Reprogramacion de Celulas Madre
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REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS
MADRE
Autora: A. Vanesa Macías CañoSeminario: Dinámica celular y tisularSupervisión: Dra. Dña. Isabel Fariñas
Curso: 2010 - 2011Fecha: 16/12/10http://www.scientificamerican.com/article.cfm?id=interactive-
your-inner-healers
¿Qué son las células madre?
Las c. madre, también denominadas c. troncales, estaminales o en inglés c. Stem son, según el NIH
“una célula no especializada, auto-renovable, capaz de generar uno o más tipos celulares diferenciados, a esta característica se le denomina potencialidad.
I.L. Weissman. New England Journal of Medicine 346; 1576-1583, 2002http://www.ecojoven.com/uno/05/celulasm.html
http://www.macroestetica.com/articulos/perspectivas-para-el-uso-clinico-de-las-celulas-madre/
¿Qué son las células madre?
www.imediapr.es/ranf-documentos_files/monografia-celulas-madre.pdf
Tipos de células madre
R. Jaenisch y R. Young. Cell 132; 567-582, 2008http://scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1137-
66272003000500002
Aguilera, J. J. (2004). Presente y futuro de las células troncales. Últimas investigaciones en Biología: Células madre y CélulasEmbrionarias.
Ventajas e inconvenientes de cada tipo
Células madre embrionarias
¿De dónde se obtienen c. madre embrionariarias?
De embriones sobrantes de fecundación in vitro
Producidos por transferencia nuclear somática (clonación)
Generados por partenogénesis de ovocitos animales /humanos
http://www.scientificamerican.com/article.cfm?id=interactive-your-inner-healers
¿POR QUÉ EL USO DE C MADREEMBRIONARIAS = A POLÉMICA
SOCIAL ? Para obtenerlas hay que destruir un embrión humano
Importante para estudios biomédicos
Aplicaciones terapéuticas medicina regenerativa y reparadora
Problemas éticos que su utilización conlleva
Posibilidad de rentabilizar económicamente su uso
J. Rossant Cell 132, 527-531, 2008R Darabi y col. Nature Medicine 14; 134-143, 2008
M.A. Laflamme y col. Nature Biotechnology 25; 1015 – 1024, 2007
PROPUESTAS PARA LAUTILIZACIÓN CLÍNICA C. MADRE
EMBRIONARIASGeron tto de lesiones de la médula espinal
Novocell generar c. Productoras de insulina
Mytogen células epiteliales pigmentadas de retina
Nature Biotechnology 26, 598-599, 2008Soria, B. et al. (2005). Gastrointestinal Stem Cells I. Pancreatic stem cells. Am J PhysiolGastrointest
Liver Physiol, 289:177-180.
LA FDA DENIEGA LA AUTORIZACIÓN
PARA REALIZAR ESTAS EXPERIENCIAS
Las tres propuestas fueron denegadas por la FDA, objetando que antes de ensayos clínicos había que cumplimentar rigurosos controles de seguridad y
experiencias en animales
Nature Biotechnology 26, 598-599, 2008http://bodybuildingdominicano.blogspot.com/2009/11/retirada-de-suplementos-sospechosos-de.html
EXPECTATIVAS TERAPÉUTICASUTILIZANDO C. MADRE
EMBRIONARIASIneficiencia del proceso de clonación,
Falta de conocimiento de los mecanismos que regulan estos procesos,
Necesidad de terapia inmunosupresiva,
Desarrollo de teratomas
Dificultades éticas
PLoS Med 6; e1000029Nature Biotechnology 2009; 27: 213-214M. Enserink. Science 313; 160-163, 2006
“Nadie podría prometer hoy la falsedad de que con c. madre embrionarias se puede
curar a alguien inminentemente”
Alternativas para la obtención de c. madre embrionarias
ALTERNATIVAS AL USO DE CÉLULAS
MADRE EMBRIONARIASImportante problema ético
Se planteó procedimientos que no requirieran la destrucción de embriones
Consejo Asesor de Bioética propuso alternativas
Best Practical Research Clinical Obstetrics and Gynecology 18; 929-940, 2004White Paper Alternate Sources of Human Pluripotent Stem Cells.Washington DC. President’s Councel
on Bioethics. 2005http://www.wikiteca.org/celulas-madre
1. Embriones en fase muy temprana de desarrollo
2. Estructuras biológicas no embrionarias generadas por
transferencia nuclearsomática alterada (ATN)
3. Estructuras biológicas obtenidas por transferencia
nuclear somática alterada (ATN) con reprogramación
asistida del ovocito (OAR) de pseudoembriones
4. De c. madre germinales
5. De ovocitos activados por partenogénesis
6. Por fusión de núcleos de c. somáticas adultas con
c.madre
embrionarias
7. Por reprogramación de c. somáticas
adultas
Alternativas
Ventajas e inconvenientes
Aguilera, J. J. (2004). Presente y futuro de las células troncales. Últimas investigaciones en Biología: Células madre y CélulasEmbrionarias.
Obtención de c.madre ≈ a las c. m. embrionarias por reprogramación directa de c. adultas
Reprogramación de c. adultas
http://www.scientificamerican.com/article.cfm?id=interactive-your-inner-healers
C. Madre. Pasado y futuro
http://www.scientificamerican.com/article.cfm?id=interactive-your-inner-healers
Reprogramación de células
adultas animales
K. Takahashi y S. Yamanaka. Cell 126; 652-655, 2006
Reprogramación de células
adultas animales
J. Yu y col. (grupo Thomson). Science 318; 1917-1920, 2007http://www.scientificamerican.com/article.cfm?id=interactive-your-inner-
healersK. Takahashi y col. (grupo Yamanaka). Cell 131; 861-872, 2007
Confirman las experiencias realizadas en animales por Takahashi y Yamanaka
Confirman las anteriores experiencias y además consiguen producir quimeras ya que si son inyectadas en blastocistos murinos pueden generar embriones vivos
Reprogramación de c.adultas animales
M. Wernig y col. Nature; 318-324, 2007
N. Maherali y col. Cell Stem Cell 1; 55-70, 2007
Pero el paso de las experiencias animales a humanos no parecía fácil
Así, Janet Rossant se preguntaba:
“¿Serán eficientes los mismos mágicos factores moleculares
para generar células iPS humanas?
Reprogramación de c.adultas animales
J. Rossant. Nature 448; 260-262, 2007http://homepage.mac.com/femtobio/plexus/C1766198132/E1670782726/index.html
Las células iPS generadas muestran:
expresión génica y modelos de metilación
muy parecidos a los de las c. madre embrionarias,
crecen internamente mientras expresan
telomerasa,
tienen un cariotipo normal
forman teratomas si se trasplantan a ratones inmunosuprimidos
Reprogramación de c.adultas animales
Ch.E. Murry y G. Keller. Cell 132; 661-680, 2008http://es.wikipedia.org/wiki/Cariotipo
2007, tras la reprogramación celular en animales por Takahasi y Yamanaka, se consigue: la reprogramación de c. adultas humanas.
Reprogramación de células
adultas humanas
M Evans y col Nature 292; 154-156, 1981JR Martin PNAS 78; 763-7638, 1981
JA Thomson y colScience 282; 1145-1147, 1998
Experiencias de los grupos de Yamanaka y Thomson
Thomson pensaba que la posibilidad de reprogramar células adultas humanas tardaría al menos 20 años
Por ello, cuando se logró la reprogramación de células adultas humanas:
“No podíamos creer que la reprogramación fuera tan fácil”
B Goldman Nature Reports Stem Cells DOI: 10.1038/stemcells.2008.67http://cenizaenlosbolsillos.blogspot.com/2009/11/preambulo-las-instrucciones-
para-dar.html
Genes reprogramadores¿Cuántos genes se requieren para obtener
las células iPS?
Takahasi y Yamanaka partieron de 24 genes reprogramadores
Cell 126; 663-676, 2006R. Jaenisch y R. Young Cell 132; 567-582, 2008
Yamanaka et al, Vol 448| 19 July 2007| doi:10.1038/nature05934http://cordis.europa.eu/fetch?CALLER=NEWSLINK_ES_C&RCN=31158&ACTION=D
IH Park y col. Confirman a Takahasi y Yamanaka
derivan células iPS de c. adultas, especialmente de
fibroblastos de fetos neonatos y sujetos adultos, utilizando los cuatro mismo
genes reprogramadores
Similitud entre las c. iPs y las c. embrionarias
humanasBiológicamente no hay diferencias entre las células iPS y las embrionarias humanas
Para confirmarlo producción de embriones humanos por clonación a partir de las c. iPS
Éticamente no es posible llevarlo a cabo
Genes reprogramadoresEl Oct4 es altamente
específico para las células pluripotentes
Los otros tres factores se expresan en otras células:
Sox2 en células madre neurales y células progenitoras
Klf4 en células de piel, estómago, intestino y músculo esquelético
c-Myc se expresa aleatoriamente
El gen que parece no poder ser reemplazado
es el Oct4
Nakagawa et al (Yamanaka) Nature Biotechnology 26; 101-106, 2008
www.imediapr.es/ranf-documentos_files/monografia-celulas-madre.pdf
Kim et al han demostrado que se pueden conseguir células iPS reprogramando células madre
neurales utilizando como factor de trascripción únicamente el Oct4
Genes reprogramadores
Kim et al Cell 136; 411-419, 2009ScienceDaily.com, 24/05/2010
http://www.monografias.com/trabajos60/linaje-dopaminergico/linaje-dopaminergico.shtml
Ramón y Cajal, ref. 3www.imediapr.es/ranf-documentos_files/monografia-celulas-madre.pdf
Generación de c. iPS a partir de
fibroblastos de piel humana
diferenciación a todo tipo de
tejidos pluripotencialidad
Reprogramación de c.adultas animales
WE Lowry y col. PNAS 105; 2883-2888, 2008
Interés por la reprogramación c.
Interés clínico y experimental que tienen las c. iPS, numerosos laboratorios han iniciado trabajos destinados a obtenerla.
Melina Fan (Addgene) distribuye los vectores virales utilizados por Yamanaka y Thomson, y a fecha de 2008, habían recibido:
704 peticiones, de 178 laboratorios el vector viral utilizado por Thomson
514 de 131 laboratorios del vector utilizado por Yamanaka para la transferencia de los factores de trascripción a células humanas,
más de 1500 peticiones procedentes de 232 laboratorios del vector utilizado para la transferencia a células murinas
Nature Reports Stem Cells DOI: 10.1038/stemcells.2008.67
Importancia de la reprogramación c.
Science ha calificado esta técnica como el descubrimiento científico del año 2008 por:
• la utilidad en la investigación de enfermedades
• la probable utilización en la medicina regenerativa y reparadora
Science 322; 1767-1773, 2008http://iss.schoolwires.com/coddlecreek/site/default.asp
Inconvenientes técnicos
Posibilidad de transmisión de enfermedades virales
Posibilidad de producir tumores
Posibles introducción del DNA de los genes reprogramadores en las c. receptoras integración genómica aleatoria mutagénesis
Aunque los genes reprogramadores son tras la reprogramación posible activación epigenética de Oct-4 y Sox2 efectos no deseados en las c. iPS transferidas
MF Pera y K Hasegawa Nature Biotechnology 26; 59-60, 2008
Problemas a resolver
Técnicos:
Sustituir los vectores virales
Sustituir el oncogén c-Myc
Biológicos:
Conocer mejor los mecanismos de la
reprogramación celular, especialmente si es
debida a:
1. modificaciones epigenéticas
2. modificaciones genéticas todavía no identificadas
J. Cibelli. Science 318; 1879, 2007http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/therapy?show=all
Problemas resueltoso Yamanaka, en tres meses, consigue:
reprogramar hepatocitos y c. de epitelio de gástrico sin utilizar el c-Myc, tanto en humanos como en ratones, sin que se generaran tumores
o Utilización de vectores virales Aoki y col, comprueban que al reprogramar c. de estómago e hígado murinas, estos no alteran su genoma
o Stadtfeld y col: consiguen introducir los FT utilizando vectores virales que no se integran en el genoma de las c. receptoras
Evitan la formación de tumores y las alteraciones génicas Consiguen derivar c. de músculo, sistema nervioso, corazón y pulmón Posible aplicación en ensayos clínicos con humanosN. Nakagama y col. Nature Biothecnology 26; 101-106, 2008
T. Aoki y col. Science: DOI 10.1126 / science 1154884 (14 – 2 – 2008)M Stadtfeld y col. Science: DOI 10.1126 / science 1162494
Ac anti c-Myc
Obtención de c. iPS sin integración del genoma viral
Generan células iPS a partir de:
o Hepatocitos de ratón utilizando adenovirus para transferir factores reprogramadores
o Fibroblastos de embriones de ratón utilizando plásmidos
o Utilizando un único vector policistrónico no vírico obtenido a partir de un plásmido que favorece la expresión de Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc
o Se pueden sustituir por nanotubos de carbono, ya que permiten introducir proteínas complejas (hasta 12) en c. testiculares y de retina
Reticencias de expertos, pues no han sido publicadas en una revista científica de garantía
Algunos indican que su introducción en las c. puede tener efectos tóxicos hasta la muerte
o Reemplazarlos introduciendo directamente los factores reprogramadores con ciertos aminoácidos unidos, lo que les permite penetrar las membranas celulares
o También utilizando pequeñas moléculas no proteícas que remeden la actividad de los factores de trascripción y que puedan penetrar las membranas celulares
Okita et al (Yamanaka) Science 322; 949-953, 2008Kaji et al Nature DOI: 10.1038/nature 07864, 2009
B Goldman Nature Reports Stem Cells DOI: 101038/stemcells.2008.671st May 2008
Obtención de c. iPS utilizando compuestos químicos
o Químicos que pueden reemplazar uno o dos genes reprogramados
Huangfu et al Nature Biotechnology 26; 1269-1275, 2008PNAS 106; 8912-8917, 2009
Shi et al Cell Stem Cell 2; 525-528, 2008Cell Stem Cell 3; 346-353, 2008
o Moléculas que inhiben el ácido valpróico e inducen reprogramación utilizando solo Oct4 y Sox2
o Otra molécula, el kenpaullné, puede sustituir el Klf4
Obtención de c. iPS utilizando pequeñas moléculas
Obtención de células iPS utilizando:o Vectores episomales que no se integran en el genoma. Así, la célula iPS
generada queda libre de secuencias transgénicas extrañas
o Utilizan doxyciclina para potenciar vectores víricos (lentivirus) y usan la recombinasa Cr/LoxP para eliminar los restos trangénicos que se hayan podido insertar
Jaenisch (MIT) la utiliza para mejorar la técnica y conseguir c. iPS de 2ª generación. Las c. obtenidas tienen una gran homogeneidad genética uso clínico
o Utilizan plásmidos del tipo piggy Bac
Ventajas del uso de iPsNo rechazo inmunológico
Fármacos específicos /paciente
No usa ovocitos humanos
Facilidad técnica
Coste reducido
Aplicaciones
Para estudios experimentales sobre la diferenciación celular y para valorar posibles diferencias entre células normales y patológicas
Para su uso en la medicina regenerativa
Podrían suplir información que ahora proporcionan las células madre embrionarias en investigación y en medicina MF Pera Nature 451; 135-136, 2008
http://www.scientificamerican.com/
article.cfm?id=interactive-your-inner-healers
Reprogramación directa de c. adultas
El equipo dirigido por D Melton
ha conseguido reprogramar células exocrinas del páncreas en células beta productoras de insulina
Con esta técnica se evita el paso intermedio de convertir la célula adulta en una célula pluripotencial
Los factores de trascripción que utilizan son el Ngn3, Pdx1 y Mafa
Nature DOI: 10.1038/nature 07314
¿Puede el uso de iPS innecesario el uso de c. madre embrionarias?
Hyun: Sería un importante error llegar a la conclusión de que la obtención de las células iPS evita la necesidad de usar células madre embrionarias
La investigación con células iPS debería continuar junto con la investigación con células madre embrionarias
D Melton: Es prematuro afirmar esto
GQ Daley: En el momento actual no estamos seguros de que las células iPS sean absolutamente equivalentes a las células madre embrionarias
K Egan: Para estar seguro de la utilidad de las células iPS se necesita hacer un gran número de experiencias con células iPS de diferentes individuos y compararlos con células madre embrionarias
I Hyun y col. Cell Stem Cell 1; 367-368, 2007CI-Hyun Park. Hastings Center Report 38; 20-22, 2008
BM Kuehn JAMA 299; 26, 2008 Holden y G Vogel Science319; 560-563, 2008
Preclínica: ratones con
anemia falciforme
Se obtienen c. somáticas de ratones con anemia falciforme tras la corrección de la anomalía genética se generan células iPS
A partir de ellas se generan c. madre hematopoyéticas normales que se reinyectan, consiguiendo mejorar su clínica
Hanna J et al Science 318; 1920-1923, 2007
Demuestran que iPS se pueden diferenciar en c. madre precursoras neurales que en cultivo puede generar c. neurales o de glia
Si las c. generadas se transfieren al cerebro de fetos de ratones, migran a distintas regiones y se diferencian en glia y neuronas
También iPS se diferencian a neuronas dopaminérgicas. Se mejoran los síntomas del Parkinson
Preclínica: ratones con Parkinson
M Wernig y col PNAS 105; 5856-5861, 2008http://www.scientificamerican.com/article.cfm?id=interactive-your-inner-healers
Preclínica: injerto de piel
www.imediapr.es/ranf-documentos_files/monografia-celulas-madre.pdf
Resultados obtenidos de c. iPS derivadas de
diferentes patologíasDesde fibroblastos de una mujer de 82 años que padecía una ELA, células iPS y diferenciarlas a neuronas motoras
También se han podido derivar células iPS en pacientes con distrofia muscular de Duchenne, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, diabetes mellitus tipo 1, síndrome de Down y síndrome de Lesch-Nyhan...
En 2009 se logró también obtener células iPS de pacientes con anemia de Fanconi las c. somáticas previamente tratadas con terapia génica para corregir su defecto genético, por lo que las células iPS producidas podían ser transplantadas
Raya A, et al. Nature 2009; 460: 53-59Park I H, et al. Cell 2008; 134: 877-886
Dimos J, et al. Science 2008; 321: 1218-1221.
Creación de SV a partir. iPS
Dos grupos de investigadores chinos han logrado producir ratones vivos:
Uno lo consiguió a partir de la producción de blastocistos tetraploides a los que se habían previamente transferido las células iPS
Zhao y col han logrado producir ratones vivos a partir de líneas de células iPS generadas de fibroblastos de piel.
A partir de los ratones producidos 2ª generación de ratones vivos que tenían las características genéticas del ratón del cual se habían derivado las células iPS
Boland M, et al. Nature 2009; 461 91-94Zhao X, et al. Nature 2009; 461:86-9
Kang L, et al. Cell Stem Cell 2009; 5: 135-138
ConclusiónA pesar de todas las controversias, no cabe duda de que la utilización de células madre en el futuro ha despertado unas enormes expectativas.
Bien como:
materia prima para terapia regenerativa de enfermedades hasta ahora incurables como la enfermedad de Parkinson, diabetes o enfermedades cardíacas crónica
vehículo de terapia génica,
sólo hemos empezado a imaginar las posibilidades terapéuticas de las c. madre.
Es fundamental recordar que para que las c. madre se trasformen en una realidad terapéutica es imprescindible:
investigación rigurosa y estricta que nos permita llegar a conclusiones.
a pesar de la presión social
imprescindible que ni los científicos, ni los políticos, ni los periodistas ni la sociedad en general levanten expectativas que lejos de la realidad, llevaran a la frustración y desencanto de los enfermos.
PREGUNTAS
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Bibliografía
GRACIAS POR SU ATENCIÓN