashi M.; Sato K.; Ibe S.; Sakae K.

2005. Cloning of a novel gene for quinolone resistance from a transferable plasmid in

Shigella flexneri 2b. Antimicrob. Agents Chemother; 49: 801-803.

Iyobe, S. 1997. Appearance of extended-spectrum beta-lactamases. Nippon Rinsho

55(5):1219-24

Jacoby, G.; Muñoz-Price, S. 2005. The new betalactamases. N. Eng J Med.

352(4):380-391.

Jarlier V., Nicolas M., Fournier G., Philippon A. 1988. Extended broad-spectrum

β-lactamases conferring transferable resistance to newer β-lactam agents in

Enterobacteriaceae: prevalence and susceptibility patterns. Rev Infect Dis 10: 867-

78.

Jehl, F.; Chomarat, M.; Weber, M.; Gérard, A. 2004. Del Antibiograma a la

prescripción. Éditions Biomériux. Segunda edición.

Jiang Y.; Zhou Z.; Qian Y.; Wei Z.; Yu Y.; Hu S. 2008. Plasmid-mediated quinolone

resistance determinants qnr and aac (6’)-Ib-cr in extended-spectrum β-lactamase-

producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in China. J Antimicrob

Chemother; 61:1003-1006

Joklik, W.; Willet, H.; Amos, D.; Wilfert, C. 1998. Zinsser Microbiología. Editorial

Médica Panamericana. 20 Ed.

82

Jonas D.; Biehler K.; Hartung D.; Spitzmuller B.; Daschner F. 2005. Plasmid-

mediated quinolone resistance in isolates obtained in german intensive care units.

Antimicrob Agents Chemother; 49:773-775.

Knothe, A.; Shah, P.; Kremery, V.; Antal, M.; Mitsuhashi, S. 1983. Transferable

resistance to Cefotaxima, cefoxitin, cefamandole and cefuroxime in clinical isolates

of Klebsiella pneumoniae and Serratia marcescens. Infection 11:315-317

Koneman, E.; Allen, S.; Dowell, V.; Janda, W.; Sommers, H.; Winn, W. 1999.

Diagnóstico Microbiológico texto y atlas color. Editorial Médica Panamericana. 3era

edición.

Lagacé-Wiens P.; Nichol K.; Nicolle L.; DeCorby M.; McCracken M.; Alfa M.;

Mulvey M.; Zhanel G. 2007. ESBL genotypes in fluoroquinolone-resistant and

fluoroquinolone-susceptible ESBL-producing Escherichia coli urinary isolates in

Manitoba. Can J Infect Dis Med Microbiol. 18(2): 133–137.

Levesque C.; Piche L.; Larose Ch.; Roy P. 1995. PCR mapping of integrons

reveals several novel combinations of resistance genes. Antimicrob Agents

Chemother. 39(1): 185-191.

Lorian, V. 1996. Antibiotics in Laboratory Medicine. 4th Ed. Williams and Wilkins.

USA.

Lucet, J.; Regnier, B. 1998. Enterobacteria producing extended spectrum beta-

lactamases. Pathol Biol 46(4):235-43.

Madigan, M. 1998. Biología de los Microorganismos. 2da edición.

Mammeri H.; Van De L.; Poirel L.; Martinez-Martinez L.; Nordmann P. 2005.

Emergence of plasmid-mediated quinolone resistance in Escherichia coli in Europe.

Antimicrob Agents Chemother; 49:71-76.

Mandell, D. 2002. Enfermedades Infecciosas. 5ta edición. Editorial Panamericana.

83

Marcano, D. 2002. Detección de Betalactamasas de Espectro Expandido en cepas

de Enterobacterias aisladas de pacientes del Hospital Universitario de Caracas.

Trabajo Especial de Grado para optar al Título de Licenciado en Bioanálisis.

Universidad Central De Venezuela, Escuela de Bioanálisis. 97 p

Martínez, L.; Pascual, A.; Conejo, M.; García, I.; Joyanes, P.; Domenech, A.;

Benedi, J. 2002. Energy-Dependent Accumulation of Norfloxacin and Porin

Expression in Clinical Isolates of Klebsiella pneumoniae and Relationship to

Extended-Spectrum Betalactamase Production. Antimicrob Agents Chemother.

46(12): 3926-3932.

Martinez-Martinez L.; Pascual A.; Jacoby G. 1998. Quinolone resistance from a

transferable plasmid. Lancet 351:797-799.

Matsumoto, Y.; Ikeda, F.; Kanimura, T.; Yokota, Y.; Mine, Y. 1988. Novel plasmid-

mediated -lactamase from Escherichia coli that inactivates oxymino-cephalosporins.

Antimicrob Agents Chemother. 32:1243-1246.

Mendelson, G.; Hait, V.; Ben-Israel, J.; Gronich, D.; Granot, E.; Raz, R.

2005. Prevalence and risk factors of extended-spectrum beta-lactamase-producing

Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in an Israeli long-term care facility. Eur J

Clin Microbiol Infect Dis;24(1):17-22.

Minarini L.; Poirel L.; Cattoir V.; Darini A.; Nordmann P. 2008. Plasmid-mediated

quinolone resistance determinants among enterobacterial isolates from outpatients in

Brazil. J Antimicrob Chemother; 62: 474-478.

Morgan-Linnell S.; Zechiedrich L. 2007. Contributions of the Combined Effects of

Topoisomerase Mutations toward Fluoroquinolone Resistance in Escherichia coli.

Antimicrob Agents Chemother. 51(11): 4205-4208.

Mullis K.; Faloona F. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-

catalyzed chain reaction. Meth. Enzymol 155,335-350.

84

Navarro F.; Miró E.; Mirelis B. 2002. Lectura interpretada del antibiograma de

enterobacterias. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin 20(5):225-234.

Nordmann P.; Poirel L. 2005. Emergence of plasmid-mediated resistance to

quinolones in Enterobacteriaceae. J Antimicrob Chemother 56: 463-469.

Oliver A.; Cantón R. 2008. Enterobacterias productoras de ß-lactamasas

plasmídicas de espectro extendido. Revista de Control de Calidad SEIMC.

Palumbo M.; Gatto B.; Zagotto G.; Palu G. 1993. On the mechanism of action of

quinolone drugs. Trends Microbiol; 1: 232-235.

Perozo A.; Castellano M. 2009. Detección de Betalactamasas de Espectro

Extendido en cepas de la familia Enterobacteriaceae. Kasmera 37(1):.25-37.

Pfaller M.; Jones R.; Doern G.; Sader H.; Messer S.; Houston A.; Coffman S.;

Hollis R. 2000. Bloodstream infections due to Candida species: SENTRY

antimicrobial surveillance program in North America and Latin America, 1997-1998.

Antimicrob Agents Chemother. 44(3):747-51.

Pfaller, M.; Jones, R.; Doern, G. 1998. Multicenter evaluation of the antimicrobial

activity for six broad-spectrum beta-lactams in Venezuela using the Etest method.

The Venezuelan Antimicrobial Resistance Study Group. Diagn Microbiol Infect Dis

30(1):45-52

Pitout J, Wei Y, Church D, Gregson D. 2008. Surveillance for plasmid-mediated

quinolone resistance determinants in Enterobacteriaceae within the Calgary Health

Region, Canada: the emergence of aac(6’)-Ib-cr. J Antimicrob Chemother; 61:999-

1002.

Prescot, L.; Harley, J.; Klein, D. 1999. Microbiología. Editorial McGraw-Hill.

Ramphal, R.; Ambrose, P. 2006. Extended Spectrum Betalactamases and Clinical

Outcomes: Current Data. Clin. Infect. Dis. 42:S164-172.

85

Reyes A.; Bello H.; Dominguez M.; Mella S.; Zemelman R.; González G. 2003.

Prevalence and types of class 1 integrons in aminoglycoside-resistant

Enterobacteriaceae from several Chilean hospitals. J. Antimicrob. Chemother. 51:

317-321.

Rodríguez J. 2006. Resistencia mediada por plásmidos en Enterobacteriaceae.

Tesis doctoral, Universidad de Sevilla, España.

Rodriguez-Martinez J. 2005. Mechanisms of plasmid-mediated resistance to

quinolones. Enferm Infecc Microbiol Clin; 23:25-31.

Rodríguez-Martínez M.; Pichardo C.; García I.; Pachón-Ibañez M.; Docobo-

Pérez F.; Pascual A. 2008. Activity of ciprofloxacin and levofloxacin in experimental

pneumonia caused by Klebsiella pneumoniae deficient in porins, expressing active

efflux and producing QnrA1. Clin Microbiol Infect. 14: 691-697.

Sierra J. 2005. Bases Moleculares de la Resistencia a Quinolonas en

Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae y Corynebacterium spp [Tesis

Doctoral] España: Universidad de Barcelona.

Spanu, T.; Luzzaro, F.; Perilli, M.; Amicosante, G.; Toniolo, A.; Fadda, G. 2002.

Occurrence of Extended-Spectrum ß-Lactamases in Members of the Family

Enterobacteriaceae in Italy: Implications for Resistance to ß-Lactams and Other

Antimicrobial Drugs. Antimicrob Agents Chemother 46(1): 196-202.

Speldooren V.; Heymn B.; Labia R.; Nicolas-Chanoine MH. 1998. Discriminatory

Detection of Inhibitor-Resistant B-Lactamases in Escherichia coli by Single-Strand

Conformation Polymorphism-PCR. Antimicrob Agents Chemother 42(4): 879 – 884.

Szabó D, Kocsi B, Rókusz L, Szentandrássy J, Katona K, Kristóf K. 2008. First

detection of plasmad-mediated, quinolone resistance determinants qnrA, qnrB, qnrS

and aac(6’)-Ib-cr in extended spectrum β-lactamase (ESBL)-producing

Enterobacteriaceae in Budapest, Hungary. J Antimicrob Chemother 62(3): 630-632.

86

Tran J, Jacoby G, Hooper D. 2005. Interaction of the plasmid encoded quinolone

resistance protein Qnr with Escherichia coli DNA gyrase. Antimicrob Agents

Chemother; 49:118-125.

Tran J, Jacoby G. 2002. Mechanism of plasmid-mediated quinolone resistance.

Proc Natl Acad Sci USA; 99:5638-5642.

Vakulenko S., Mobashery S. 2003. Versatility of Aminoglycosides and Prospects for

Their Future. Clinical Microbiology Reviews, 16: 430-450.

Walsh, C. Antibiotics: Actions, origins, resistance. 2003. ASM press. 1era ed.

Washington DC. p 6-15 (335p)

Wang M.; Sahm D.; Jacoby G.; Hooper D. 2004. Emerging plasmid-mediated

quinolone resistance associated with the qnr gene in Klebsiella pneumoniae clinical

isolates in the United States. Antimicrob Agents Chemother; 48:1295-1299.

Wang M.; Tran J.; Jacoby G.; Zhang Y.; Wang F.; Hooper D. 2003. Plasmid-

mediated quinolone resistance in clinical isolates of Escherichia coli from Shanghai,

China. Antimicrob Agents Chemother; 47:2242-2248.