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Inhibición

Beatriz Alvarez

Laboratorio de Enzimología

Inhibidor: molécula que disminuye la velocidad de la reacción catalizada enzimáticamente.

Importancia farmacológica y toxicológica.Ejemplos: cianuro, gases nerviosos, drogas.

Importancia como herramientas para estudios metabólicos y mecanísticos. Ejemplos: malonato inhibidor succinato deshidrogenasa.

Ejemplos de inhibidores enzimáticos con utilidad como drogasInhibidor Condición Enzima blanco

Aciclovir Herpes DNA polimerasa viralAlopurinol Gota Xantina oxidasaAspirina Inflamación CiclooxigenasaCaptopril Hipertensión Convertasa angiotensinaDuP450 SIDA Proteasa HIVFluorouracilo Cáncer Timidilato sintasaIbuprofeno Inflamación CiclooxigenasaLovastatina Colesterol alto HMGCoA reductasaMetotrexato Cáncer Dihidrofolato reductasaNitecapone Parkinson Catecol metiltransferasaOmeprazol Úlcera gástrica H+,K+ -ATPasaPenicilina Infección bacteriana TranspeptidasaPhenelzine Depresión Monoamino oxidasaSorbinil Retinopatía diabética Aldosa reductasaZidovudina SIDA Transcriptasa reversa HIV

Tipos de inhibidores

Reversibles

E(S) + I E(S)I

- competitivos- no competitivos- acompetitivos- mixtos

Irreversibles

E(S) + I → E(S)I

Inhibidor reversible competitivo

E + S ES E + P+

I

EI

KI

SS

K [ES][E] [S]K = [E] = [ES] [S]

⇒

SI

I I

K [ES] [I][E] [I] [E] [I]K = [EI] = = [EI] K [S] K

⇒

Derivemos la ecuación de estado estacionario asumiendo equilibrios rápidos:

T

S ST

I

ST

v = k [ES]

Divido ambos miembros entre [E]

v k [ES] k [ES] = =K [ES] K [ES] [I][E] [E] + [ES] + [EI] + [ES] +

[S] [S] K

Multiplico numerador y denominador por [S]

v k [ES] [S] = K [ES] [E] [S] + [ES]

[S]S

I

T MAX

S S SI I

K [ES] [I][S] + [S][S] K

k [E] [S] V [S]v = = v = [I] [I] K + [S] + K K 1 + + [S] K K

⎡ ⎤⎢ ⎥⎣ ⎦

Inhibidor reversible competitivo Se une a E libre

E + S ES E + P+

I

EI

KIC =

[E] [I]

[EI]

MAX

S CI

V [S]v = [I] K 1 + + [S] K

⎡ ⎤⎢ ⎥⎣ ⎦

+ I

- I

V 0

[sustrato]

KI = KIc

Inhibidor competitivoGráfico del doble recíproco

KmVmax


+ I

- I

V 0[sustrato]

IM M

I

[I]K = K 1 + K

⎡ ⎤⎢ ⎥⎣ ⎦

IMAX MAXV = V

MAXI

MMAX

M

I

VKV =

K [I]1 + K

⎛ ⎞⎜ ⎟⎛ ⎞ ⎝ ⎠

⎜ ⎟ ⎡ ⎤⎝ ⎠⎢ ⎥⎣ ⎦

…pues se une a E libre

Inhibidor competitivov versus [I] con sustrato fijo

[I]

v 0

1/v 0

[I]

Gráfico de DixonGráficos de 1/v versus [I] lineales


Características de los inhibidores reversibles competitivos:

1. Aumenta la KM aparente por el sustrato.

2. Disminuye VMAX/KM.

3. VMAX no cambia.

4. A menor KI, mayor inhibición.

5. Si aumenta [I], aumenta KM aparente.

6. Si aumenta [S] a [I] fija, disminuye la inhibición.

7. El grado de inhibición depende de [S], [I], KM y KI.

8. KI no es IC50.

Drogas sulfas – antibióticos – primera droga milagrosaRelacionadas a colorantes. Se descubrieron a partir de un colorante azo con sufanilamida. Tienen un grupo sulfonamida.

Las bacterias necesitan sintetizar folato. La sulfa es un inhibidor de la enzima encargada de sintetizar folato a partir de PABA y dihidropteroato. Como los humanos no sintetizamos folato sino que lo adquirimos de la dieta, no nos afecta.

Las descubrió Gerhald Domagk en 1932 en Alemania. Luego de experimentos con animales, prueba el colorante rojo Prontosil con su hija. Patente 1935, publicaciones de resultados en humanos 1935. Nobel 1939, otorgado 1947.

Muy importantes en la segunda guerra. Muerte de heridos en ejército americano: 8.25% en primera guerra, 4.5% en segunda. Bactrim. Penicilina: descubierta 1928 por Fleming, disponible 1942.

Aída Matilde, ~1935, sepsis, S. aureus. Dubordier trae la novedad de Francia, Prontosil, orina roja. Desahuciada, sobrevive a 5 médicos tratantes.

Modelos de inhibición competitiva (Segel)a) Clásico: S e I son análogos estructurales y compiten por el mismo sitio de unión.

b) S e I son mutuamente excluyentes por impedimento estérico.

d) S e I comparten un grupo de unión a la enzima similar.

c) Los sitios de unión de S e I son diferentes pero se solapan. e) I se une a

un sitio diferente, pero causa un cambio conforma-cional que impide la unión de S.

[I]1/

v

1/[S]

Inhibidor parcialmente competitivoReduce la afinidad de la enzima por el sustrato sin prevenir completamente su combinación.

Este sistema es indistinguible del totalmente competitivo en experimentos donde varía [S] con [I] fijo.

Inhibidor parcialmente competitivoPero al variar [I], la velocidad no disminuye indefinidamente sino que llega a un límite definido. Los gráficos de 1/v versus [I] (Dixon) no son lineales sino hiperbólicos.

inhibidor parcial

inhibidor total

v 0

[I]

inhibidor total

inhibidor parcial

1/v 0

[I]

INHIBIDOR COMPETITIVO

la concentración de inhibidor debe cambiar 81 veces

⎡ ⎤⎢ ⎥⎣ ⎦

MAX

SI

V [S]v = [I]K 1 + + [S] K

II

M

II

M

v 1 [S] = 0.9 cuando [I] = K 1 + v 9 K

v [S] = 0.1 cuando [I] = 9 K 1 + v K

⎡ ⎤⎢ ⎥⎣ ⎦⎡ ⎤⎢ ⎥⎣ ⎦

¿Cuánto debe cambiar la concentración de inhibidor para que la velocidad pase de 90% a 10% de VMAX?

El metotrexato es un inhibidor competitivo de la dihidrofolato reductasa. Tiene una afinidad 1000 veces mayor que el sustrato por la enzima. Bloquea los procesos que requieren folato y tiene utilidad como anticancerígeno.

Los análogos de estado de transición son inhibidores competitivos de muy alta afinidad.

Inhibidores de alta afinidad

Ya no se cumple que [I]T >> [E]T

321

3210

v

[E]T

[I]

1/v

1/[S]

v

[I]

[ ] { }* * 2 *T T I app T I app T I app T

T

= ([E] - [I] - ) + ([I] + - [E] ) - 4 [E]2 Eivv K K K

MAX

SI

V [S]v = [I]K 1 + + [S] K

⎡ ⎤⎢ ⎥⎣ ⎦

En lugar de la ecuación clásica:

El inhibidor de alta afinidad sigue la ecuación:

[I]

v 0

Resultados de Martín Fló y Cecilia Fernández con EgKu8 y tripsina canina

Inhibidor reversible no competitivoSe une a E y a ES “con las mismas ganas”

E + S ES E + P+I

EI + S

+I

ESI

MAX

I

M

V[I]1 + K

v = K + [S]

⎡ ⎤⎢ ⎥⎣ ⎦

+ I

- I

V 0

[sustrato]

KI KI

I MAXMAX

I

VV = [I]1 + K

⎡ ⎤⎢ ⎥⎣ ⎦

IM MK = K

Inhibidor no competitivoGráfico del doble recíproco

Gráfico de DixonGráficos de 1/v versus [I] lineales

Inhibidor reversible no competitivo

Los inhibidores puramente no competitivos son raros.

El inhibidor no competitivo debería interferir con las propiedades catalíticas sin interferir con la unión del sustrato (raro).

En otras palabras, debe unirse a E y a ES “con las mismas ganas” (raro).

Se puede observar inhibición no competitiva en el caso de protones, iones metálicos y poca cosa más.

Los inhibidores puramente no competitivos son raros.

Un inhibidor irreversible o uno de alta afinidad pueden dar la apariencia de no competitivo.(Pues “matan” una parte de la enzima, pero la parte que queda “viva” tiene el mismo Km.)

+ REVERSIBLENO COMPETITIVO

+ IRREVERSIBLE

CONTROL

V MAX

[E]T

Una forma de distinguirlos es variando la concentración de enzima.

E + S ES E + P+I

ESI

Inhibidor reversible acompetitivoSe une solo a ES

MAX

I MAX

MM

I

I

V [S][I]1 + K V [S]v = =

K [I] + [S] K + [S] 1 + [I] K1 + K

⎡ ⎤⎢ ⎥⎣ ⎦

⎡ ⎤⎢ ⎥⎡ ⎤ ⎣ ⎦⎢ ⎥

⎣ ⎦

+ I

- I

V 0

[sustrato]

KI = KIa

I MAXMAX

I

VV = [I]1 + K

⎡ ⎤⎢ ⎥⎣ ⎦

I MM

I

KK = [I]1 + K

⎡ ⎤⎢ ⎥⎣ ⎦

I

MAX MAX

M M

V V=K K

⎛ ⎞ ⎛ ⎞⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎝ ⎠ ⎝ ⎠

Inhibidor acompetitivoGráfico del doble recíproco

Inhibidor reversible mixto

E + S ES E + P+I

EI + S

+I

ESI

KIc KI

a

MAX

aI

McI

aI

V [S][I]1 + K

v = K [I]1 + + [S]

K[I]1 + K

⎡ ⎤⎢ ⎥⎣ ⎦

⎡ ⎤⎢ ⎥⎡ ⎤ ⎣ ⎦

⎢ ⎥⎣ ⎦

I

I MAXMAX

a

VV = [I]1 + K

⎡ ⎤⎢ ⎥⎢ ⎥⎣ ⎦

I MM c

IaI

K [I]K = 1 + K[I]1 +

K

⎡ ⎤⎢ ⎥⎡ ⎤ ⎣ ⎦

⎢ ⎥⎣ ⎦

MAXI

MMAX

McI

VKV =

K [I]1 + K

⎛ ⎞⎜ ⎟⎛ ⎞ ⎝ ⎠

⎜ ⎟ ⎡ ⎤⎝ ⎠⎢ ⎥⎣ ⎦

Inhibidor mixto- reacciona con la enzima libre y también con el complejo enzima-sustrato.

- modifica el KM y la Vmaxen proporciones diferentes.

Inhibidores lentos o dependientes del tiempo

Hasta ahora, los equilibrios entre enzima e inhibidor se establecían rápido en la escala de tiempo del recambio enzimático. Sin embargo, hay algunos inhibidores que se unen en forma lenta, llevando a cambios graduales en la velocidad de la reacción hasta que se alcanza el equilibrio, de tal forma que los gráficos de formación de producto versus tiempo no son lineales.

Aquí se preincuba inhibidor y sustrato y se larga con enzima. Se obtiene una gráfica con concavidad negativa compatible con una “kon” baja (lenta).

¿A qué función ajusta?

Aquí se preincuba enzima con inhibidor y se larga con sustrato, para lo cual hubo una dilución. Se observa una concavidad positiva típica de una “koff” chica (lento).

INHIBIDORES IRREVERSIBLESLos inhibidores irreversibles son aquellos que reaccionan con laenzima muy fuertemente o covalentemente, de tal forma que la enzima queda inhibida y no se recupera la actividad por remoción del inhibidor por diálisis, gel filtración o similar.

Aunque el inhibidor irreversible no se disocie espontáneamente, es posible que sí se recupere actividad por una reacción química que revierta la inhibición.

La inhibición irreversible aumenta progresivamente con el tiempo. La eficiencia del inhibidor está representada por una constante cinética kI (minúscula) que nos dice cuánta enzima se inhibe en determinado tiempo.

E + I → EIkI

E + I → EIkI

Inhibidores irreversibles

O O

O O O

O

-k't -k'tO O O

d(EI) = k(E)(I)=k(E -EI)(I -EI)dt

En condiciones de pseudo primer orden:d(EI) = k(E -EI)(I ) = k'(E -EI)

dtd(EI) = k' dt

(E -EI)Integrando entre t = 0 y t(EI) = E (1 - e ) y (E -EI) = E eSi la ve O

-k'tO

obs

locidad es proporcional a (E -EI)

entonces v = v ek = k' = k[I]

0 10 20 30 40 500

10

20

30

40

50

v

tiempo

k'[I]


Inhibidores grupo-específicos

Un reactivo que modifique un aminoácido crítico en forma irreversible se comportará

como un inhibidor irreversible de la enzima.

Cisteína

Glutamato

Histidina

Aminas

Tirosina

Tetranitrometano

¿Qué problema pueden plantear los modificadores de aminoácidos si se quiere que actúen como drogas?

ESPECIFIDAD


Etiquetas de afinidad: Inhibidores irreversibles dirigidos al sitio activo

Tienen similitud con los sustratos. Por lo tanto, se unen inicialmente al sitio activo. Pero presentan reactividad, por lo cual

forman a continuación enlaces covalentes con la enzima, modificándola irreversiblemente.

Generalmente alquilan aminoácidos nucleofílicos del sitio activo.

La unión covalente puede ser desencadenada por la luz: etiqueta de fotoafinidad (photoaffinity label)

Son más específicos que los modificadores grupo específicos.



Ejemplo: bromoacetol fosfato y la triosa fosfato isomerasa


Ejemplo: Tosil fenilalanil clorometil cetona (TPCK) es un análogo de sustrato para quimotripsina. Se une al sitio activo y reacciona irreversiblemente con la histidina crítica, inhibiendo la enzima.

Estructura de tripsina bovina

Ser195: violeta

His57: azul

Asp102: rojo

Sustrato: verde

Residuos del sitio activo de la quimotripsina

E + I EIKI

E-IkI

Inhibidor irreversible con equilibrio rápido previo

Etiquetas de afinidad

Inhibidores irreversibles dirigidos al sitio activo

Característcas:

1. La inactivación de la enzima es protegida por sustratos o inhibidores reversibles.

2. La inactivación tiene el mismo perfil de pH que kCAT/KM.

3. Se une un mol de inhibidor covalentemente a un mol de enzima.

4. El inhibidor presenta cinética de saturación.

E + I EIKI

E-IkI

Inhibidor irreversible con equilibrio rápido previo

Etiquetas de afinidad

Inhibidores irreversibles dirigidos al sitio activo

0 10 20 30 40 500

10

20

30

40

50

v

tiempo

k obs

[I]

Iobs

I

k [I]k = K + [I]

¿Qué problema pueden plantear las etiquetas de afinidad si se quiere que actúen como drogas?

Este tipo de compuestos suelen ser altamente reactivos. Generalmente alquilan residuos nucleofílicos de las enzimas.

Suelen discriminar mal y presentar baja selectividad. Son inherentemente tóxicos.


Inhibidores suicidasOtros nombres: Inhibidores irreversibles activados por la enzima, inhibidores basados en el mecanismo, caballos

troyanos

Son inertes en ausencia de enzima, pero son activados por la enzima blanco

En la guerra de Troya, los griegos lograron entrar a la ciudad porque construyeron un gran caballo de madera con hombres escondidos dentro.

Metafóricamente, un caballo troyano representa un truco o estratagema que permite que un blanco deje entrar un enemigo a un bastión protegido. Asociado a “malware”.

Inhibidores suicidas

Características:

1. Mismas características de las etiquetas de afinidad (protegidos por sustratos, cinética de saturación, mol a mol, kCAT/KM), y además:

2. Inertes en ausencia de enzima blanco.

3. Activados por la enzima blanco.

4. kI >> kDIS (la forma activa no debe liberarse).

E + I E·IKI

E·I*kcat

E-I*

E + I*

kI

kDIS

Muchos inhibidores suicidas se basan en la generación de un intermediario con dobles enlaces conjugados que es susceptible a reacciones de adición de Michael a partir de un grupo nucleófilo de la enzima

X

RE:

X

ER

BH+

ER

X

X = O, N o S

Se prestan para esto las enzimas con piridoxal fosfato, las monoamino oxidasas y las flavoproteínas.

Ornitina descarboxilasaEnzima de la síntesis de poliaminas

Requiere piridoxal fosfato

La difluorometilornitina es un inhibidor suicida de la ornitina descarboxilasa.

La ornitina descarboxilasa humana tiene un recambio muy rápido. En cambio, la enzima de Trypanosomabrucei es estable. Por lo tanto, la difluorometilornitina es eficiente contra la enfermedad del sueño.

También se usa para tratar hirsutismo en forma de aplicación tópica (Vaniqa).

Inhibición de la monoamino oxidasa por N,N-dimetilpropargilamina.

La monoamino oxidasa (MAO) es responsable de degradar neurotrasmisores como dopamina y serotonina. Los inhibidores de la MAO se utilizan en el tratamiento contra el Parkinson y la depresión.

Historia de las balas mágicasEn 1908, Paul Ehrlich descubre el Salvarsan(arsphenamine) examinando cientos de compuestos con arsénico para el tratamiento de la sífilis. El salvarsan era mejor que los mercuriales pero tenía efectos secundarios, y se utilizó hasta que apareció la penicilina.

En 1932, Gerald Domagk descubre el Prontosil, un colorante azo con sulfonamida, inhibidor de la síntesis de ácido fólico a partir de ácido para-amino benzoico.

Penicilina - Uno de los primeros antibióticos

PenicilinaDesde la antigüedad, se utilizaban hongos para tratar infecciones.

1929 – Alexander Fleming, en Inglaterra, se va de vacaciones y deja placas con Staphylococcus aureus “tiradas”. A la vuelta, observa que algunas se contaminaron con hongos (Penicetumnotatum). En estas placas contaminadas, las bacterias no crecieron.

1939 – Howard Florey y Boris Chain, en Oxford, comienzan a caracterizar la actividad microbicida de la penicilina.

1941-1943 – En Estados Unidos (Peoria, Illinois), comienza la producción masiva de penicilina. Hubo que encontrar una cepa que creciera sumergida.

1945 – Fleming, Florey y Chain reciben el premio Nobel.

1957 – Joshua Lederberg muestra que las bacterias pueden crecer en presencia de penicilina si el medio es hipertónico. Se deduce que la penicilina altera la pared.

Peptidoglicano de S. aureusN-acetilglucosamina y N-acetilmurámico unidos por enlace beta(1,4). Al N-acetilmurámico se le une una pequeña cadena de aminoácidos “raros” (incluyen D-aminoácidos). Los aminoácidos se entrecruzan gracias a enzimas transpeptidasas.

1965 – Park y Strominger muestran que la penicilina bloquea el último paso de la síntesis de peptidoglicano, el entrecruzamiento que implica el ataque de un amino al enlace peptídico de dos residuos de D-Ala. Esto es catalizado por una transpeptidasa.

En el mecanismo se forma un intermediario acil-enzima.

Estructura de la penicilinaBencil penicilina

Penicilina

Anillo tiazolidina fusionada a un anillo β-lactámico, al cual se une un grupo R variable por enlace amida.

La penicilina encaja perfecto en el sitio activo de la transpeptidasa porque se parece al péptido R-D-Ala-D-Ala.

Más aún, se parece al estado de transición postulado.

La penicilina unida al sitio activo de la transpeptidasareacciona con un residuo de serina, inactivándola irreversiblemente.

Esto es favorecido por la alta reactividad del anillo β-lactámico.

La penicilina es inactivada por la penicilinasa o β-lactamasa.

La penicilinasa también forma un intermediario covalente con la penicilina, pero el intermediario se hidroliza rápidamente, inactivando la penicilina.

El uso indiscriminado de antibióticos β-lactámicos ha llevado a la selección de cepas resistentes.

Ácido clavulánico

Inhibidor de β-lactamasaN

O

O

OOH

OH

AMOXICILINA / ACIDO CLAVULANICOVIA ORALComprimidos - Suspensión pediátrica

Suspensión lactantes

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