PROBLEMAS DE ENZIMAS

1. Comentar las siguientes cuestiones

a) La Km de un enzima para un sustrato varía proporcionalmente con la concentración de enzima.b) Si se añade suficiente sustrato, la Vmax de una reacción enzimática puede alcanzarse incluso en presencia de un inhibidor no competitivo.c) Cuando un enzima posee varios sustratos, el valor de Km para todos ellos es siempre el mismo.d) En cinética enzimática michaeliana, la inhibición reversible competitiva se caracteriza por aumentar la Km de la reacción.e) Un efector alostérico actúa al unirse al enzima en un sitio diferente al centro activo.f) A niveles de saturación de sustrato, la velocidad de una reacción enzimática es proporcional a la concentración del enzima.g) La constante de Michaelis-Menten equivale a la concentración de sustrato para la cual vo es ½ de la Vmax.

2. Si a temperatura constante de 298 K una enzima consigue incrementar la velocidad de una reacción 10 7

veces, ¿cuánto habrá conseguido disminuir la barrera de energía libre de su estado de transición.

3. La enzima malato deshidrogenasa (MDH) cataliza la reación:

L-malato + NAD+ ===== oxalacetato + NADH + H+

10L de una solución del enzima parcialmente purificada, que contiene 0,4 mg de proteína /mL, permite la transformación de 0.45 moles de L-malato/min. El L-malato se mantiene en exceso durante la reacción. Calcular en UI/mg de proteína la acividad enzimatica específica de la MDH.

4.- Calcula el número de recambio de una enzima pura que tiene una actividad específica de 30 moles s-

1mg-1 de enzima. El enzima es tetramérico con 4 sitios activos idénticos uno en cada monómero y posee una Mr de 100 kD.

5. Un volumen de 0,1 mL de una preparación homogénea de nitrato reductasa (Mr =500 kD), que contiene 0,5 mg de proteína/mL, cataliza la producción de 20moles de nitrito en 5 minutos, utilizando una mezcla de reacción cuyo volumen final es de 1 mL. Calcúlese:

(a) La actividad de la preparación en UI/mL(b) La actividad específica(c) La actividad total, en katales, de 100 mL de preparación(d) La actividad molar (número de recambio) de la preparación(e) La actividad por centro activo, suponiendo que el enzima dispone de 2 sitios activos para la

reducción del nitrato.(f) El tiempo requerido para que se transforme una molécula de sustrato en producto

6. La hidrólisis del pirofosfato a ortofosfato es importante para impulsar reacciones biosintéticas tales como la síntesis de DNA. Esta reación está catalizada en Escherichia colí por una pirofosfatasa que tiene una masa molecular de 120 kD y está constituida por 6 subunidades idénticas. Para este enzima una unidad se define como la cantidad de enzima que hidroliza 10 moles de pirofosfato en 15 minutos a 37 ºC en condiciones de ensayo estándar. El enzima purificado tiene una Vmax de 2800 unidades por mg de enzima.

(a) ¿Cuántos moles de sustrato se hidrolizan por segundo y por mg de enzima cuando la concentración de sustrato es mucho mayor que que Km?

(b) ¿Cuántos moles de centro activo existen en un mg de enzima? Suponer que cada subunidad solo tiene un centro activo.

(c) ¿Cuál es el número de recambio del enzima?

7.- En una reacción enzimática: S-----P, se presenta una Km para el sustrato de 1 mM y una Vmax de 0,1 moles/min.

(a) Si se ensaya con una concentración inicial de sutrato de 10 M, se observa que, al cabo de 23 min de reación, la concentración de sustrato ha bajado hasta 1 M. Calcúlese la concentración de sustrato que permanecerá después de 46 min de reacción.

(b) Si la enzima se ensaya con una concentración inicial de sustrato de 100 mM, calcúlese la cantidad de sustrato que habrá desaparecido a los 8 min de reacción.

8. Una enzima de Km= 3 x 10-4 M se ensaya con una concentración inicial de sustrato de 10 -8M. Al cabo de un minuto se ha utilizado el 0,5% del sustrato:

(a) ¿Qué porcentaje del sustrato se habrá utilizado al cabo de 5 minutos?(b) Si la concentración inicial de sustrato fuera 8 x 10-7 M ¿qué porcentaje del sustrato se habrá utilizado al cabo de 5 minutos?(c) Calcular la Vmax(d) Para una concentración de sustrato de 8 x 10-7 M ¿qué timpo se requiere para que se utilice el

50% del sustrato?,y(e) Para una concentración de sustrato 3 x 10-6 M ¿qué tiempo se requiere para que se utilice el

75%?

9. En una preparación enzimática conteniendo 58 g de enzima/mL, se determinó la actividad enimática midiendo la variación en la absorbancia del sustrato empleado con el tiempo. La mezcla de reacción contenía 0.1 mL de extracto enzimático al que se añadieron diferentes concentraciones del sustrato disuelto en el mismo tampón, hasta un volumen final de 2 mL. Las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo en condiciones óptimas de pH, temperatura y fuerza iónica. Los valores de las velocidades iniciales de la reacción para diferentes concentraciones de sustrato figuran en la siguiente tabla:

(S) (M) Velocidad inicial( M/min)

1,0 x 10-8 6,818 x 10-6

5,0 x 10-8 25,00 x 10-6

1,0 x 10-7 37,50 x 10-6

2,5 x 10-7 53,571 x 10-6

7,5 x 10-7 62,50 x 10-6

1,0 x 10-6 68,182 x 10-6

Determinar:(a) el valor de Km y Vmax(b) Sabiendo que la masa molecular del enzima es 125kD y que contiene dos subunidades idénticas

de 62.5 kD, teniendo cada una de ellas un centro catalítico para el sustrato, determinar: la actividad específica, la actividad molecular, la constante catalítica de la reacción y la actividad por centro activo.

10.- Para determinar la energía de activación del proceso de reducción de nitrógeno hasta amonio por la deshidrogenasa de una cianobacteria se estudió la velocidad de reducción de nitrógeno a diferentes temperaturas, obteniéndose los siguientes resultados:Temperatura (ºC) 10 20 30 35 40 45Vmax(mol N2/mg . h) 6.98 15,99 38,44 46,82 46,84 46,12

(a) Determínese gráficamente el valor de Ea(b) Calcula el Q10 entre 20ºC y 30 ºC(c) Explique por qué a partir de una determinada temperatura no se cumple la ecuación de Arrhenius

11.- La tabla siguiente muestra los valores de la concentración de producto p (en mM) a varios tiempos (en min), para 5 concentraciones de sustrato diferentes (en mM). ¿ Sigue ensta enzima una cinética de Michaelis-Menten? Si es así calcule su Km para el sustrato y la Vmax.t (S)= 1 (S)= 2 (S)= 5 (S)= 10 (S)= 201 0,095 0,18 0,37 0,56 0,762 0.185 0.34 0,71 1,08 1,503 0,260 0,49 1,01 1,57 2,204 0,330 0,62 1,29 2,04 2,885 0,395 0,74 1,56 2,47 3,506 0,450 0,85 1,80 2,87 4,127 0,505 0,95 2,02 3,23 4,668 0.555 1,04 2,220 3,59 5,249 0,595 1,12 2,40 3,92 5,7410 0,630 1,20 2,58 4,22 6,24

12.- Se añaden 25 l de una preparación de un enzima monosustrato a 1ml de mezcla de reacción para el ensayo de la actividad enzimática, utilizando diferentes concentraciones de sustrato. Las v o obtenidas en cada caso fueron las siguientes:

[S] (M) vo(nmoles/min)10-2 75,0010-3 74,9010-4 62,007,5x10-5 58,254x10-5 46,152x10-5 33,006x10-6 15,00

A partir de estos datos:

a) Hacer la representación gráfica según Michaelis-Menten y Lineawever Burk.b) Determinar el valor de las constantes cinéticas (Km, y Vmax). c) Calcular la velocidad de la reacción para una [S] = 1,5x10-5M y [S] = 0,02M.d) Si [S] = 0,04M, ¿Cuál sería la cantidad de producto formado una vez transcurridos 3 minutos?.e) ¿Cuál sería la vo obtenida si el ensayo se hace con 50l de la preparación enzimática y a

concentración saturante de sustrato?.

13. Se midió la cinética de un enzima en función de la concentración de sustrato en presencia u ausencia del inhibidor (I) a una concentración de 2 mM. (S) (M) Velocidad (mol/min)

- I + I3 10.4 2.15 14.5 2.910 22.5 11.330 33.8 22.690 40.5 33.8

(a) ¿Cuáles son los valores de Km y Vmax en ausencia y en presencia del inhinidor?(b) ¿De qué inhibición se trata?(c) ¿Cuál es su Ki?(d) Cuando la concentración del sustrato es 10 M y la del inhibidor 2 mM,¿qué fracción de las

moléculas de enzima están unidas al sustrato?¿y al inhibidor?

14.- Se representaron en un diagrama de Lineweaver-Burk los datos obtenidos midiendo las velocidades inciales, expresadas en moles min-1, obtenidas con varias concentraciones de sustrato (mM), en ausencia y en presencia de una concentración 2 M de un inhibidor. Se obtuvieron dos rectas que cortan a los ejes de abscisas y ordenadas en los siguientes puntos

------------------------------------- (I) = 0 (I) = 2 mM

-------------------------------------y 0,5 0,5x -2,0 -0,5-------------------------------------

(a) calular Vmax y Km en ausencia y en presencia del inhibidor, así como el tipo de inhibición y los valores de la constante de inhibición

(b) Si se representasen los datos en un diagrama de Hanes-Wolf, ¿cuáles sería los puntos de corte?(c) ¿y en Eadie-Hofstee?(d) Calcular la cantidad de sustrato consumida en 4 min de reacción, en ausencia de inhibidor, si la

concentración inicial de sustrato es 0,1 M.

15.- La subtilisina (Mr = 27,6 kK) es una proteasa bacteriana que hidroliza específicamente ésteres aromáticos y amidas. Los valores de Km y kcat para la hidrólisis de un éster derivado de tirosina son 0,146 M y 548 s-1, respectivamente.

(a) Cuál es la Vmax para esta reación?(b) El indol es un inhibidor competitivo de la subtilisina, con una Ki de 0,05 M. Calcule la velocidad

máxima de la hidrólisis del sustrato anterior en presencia de 6,25 M de indol(c) ¿Cuál es la velocidad inicial de la reacción en presencia de 6,25 mM de indol?

16.- Se estudió la cinética de un enzima en ausencia de inhibidor y en presencia de dos inhibidores A y B, este último a dos concentraciones distintas. La siguiente tabla muestra los valores de la velocidad inicial de la reacción en los cuatro casos y en función de la concentración de sustrato.

vo (mmol/ L x min) Sin Inhibidor A Inhibidor B Inhibidor B [S] mmol/L inhibidor 3mM 3 mM 5 mM

1,25 1,72 0,98 1,25 1,01 1,67 2,04 1,17 1,54 1,26 2,50 2,63 1,47 2,00 1,72 5,00 3,33 1,96 2,86 2,5610,00 4,17 2,38 3,70 3,49

(a) ¿Qué tipo de inhibición realizan los inhibidores A y B?(b) Determinar el valor de Km y Vmax en ausencia y presencia de cada inhibidor.

(c) Calcular el valor de la constante de disociación, KI, del complejo enzima- . inhibidor B.

17. El enzima succinato deshidrogenasa de corazón de buey es capaz de liberar dos átomos de hidrógeno del ácido succínico para transferirlos al FAD. El ácido malónico [CH2(COOH)2] interfiere esta acción, de acuerdo con las cifras de la siguienta tabla:

Velocidad de reacción(nmoles de FADH2 formados por minuto)

Succinato(mM) En ausencia de malónico En presencia de malónico10-4M

0,1 3,6 1,1

0,4 11,4 4,1

1 20 9,1

4 32 21,3

10 36,4 29,6

a) Trazar las gráficas con y sin inhibidor, utilizando la representación de Lineweaver-Burk.

b) Calcular en ambos casos (utilizando la representación), los valores de las constantes cinéticas Km y Vmaxc) Deducir el tipo de inhibición que se produce, calcular KI y razonar la posible acción del ácido malónico, a la vista de su estructura química.

18.- Se determinó la velocidad inicial de una reación catalizada por una enzima reguladora con la siguiente

gama de concentraciones de sustrato:

(S)0 (mmol L-1) Vo (mmol L-1)0,1 1.6 x 10-4

0,3 1,4 x 10-3

0,5 4,0 x 10-3

1,0 1,6 x 10-2

3,0 0,145,0 0,3910,0 1,45100,0 14,6500,0 15,91000,0 16,0

Determínese el indice de Hill y el valor de S0,5.

19.- La aspartato transcarbamilasa, que cataliza la siguiente reacción:carbamil-P + L-asp ======== N-carbamil-L-asp + Pi

presenta, a saturación de carbamil-P, los siguientes datos de velocidad en presencia o ausencia de los moduladores, ATP o CTP:

(Asp) (mM) Control +ATP 2 mM +CTP 0,5 mM1 0,30 0,75 0,152 0,94 1,78 0,533 1,63 2,53 0,844 2,53 3,32 1,165 3,05 3,79 1,796 3,58 4,05 2,218 4,63 4,89 3,0510 5,05 5,21 4,1112 5,42 5,63 4,9515 5,74 5,95 5,4717 5,89 6,11 5,6820 6,00 6,11 5,89

A partir de estos datos determínense:(a) Los parámetros cinéticos del enzima en ausencia de moduladores(b) El efecto del ATP y CTP en la modulación de la actividad enzimática(c) ¿Se trata de un enzima tipo K o tipo V?