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REPARACIÓN DE LAS LESIONES GENÓMICAS INDUCIDAS POR LOS VENENOS DE LA
TOPOISOMERASA II
M. de Campos Nebel, M.E. Elguero, I. Larripa, M. González-Cid.
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Depto. de Genética, I.I.HEMA. Academia Nacional de Medicina.
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Topoisomerasa II
dos isoformas, α y β, codificadas por diferentes genes
enzima dependiente de ATP,
cataliza cambios en la topología del ADN,
y β p g
expresión fuertemente regulada durante el ciclo celular,
rol en la condensación y separación cromosómica,
participa en la organización de la cromatina y en transcripciónparticipa en la organización de la cromatina y en transcripción,
blanco de acción de muchos agentes quimioterapéuticos.
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Venenos de Topoisomerasa II
Idarubicina EtopósidoIdarubicina Etopósido
Blanco principal para inducir daño
Droga Blanco daño al ADN
Idarubicina Topoisomerasa II α DSB
Síntesis de ADN DSBSíntesis de ADN DSB
Topoisomerasa I (in vitro) SSB
Etopósido Topoisomerasa II α DSB
Topoisomerasa II β DSB
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Envenenamiento de la Topoisomerasa IIDroga
Complejo ternario
(ADN-enzima-droga)
DSB persistente
Etop
ósid
o2h
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H2AX
Reparación de las DSB generadas
γH2AX
Procesado de extremos
Reparación por HR Reparación por c-NHEJ
pS2056DNA-PKcsFocos Rad51
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Idarubicina:• primera y segunda línea de tratamiento en leucemia mieloide aguda,
Venenos de Topoisomerasa II
• segunda línea en leucemia linfoblástica aguda,
• cáncer de mama,
• leucemia mieloide crónica y linfoma No-Hodgkin.
Et ó idEtopósido:• primera línea de tratamiento de tumores testiculares y carcinoma de pulmón de células pequeñas,
• tratamiento de linfomas de Hodgkin y No-Hodgkin y leucemia mieloide aguda,
• tratamiento de varios carcinomas, hepatoblastoma, leucemia linfoblástica aguda, linfomas de células T cutáneos, mieloma múltiple, neuroblastoma, sarcomas de tejidos blandos, tumores cerebrales primarios, tumores trofoblásticos gestacionales, y carcinomas de pulmón de células no pequeñas.
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Tumores relacionados a la terapia
• Frecuentes (1-15% de los pacientes, dependiendo de la terapia).
A t l T i IIAgentes que envenenan a la Topoisomerasa II:• 5-15% de los pacientes con neoplasias desarrollan LMA-t luego de un corto período de latencia.
LMA:- 70% presentan translocacionesque involucran al gen MLL.
Nat. Rev. Cancer (2005), 5: 943-55
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OBJETIVO
- Evaluar el rol de las vías c-NHEJ y HR en impedir lapropagación de inestabilidad genómica inducida por ETO eIDA en fibroblastos humanos normales y en líneas celularesIDA en fibroblastos humanos normales y en líneas celularesde Hámster chino proficientes y deficientes en estosmecanismos.
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Esquema experimental (I)
Fibroblastos humanos diploides (PTP)
t=0 2h 26h
52h38h 50h 74h28h
Evaluación de muerte celular por Anexina V (Cit Flujo)-Evaluación de muerte celular por Anexina V (Cit. Flujo)
Cultivos sincronizados -Focos de reparación por HR (Rad51) y NHEJ (pS2056DNA-PKcs)
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Fibroblastos de Hámster chino:
Esquema experimental (II)
-CHO9 (wt) y XR-C1 (DNA-PKcsmut)-V79 (wt) y V-C8 (BRCA2mut)
Cultivos sincronizados:
Cultivos asincrónicos: Daño residual (γH2AX), aberraciones cromosómicas y MN
Tratamiento c/ IDA o ETO
InterfaseG1 S G2 M
t=0
Análisis de aberraciones cromosómicas
Formación de MN
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Efecto de ETO e IDA sobre la inducción de muerte celular
ETO
2h
EID
A 2h
PLoS ONE 2010, 5(9): e12541.
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Cinética de reparación de DSB
PLoS ONE 2010, 5(9): e12541.20 µm
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Reparación por c-NHEJ
PLoS ONE 2010, 5(9): e12541.
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Reparación por HR
PLoS ONE 2010, 5(9): e12541.
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C-NHEJ y HR actúan con especificidad de fase en el ciclo celular
PLoS ONE 2010, 5(9): e12541.
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Eventos de reparación residual por c-NHEJ frente al daño inducido por los venenos de Topoisomerase II
ETO: MN= 5-17% pS2056+ ; Ap=14-56% pS2056+
IDA: MN=12 28% pS2056+ ; Ap=40 63% pS2056+
Ampliación:
IDA: MN=12-28% pS2056+ ; Ap=40-63% pS2056+ ET
O 3
8 h
PLoS ONE 2010, 5(9): e12541.
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Daño remanente en células deficientes en c-NHEJ o HR
Cultivos asincrónicos:
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Cultivos sincronizados:
Aberraciones cromosómicas en primera mitosis
Cultivos sincronizados:
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Aberraciones cromosómicas inestables
XR-C1:
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Conclusiones
. c-NHEJ y HR actúan con especificidad de fase en el ciclo celular en respuesta al daño inducido por los venenos de Topoisomerasa II,
. Las actividades residuales de reparación por c-NHEJ mediadas por DNA-PKcs pueden contribuir a la generación de inestabilidad cromosómica,
.Tanto c-NHEJ como HR son importantes para impedir la propagación de inestabilidad genómica inducida por los venenos de Topoisomerasa II,
. Si bien alteraciones en c-NHEJ o HR resultan en frequenciast d d b i ó i i d id ETO IDA l
,
aumentadas de aberraciones cromosómicas inducidas por ETO e IDA, la vía c-NHEJ mediada por DNA-PKcs en S/G2 preserva la integridadcromosómica y promueve la progresión de células aberrantes.
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