Reporte Final - Conacyt · Jesús O. Medina-López, Saúl A. Martínez-Morales, Feliciano...

Análisis de sensibilidad y resistencia de lepidópteros asociados al cultivo de algodón transgénico (164429) Reporte Final

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Reporte Final

BIOSEG-2011-1

Demanda 1: Manejo de la resistencia asociada al cultivo de organismos genéticamente modificados en México: el caso del algodón

Identificación de la propuesta:

Análisis de sensibilidad y resistencia de lepidópteros asociados al cultivo

de algodón transgénico (CIBIOGEM 164429)

Responsable: Dr. Benito Pereyra Alférez


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Producción del Período

Objetivos y Metas: Hemos cumplido con las Actividades 1 y 2, y con el 100% de los objetivos

y metas trazadas en el proyecto.

Formación de Recursos Humanos

1. Jesús Oswaldo Medina López. Biólogo, “Obtención de Helicoverpa zea (Boddie) resistente

a la δ-endotoxina Cry1Ac de Bacillus thuringiensis”. 27 de Junio 2014.

2. Saúl Andrés Morales Martínez. Biólogo, “Análisis de la resistencia de Helicoverpa zea

(Boddie) a la δ-endotoxina Cry1Ac de Bacillus thuringiensis Berliner”. 15 de Junio de 2016.

3. Miguel Ángel Muro Campillo. Químico Bacteriólogo Parasitólogo, “Análisis de la resistencia

a las δ-endotoxinas Cry1ac y Cry2ab de Bacillus thuringiensis (Berliner) en Helicoverpa zea

(boddie)”. Agosto 2017

Distinciones

Premio a la Mejor Tesis de Licenciatura (Jesús Oswaldo Medina López) en el Área de Ciencias

Agropecuarias. 22 de Septiembre de 2015. UANL.

Divulgación de Resultados

1. Evento: Foro Científico de Bioseguridad para Organismos Genéticamente Modificados

Lugar: Colegio de Posgraduados. Chapingo, México

Fecha: 23-25 de Octubre de 2013

2. Evento: XXXV Congreso Nacional de Entomología.

Lugar: Concepción de Chile 27-29 de Noviembre 2013

Fecha: 27-29 de Noviembre de 2013

3. Evento: BIT's 4th Annual World Congress of Agriculture

Lugar: Changchun Dalian, China

Fecha: 29-31 de Agosto de 2014

4. Evento: Biotechnology Summit 2014

Lugar: Huatulco, Oaxaca. México

Fecha: 08-10 de Octubre de 2014

5. Evento: XXXVII Congreso Nacional de Control Biológico

Lugar: Mérida, Yucatán. México

Fecha: 2-7 de Noviembre de 2014

Artículos Científicos

Jesús O. Medina-López, Saúl A. Martínez-Morales, Feliciano Molina-Estrada, and Luis J. Galán-Wong and B. Pereyra-Alférez. 2017. Cry1Ac protoxin from Bacillus thuringiensis affects the fitness of Helicoverpa zea B. (Lepidoptera, Noctuidae). Sometido


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RESUMEN

El algodón biotecnológico BollgardII® es un material que expresa las toxinas Cry1Ac y

Cry2Ab de Bacillus thuringiensis (Bt) y la resistencia al herbicida glifosato. Entre las principales

plagas del algodonero y razón de este estudio se encuentra el gusano bellotero, Helicoverpa zea.

La posible aparición de resistencia en campo al algodón Bt, ha generado preocupación y motivo

de estudio. El objetivo de este trabajo fue la obtención de colonias de H. zea resistentes a la

protoxina Cry1Ac y Cry2Ab, así como la forma de herencia de la resistencia. El abordaje

experimental fue dividido en dos actividades: Actividad 1: “Evaluación de la frecuencia de alelos

de resistencia a las -endotoxinas Cry1Ac y Cry2Ab de Bacillus thuringiensis y susceptibilidad a

otras toxinas Cry en insectos del orden lepidóptera en la zona de cultivo de algodón transgénico”.

Visitamos campos cultivados con BollgardII® en San Pedro de las Colonia, Coah., Sonoyta, Son.,

y el valle de Mexicali, BC, en busca de H. zea y Pectinophora gosypiella (gusano rosado).

Demostramos que las plantas de los campos visitados expresan Cry1Ac, Cry2Ab y resistencia al

herbicida glifosato y no encontramos adultos, huevos, larvas o pupas de ninguno de los insectos

buscados. A partir de larvas de H. zea colectada de cultivos no Bt, iniciamos la colonia de

laboratorio. Los bioensayos mostraron una LC50 basal de 1.309 y 4.2 µg/ml de dieta para las

protoxinas Cry1Ac y Cry 2Ab, respectivamente. La colonia fue retada, por separado, con protoxina

de Cry1Ac y Cry2Ab a dosis de 10, 20 y 50 g/g de dieta. Con respecto a Cry1Ac, obtuvimos una

colonia con resistencia a 20 g. Los ensayos de herencia sugieren que la resistencia podría estar

asociada a un alelo parcialmente dominante. Las larvas resistentes son, en su mayoría machos

en proporción 2:1 con respecto a hembras. Experimentos de RT-PCR demostraron la presencia

de dos transcritos de aminopeptidasa N (APN) y uno de cadherina. La actividad enzimática de

APN y fosfatasa alcalina (ALP) fue diferencial, la colonia resistente presentó 30% menos actividad

de APN, pero más de fosfatasa alcalina (ALP). Sin embargo, en ensayos de intoxicación con

Cry1Ac, la actividad de ALP disminuyó considerablemente después de ingerir la toxina, con un

42.5% en las susceptibles y 58% en resistentes. La actividad y cantidad de cadherinas presentes

en las BBMV disminuyó en ambas líneas al ingerir la toxina, lo que indica que participan

activamente en el mecanismo de acción de Cry1Ac. Las secuencias nucleotídicas obtenidas a

partir de PCR para cadherinas y APN sugieren que el splicing diferencial como otro de los

mecanismos que confieren resistencia a Cry1Ac. Los resultados indicaron que la resistencia a

Cry1Ac en H. zea es de carácter poligénico. Finalmente, utilizando anticuerpos para BT-R1 de

Manduca sexta, se reporta una posible isoforma de cadherina de ~40kDa, sin embargo, se

requieren estudios posteriores para confirmar que pertenezca a este grupo. En las colonias

resistentes se observó bajo peso larval, bajo peso en estado de pupa, prolongación de los

estadios larvales y el estado de pupa, pupas deformes, y adultos con problemas de copula. La

búsqueda de la F2, cruza 1: hembras R x machos S; cruza 2: machos R x hembras S; cruza 3,

machos R x hembras R, demostró que: i) cruza 1, hubo oviposición, pero ninguno fértil; ii) cruza

2, oviposición fértil, pero muy reducida con respecto a lo esperado; iii) cruza 3, oviposición infértil.

Finalmente, las colonias colapsaron.

Actividad 2: “Potencial para el desarrollo de resistencia en plagas de algodón a la toxina Cry1Ac

de Bacillus thuringiensis kustaki Berliner”. Obtuvimos dos colonias de H. zea; una resistente a

Cry1Ac (colonia 1Ac) y otra a Cry2Ab (colonia 2Ab). La colonia susceptible, (colonia S) fue retada

usando, por separado, 10 µg de las protoxinas solubilizada de Cry1Ac y Cry2Ab por ml de dieta.


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Las larvas neonatas, n=1104, fueron expuestas 7 días, la sobrevivencia fue: 134 y 228 para

Cry1Ac y Cry2Ab, respectivamente. De las cuales 54 para Cr1Ac y 111 para Cry2Ab, alcanzaron

la etapa de pupa. Mientras que solo 42 (Cry1Ac) y 78 (Cry2Ab) llegaron a adultos. Dando una

sobrevivencia global de 12.13% y 20.56% para Cry1Ac y Cry2Ab, respectivamente. Las larvas

sobrevivientes fueron la base para establecer las colonias 1Ac y 2Ab durante cuatro generaciones

sometidas a la presión selectiva de 10 g de protoxina/ml de dieta. El efecto de la sobrevivencia

en las colonias 1Ac y 2Ab generó un costo en la aptitud biológica, el cual se encuentra

directamente relacionado con la adquisición de resistencia. La prolongación de estadios,

disminución en los porcentajes de pupación, emergencia y de sobrevivencia en general, así como

la presencia de malformaciones en distintos estadios son solo algunas de las consecuencias del

costo en la aptitud biológica. Los ensayos de resistencia cruzada mostraron una resistencia

parcial, pero asimétrica. Cuando la colonia 2Ab fue tratada con Cry1Ac observamos 35% de

sobrevivencia. Mientras que cuando la colonia 1Ac fue retada con Cry2Ab, obtuvimos una

sobrevivencia de 7.05%.

Nuestros resultados demuestran que los alelos de resistencia a las proteínas Cry están presentes

en la población de manera natural, aún en los organismos que nunca han estado expuestos a las

toxinas Bt.

El desarrollo de resistencia tuvo un alto costo para la colonia. De esta manera, la colonia inicial,

colapsó después de 24 generaciones. Por lo cual debimos iniciar otra colonia que nunca estuvo

expuesta Bt. Ambas provenientes de La Laguna. La segunda colonia tiene 26 generaciones y ya

inicia el proceso de “debilitamiento”.

El estudio de la resistencia en laboratorio sirve para crear mejores estrategias de control en los

cultivos a campo abierto. Las medidas en campo abierto como lo es la expresión de altas dosis

de toxina y refugios es un método efectivo para evitar que las poblaciones de plagas puedan

generar una resistencia.


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Introducción

El algodón representa alrededor del 40% de la fibra natural a nivel mundial y es cultivado

comercialmente en 78 países. Sin embargo, éste puede ser el blanco de >1300 especies de

insectos, entre los que destacan más de 30 especies de lepidópteros, principalmente Helicoverpa

zea and Heliothis sp., Pectinophora gossypiella, y Earias sp. (Benedict y Ring. 2004; Naranjo.

2011).

El control de los insectos plaga se realiza, tradicionalmente con insecticidas químicos,

como piretroides, organoclorados y organofosforados. Sin embargo, éstos tienen la limitante de

ser inespecíficos y afectan, no solo a la fauna silvestre sino también al ser humano. Por tanto, el

control de las plagas se modificó con el uso de organismos enemigos naturales de las plagas:

entomopatógenos y entomófagos. Entre los agentes de mayor uso se encuentra Bacillus

thuringiensis (Bt). Bt es un organismo esporulado que sintetiza un cristal de naturaleza proteica

(δ-endotoxinas) con actividad tóxica hacia ciertos organismos, especialmente insectos

Lepidópteros, Dípteros y Coleópteros (Ferré et al., 2008; Iracheta et al., 2000; Marroquín. 2006).

Los productos comerciales a base de Bt se aplican en forma de polvos humectables sobre

el área foliar de los cultivos, con la desventaja de la inactivación por radiación solar y lavado por

lluvia. La clonación y expresión de genes de δ-endotoxina en otras bacterias y en plantas ha

incrementado el uso de Bt como el insecticida biológico de mayor uso (Tabashnik et al., 2009). El

cultivo de plantas modificadas por ingeniería genética (IG), entre 1996 y 2009 representaron cerca

de mil millones de Ha en varios países alrededor del mundo, con un incremento constante de 10

millones de Ha/año desde 1996 (James. 2009; Naranjo. 2011).

En el 2009, plantas modificadas por ingeniería genética (IG) fueron sembradas en más de

134 millones de Has en 25 países, representando alrededor de 63% del total. Entre las plantas

de mayor cultivo se encuentran las tolerantes a herbicidas como glifosato o glufosinato (James.

2009). Mientras que las resistentes a insectos produciendo las toxinas de Bt comprenden el resto,

pero comparten el 57% con las tolerantes a herbicidas (Benedict y Ring. 2004; Naranjo. 2011).

Entre los principales productos biotecnológicos del algodonero, se encuentran Bollgard®

y Bollgard II®. Bollgard sintetiza solo la toxina Cry1Ac, pero el Bollgard II® produce dos; Cry1Ac

y Cry2Ab (Moar y Anilkumar. 2007).

En los Estados Unidos la patente de Bollgard® finalizó en el 2009, por lo que ha sido

reemplazado por el Bollgard II® y el Widestrike®. Con éste último, se obtiene el plus de la

tolerancia a herbicidas (Naranjo. 2011). A pesar de todos estos desarrollos biotecnológicos, se

ha reportado la aparición de resistencia a las toxinas de Bt en varios insectos plaga, entre los que

se encuentra Pectinophora gossypiella "el gusano rosado", la principal plaga del algodonero


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(Tabashnik et al., 2009; Soberón et al., 2007; Ferré et al., 2008), además de otros insectos plaga

como Helicoverpa zea (Sivasupramaniam et al., 2008; Anilkumar et al., 2009; Jackson et al., 2006

) y Heliothis virescens ( Jurat et al., 2003, 2004, 2006).

Una solución, parcial, al problema de resistencia ha sido la obtención de semillas que

generen plantas que sinteticen dos toxinas, como el Bollgard II®, las dos proteínas actúan

independientemente, uniéndose a receptores distintos en el intestino del insecto (Moar y

Anilkumar. 2007). Otra posible solución podría ser la generación de plantas con toxinas

modificadas, como la Cry1Ab, donde se demostró que la α-hélice 5 es la responsable de la

resistencia en "el gusano rosado" (Soberón et al., 2007).

Con respecto a las plantas Bt y las combinaciones con tolerancia a herbicidas, quedó de

manifiesto que solo las plantas Bt rinden ahorro significativo. Mientras que las plantas con

tolerancia a herbicidas en la mayoría de los casos no mostraron diferencias con las normales, al

ser necesario aplicar mayor cantidad del herbicida para eliminar a las malezas (Cataneo et al.,

2006; Cao et al., 2014). En las zonas algodoneras del país como Mexicali, BC., La Laguna,

Sonoyta, Son., Delicias, Chih., y Tamaulipas, los insectos P. gossypiella, H. zea, H. virescens

y Spodoptera exigua son las principales plagas del algodón y afectan gravemente su producción,

causando cuantiosas pérdidas año con año.

En nuestro país la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y

Alimentación (SAGARPA) en asociación con la Comisión Intersecretarial de Bioseguridad de

Organismos Genéticamente Modificados (CIBIOGEM) solicitaron revisar el estado de la

entomofauna asociada al algodón biotecnológico, especialmente Bollgard II® (CIBIOGEM. 2011).

Ante esta situación, el objetivo de nuestro trabajo consistió en: i) revisar el estado de

colonización de los cultivos biotecnológicos Bollgard II® con los insectos mencionados; ii)

establecer una colonia de H. zea en el laboratorio, conocer la línea basal de susceptibilidad,

inducir resistencia y conocer la forma de herencia de la misma.


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Importancia Aún y cuando previo a la comercialización del algodón Bt en EUA, Canadá y la Unión Europea

se evaluaron los potenciales riesgos ambientales de las plantas transgénicas resistentes a

insectos, se ha requerido de una enorme inversión de recursos económicos para evaluar el

impacto ambiental en cultivos a "cielo abierto" (US EPA. 2007).

Un primer paso es la determinación del potencial riesgo de toxicidad hacia entomofauna

benéfica o no blanco (Cao et al., 2014: Duan et al., 2010; Wolfenbarger et al., 2008). De no existir

daño de muerte o toxicidad, entonces se juzga como de riesgo mínimo (Rose. 2006; Romeis et

al. 2006). En 2010, Duan y cols dirigieron un estudio para evaluar el impacto sobre organismos

no blanco, concluyendo que, aún y cuando no existe un efecto, estadísticamente significativo,

sobre los organismos no blanco es preciso realizar el estudio ambiental (Duan et al., 2010). A

pesar de la enorme importancia económica y ecológica, poco es conocido sobre la genética de

la mayoría de los lepidópteros, debido a su gran número de cromosomas, en estas especies un

gen recesivo autosómico es el que confiere resistencia a, por lo menos, cuatro toxinas de Bt

(Heckel et al., 1999).

Diversos estudios moleculares realizados en Bombyx mory para la identificación de genes,

ha permitido el estudio del gen que confiere resistencia en Plutella xylostella, dicho estudio fue

llevado acabo por Heckel y col (1999) donde encontró que el locus BtR-1 el cual consiste de un

simple gen que es el responsable de la resistencia recesiva, la cual no solo es hacia una toxina

por lo que el locus BtR-1 confiere resistencia a múltiples toxinas (multitoxina) de Bt.

El conocimiento de la fisiología, bioquímica y genética para el desarrollo de resistencia en

insectos es esencial para designar estrategias efectivas para el manejo de plagas resistentes,

por lo tanto, este estudio tiene como objetivo aportar información sobre las características de

unión implicadas principalmente, de acuerdo a estudios realizados, en el comportamiento de la

resistencia hacia algunas toxinas de Bacillus thuringiensis en insectos plaga de México.


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Objetivo General:

Incrementar el conocimiento sobre la resistencia en plagas de insectos a toxinas Cry

presentes en los cultivos transgénicos de algodón de nuestro país

Objetivos particulares, metas e indicadores:

1. Analizar la susceptibilidad de insectos presentes en zona algodonera hacia toxinas nativas

Cry1Ac y Cry2Ab

2. Lograr generar una resistencia inducida en laboratorio hacia toxinas Cry1Ac o Cry2Ab en

insectos colectados de la zona algodonera, para poder conocer la velocidad con que la resistencia

es adquirida por las diferentes especies de insectos y predecir el lapso de tiempo que tardará en

ganarse la resistencia en forma natural en campo

3. Generar planes de manejo mediante los que se pueda disminuir en campo la velocidad

con que se desarrolla la resistencia, así como la manera y prevenirla antes de que se presente

en campo

4. Identificar, si los resultados así lo permiten, medidas de seguridad para actuar en caso de

que se generen resistencias en campo, dando seguridad al productor agrícola y al país.

Considerar incluir elementos evaluación y protección al medio ambiente, diversidad biológica y

sanidades

Meta:

Generar información, herramientas y estrategias para contrarrestar la resistencia que

seguramente se generará por el uso continuo de OGM, para utilizarla en el momento en que la

resistencia se presente en el campo y constituya un problema real.


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Materiales y Métodos

Actividad 1: “Evaluación de la frecuencia de alelos de resistencia a las -endotoxinas Cry1Ac y

Cry2Ab de Bacillus thuringiensis y susceptibilidad a otras toxinas Cry en insectos del orden

lepidóptera en la zona de cultivo de algodón transgénico”.

1. Lugares de visita y colecta y obtención de la colonia: Mexicali, BC, Sonoita, Sonora y La

Laguna. Usamos Helicoverpa zea obtenida de la Laguna obtenida de cultivos no Bt. La

instalación de la colonia en el lab, requirió de cinco generaciones (F5), casi cinco meses. Una

que la colonia fue estable, determinamos la LC50 para Cry1Ac y, posteriormente para Cry2Ab.

2. Purificación de protoxinas a partir de cepas recombinantes: Microorganismos: Cry1Ac fue

obtenida a partir de Bacillus thuringiensis var. kurstaki cepa HD73, la cual pertenece a la

colección del laboratorio 4 del Instituto de Biotecnología de la UANL. La protoxina Cry2Ab se

obtuvo de la cepa recombinante ECE-126 de Escherichia coli procedente del “Bacillus Genetic

Stock Center”.

3. Obtención y solubilización de Cry1Ac: Para la purificación y solubilización de los cristales

proteínicos se siguió el protocolo de Iracheta-Cárdenas (2000). Purificación Cry1Ac: Inocular

tubos de vidrio conteniendo 5 ml de caldo nutritivo estéril con una asada de la cepa HD-73 e

incubar a 28°C en agitación a 150 rpm durante toda la noche.

a) Verter el medio de los tubos a matraces de 1L conteniendo 200 ml de medio nutritivo

estéril. Incubar los matraces a 28°C en agitación constante de 150 rpm durante 48-72 h

para propiciar la esporulación.

b) Centrifugar a 7000xg durante 5 min a 4°C para separar la mezcla de esporas-cristales

desechando así el sobrenadante.

c) Lavar la pastilla resultante con NaCl 1M con un ciclo de centrifugación a 7000xg por 5 min.

d) Lavar dos veces la pastilla con NaCl 1M/EDTA 5mM utilizando el mismo ciclo de

centrifugación.

e) Lavar una vez la pastilla con KCl 10mM utilizando el mismo ciclo de centrifugación.

Solubilización Cry1Ac: Resuspender el precipitado resultante en tampón de carbonatos

(NaCl 100mM/ Na2CO3 50mM/ DTT 10mM) a pH 11.5. Incubar solución durante 2 h en

agitación constante de 150 rpm a TA. Centrifugar a 14000xg durante 10 min para obtener el

sobrenadante, el cual contiene la protoxina solubilizada


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4. Purificación y solubilización de Cry2Ab: Para la purificación de protoxina Cry2Ab se utilizó

una modificación al protocolo de Shantanu y Udayasurivan (2004).

Purificación Cry2Ab: Inocular con la cepa ECE-126 (Zeigler, 1999) tubos de vidrio

conteniendo 5 ml de caldo LB estéril con una concentración de 100 µg/ml de ampicilina e

incubarlos a 30°C durante toda la noche.

a) Verter el medio de los tubos en matraces de 1L conteniendo 200 ml de caldo LB estéril con

una concentración de 100 µg/ml de ampicilina y 1mM de IPTG e incubaros a 30°C durante

toda la noche.

b) Centrifugar a 10000 rpm por 10 min a 4°C para obtener el paquete celular. Desechar el

sobrenadante.

c) Resuspender el paquete celular en un tampón de lisis (Tris-HCl 25mM/NaCl 100mM/EDTA

1mM) a pH 8.0.

d) Sonicar la solución por 30 ciclos (15 on: 15 off) en frío durante 20 min.

e) Centrifugar a 10000 rpm por 15 min a 4°C y desechar el sobrenadante.

f) Lavar dos veces el precipitado con NaCl 0.5 M/Triton X-100 1% utilizando ciclos de

centrifugado de 10000 rpm por 5 min.

g) Lavar tres veces el precipitado con agua destilada estéril utilizando el mismo ciclo de

centrifugación.

Solubilización Cry2Ab: Resuspender el precipitado en un tampón de carbonatos

(Na2CO3 50mM/ DTT 10mM) a pH 10.0. Incubar la solución durante dos horas en agitación

constante de 150 rpm a 37°C. Centrifugar a 12000xg por 15 min y colectar el

sobrenadante.

5. Evaluación de la calidad y cantidad de toxina obtenida: La confirmación de la presencia

de las toxinas en el purificado final se llevó a cabo con inmuno-tiras Bt-Cry1Ab/Cry1Ac y Bt-

Cry2A InmunoStrip® Test de Agdia® y la calidad de las toxinas purificadas fue evaluada en

SDS-PAGE de distintas concentraciones de poliacrilamida. Finalmente, la proteína total

soluble fue evaluada mediante el método de Bradford (1976).

6. Bioensayos, Concentración letal media (LC50) de los productos Cry1Ac y Cry2Ab: Los

bioensayos fueron iniciados con las colonias resistentes y la LC50 se llevó a cabo usando siete

concentraciones distintas de las toxinas de acuerdo a lo reportado anteriormente (Iracheta et

al., 2000; Marroquín et al., 2009). Como control negativo usamos dieta normal a la cual

agregaremos agua estéril en lugar de toxina. En breve: Los experimentos se llevaron a cabo

en placas plásticas de 24 orificios con 2 ml de dieta artificial c/u. Las placas con dieta fueron

secadas y añadida la toxina. Iniciaremos con siete dosis preliminares: 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10.0,


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30.0 y 100.0 g de proteína/cm2 de dieta más el testigo sin toxina. Los bioensayos fueron

realizados con 12 larvas (una por orificio) por dosis. Las placas cubiertas con plástico delgado

con pequeñas incisiones de alfiler fueron incubadas cinco días en cámaras a 26ºC y 65% de

humedad. La mortalidad evaluada y comparada con el control.

7. Determinación de resistencia: Las larvas que sobreviveron a 10 g/ml pueden ser

consideradas como resistentes (Tabashnik et al., 2000). Estas llevadas hasta adultos y

repetimos los ensayos de resistencia por dos generaciones más para obtener mayor cantidad

de adultos para los ensayos de segregación. De a cuerdo a Tabashnik y col (2005) en el

“gusano rosado”, Cry1Ac a 10 g/ml mata a homo (SS) y heterocigotos susceptibles (RS), pero

los homocigotos resistentes (RR) sobreviven (Tabashnik et al., 2005).

Obtención de la F2: Los ensayos de segregación se realizaron como sigue:

Padres Lab (SSensible) x RResistente (Sobreviviente a > 10 g/ml)

Las cruzas se realizaron con por triplicado con, al menos 200 larvas por bioensayo a partir

de la F2 (esquema izquierda) y F2 (RC). La concentración de selección fue de 10 g/ml de dieta.

Actividad 2: “Potencial para el desarrollo de resistencia en plagas de algodón a la toxina

Cry1Ac de Bacillus thuringiensis kustaki Berliner”

1. Selectividad de las colonias a los formulados con Cry1Ac: Usamos Helicoverpa zea

obtenida de la Laguna a partir de cultivos no Bt. La instalación de la colonia en el lab, requirió

de cuatro generaciones (F4), casi cinco meses. Una que la colonia fue estable, determinamos

la LC50 para Cry1Ac.

SS x RR

F1, RS

RS x RS

F2, RR + RS + SS

SS x RR

F1, RS

RS x SS

F2 (RC), RS + SS


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2. Muestreo de algodón GM: Toma de muestras de hojas, flores, bellotas y algodón fueron

obtenidas en viajes a campo en las hectáreas donde el algodón transgénico es sembrado para

verificar la expresión de las proteínas Cry1Ac y Cry2Ab y resistencia a glifosato, dicha prueba

fue realizada a base de inmunotiras Agdia® y el protocolo fue seguido de acuerdo a la

instrucciones del producto.

3. Concentración letal media (LC50) de la protoxina Cry1Ac: Los bioensayos para determinar

la LC50 se llevaron a cabo usando ocho concentraciones distintas de la protoxina Cry1Ac. La

protoxina fue preparada esencialmente de acuerdo a lo reportado previamente (Iracheta et al.,

2000; Marroquín et al., 2009). Como control negativo usamos dieta normal a la cual agregamos

agua estéril en lugar de protoxina. En breve: Los experimentos fueron hechos en placas

plásticas de 24 orificios con 2 ml de dieta artificial c/u a la cual se le adicionó la protoxina.

Iniciamos con siete dosis preliminares: 01., 0.5, 1, 5, 10, 20, 50, 100 µg/g de dieta más el

testigo sin protoxina. Posteriormente usamos 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 5 y 10 g/g dieta. Los

bioensayos fueron realizados con 48 larvas por dosis. Las placas cubiertas con plástico

delgado con pequeñas incisiones de alfiler. Las placas fueron incubadas durante siete días en

cámaras a 28ºC y 70% de humedad. La mortalidad fue evaluada y comparada con el control.

4. Determinación de resistencia: Una vez establecida la colonia, fueron iniciados los

bioensayos con larvas neonatas. La protoxina Cry1Ac solubilizada, colocada por separado a

dos dosis, 10 y 20 μg/g de dieta. Usamos lotes de 200-400 larvas por dosis. El control de este

experimento, fueron colonias no sujetas a presión artificial. El bioensayo se realizó de la

siguiente manera: La dieta con la protoxina incluida fue colocada en placas plásticas de 24

orificios cada una, posteriormente una larva fue colocada en cada orificio e incubadas 7 días

bajo las condiciones señaladas. Las larvas sobrevivientes a 10 μg/g de dieta fueron

consideradas como resistentes (Tabashnik et al., 2000). Estas fueron llevadas hasta adultos y

repetimos los ensayos de resistencia por dos generaciones más para obtener mayor cantidad

de adultos para los ensayos de segregación.

5. Ensayos de segregación: Después de conseguir colonias resistentes de H. zea, las pupas

fueron sexadas y colocadas en camaradas de oviposición para realizar un experimento del

costo de selección a la toxina y herencia de la resistencia en las siguientes generaciones,

siguiendo este arreglo:


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Estrategia de segregación de la resistencia

♂ Susceptibles X ♀ resistentes

♀ Susceptibles X ♂ resistentes

♀ Resistentes X ♂ resistentes

♀ Susceptibles X ♂ Susceptibles

Con el fin de determinar el mecanismo de herencia de la resistencia a Cry1Ac se realizaron

2 retrocruzas: Hembras resistentes con Machos susceptibles (HR x MWt) y Machos resistentes

con Hembras susceptibles (MR x HWt). Dependiendo del modo de transmisión del o los genes,

puede haber 2 respuestas: que la resistencia se asocie a genes autosómicos dominantes o bien,

que esté ligada al sexo. Si fuese dominante, hacia la F1 la gran mayoría serían individuos

resistentes homocigotos y heterocigotos (RR y RS).

Wt = SS; RS; RR x HzR = RS; RR

F1 = RS; RR

Si la resistencia a Cry1Ac es de carácter recesivo, ésta solo se podría observar si el o los

genes estuvieran ligados al sexo. En uno de los casos la resistencia se heredaría a través del

cromosoma “Z”, y tanto machos (ZZ) como hembras (ZW) resistentes producirían progenie

resistente.

ZRZS x ZRW; ZSW ZSZS; ZRZS x ZRW

F1 = ZRZS; ZRW F1 = ZRZS; ZRW

Por otro lado, si se hereda por vía materna, toda la progenie de hembras resistentes sería

también resistente, mientras que la de los machos resistentes sería susceptible, ergo, la

transmisión de la resistencia a la F1 estaría restringida a las hembras, ya que son hemicigóticas

en los cromosomas sexuales (Ma et al., 2005).

HR (ZW) x MS (ZZ) HS (ZW) x MR (ZZ)

F1 = HR (ZW); MR (ZZ) F1 = HS (ZW); MS (ZZ)

Las cruzas fueron realizadas con 10 machos y 10 hembras. La F1, 240 larvas por cruza

fueron sometidas a bioensayos utilizando 20 μg/ml de Cry1Ac y posteriormente se transfirieron a

cría.


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6. Identificación de genes de receptores asociados al mecanismo de resistencia,

Extracción de ADN: Fue utilizado un protocolo modificado de extracción de ADN realizado

por el laboratorio UEG (2009) con fenol:cloroformo:alcohol Isoamilíco (24:24:1). Tejido

utilizado: Larva completa, intestino, pupa o adulto. Precalentar el buffer de extracción a 55°C

por 10 min en un tubo de 1,5 ml introducir 20 g de tejido. Agregar 500 µl del buffer de extracción

precalentado. Picar el tejido con la tijera hasta tener trozos muy pequeños. Agregar 10 µl de

Proteinasa K (20 mg/ml). Incubar a 55°C por una noche entera. Agregar 500 µl de

fenol:cloroformo:alcohol isoamilíco. Resuspender por inversión cuidadosamente hasta que se

forme una emulsión (unas 30 inversiones). Centrifugar a 8000 rpm durante 10 min. Transferir

la fase acuosa (la de arriba) con una pipeta a un tubo nuevo de 1,5 ml. Repetir la limpieza con

fenol:cloroformo:alcohol Isoamilíco (pasos 7-8-9). Agregar un volumen de NaCl (5 M)

correspondiente al 10% de la muestra, y mezclar bien. Agregar un volumen de isopropanol frío

correspondiente al volumen de la muestra resultante del punto 10. Incubar a -20°C de 2 h en

adelante. Centrifugar a TA, a 12000 rpm durante 5 min y descartar líquido por inversión del

tubo. Agregar 400 µl de etanol frio al 70%. Centrifugar a TA a 12000 rpm durante 3 min y

descartar el líquido por inversión del tubo. Dejar secar el ADN a TA, con el tubo abierto.

Resuspender en 50 µl de T10E1 (10mM) y agregar 1 µl de RNasa (10 mg/ml). En su defecto

resuspender en agua milliQ autoclavada. Incubar A 37°C por 20 min.

7. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Los iniciadores diseñados a partir de las

secuencias nucleotídicas depositadas en el Genbank de los receptores. Se utilizaron los

iniciadores específicos cadLHz (GenBank: AY909578.1), apn1Ha (GenBank: EU568874.1) y

apn2Ha (GenBank: AY279536.1) para amplificar las regiones específicas para la cadherina y

dos diferentes tipos de aminopetidasas a partir de 10 ng de DNA genómico con una mezcla

de reacción que incluye Tris -HCl 10 mM, pH 8.5, KCl 50 mM, MgCl2 1.5 mM, 200 μM de cada

dNTP´s (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 100 nM de cada iniciador y 0.5 U de Taq DNA polimerasa.

Los productos se observaron en geles de poliacrilamida-SDS al 10%.

8. Evaluación del cambio en la aptitud biológica: Para analizar el efecto en la aptitud biológica

que supone la adquisición de resistencia se comparó el tamaño, el tiempo necesario para

alcanzar la fase de pupa y adultez, el peso promedio de pupas, el porcentaje de emergencia

de adultos, la producción de huevecillos, el porcentaje de eclosión y finalmente el porcentaje

de mortalidad en cada fase de las líneas resistentes frente a la sensible.


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Tabla 1. Iniciadores utilizados para la amplificación de genes de los receptores involucrados en la resistencia en lepidópteros.

Iniciador Secuencia (5'-3') Tamaño (pb) Clave

CadLHzF ATGGAGGAAACTGCGATGACCCTG 190 AY909578.1

CadLHzR CTCTGGCACTTCGAAGTCCAGCAT

Apn1HaF AATTCCAGCCTGGCCACGCTC 346 EU568874.1

Apn1HaR GCGCTCCATGACTTCCAAGAGA

Apn2HaF CACATGTGGTTCGGTAACCTGG 291 AY279536.1

Apn2HaR CGAGAAGATGCTCAGTCATTCTG

9. Evaluación de resistencia cruzada: Para evaluar la resistencia cruzada entre las toxinas

Cry1Ac y Cry2Ab se realizaron tres bioensayos. El primero consistió en administrar las dos

toxinas al mismo tiempo a una concentración individual de 10 µg/ml a larvas sensibles, el

segundo se llevó a cabo utilizando larvas resistentes a Cry1Ac a las cuales se les administro

toxina Cry2Ab a una concentración final de 10 µg/ml en la dieta y por último el tercero se llevó

a utilizando larvas resistentes a Cry2Ab a las cuales se les administro la toxina Cry1Ac a la

misma concentración. Todos los bioensayos fueron llevados a cabo en vasos de plástico del

No. 0A con 10 ml de dieta tratada. Se contó con grupos control en cada uno de los bioensayos.


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Resultados

Lugares de visita y colecta: Mexicali, BC, Sonoita, Sonora y La Laguna. En cada una de las

ciudades visitadas, colectamos, al menos, en tres predios diferentes. Las muestras de hojas,

flores y bellotas colectadas, fueron probadas para evaluar la expresión de la toxina Cry1Ac con

las inmunotirillas.

Figura 1. Vista general de

los cultivos en Mexicali,

BC. Imágenes: 1, Becario

Saúl Martínez (con mochila)

e Ing. Ari Mateos,

responsable de Monsanto

(camiseta azul y sobrero); 2,

Becario y Dr. Pereyra

Vista general de los cultivos

en Sonoita, Son.

Imágenes: 3, Dr. Pereyra,

Ing. Mateos y productor Ing.

Paredes; 4, Becario Saúl

Martínez (con mochila); 5-6,

Quelite atacado por S.

frugiperda

Vista general de los cultivos

en La Laguna (San Pedro

de las Colonias, Coah.

Imágenes: 7, Becarios

Jesús Medina y Saúl

Martínez (izquierda); 8,

Becarios con los Ingenieros

responsables Técnicos de

Monsanto


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Solo en los cultivos de Sonoita, Son., encontramos evidencia de la presencia de

lepidópteros, especialmente de Spodoptera frugiperda. Esta evidencia fue encontrada en plantas

NO algodoneras, específicamente en quelite. Sin embargo no encontramos ninguna forma de

vida del insecto, huevos, larvas o adultos (Fig. 1, imágenes 3-6).

Expresión de Toxina Cry1Ac, Cry2Ab y resistencia a glifosato (CP4 EPSPS): Las inmunotiras

fueron depositadas en una solución donde previamente se había macerado hojas del algodón

GM de las zonas de producción del norte del país. Las figuras 2-4 muestran el proceso general

de la detección. La parte superior de la tira la línea control y la parte inferior la línea positiva a la

presencia de Cry1Ac, Cry2Ab o resistencia a glifosato (RR).

Nuestros resultados indican que, al menos en los predios visitados NO existe algodón

100% convencional. El que no contiene los genes cry, posee los genes para la resistencia a

glifosato (RR).

Línea

control

Figura 2. Inmunotiras Agdia®

presentando positivo a Cry1Ac,

Cry2Ab y resistencia a herbicidas

(RR), en la localidad San Pedro de las

Colonias, Coah. 2013.

Línea

positiva

Figura 3. Hojas utilizadas en el diagnóstico de

expresión del algodón GM


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Obtención de proteínas Cry1Ac y Cry2Ab: La protoxina Cry1Ac fue obtenida a partir del cultivo

de la cepa de Bt HD73, realizándose primeramente en placas de agar nutritivo y posteriormente

transfiriéndolas en matraces con caldo nutritivo. Obtuvimos concentraciones desde 1-6 mg/ml de

la proteína solubilizada la cual fue almacenada a -20°C hasta el momento de su uso. Las

proteínas fueron visualizadas y cuantificadas en geles de poliacrilamida (Fig. 5A y 5B), donde

usamos BSA como estándar para cuantificar a concentración de Protoxina.

Figura 5. Gel de poliacrilamida-

SDS al 10% de la protoxina Cry1Ac

(Panel A) y Cry2Ab (Panel B).

Panel A, carril 1. Marcador de peso

molecular. Carriles 2-7. Albumina

(BSA). Carril 8-10. Toxina Cry1Ac.

Protoxina 130 kDa

BSA

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figura 4. Inmunotiras Agdia® presentando

positivo a Cry1Ac, Cry2Ab y resistencia a

glifosato (CP4 EPSPS), en las localidades de

San Rafael, Mexicali en Baja California norte y

Sonoyta en Sonora, 2013

A


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Determinación de la LC50: Después de tres bioensayos realizados durante la cría de H. zea

sometiendo a las larvas a diferentes concentraciones los resultados fueron ingresados al

programa BMDS (Benchmark Dose Software) proporcionado por la EPA dando la cifra promedio

de 1.309 µg/gramo de dieta como la LC50 referente para el estudio (Fig. 6).

Figura 5 B. Proteína Cry2Ab. Geles de poliacrilamida-SDS. Del lado izquierdo se muestra un gel de poliacrilamida-SDS al 10% donde M es el marcador de peso molecular y los carriles 1-4 son muestras de la protoxina Cry1Ac (130 kDa). Del lado derecho se muestra un gel de poliacrilamida-SDS al 8% donde los carriles 1 y 2 son muestras de la protoxina Cry2Ab (70.7 kDa).

B

Figura 6. Placa de 24 orificios empleada en la determinación de la LC50 y los bioensayos de resistencia.


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Bioensayos de resistencia. Cry1Ac: Desde enero del 2013 se realizaron bioensayos de

exposición progresiva de Cry1Ac en las cuales fueron establecidas dos colonias de H. zea

resistentes a 10 µg/g y 20 µg/g. La Tabla 2 muestra la evolución de los bioensayos. Durante el

desarrollo de los bioensayos se presentaron aparte de la alta mortalidad de larvas, prolongación

de los estadios larvales, prolongación del estado de pupa, pupas deformes, una mayor producción

de machos en comparación a las hembras y baja producción de huevecillos. El efecto de la toxina

es evidente y se observa en la figura 7.

Bioensayos de resistencia Cry2Ab: Los bioensayos de resistencia comenzaron el mes de

septiembre y finalizaron en el mes de diciembre 2016. Durante este tiempo se llevaron a cabo

cinco bioensayos para cada una de las protoxinas (Cry1Ac y Cry2Ab). La tabla 3 engloba los

resultados de todos los bioensayos de manera cronológica. Según la prueba estadística T para

muestras independientes (Tabla 4), H. zea, demostró menor susceptibilidad hacia la toxina

Cry2Ab frente Cry1Ac debido a que hubo diferencia significativa entre las medias de

sobrevivencia de ambas líneas con mayor porcentaje de supervivencia entre las larvas tratadas

con Cry2Ab a aquellas que fueron tratadas con Cry1Ac. Durante el transcurso de los bioensayos

se observó además de alta mortalidad, una prolongación de estadios en comparación con la línea

susceptible y un alto porcentaje de infertilidad de huevecillos, sin embargo, aunado a el bajo

porcentaje de sobrevivencia, se logró establecer una línea resistente para Cry1Ac y otra para

Cry2Ab. Pero éstas colonias colapsaron en febrero de 2015 (Dato no mostrado).

Por tal motivo fue importante establecer otra colonia. Esta segunda colonia fue

proporcionada por el Dr. Concepción Rodríguez, la cual proviene de San Pedro de las Colonias,

Figura 7 Diferencia de tamaño entre una larva control (lado izquierdo) y una larva expuesta a una

concentración de 10 µg/g de protoxina Cry1Ac (lado derecho) después de una semana.


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Coah. a partir de campos de cultivos no Bt. La segunda colonia fue establecida en junio de 2015

y mantenida por seis generaciones sin ser expuestas a proteínas Cry. Los retos con Cry1Ac

iniciaron en enero de 2016.

Tabla 2. Transcurso cronológico de los ensayos en H. zea.

Fecha Clave Concentración Larvas expuestas

Sobrevivientes %

21/01/13 Hz0 0.1-100 µg/g 216 *

19/02/13 Hz20a (F1) 20 µg/g 96 32 33.3%

27/02/13

Hz20a (F1)

Hz50a (F1)

20 µg/g

50 µg/g

120

120

12

0

10%

0%

01/04/13

Hz20b(F1)

Hz20a (F2)

20 µg/g

20 µg/g

432

96

68

19

15.74%

19.79%

30/04/13

Hz20b (F2)

Hz20a (F3)

20 µg/g

20 µg/g

68

19

24

7

35.29%

36.84%

10/05/13

Hz10a(F1)

Hz20c(F1)

10 µg/g

20 µg/g

216

216

127

79

58.79%

36.57%

20/05/13

Hz20b (Hz20b(F1) y Hz20a(F3)

Dieta sin protoxina

105 76 72.38%

26/06/13

Hz20b* Dieta sin protoxina

** ** **

26/06/13

Hz20c (F2) Hz10a (F2)

20 µg/g 10 µg/g

240 240

67 113

27.91% 47.08%

*No contabilizado; **La colonia colapso al producir huevecillos infértiles.

Tabla 3. Cronología de los bioensayos de selección y sobrevivencia de la segunda colonia.


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Tabla 4. Prueba de muestras independientes. Se observa que P-valor (0.010) es menor que α (0.05) por lo que existe

diferencia significativa entre las medias de sobrevivencia de Cry1Ac y Cry2Ab.

Cruza de colonias Cry1Ac: Previo a la cruza, las larvas fueron separadas por sexo (Fig. 8). La

cruza de colonias fue realizada el 15 de julio del 2013 entre colonias resistentes de 20 µg/g

(machos y hembras) y 10 µg/g (machos y hembras) con colonias susceptibles pertenecientes al

laboratorio de cría de insectos del Instituto de Biotecnología (Tabla 5).

Tabla 5. Cruza de colonias de H. zea.

Machos Hembras Resultado

12 machos de Hz10a (F2) 18 hembras susceptibles Huevecillos viables (F3)

10 machos susceptibles

20 hembras de Hz10a (F2) Huevecillos infértiles

12 machos de Hz20c (F2)

18 hembras susceptibles Huevecillos viables (F3)

10 machos susceptibles 19 hembras de Hz20c (F2) Huevecillos infértiles

Figura 8. Determinación de sexos en H. zea del lado izquierdo se encuentra un macho y del lado derecho una hembra.


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Bioensayos de resistencia con la cruza de colonias: Después de la cruza de las colonias se

procedió a realizar más ensayos de resistencia a la protoxina Cry1Ac, en la tabla 6 se muestra el

seguimiento en los ensayos de resistencia a partir de los huevecillos fértiles procedentes de la

cruza de colonias.

Tabla 6. Bioensayos de resistencia con la cruza de colonias.

Fecha Clave Concentración Larvas

expuestas

Larvas

sobrevivientes

Porcentaje

30/07/13 Hz10

Hz20

10 µg/g

20 µg/g

370

370

313*

326*

84.59%*

88.1%*

04/10/13 Hz10

Hz20

10 µg/g

20 µg/g

360

360

101

93

28.05%

25.8%

*Proteína degradada.

Segunda cruza de colonias: La segunda cruza de colonias fue realizada el 6 de noviembre del

2013 entre colonias resistentes de 20 µg/g (machos y hembras) y 10 µg/g (machos y hembras)

con colonias susceptibles pertenecientes al laboratorio de cría de insectos del Instituto de

Biotecnología (Tabla 7).

Tabla 7. Segunda cruza de colonias de H. zea.

Machos Hembras Resultado

10 machos de Hz10 13 hembras susceptibles Huevecillos viables

7 machos susceptibles 8 hembras de Hz10 Huevecillos infértiles

9 machos de Hz20 10 hembras susceptibles Huevecillos infértiles

10 machos susceptibles 14 hembras de Hz20 Huevecillos infértiles.

Resumen de los Bioensayos Cry1Ac

Protoxina

Cry1Ac (g)

Sobrevive/Expuestas %

10 360 / 696 51.7 % (F= 0.52)

20 412 / 1527 26.98 % (F= 0.23)

50 71 / 478 14.8 % (F= 0.025)


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No encontramos insectos, lepidópteros, en ninguno de los campos visitados en Mexicali,

BC., Sonoita, Son. y La Laguna

Los campos algodoneros visitados NO cultivan algodón 100% convencional. El llamado

“convencional” contiene resistencia a gliofosato (RR)

Ensayos en laboratorio para Cry1Ac demostraron una LC50 de 1.309 µg/gramo de dieta

Los resultados de bioensayos demostraron que la resistencia se hereda de manera

parcialmente dominante y está asociada a un gene que impacta más a hembras.

La proporción de macho:hembra en la población resistente a nivel de pupa es de 2:1.

Contrario a lo reportado previamente

La F2 en cruzas entre resistentes generan progenie estéril

La F2 en cruzas con normales, demostró que las hembras resistentes generan adultos

estériles

La F2 de macho Resistente con Hembra sensible generó progenie fértil

Bioensayos y cruzas

Tras la selección con la toxina en la línea Hz-1 se lograron obtener 2 líneas genéticas resistentes:

Hz1-R10 y Hz1-R20 utilizando 10 y 20 μg de toxina respectivamente, pero debido a la alta

mortalidad de larvas e infertilidad en los adultos de dichas líneas se obtuvieron dos líneas

resistentes nuevas: Hz10-F1’ y Hz20-F1’, que también se perdieron por infertilidad. Después de

un tiempo de no producir progenie suficiente para realizar los bioensayos, la línea base Hz-1

terminó por colapsar. Posteriormente obtuvimos una línea base nueva, HzSPC de la cual se

seleccionó una línea resistente a 20 μg/g dieta, denominada Hz2-R, que se mantuvo por 4

generaciones de selección constante. Los porcentajes de sobrevivencia de las larvas en cada

generación y de las cruzas se muestran en la Tabla 8.

RR

RR= 100% RR

RS= 50% RR 50% RS SS= 100% RS

SS

RR= 100% RS

RS= 50% RS 50% SS SS= 100% SS

Genotipo de la Población

No puede ser RR: Porque nuestros resultados darían un 100 % de sobrevivencia

No puede ser SS: Porque NO habría sobrevivientes. Mortalidad 100%

Nuestra población contiene todos los genotipos (RR; RS y SS) y se aparean de manera

homogénea

RR= 50% RR 50% RS

RS= 25% RR 50% RS 25% SS SS= 50% RS 50% SS

RS


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Tabla 8. Cronología de los bioensayos de selección y mantenimiento bajo presión de selección.

Fecha Línea Sensibles expuestas

Sobrevivientes/ no expuestas

Pupas Adultos Sobrevivencia

(%)

04/10/2013 Hz10-F1 360 101 62 (31♀ y 31♂)-20* 33 28.06

Hz20-F1 360 93 85 (35♀ y 50♂) 20 25.83

22/11/2013 Hz10-F2 192 58 ?? ?? 30.21

Hz10♂ x Wt♀-F1 264 77 ?? ?? 29.17

10-14/01/2014 Hz10♂ x Wt♀-F2 - 133 56 (22♀ y 34♂) 46 (19♀ y 28♂) -

Hz20-F2 - 135 110 (54♀ y 56♂) 94 (44♀ y 50♂) -

26/02/2014 Hz20-F3 240 119 ?? ?? 49.58

30/05/2014

Hz10-F1' 240 138 86 64(24♀ y 40♂) 57.50

Hz20-F1' 240 111 71 38 46.25

Hz50-F1 65 38 16 -

14/11/2014 Hz susceptible** - - 57 (28♀ y 29♂) 54 (27♀ y 27♂) -

01/12/2014 Hz20b-F1 936 654 200 (110♀ y 90♂)-20* 135 (77♀ y 58♂) 69.87

24/01/2015 Hz20b-F2 672 117 44 (23♀ y 21♂) (16♀ y 18♂) 17.41

Hz20b♀ x Wt♂ 192 30 18 (8♀ y 10♂) 15 15.63

17/02/2015 Hz20b-F3 227 106 41 (23♀ y 28♂) - 46.70

11/05/2015 Hz20b-F4 480 93 - - 19.38

Durante el desarrollo de los individuos de las líneas resistentes, se observaron diferencias

notables en la aptitud biológica de éstas con respecto a la susceptible. El estado larvario se

prolongó de 7 días más a incluso 15 días durante el invierno, resultando en un estado larvario

con 1 mes de duración, mientras que en las susceptibles sólo se prolongaba unos 5 días como

máximo durante el invierno. El crecimiento de las larvas se vio claramente disminuido en las

líneas resistentes, y hubo una tasa de mortalidad en pupas de un 17%, mientras que en la línea

susceptible fue prácticamente nula. Algunas larvas no lograban completar el proceso de pupación

y las pupas no se lograban desarrollar por completo, por lo que se consideraron como muertas.

Estas características fueron observadas en ambas colonias y se muestran en la Figura 10; sin

embargo, durante las últimas generaciones de la línea Hz2-R los adultos resultantes no lograban

producir progenie o ésta era poca, y finalmente terminó por colapsar.


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Debido al retraso en el desarrollo de los individuos resistentes, no siempre hubo adultos

susceptibles y/o resistentes al mismo tiempo, por lo cual sólo se pudieron realizar 2 cruzas: la

primera con la línea genética Hz1-R10 de la cual sólo los machos resistentes produjeron progenie

con las hembras susceptibles; y la segunda con Hz2-R. En esta última, hubo descendencia en

hembras resistentes, y fue sometida a selección con Cry1Ac, sin embargo, 2 días después los

huevecillos producto de la cruza con machos resistentes originaron larvas, pero estas no fueron

sometidas a la toxina debido a la falta de ésta y murieron al poco tiempo. Los resultados de

sobrevivencia en las dos cruzas se muestran en la Tabla 8. La descendencia de la cruza con

machos resistentes, fue prácticamente el doble (29. 17%) de la resultante de hembras resistentes

(15.63%). En la primera línea genética Hz-1, que se encontraba disponible en el instituto, las dos

colonias resistentes que obtuvimos fueron Hz10 y Hz20. Hz10 produjo 2 generaciones, con una

sobrevivencia del 30% prácticamente en ambas, en Hz10-F1 el porcentaje fue de 57.5%,

contrastando con las dos anteriores. La otra línea, Hz20, produjo 3 generaciones, de las cuales

la F1 tuvo una sobrevivencia del 25.83%.

Durante las primeras generaciones de Hz10 y Hz20 se puede observar que el porcentaje

de sobrevivencia se mantuvo alrededor del 28%, mientras que hacia la F3, se incrementó hasta

49.58%. Sin embargo, después de esta generación no hubo progenie, por lo que se continuó con

Hz10-F1’, Hz20-F1’, y Hz50-F1; sin embargo, a pesar de un incremento en la supervivencia, los

adultos no produjeron huevecillos viables y finalmente las líneas terminaron por colapsar,

incluyendo la susceptible. Con la segunda línea genética susceptible*, se obtuvieron 4

generaciones, pero la supervivencia demostró ser muy variable en cada generación. Las retro

Figura 10. Arriba: Las larvas expuestas a Cry1Ac llegaron al 3er estadío en 7 días (izquierda), mientras que el control alcanzó el 4° estadío (derecha). Abajo: Se muestra una pupa completa y tres pupas de la línea resistente que no completaron el proceso de pupación.


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cruzas se realizaron solamente con Hz10-F1 y Hz20b-F1 debido a la diferencia de tiempos de

desarrollo con respecto a las susceptibles.

Al principio, hacia la F1 de la línea Hz, el porcentaje de sobrevivencia fue de casi el 70%,

mostrando un carácter dominante de la resistencia, en donde los individuos sobrevivientes serían

heterocigotos y homocigotos recesivos (RS y RR). Hacia la F2 esperaríamos que todos fueran

resistentes al someterlos a selección, sin embargo, al hacerlo solamente el 17.41% de las larvas

quedaron vivas después de 7 días, y hacia la F3, se incrementó hacia un 46.7% y nuevamente

disminuyó en la F4 hasta 19.38%. Esto podría indicarnos que la resistencia está determinada por

varios genes y/o alelos.

Los resultados de las retrocruzas mostraron una tendencia a ser recesiva en la F1, y

además, la descendencia resultante de la cruza con hembras resistentes fue de un 15.63%,

mientras que en el caso contrario, donde los machos eran los resistentes, fue del doble. Cabe

recalcar que la cruza de machos resistentes se realizó con la línea Hz-1, y en la que obtuvimos

progenie de las hembras resistentes se utilizaron individuos de la HzSPC y HzR-2, por lo cual

pudiera existir un sesgo entre las dos cruzas.

Evaluación del cambio en la aptitud biológica frente a la adquisición de resistencia: Los

datos que se utilizaron para la evaluación de la aptitud biológica fueron: tamaño al tiempo de una

semana, tiempo necesario para formación de pupa, tiempo necesario para emerger, así como los

porcentajes de pupación y emergencia. Los datos se encuentran registrados en la tabla 9. Así

mismo se realizó un análisis estadístico de Tukey (Tablas 10-14) el cual indicó que había

diferencia significativa en cada uno de los factores evaluados tanto entre líneas resistentes

(Cry1Ac y Cry2Ab) como con respecto a la línea susceptible. Además de los datos analizados,

se presentaron malformaciones en las fases de pupa y de adulto (Fig. 11) siendo síntomas de la

disminución en la aptitud biológica.


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Tabla 9. Factores evaluados para el análisis del costo en la aptitud biológica. En negro (arriba) se muestran los datos de la línea resistente a Cry1Ac y en rojo (abajo) se muestran los datos de la línea resistente a Cry2Ab.

Bioensayo Tamaño a los 7 días

Tiempo necesario para

pupar

% pupación

Tiempo necesario

para emerger

% emergencia

1 5.3 mm 7.1 mm

17 días 17 días

60.87 65.79

16 días 16 días

85.71 80

2 5.5 mm 7.2 mm

20 días 19 días

61.11 69.13

17 días 15 días

75.75 66.07

3 2.4 mm 4.6 mm

29 días 25 días

12.28 26.61

24 días 19 días

62.50 72.41

Línea sensible

15 mm 14 días 86.1 15 días 91.3

Figura 11. 1.- Efecto de Cry2Ab. Diferencia de tamaño entre una larva tratada (2 mm) y una larva sensible (15 mm). 2.- Diferencia de tamaño entre una pupa de línea resistente (15 mm) y una pupa de línea sensible (19 mm). 3.- Falla en la emergencia de un adulto tratado. 4.- Muerte por necrosis de una larva tratada. 5 y 6.- Fallo en el proceso de pupación. 7.- Adulto con malformaciones en las alas.


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Tabla 10. Prueba de Tukey para el tamaño de las larvas a los 7 días. Línea 1: Sensible, línea 2: resistente a Cry1Ac y línea 3: resistente a Cry2Ab. Se puede observar que hay diferencia significativa entre las líneas resistentes y la

línea sensible, así como entre ambas líneas resistentes.

(I) Línea (J) Línea Diferencia de medias (I-J)

Error estándar Sig.

Intervalo de confianza al 95%

Límite inferior Límite superior

1.00 2.00 12.60000* .59240 .000 11.0196 14.1804

3.00 10.42000* .59240 .000 8.8396 12.0004

2.00 1.00 -12.60000* .59240 .000 -14.1804 -11.0196

3.00 -2.18000* .59240 .008 -3.7604 -.5996

3.00 1.00 -10.42000* .59240 .000 -12.0004 -8.8396

2.00 2.18000* .59240 .008 .5996 3.7604

*. La diferencia de medias es significativa en el nivel .05.

Tabla 11. Prueba de Tukey para el tiempo necesario para pupar. Línea 1: Sensible, línea 2: resistente a Cry1Ac y línea 3: resistente a Cry2Ab. Se puede observar que hay diferencia significativa entre las líneas resistentes y la línea

sensible, así como entre ambas líneas resistentes.

(I)

Línea

(J)

Línea

Diferencia

de medias

(I-J)

Error

estándar Sig.

Intervalo de confianza al

95%

Límite

inferior

Límite

superior

1.00 2.00 -15.00000* 1.15470 .000 -18.0806 -11.9194

3.00 -11.00000* 1.15470 .000 -14.0806 -7.9194

2.00 1.00 15.00000* 1.15470 .000 11.9194 18.0806

3.00 4.00000* 1.15470 .012 .9194 7.0806

3.00 1.00 11.00000* 1.15470 .000 7.9194 14.0806

2.00 -4.00000* 1.15470 .012 -7.0806 -.9194



30/ 59

Tabla 12. Prueba de Tukey para el porcentaje de pupación. Línea 1: Sensible, línea 2: resistente a Cry1Ac y línea 3: resistente a Cry2Ab. Se puede observar que hay diferencia significativa entre las líneas resistentes y la línea sensible, así como entre ambas líneas resistentes.

(I)

Linea

(J)

Linea

Diferencia

de medias

(I-J)

Error

estándar Sig.


95%

Límite

inferior

Límite

superior

1.00 2.00 73.82000* .65115 .000 72.0828 75.5572

3.00 59.49000* .65115 .000 57.7528 61.2272

2.00 1.00 -73.82000* .65115 .000 -75.5572 -72.0828

3.00 -14.33000* .65115 .000 -16.0672 -12.5928

3.00 1.00 -59.49000* .65115 .000 -61.2272 -57.7528

2.00 14.33000* .65115 .000 12.5928 16.0672


Tabla 13. Prueba de Tukey para el tiempo necesario para emerger. Línea 1: Sensible, línea 2: resistente a Cry1Ac y línea 3: resistente a Cry2Ab. Se puede observar que hay diferencia significativa entre las líneas resistentes y la línea


(I)

Linea

(J)

Linea

Diferencia

de medias

(I-J)

Error

estándar Sig.


95%

Límite

inferior

Límite

superior

1.00 2.00 -9.00000* 1.12546 .000 -12.0026 -5.9974

3.00 -4.00000* 1.12546 .010 -7.0026 -.9974

2.00 1.00 9.00000* 1.12546 .000 5.9974 12.0026

3.00 5.00000* 1.12546 .002 1.9974 8.0026

3.00 1.00 4.00000* 1.12546 .010 .9974 7.0026

2.00 -5.00000* 1.12546 .002 -8.0026 -1.9974



31/ 59

Tabla 14. Prueba de Tukey para el porcentaje de emergencia. Línea 1: Sensible, línea 2: resistente a Cry1Ac y línea 3: resistente a Cry2Ab. Se puede observar que hay diferencia significativa entre las líneas resistentes y la línea


(I) Linea (J) Linea

Diferencia de

medias (I-J)

Error

estándar Sig.

Intervalo de confianza al 95%

Límite inferior

Límite

superior

1.00 2.00 28.80000* .46833 .000 27.5506 30.0494

3.00 18.89000* .46833 .000 17.6406 20.1394

2.00 1.00 -28.80000* .46833 .000 -30.0494 -27.5506

3.00 -9.91000* .46833 .000 -11.1594 -8.6606

3.00 1.00 -18.89000* .46833 .000 -20.1394 -17.6406

2.00 9.91000* .46833 .000 8.6606 11.1594


Evaluación de resistencia cruzada: Para la evaluación de la resistencia cruzada a la colonia

susceptible se le administró una mezcla de dieta con las dos protoxinas a una concentración de

10 µg/ml cada una, mientras que a las líneas resistentes se les intercambió la protoxina. Los

resultados obtenidos (Tabla 15) muestran un porcentaje mayor de sobrevivencia en H. zea

cuando primero se seleccionan con Cry2Ab para después ser enfrentadas a la toxina Cry1Ac.

Tabla 15. Resultados del cambio de protoxinas a las líneas resistentes. Se puede observar como el porcentaje de sobrevivencia de la línea susceptible es muy bajo cuando se administran ambas protoxinas al mismo tiempo.

Línea Concentración Larvas

expuestas Larvas

sobrevivientes %

sobrevivencia

Susceptible 10 µg/ml 10 µg/ml

100 5 5

Resistente Cry1Ac

10 µg/ml 85 6 7.05

Resistente Cry2Ab

10 µg/ml 123 44 35.77

*. Concentración: En negro (arriba) concentración Cry1Ac y en rojo (abajo) concentración Cry2Ab.

Genes y proteínas asociados al mecanismo de resistencia: Los iniciadores establecidos para

los dos tipos de aminopeptidasas (Apn1 y Apn2) y una cadherina fueron amplificados mediante

PCR y observados por electroforesis en gel de poliacrilamida al 10%, esperando un tamaño de

346 pb para Apn1Ha, 291 pb para Apn2Ha y 190 pb para CadLHz (Fig. 12).


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Enzimas (Proteasas y Fosfatasas): En total se reportan 2 zimografías, la primera con vesículas

de la línea HzS y HzR20-F2¨que se comparó con muestras de Trichoplusia ni; mientras que la

segunda se realizó con muestras de la línea HzSPC y Hz2R-F1que se comparó con Spodoptera

exigua. Cada una se realizó por triplicado. En la primer zimografía correspondiente a las líneas

HzS y HzR20 se observaron 2 mismas bandas en los 4 grupos y aparentemente una banda

adicional en la muestra HzS intoxicada (carril 5) (Fig. 13), lo cual contrastó con T. ni, que mostró

un barrido uniforme sin bandas definidas, producto de la alta cantidad y actividad de proteasas.

1 2 3 4 5 6 7 8

9 10 11 12

Figura 12. PCR con los iniciadores Apn1Ha, Apn2Ha y CadLHz. Carriles. 1, Marcador de talla molecular; 2-4, 1- Apn1 en larva, pupa y adulto; 5, control negativo; 6-8, Apn2 en larva, pupa y adulto; 9, Marcador de talla molecular; 10-12, CadLHz en larva, pupa y adulto. Electroforesis en gel de agarosa al 1.0% en buffer TAE.

Intoxicadas Intoxicadas Tripsina T. ni HzS R20-F2’ HzS R20-F2’ Tripsina S. exigua HzSPC R2-F1 HzSPC R2-F1

Figura 13. Zimografía con las muestras HzS y HzR20-F2’, Izquierda y HzSPC y HzR2-F1 Derecha. Con excepción de

tripsina, (0.5 µg), en cada ensayo se usaron 5 g de proteína total. Se puede observar el barrido en cada muestra además de las 2 bandas que anteriormente se observaron en la línea HzS y HzR20-F2’. Incluso se puede observar una tercera banda en el carril 5 (HzSPC intoxicadas)

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6


33/ 59

Por otro lado, las muestras de las líneas HzSPC y HzR, exhibieron una actividad proteolítica

distinta a las primeras (Fig. 13 arriba). Se pudo observar que la actividad proteolítica es mayor

que en la primera línea, pues se produjo un barrido a diferencia de bandas bien definidas como

en el primer caso. Sin embargo, se puede apreciar la presencia de las dos bandas que se

observaron en el primer zimograma y además se logra observar la tercera banda en la muestra

HzSPC intoxicada (Fig. 13 abajo). La muestra correspondiente a Spodoptera exigua produjo un

barrido similar a T. ni y una tenue banda más abajo, lo cual es evidencia de una mayor cantidad

de proteasas con respecto a H. zea.

Actividad de ALP y APN: La absorbancia y la actividad específica de la ALP en los tres tiempos

(5, 20 y 50 min) demostraron ser aparentemente más alta en individuos resistentes que en

sensibles que no habían ingerido Cry1Ac, mientras que en los que ingirieron la protoxina ocurrió

lo contrario. Por otro lado, en la APN fue mayor en individuos sensibles con respecto a los

resistentes, aún después de haber ingerido la protoxina (Fig. 14). La actividad enzimática

promedio de ambos receptores se muestra en la Tabla 16 representada en U/µg.

Figura 14. Absorbancia a 450nm en ensayo de actividad enzimática en BBMV, incluyendo el positivo en cada caso y las muestras de T. ni. Se indica la absorbancia correspondiente a cada tiempo y en el caso de la fosfatasa alcalina (ALP) ésta fue menor en las muestras de larvas intoxicadas, mientras que con respecto a la aminopeptidasa-N, ésta fue menor en las muestras de larvas resistentes. Adicionalmente en T. ni se observa una mayor absorbancia para la aminopeptidasa-N con

respecto a la fosfatasa alcalina.

5 min

20 min

50 min


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Detección inmunológica de cadherinas: Dot-Blot: El anticuerpo pudo detectar el antígeno

presente en las BBMV a partir de 0.01µg hasta 5µg sin mucha diferencia entre concentraciones

de 1:10000 y 1:30000 (Fig. 15). Con base en la intensidad de la reacción se decidió utilizar 5µg

de muestra para los experimentos posteriores. Adicionalmente, el anticuerpo se probó en BBMV

de T. ni y S. exigua, obteniendo resultados positivos en esta última (Fig. 16). Por lo cual S. exigua

se utilizó como testigo en los ensayos de inmunodetección tipo “Western-Blot“.

Tabla 16. Actividad enzimática promedio de ALP y APN expresada en U/µg. Cada experimento se realizó al menos 6 veces. El resultado representa la media aritmética

APN ALP

5 min 20 min 50 min 5 min 20 min 50 min

Sus 133.848 1783.584 9218.88 120.62 1210.64 5535.2

SusTx 129.492 1774.08 9321.84 63.64 695.6 3441

Res 93.852 1300.464 7258.68 126.54 1311.28 5823.8

ResTx 78.012 1104.048 6280.56 52.54 600.88 2989.6

A B

5 µg/µL

1 µg/µL

0.1 µg/µL

0.01 µg/µL

S R

Figura 15. Dot-Blot para probar anticuerpo en las muestras de BBMV de H. zea. A) Concentración 1:10,000; B) Concentración 1:30,000. Del lado izquierdo se muestran las concentraciones de vesículas utilizadas y en la parte de arriba si son de larvas susceptibles (S) o resistentes (R).

S R

A

D C

B Figura 16. Dot-blot con las muestras de BBMV. A) H. zea susceptible (HzS); B) H. zea resistente (HzR20); C) T. ni; D) S. exigua. De cada muestra se cargaron 5 µg de proteína y se observa reacción en ambas líneas de H. zea así como en S. exigua con la misma

intensidad, mientras que en T. ni no lo es tanto.


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ELISA: En ambas condiciones, nativas y desnaturalizadas, la cantidad de cadherina cuantificada

fue casi el doble en las muestras de BBMV de larvas resistentes con respecto a las susceptibles,

mientras que entre ambas muestras de larvas susceptibles (intoxicadas y no intoxicadas) no fue

mucha la diferencia (Tabla 17). Además, el conjugado (Anti IgG. Sigma A3812) detectó mayor

cantidad de cadherina en condición nativa que en la desnaturalizada.

Tabla 17. Unidades por miligramo (U/mg) de cadherina en función de la actividad de la fosfatasa alcalina.

Nativa Desnaturalizada

Sus 162.504 148.74

Res 260.628 219.632

SusTx 170.200 146.668

ResTx 141.488 131.128

Inmunodetección: Se observaron 2 bandas en las muestras de H. zea tanto en las vesículas

provenientes de larvas resistentes como de las susceptibles, una de ellas de aproximadamente

40 kDa y de ca. 28kDa (Fig. 18). Además, la muestra de S. exigua utilizada en uno de los ensayos

exhibió bandas por debajo de los 25 kDa, mientras que T. ni no exhibió ninguna.

Figura 18. Inmunodetección en los que se muestran las bandas detectadas con el anticuerpo anti cadherina de M. sexta. En Panel A, se cargaron vesículas de T. ni en el carril 1, y en el B utilizamos vesículas de S. exigua, la cual exhibió varias bandas por debajo de los 25 kDa y que se observan en la figura. Con flechas se indican las bandas de ~40 kDa que se observaron

con mayor intensidad en las muestras de H. zeaS (carril 2) y resistentes (carril 3) tras terminar el experimento.

1 2 3 1 2 3

A

kDa

10075 50

37

25

15 B


36/ 59

PCR’s y análisis de secuencias: De los primers utilizados en este trabajo, solo 3 pares

amplificaron algún producto al utilizar ADN genómico, los dos diseñados para APN (APN1Ha y

APN2Ha) y el de cadherina (cadLHz), resultando en bandas de ~500pb mientras que para la

aminopeptidasa N (apn1Ha) fue de ~600pb (Fig. 19). Al purificar y secuenciar el DNA de las

bandas obtuvimos un producto de 425 y 559pb para la cadherina y aminopeptidasa N,

respectivamente.

La RT-PCR se realizó únicamente con muestras de individuos susceptibles y se

obtuvieron bandas de aparentemente el mismo número de pb, pero también se produjeron

bandas de menos peso molecular: unas de ~400 pb en la cadherina y de ~200 pb en la

aminopeptidasa N (Fig. 19). Al purificar y secuenciar las bandas se obtuvo el peso molecular de

cada producto, y sobre todo, el total de bases que se alinearon significativamente con las

secuencias originales. Los datos se muestran en la Tabla 18 y los alineamientos con las

secuencias depuradas se muestran en las Figuras 20 y 21. Las secuencias mostraron que los

productos obtenidos tienen una alta probabilidad de pertenecer a algún gen de cadherina o

aminopeptidasa N. Además, se observaron algunas diferencias en la secuencia de nucleótidos

de algunas muestras. Cabe mencionar que esta secuenciación se realizó únicamente con ADNc

obtenido a partir de larvas susceptibles.

Cadherina Aminopeptidasa

Figura 19. Productos de la RT-PCR para detectar alelos de cadherina (Izquierda) y aminopeptidasa N (Derecha). Se observan 2 bandas en algunas muestras, de alrededor de 500 pb y 200 pb para cadLHz y de aproximadamente 600pb y 400pb con apn1Ha, dichas bandas fueron purificadas y secuenciadas para su posterior análisis. En el segundo y tercer carril de cada gel se muestran dos controles de DNA genómico.


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Tabla 18. Resumen de la comparación de secuencias nucleotídicas de los amplicones de DNA. Porcentajes de alineamiento y tallas moleculares de las secuencias obtenidas a partir del DNA genómico (sombreado) y del ADNc (el resto) con las secuencias a partir de la cual se diseñaron los primers (mencionadas en este trabajo). Los porcentajes y bases alineadas corresponden a las secuencias después de haber sido depuradas.

Producto Total de bases alineadas (pb)

% de alineamiento

% de identidad

Cadherina (DNA) 425 92.5 89.9

Secuencias superiores 349 76.5 49 Secuencias inferiores 327 69 34.3 Secuencias inferiores x superiores

307 79.4 69.6

Apn1 (DNA) 559 81.4 80.6

Secuencias superiores 179 72.3 42.7 Secuencias inferiores 89 72.3 44.4 Secuencias inferiores x superiores

78 74.3 66.7


38/ 59

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39/ 59

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43/ 59

Discusión

La plantación del algodón Bollgard II® el cual expresa las toxinas Cry1Ac y Cry2Ab cada

una de ellas con un sitio de unión diferente en el intestino de las larvas maximizando la toxicidad

combinada, una formación conocida como pirámide (Moar. 2010) ha generado ganancias

económicas desde su implementación en México, la preocupación constante ha sido la

posibilidad de resistencia a dichas toxinas en campo. Hay un desacuerdo considerable en la

literatura científica sobre la definición de resistencia, especialmente "resistencia de campo"

(Andow. 2008; Tabashnik et al., 2009). El Consejo Nacional de Investigación (1986) propuso que

se define resistencia a los insecticidas como un rasgo individual, que es una capacidad heredada

de un insecto de tolerar dosis de un tóxico que probarían letal para la mayoría de los individuos

en la población normal de la especie. Andow (2008) sugirió que un alelo de resistencia importante

a un cultivo Bt está presente cuando los individuos homocigotos resistentes pueden crecer y

madurar en el cultivo Bt, tener copula y producir descendencia viable. Tales genes mayores de

resistencia se han detectado en varias plagas objetivo de los cultivos Bt (Tabashnik et al., 2008).

Sin embargo, la búsqueda de los principales alelos de resistencia en poblaciones de insectos de

campo no significa que la resistencia de campo está presente. El Comité de Acción de Resistencia

a los Insecticidas (2010) define la resistencia de campo cuando hay un "incumplimiento reiterado

de un producto para alcanzar el nivel de control cuando se utiliza de acuerdo con la

recomendación de la etiqueta para las especies de plagas”. Por lo tanto, la resistencia de campo

es una característica de una población, y depende de muchos factores, entre ellos la frecuencia

del alelo de resistencia, la aptitud de los individuos resistentes, y la densidad de población en el

campo. La diferenciación entre la resistencia "individual" y la resistencia de campo es necesaria

porque la resistencia individual no siempre se traducirá en la resistencia de campo, la resistencia

de campo se produce sólo cuando la resistencia individual es común. En base a esta definición

de la resistencia en el campo, la resistencia a un cultivo Bt se produce cuando hay un fallo de

control de campo o de reducción de la eficacia de los cultivos Bt. Después de 15 años de uso de

los cultivos Bt en el mundo, la resistencia de campo o falta de control se ha documentado

claramente en tres casos (Huang et al., 2011) por eso conocer la susceptibilidad de H. zea a la

toxina Cry1Ac proveniente de Bt es determinante para ajustar, mejorar, o cambiar los actuales

usos del algodón GM en México.

En el caso de H. zea, la susceptibilidad basal a la protoxina Cry1Ac presentó una LC50

de 1.309 µg/gramo de dieta en la primera etapa y 1.56 µg/gramo de dieta en la segunda colonia.

Este resultado fue comparado con reportes previos, Sivasupramaniam y cols. (2008) reportaron


44/ 59

una LC50 inferior a la nuestra de 0.870 µg/gramo de dieta para Cry1Ac, mencionando en adición

que plagas susceptibles a dosis menores a 1ppm son controladas por las "dosis altas" presentes

en el algodón GM, una dosis alta es referida por la EPA (1998) como veinticinco veces más la

LC99. El valor más alto reportado por Ali y cols. (2006) fue de 1.746 µg/gramo de dieta, ambas

cantidades cercanas a la nuestra por 0.4- 0.5 µg/gramo de dieta, un valor mayor a los anteriores

fue encontrado por Zenner de Polanía y cols. (2008), en cuyo estudio la LC50 varió entre 3,42 y

6,12 µg/g dieta demostrando además como al aumentar la dosis de la toxina disminuía el peso y

obtuvo un alto porcentaje de pupas deformes. El valor reportado por Medel y Maciel (2011) entre

las nueve regiones que muestrearon en las zonas algodoneras vario entre 13.5-23.7 µg/g dieta.

La diferencia de susceptibilidad a Cry1Ac en H. zea se ha analizado y se han expuesto

diferentes opciones al caso, por ejemplo, Iracheta (1999) menciona los siguientes puntos

referentes a la susceptibilidad de la toxina;1) Condiciones en las que se realiza el bioensayo

(incorporación de la proteína en la dieta, extensión en superficie; tiempo de incubación). 2) Fuente

de las toxinas (diferentes toxinas se expresan en cepas recombinantes de E. coli o en Bt. 3) La

colonia del insecto (origen geográfico, distribución y migración). La variabilidad geográfica de las

diferentes poblaciones de H. zea como una respuesta a los cambios en la susceptibilidad más

allá de la resistencia asociada también es mencionado por Sivasupramaniam y cols. (2008).

Medel y cols. (2007) y Zenner de Polania y cols. (2011) concuerdan que la implementación de

una línea base de susceptibilidad de Cry1Ac como la nuestra es importante por las diferencias

entre poblaciones de diferentes regiones. De acuerdo a los datos obtenidos, las colonias de

nuestra línea base siguen siendo susceptibles a la toxina Cry1Ac presente en el algodón Bollgard

II®.

La proteína Cry1Ac utilizada durante los ensayos de resistencia mostro una anomalía el

30/07013 en un ensayo al obtener un porcentaje de sobrevivencia mucho mayor al esperado,

corriendo un gel de poliacrilamida-SDS al 10% se encontró que la protoxina Cry1Ac utilizada que

usualmente muestra una banda de 130 kDa mostraba dos bandas de aproximadamente 50 y 80

kDa, estudios se han realizado con anterioridad ejemplificando las diferencias entre el uso de la

proteína Cry1Ac en su manera toxica activa o en forma de protoxina aún no procesada, (Van

Frankenhyuze. 2009; Caccia et al., 2012; Tabashnik et al., 2009) y el rango de la resistencia

producida por las plagas a estas variaciones, además de los estudios realizados a proteínas Cry

modificadas ( Soberón et al., 2007; ) así como los procesos necesarios para obtener la toxina en

su forma activa (Karim et al., 2000; Bravo et al., 2011). Comparando la literatura con nuestros

resultados de los anteriores y posteriores bioensayos sugiere que la protoxina llego separada

antes del proceso de solubilizacion y activación en el intestino de las larvas, el núcleo de la toxina


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Cry1Ac proviene de la mitad N terminal de la protoxina eliminando entre 500 a 600 aminoácidos

desde el extremo C terminal y los primeros 27 a 29 aminoácidos del extremo N terminal

(Lightwood et al., 2000; Bravo et al., 2011; Piggot y Ellar. 2007) creando la forma activa de

aproximadamente 60 kDa, al ingresar al intestino de las larvas productos de 50 a 80 kDa la

probabilidad para que la actividad proteolítica pueda crear regiones activas de la proteína Cry1Ac

serían muy bajas y su capacidad toxica reducida, por ende el manejo adecuado de la toxina y la

forma de utilizarla (Protoxina o toxina activada) interfiere significativamente en el proceso de

resistencia en laboratorio (Animulkar. 2008).

El algodón Bollgard II® expresa en complemento Cry2Ab, si llegara a provocarse una

resistencia en campo a la toxina Cry1Ac, la segunda toxina presente entra para ejercer el grado

de toxicidad necesario para mantener la eficiencia contra las plagas, Medel y cols. (2007, 2011)

y Lutrell y Jackson (2012) así como Tabashnik y cols. (2002) han realizado estudios en H. zea

y Pectinophora gossypiella respectivamente, demostrando en dichos estudios la inexistencia de

la resistencia cruzada entre las dos proteínas expresadas por el algodón GM utilizado para el

control de las plagas de lepidópteros en las zonas algodoneras.

Colonias resistentes a 100 hasta 400 µg/gramo de dieta criadas en laboratorio se han

reportado antes (Animulkar. 2008), las colonias resistentes a 10 µg/ml y 20 µg/ml en nuestro

estudio se mantuvieron de esta manera para evitar ejercer demasiada presión y poder realizar

las cruzas consecuentes para el diagnóstico de la variación genética, heredabilidad y costo de

resistencia a la toxina Cry1Ac (Jackson et al., 2006, Animulkar; 2008,2009).

Sin embargo, durante el desarrollo de los ensayos se presentaron aparte de la alta

mortalidad de larvas, prolongación de los estadios larvales, inhibición del desarrollo en el tercer

instar, prolongación del estado de pupa, pupas deformes, una mayor producción de machos en

comparación a las hembras y baja producción de huevecillos. Estos resultados coinciden con

estudios previos realizados por Jackson (2006) y Animulkar (2008) en H. zea y Williams (2009)

en Pectinophora gossypiella.

Jackson y cols. (2006) mencionaron sobre la base de estudios previos de Burd y cols.

(2000, 2003), la herencia de H. zea para la resistencia a Cry1Ac es dominante o incompletamente

dominante. Por lo tanto, algunos de los organismos que llevan alelos de resistencia eran

propensos a sobrevivir en una dosis discriminante de la toxina Cry1Ac en la dieta artificial. Este

tipo de herencia permite a heterocigotos sobrevivir cuando se selecciona en la dieta. Los

heterocigotos también serían los portadores más probables de alelos de resistencia en las

poblaciones en campo, los apareamientos más probables en la población general se producirían

entre los heterocigotos y homocigotos susceptibles.


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Analizando los resultados en los bioensayos de selección partimos desde la línea base

donde los alelos de resistencia son particularmente raros en poblaciones grandes (Huang et al.,

2011), nuestros resultados marcan porcentajes de sobrevivencia promedio de 35% para colonias

expuestas a 20 µg/ g dieta, y 47-58% para colonias expuestas a 10 µg/g dieta antes de haber

realizado las cruzas, después de las cruzas los porcentajes se colocaron en un aproximado de

25%, para ambas colonias, porcentajes menores fueron descartados por la ausencia de larvas

muertas que escaparon durante los siete días que se mantuvieron en la dieta. Basándose en

genética mendeliana y estudios anteriores (Jackson et al., 2006; Burd et al., 2003) estos

porcentajes sugieren la presencia de un alelo dominante o parcialmente dominante como el

causante de la resistencia en las colonias de H. zea, estudios anteriores ejemplifican a los alelos

recesivos como productores de la resistencia a diferentes especies de insectos como Plutella

xylostella (Sayyed et al., 2000; Zhao et al., 2002; Tabashnik et al., 2003; Ferre y Hernández.

2005) y el gusano rosado Pectinophora gossypiella ( Morín et al., 2003, 2004; Xu et al., 2005;

Tabashnik et al., 2003); sin embargo, en el caso de poblaciones de H. zea como la nuestra, las

investigaciones llevadas a cabo sugieren que el responsable es un alelo parcialmente dominante

o dominante el cual confiere la resistencia a la toxina Cry1Ac (Tabashnik et al., 2003,2008;

Jackson et al., 2006; Burd et al., 2003; Moar et al., 2010) comparando los resultados obtenidos

con las investigaciones realizadas, nuestras colonias exhiben un comportamiento genético

emparentado a la teoría del alelo parcialmente dominante.

Animulkar (2008) en respuesta a selección con Cry1Ac, reportó valores altos de

heredabilidad para la colonia resistente en las generaciones 4 a7 y la disminución en las

generaciones 11 a 19. La colonia resistente había aumentado significativamente en mortalidad

pupal, una relación de sexo machos:hembras desproporcional, y éxito de apareamiento menor

en comparación con la colonia parental no seleccionada. Los machos resistentes tenían más

costos de apareamiento en comparación con las hembras, mayor mortalidad de las larvas, menor

peso de las larvas, período alargado de desarrollo en las larvas, menor peso de pupa, mayor

duración de pupa, y una mayor cantidad de adultos morfológicamente anormales en comparación

con la colonia susceptible. En comparación a estos resultados la única diferencia con los nuestros

fue durante la cruza de colonias, las hembras de las dos colonias resistentes produjeron

huevecillos de manera deficiente y no viables, solo las colonias con machos resistentes y

hembras susceptibles además de las colonias con machos susceptibles y hembras susceptibles

produjeron huevecillos viables, estos resultados sugieren que durante la selección con Cry1Ac

probablemente el costo de aptitud afecto la fisiología en la producción y fertilidad de los

huevecillos en las hembras (Animulkar. 2008; Jackson et al., 2006).


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Este estudio demostró que los costos de aptitud están estrechamente vinculados con la

selección para la resistencia a Cry1Ac en H. zea en el laboratorio, y los costos de aptitud

permanecen, y en algunos casos, incluso aumentan después de ser eliminada la presión de

selección.

Con respecto a los genes de receptores asociados se encontró la presencia de dos

aminopetidasas y una cadherina, dichos receptores han sido confirmados como participes en el

mecanismo de resistencia asociado a los lepidópteros (Piggot y Ellar. 2007; Soberón y Bravo.

2008). La amplificación de los iniciadores deberían mostrar bandas de entre 300 y 350 pb para

las aminopeptidasas y 200 pb para la cadherina, los resultados obtenidos mostraron bandas de

alrededor de 500 pb para las aminopeptidasas y 300 para la cadherina, los iniciadores al ser

preparados a partir de RNA mensajero permitió la posibilidad de la presencia de intrones en el

genoma de H. zea lo cual explicaría el aumento de pb observados en el gel (Brown. 2002).

Estos resultados junto con la recopilación de Moar y cols. (2010) aunados a los nuestros

apoyan la falta de éxito de la selección, y el mantenimiento de las poblaciones de Cry1Ac

resistentes de H. zea en laboratorio, y puede ayudar a explicar por qué la resistencia en campo

aún no se ha observado en esta importante plaga del algodonero.

Establecimiento de líneas resistentes: La línea susceptible de H. zea de nuestro laboratorio

obtuvo una LC50 de 1.56 µg/ml de dieta para la toxina Cry1Ac y 4.2 µg/ml para la toxina Cry2Ab.

Existe una ligera diferencia entre la LC50 para Cry1Ac de nuestra colonia y la reportada por otros

autores. Ali y su equipo (2006) reportaron una LC50 de 2.17 µg/ml la cual es mayor a la

encontrada por nosotros, mientras que Sivasupramaniam y colaboradores (2008) reportaron una

LC50 inferior, de 0.870 µg/ml, estas diferencias de susceptibilidad pueden deberse a distintos

factores, por ejemplo: 1) Las condiciones en las que se realizó el bioensayo; En ambos reportes

los bioensayos se realizaron de manera distinta a nosotros ya que ellos colocaron la protoxina en

la superficie de la dieta ya solidificada mientras que nosotros incorporamos la protoxina a la dieta.

2) El origen geográfico de la colonia; en ambos reportes previos, la colonia susceptible de H. zea

provenía de Estados Unidos mientras que la colonia utilizada en este trabajo provenía del estado

de Coahuila en México por lo que la variabilidad genética de las diferentes zonas geográficas

pudo afectar el grado de susceptibilidad. La importancia de estos factores se observa de manera

más clara al comparar los resultados obtenidos por Medina-López (2014) quien obtuvo una LC50

muy similar de 1.309 µg/ml al utilizar las mismas condiciones de bioensayo, así como una colonia

procedente de la misma región. Por otro lado, Zhang (2014) reportó una LC50 de 5.19 µg/ml de

la protoxina Cry2Ab la cual es muy similar a la encontrada en este trabajo. La diferencia de

susceptibilidad entre la toxina Cry1Ac y Cry2Ab encontrada en este trabajo es debido a que de


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manera natural H. zea es menos susceptible a la toxina Cry2Ab, necesitándose así una mayor

concentración de esta toxina para matar las larvas de H. zea (Tabashnik et al., 2008).

Mediante la selección de organismos resistentes, se logró establecer una línea resistente

a Cry1Ac y otra resistente a Cry2Ab en el laboratorio durante cuatro generaciones. A pesar de un

bajo porcentaje de supervivencia, un elevado costo en la aptitud biológica y un porcentaje alto de

infertilidad, los organismos seguían siendo capaces de sobrevivir a una concentración de 10

µg/ml y de generar descendencia esto concuerda con los datos reportados que mencionan que

H. zea es capaz de sobrevivir con mayor facilidad que otros lepidópteros tanto a la toxina Cry1Ac

como a Cry2Ab (Burd et al., 2003). Líneas resistentes a Cry1Ac y resistentes a Cry2Ab en H. zea

han sido establecidas en múltiples ocasiones (Greenplate, 1999; Hardee et al., 2001; Gore et al.,

2003) apoyando nuestro éxito en el establecimiento de estas líneas.

Costo en la aptitud biológica: Durante el establecimiento de las líneas resistentes se observó

un retraso en el desarrollo larval y pupal, así como una disminución considerable en el porcentaje

de pupación y de emergencia, además de la aparición de malformaciones, tales fenómenos se

encuentran asociados con la perdida de vigor o un decremento en la aptitud biológica (Cao et al.,

2014). Este costo se ha reportado de manera frecuente en distintas especies (Bird et al., 2005;

Liu et al., 2016) y de igual manera en H. zea (Medina-Lopez, 2014; Martínez-Morales, 2016;

Dively et al., 2016).

El costo en la aptitud biológica frente a la adquisición de resistencia se ha ligado a tres

distintas fases: 1) Ocurre un cambio en la fisiología del insecto lo que le confiere resistencia

mientras le provoca una pequeña disminución en el vigor, 2) Ocurre la selección de mutaciones

genéticas las cuales confieren un alto grado de resistencia pero también un gran costo en el vigor

3) La acumulación de mutaciones genéticas que confieren resistencia ejercen un efecto

pleiotrópico sobre otras funciones importantes para el desarrollo de los organismos (Cao et al.,

2014), esta última fase es la más importante para el costo en la aptitud biológica ya que cuando

esto ocurre es cuando este costo se hace más notorio.

Un ejemplo de los efectos pleiotrópicos que se pueden generar, es cuando la mutación en

los receptores es la causa de la adquisición de resistencia, ya que estos receptores (APN, ALP y

Cadherinas) al verse alteradas sus secuencias aminoacídicas no solo evitan el reconocimiento

de la toxina sino también modifican sus funciones biológicas afectando así de manera negativa

en el desarrollo normal del organismo.

A pesar de que ambas líneas resistentes presentaron una disminución en la aptitud

biológica, esta no se presentó en ambas líneas de igual manera ya que los tiempos de desarrollo

larval y pupal y también los porcentajes de pupación y emergencia fueron estadísticamente


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diferentes. Actualmente no hay reportes previos en los que se comparen estos factores, pero esto

puede deberse a la diferencia de receptores, ya que los efectos pleiotrópicos de los receptores

para la toxina Cry2Ab pueden tener un menor impacto por lo que el costo de la aptitud biológica

parece ser menor cuando se trata de esta toxina. Además, la susceptibilidad natural es un factor

a considerar ya que H. zea es menos susceptible a Cry2Ab en comparación a Cry1Ac.

Evaluación de resistencia cruzada: Desde la implementación del apilamiento de genes en el

algodón Bt, la investigación de la posibilidad de resistencia cruzada entre las toxinas utilizadas

en este cultivo (Cry1Ac y Cry2Ab) ha ido en aumento. Los reportes iniciales mostraron que no

había resistencia cruzada entre ambas toxinas en las plagas de mayor importancia (Wei et al.,

2015). Sin embargo, Jin y colaboradores (2013) reportaron la existencia de una colonia resistente

en campo a Cry1Ac de H. armigera que demostró una pequeña pero significativa resistencia

cruzada hacia Cry2Ab sin embargo en H. zea no se ha reportado la existencia de resistencia

cruzada entre estas toxinas.

Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que no hay resistencia cruzada

cuando las dos toxinas son administradas al mismo tiempo, sin embargo, la selección con Cry2Ab

confiere una mayor resistencia a la toxina Cry1Ac en comparación a la resistencia a Cry2Ab

cuando se selecciona con Cry1Ac debido a que hubo un mayor porcentaje de sobrevivencia en

la línea seleccionada con Cry2Ab lo cual se comprobó mediante la estadística. Tabashnik y su

equipo (2009) reportaron algo similar al seleccionar a P. gossypiella con la toxina Cry2Ab, ya que

esta mostraba una resistencia a Cry1Ac, pero de igual forma al ser seleccionada con Cry1Ac esta

no mostraba resistencia a Cry2Ab a lo que ellos llamaron como resistencia asimétrica.

Poco se sabe sobre el mecanismo bioquímico o genético sobre esta resistencia

asimétrica, sin embargo, Ma y colaboradores (2011) encontraron que la tolerancia a las toxinas

Cry1Ac y Cry2Ab en algunos casos podía deberse al secuestro de monómeros de toxina por la

unión de glucolípidos los cuales al unirse al domino II de ambas toxinas impiden la formación del

pre-poro evitando así la muerte por descomposición osmótica.

Se puede teorizar que cambios en la fisiología de H. zea pudieron derivar en la

sobreproducción de glucolípidos permitiendo así que un mecanismo de resistencia para Cry2Ab

tenga efecto sobre la resistencia a Cry1Ac ya que los mismos tipos de glicolípidos pueden unirse

al dominio II tanto de Cry1Ac como de Cry2Ab. Sin embargo, esto no explicaría de manera

satisfactoria él porque parece ocurrir solo cuando la selección se realiza con Cry2Ab. Una mejor

explicación para este fenómeno es que la presión selectiva con Cry2Ab seleccione la mutación

de dos alelos distintos, uno que confiera resistencia a Cry2Ab y un segundo alelo que se trate de

una cadherina, la cual no afecta la susceptibilidad a Cry2Ab, pero si lo hace para Cry1Ac, mientras


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que la presión selectiva con Cry1Ac solo favorezca la selección de alelos relacionados con

cadherinas (Medina-López 2014; Martínez-Morales 2016) confiriendo resistencia a Cry1Ac, pero

no así para Cry2Ab.

A pesar de haber establecido líneas resistentes en el laboratorio de manera exitosa y de

demostrar una resistencia asimétrica, esto no implica que las líneas obtenidas en este trabajo

sean capaces de sobrevivir en los cultivos de algodón Bollgard II®. Ya que la cantidad de toxina

expresada es 50 o 100 veces más alta (Wan et al., 2005) que la concentración utilizada en este

trabajo, además de que las condiciones del laboratorio son mucho más favorables para el

desarrollo en comparación a las condiciones ambientales del campo. En cuanto a la resistencia

asimétrica, esta tampoco pone en riesgo el uso del algodón biotecnológico ya que primero es

necesario la selección con Cry2Ab para que ocurra este fenómeno, condición que en el campo

difícilmente se llevará a cabo ya que el algodón Bollgard II® produce de manera eficiente las dos

toxinas en cualquier momento del año y en cualquier parte de la planta (Wan et al., 2005) por lo

que es poco probable que una población de H. zea solo tenga contacto con la toxina Cry2Ab en

el campo.

El éxito del apilamiento de genes y la razón por la que en este trabajo como en otros

estudios no se ha encontrado poblaciones capaces de sobrevivir a ambas toxinas es que para

que exista una resistencia cruzada como tal es necesario que un mismo mecanismo confiera

resistencia tanto a Cry1Ac como a Cry2Ab; sin embargo, esto es poco probable ya que no

comparten sitios de unión y la modificación de dichos sitios parece ser el mecanismo más

importante de resistencia. Debido a esto, para que una población sobreviva a las dos toxinas es

necesario que existan mutaciones en al menos dos alelos (lo cual no se considera como

resistencia cruzada); uno para la resistencia a Cry1Ac y otro para la resistencia a Cry2Ab, sin

embargo, la tasa de mutación promedio en organismos eucariotas es de 1 por 109 bases

nucleotídicas (Baer et al., 2007) lo que quiere decir que la probabilidad de que existan dos

mutaciones es 2 en 1018 los cual es bastante bajo y si a esto le sumamos que la resistencia tanto

para Cry1Ac como Cry2Ab en H. zea es de carácter poligénica (Liu et al., 2016) nos hace pensar

que múltiples mutaciones son necesarias para la supervivencia lo cual es muy poco probable.


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Conclusiones

1. La LC50 de dos colonias susceptibles obtenidas en dos ciclos distintos, mostraron

resultados de 1.309 y 1.56 µg/g de dieta para Cry1Ac y de 4.2 µg/g de dieta para Cry2Ab.

2. Dos colonias de H. zea resistentes a 10 y 20 µg/g de dieta fueron establecidas en el

Instituto de Biotecnología, UANL.

3. Los alelos que confieren la resistencia a las poblaciones de H. zea son parcialmente

dominantes o dominantes.

4. La proporción macho:hembra de pupas en la población resistente es de 2:1. Contrario a

lo reportado previamente

5. El costo de aptitud de H. zea está directamente relacionado con la selección de resistencia

a Cry1Ac.

6. Los genes de los receptores asociados a la resistencia (Aminopeptidasas y Cadherinas)

resultaron de mayor tamaño al esperado por la presencia de intrones en el genoma de H.

zea, estos no se presentan en el RNA mensajero del cual fueron hechos los iniciadores

para PCR.

7. De un total de 1104 larvas tratadas por separado con 10 µg de las protoxinas solubilizadas

de Cry1Ac y Cry2Ab por ml de dieta, solo un 12.13% y un 29.56% lograron sobrevivir

hasta la fase de adulto respectivamente.

8. Aunque existe el costo en la aptitud biológica frente a la adquisición de resistencia, este

costo no fue suficiente para evitar la sobrevivencia de las líneas resistentes.

9. La resistencia a la toxina Cry2Ab representa un menor costo en la aptitud biológica en

comparación con la resistencia a Cry1Ac.

10. La colonia sensible de H. zea no sobrevivió cuando las dos toxinas se encuentran

presentes en la dieta por lo que no hay resistencia cruzada.

11. Una resistencia asimétrica se presentó al seleccionar la colonia con Cry2Ab confiriéndole

una ligera pero significativa resistencia frente a la selección con Cry1Ac.

12. El algodón Bollgard II® logra evitar de manera efectiva el desarrollo de resistencia gracias

al apilamiento de genes.


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Reporte Final - Conacyt · Jesús O. Medina-López, Saúl A. Martínez-Morales, Feliciano...

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