Reglamento Trabajo Final - IIB-INTECH · Maite Lobo, Giannina Carlevaro, Luciano Melli*, ......

FACULTAD DE INGENIERIA Y CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

Licenciatura en Ciencias Biológicas

TRABAJO FINAL

Expresión, localización y perfil antigénico de proteínas TolT de

Trypanosoma cruzi.

Comisión Evaluadora:

Integrante N°1:

Integrante N°2:

Integrante N°3:

Director del trabajo: Buscaglia Andrés Carlos.

Codirectora del trabajo: Virginia Balouz.

Alumna: Lobo Mabel Maite.

Orientación: Ciencias de la Salud.

Fecha: 00-08-17.

Firma integrante N°1 de CE Firma integrante N°2 de CE

Firma integrante N°3 de CE

Firma integrante N°1 de CTF

Firma integrante N°2 de CTF

Agradecimientos

Parte de los resultados obtenidos en este trabajo han sido incluidos

en:

Expresión, localización y perfil antigénico de proteínas TolT de Trypanosoma

cruzi.

Lobo M, Balouz V, Melli LJ, Ciocchini A, Agüero F, Buscaglia CA.

Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología, Santa Fe, Argentina, 2016.

Molecular characterization of TolT antigens from Trypanosoma cruzi.

Maite Lobo*, Giannina Carlevaro*, Luciano Melli*, Virginia Balouz*, María Eugenia

Cortina, María de los Milagros Cámara, Gaspar E. Cánepa, Santiago Carmona, Oscar

Campetella, Andrés Ciocchini, Fernán Agüero, Juan Mucci, Carlos A. Buscaglia.

*Todos estos autores contribuyeron igualmente al trabajo.

Manuscrito en preparación.

Índice

ABREVIATURAS ............................................................................................................... 1

RESUMEN ........................................................................................................................... 3

ABSTRACT .......................................................................................................................... 5

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 7

TRYPANOSOMA CRUZI Y ENFERMEDAD DE CHAGAS .......................................................... 7

TRYPANOSOMA CRUZI - FLAGELO ...................................................................................... 8

TOLT ................................................................................................................................. 9

OBJETIVOS ....................................................................................................................... 12

MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................................... 13

ANÁLISIS DE SECUENCIAS ............................................................................................... 13

STOCK DE PARÁSITOS Y LÍNEAS CELULARES .................................................................. 13

PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS ANCLADAS POR GPI ....................................................... 14

ENSAYO DE SECRECIÓN ................................................................................................... 14

DISEÑO Y VALIDACIÓN DE OLIGONUCLEÓTIDOS PARA REAL TIME QPCR ................... 15

EXTRACCIÓN DE ARN Y RETROTRANSCRIPCIÓN ........................................................... 15

CUANTIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA POR REAL-TIME QPCR .......................... 15

EXTRACCIÓN DE ADN Y AMPLIFICACIÓN GÉNICA POR PCR ........................................ 17

CLONADO ......................................................................................................................... 18

SECUENCIACIÓN .............................................................................................................. 19

PREPARACIÓN DE CÉLULAS COMPETENTES ................................................................... 19

CONDICIONES DE CULTIVO BACTERIANO ....................................................................... 19

EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS TOLT RECOMBINANTES EN BACTERIAS .............................. 19

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR ............................................................................ 20

PÉPTIDOS ......................................................................................................................... 20

INMUNIZACIÓN ................................................................................................................ 20

DECLARACIÓN DE ÉTICA ................................................................................................. 21

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA Y WESTERN BLOT .............................. 21

ENSAYOS DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) ............................................... 21

POBLACIÓN EN ESTUDIO ................................................................................................. 22

MICROARREGLO DE PÉPTIDOS ....................................................................................... 22

ELISA ............................................................................................................................. 23

ANÁLISIS ESTADÍSTICO ................................................................................................... 23

RESULTADOS .................................................................................................................. 25

IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN IN SILICO DE LA FAMILIA GÉNICA TOLT EN T.

CRUZI ............................................................................................................................... 25

FAMILIA GÉNICA TOLT .......................................................................................................... 25 PROTEÍNAS TOLT ................................................................................................................... 30

EXPRESIÓN DE ARNM Y PRODUCTOS DE TOLT DURANTE EL CICLO DE VIDA DE T.

CRUZI ............................................................................................................................... 35

EXPRESIÓN GÉNICA DE TOLT ................................................................................................ 35 EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS TOLT .................................................................................. 36 LOCALIZACIÓN SUBCELULAR DE LAS PROTEÍNAS TOLT .................................................... 38

IDENTIFICACIÓN Y MAPEO DE LOS EPITOPES B DE TOLT .............................................. 39

CONCLUSIONES Y DISCUSIÓN .................................................................................. 45

IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN IN SILICO DE LA FAMILIA GÉNICA TOLT EN T.

CRUZI ............................................................................................................................... 45

EXPRESIÓN DE ARNM Y PRODUCTOS DE TOLT DURANTE EL CICLO DE VIDA DE T.

CRUZI ............................................................................................................................... 47

IDENTIFICACIÓN Y MAPEO DE LOS EPITOPES B DE LA FAMILIA TOLT .......................... 48

INFORMACIÓN SUPLEMENTARIA ........................................................................... 49

BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................... 56

Trabajo Final - Lobo Maite Abreviaturas

1

Abreviaturas

aa: Aminoácido/s.

ADN: Ácido desoxirribonucleico.

Ala: Alanina.

Arg: Arginina.

ARN: Ácido ribonucleico.

ARNm: Ácido ribonucleico mensajero.

BLASTN: Basic Local Alignment Search Tool N.

BSA: Albúmina sérica bovina.

Cys: Cisteína.

DAPI: 4’,6-diamino-2-fenilindol.

dNTPs: Desoxirribonucleótidos trifosfato.

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay): Ensayo por inmunoabsorción ligado a

enzimas.

FCS (fetal calf serum): Suero fetal de ternera.

FITC (fluorescein isothiocyanate): Isotiocianato de fluoresceína.

fw: Forward.

Glu: Ácido glutámico.

GPI: Glicosilfosfatidilinositol.

GST: Glutatión-S-Transferasa.

HAI: Hemoaglutinación indirecta.

HRP (horseradish peroxidase): Peroxidasa de rábano.

IFI: Inmunofluorescencia indirecta.

IgG: Inmunoglobulina G.

IPTG: Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido.

kDa: KiloDalton.

LB: Medio de cultivo Luria-Bertani.

Leu: Leucina.

Lys: Lisina.

MASPs (mucin-associated surface proteins): Proteínas de superficie asociadas a mucinas.

MCS (multiple cloning site): Sitio de clonado múltiple.

MEM (minimum essential medium): Medio mínimo esencial.

NLS (nuclear localization signal): Señal de localización nuclear.

Trabajo Final - Lobo Maite Abreviaturas

2

nm: Nanómetros.

nt: Nucleótido/s.

OD (optical density): Densidad óptica.

PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis): Electroforesis en gel de poliacrilamida.

PBS: Buffer fosfato salino.

PBSA: Albúmina sérica bovina en PBS.

PBST: Tween 20 en PBS.

PCR (polymerase chain reaction): Reacción en cadena de la polimerasa.

PFA: Paraformaldehído.

pI: Punto isoeléctrico.

PI-PLC (phosphoinositol specific phospholipase C): Fosfatidilinositol fosfolipasa tipo C.

PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride): Fluoruro de fenilmetilsulfonilo.

PVDF: Polifluoruro de vinilideno.

RE: Retículo endoplasmático.

rpm: Revoluciones por minuto.

rv: Reverse.

SD: Desvío estándar.

SDS: Dodecil sulfato sódico.

SDS-PAGE: PAGE en condiciones desnaturalizantes.

SP (signal peptide): Péptido señal.

TCA: Tricloro acético.

TcCLB: Trypanosoma cruzi clon CL Brener.

TCDM: Trypanosoma cruzi clon Dm28c.

Tc_MARK: Trypanosoma cruzi marinkellei.

Tc_SYL: Trypanosoma cruzi Sylvio X10/1.

TRSC58: Trypanosoma rangeli SC58.

U.A.: Unidades Arbitrarias.

Trabajo Final - Lobo Maite Resumen

3

Resumen

Trypanosoma cruzi, agente etiológico de la Enfermedad de Chagas, posee un ciclo de

vida digenético, que alterna entre un insecto vector y un mamífero hospedador y consta de

varias formas de desarrollo. A lo largo de su ciclo de vida, el parásito experimenta cambios

en sus caracteres morfológicos, fisiológicos y bioquímicos siendo de los más remarcables

la organización del aparato flagelar. En el año 1990 el grupo de Jerry Manning identificó

una familia de antígenos aparentemente relacionados, con expresión localizada en la

superficie del flagelo en contacto con el cuerpo celular de tripomastigotes y peso

molecular entre 34 y 45 kDa, dependiendo del aislamiento del parásito. El mismo grupo

luego describió un tándem genómico de 3 genes altamente relacionados (>97% de

identidad nucleotídica) como codificantes de estos antígenos. Los productos deducidos de

estos genes mostraron homología con las proteínas TolA de Escherichia coli y

Pseudomonas aeruginosa por lo que se los nombró TolT. Las proteínas TolT, además,

resultaron blanco de la respuesta inmune celular durante la infección. Ante la

disponibilidad de nueva información genética surgida de la secuenciación de múltiples

genomas de distintos aislamientos de T. cruzi y organismos filogenéticamente

emparentados, en esta Tesina de Licenciatura se reevaluó la complejidad de la familia

TolT con el objetivo de llevar a cabo una caracterización detallada a nivel de expresión,

localización sub-celular, y perfil antigénico. Una búsqueda de tipo BLASTN definió 22

secuencias con similitud significativa con TolT1 en el genoma de tripanosomátidos, los

que se agruparon en 3 subfamilias denominadas TolT-A, TolT-B y TolT-C en base a

criterios estructurales. Los miembros de la familia se disponen en tandem en orientación

cabeza-cola de a 3 unidades, poseen un péptido señal clivable en el extremo N-terminal,

seguido por una región madura más conservada y una señal de anclaje por GPI en el

extremo C-terminal y sufren modificaciones post-traduccionales de tipo N-glicosilación.

TolT-A (96-99% identidad nucleotídica entre ellos) y B (76-90% identidad nucleotídica

con TolT-A) presentan una región C-terminal muy conservada y un menor grado de

identidad hacia la región N-terminal, mientras que TolT-C (~47% de identidad

nucleotídica con TolT-A) es mucho más divergente. Se analizó la expresión a nivel de

ARNm mediante Real-Time qPCR observándose, para todos los estadios, una mayor

expresión de TolT-A, seguida por TolT-B y una mínima expresión de TolT-C. Un análisis

comparativo entre estadios indicó que TolT-A presenta mayor expresión en

tripomastigotes, mientras que TolT-B y C resultan más homogéneas. A nivel proteico

Trabajo Final - Lobo Maite Resumen

4

TolT-A se expresa en tripomastigotes y, en mucha menor medida, en amastigotes mientras

que TolT-B lo hace solo en tripomastigotes según ensayos de WB realizados con

anticuerpos específicos para las distintas subfamilias. La localización de TolT-A y B se

restringe al flagelo de tripomastigotes y al extremo posterior o anterior de amastigotes,

respectivamente. No se obtuvieron datos de expresión proteica para TolT-C en ningún

estadio del parásito. Estos resultados muestran una alta correlación entre los niveles de

mRNA y proteína para las distintas subfamilias de TolT. La antigenicidad de TolT está

dirigida mayormente contra el C-terminal compartido por los grupos TolT-B y A, cuya

prevalencia en la población de pacientes seropositivos resultó ser de ~42.9%. En algunos

pocos casos, también encontramos anticuerpos dirigidos contra la región N-terminal

diferencial de TolT-B y contra TolT-C. En conjunto, nuestros resultados indican que TolT

resulta ser una familia multigénica mucho más compleja que la descripta originalmente,

dentro de la cual pueden delinearse subfamilias de proteínas con patrones de expresión y

localización (y probablemente también función) distintos.

Trabajo Final - Lobo Maite Abstract

5

Abstract

Trypanosoma cruzi, etiological agent of Chagas disease, has a digenetic life cycle that

alternates between an insect vector and a vertebrate host, and consists of several

developmental forms. Along these transformations, the parasite undergoes remarkable

morphological, physiological and biological changes, including the organization of its

flagellar apparatus. In 1990, Jerry Manning’s group identified a family of apparently

related antigens that localized to the surface of the flagellum in contact with the cell body

of trypomastigotes. These molecules displayed a relative molecular mass between 34 and

45 kDa, depending on the parasite strain. Then, the same group described a genomic

tandem of 3 highly related genes (>97% nucleotide identity) coding for these antigens. The

predicted products encoded by these genes showed homology with the TolA proteins of

Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa, and they were accordingly designated

TolT. TolT proteins also resulted target antigens of the cellular immune response during T.

cruzi experimental infection. Due to the availability of new genetic information arising

from the sequencing of multiple genomes of different T. cruzi strains and other

phylogenetically related organisms, in this Thesis, we reevaluated the complexity of the

TolT family and provided a detailed characterization of its expression pattern, localization,

and antigenic profile. A BLASTN search defined significant similarity between TolT1 and

22 sequences in the genome of trypanosomatids, which were split into 3 subfamilies

named TolT-A, TolT-B y TolT-C based on structural criteria. Family members are

arranged in head-to-tail tandem of 3 genes in different chromosomes. Their encoded

products possess a cleavable N-terminal signal peptide followed by a more conserved

mature region and a GPI anchor signal at the C-terminal end, and undergo N-

glycosylation. TolT-A (96-99% nucleotide identity among them) and TolT-B (76-90%

nucleotide identity with TolT-A) have a highly conserved C-terminal region and a lower

degree of identity towards the N-terminal region, whereas TolT-C (~47% nucleotide

identity with TolT-A) is much more divergent. mRNA expression levels were quantified

by Real-Time qPCR showing, for all developmental stages, a higher expression of TolT-A,

followed by TolT-B and a minimal expression of TolT-C. A comparative analysis between

stages indicated that TolT-A shows higher expression in trypomastigotes, whereas TolT-B

and C are more homogeneous. At the protein level TolT-A is expressed in trypomastigotes

and, to a lesser extent, in amastigotes whereas TolT-B is restricted to trypomastigotes

according to the WB assays with specific antibodies for the different subfamilies. The

Trabajo Final - Lobo Maite Abstract

6

localization of TolT-A and TolT-B is restricted to the flagellum of trypomastigotes and to

the posterior or anterior end of amastigotes, respectively. No protein expression data were

obtained for TolT-C at any developmental stage of the parasite. These results show a high

correlation between mRNA and protein levels for the different TolT subfamilies. The

humoral immune response of T. cruzi-infected individuals is mainly directed against the C-

terminal end shared by TolT-B and A (seroprevalence 42.9%). In a few cases, we also

detected antibodies directed against the N-terminal differential region of TolT-B and

against TolT-C. Taken together, our results indicate that TolT is a much more complex

multigenic family than originally described, within which protein subfamilies with distinct

expression and localization patterns (and likely function) can be delineated.

Trabajo Final - Lobo Maite Introducción

7

Introducción

Trypanosoma cruzi y enfermedad de Chagas

Los protozoarios son eucariotas unicelulares de morfología y metabolismo complejos.

Son holozoicos, algunos poseen estructuras para la propulsión u otro tipo de movimiento

(pseudópodos, cilios o flagelo) y la mayoría se reproducen asexualmente por fisión binaria

y tienen vida libre, existiendo también comensales y parásitos [1]. Dentro de estos se

encuentra el orden Trypanosomatida, cuyos miembros son todos parásitos que causan

enfermedades en plantas y animales, e incluye especies de Leishmania, causante de

distintas leishmaniasis en todo el mundo, Trypanosoma brucei, responsable de la

enfermedad del sueño o tripanosomiasis africana y Trypanosoma cruzi (Familia

Trypanosomatidae), el agente etiológico de la Enfermedad de Chagas. Esta enfermedad es

endémica de América Latina, y se estima que afecta a unas 6-7 millones de personas [2].

En la actualidad no hay vacunas disponibles y las drogas utilizadas en el tratamiento son

tóxicas y no totalmente efectivas por lo que la enfermedad de Chagas se ha convertido en

un problema emergente de la salud pública global [3].

T. cruzi posee un ciclo de vida digenético, que alterna entre un insecto vector

(Subfamilia: Triatominae, Familia: Reduviidae, Orden: Hemiptera) y un mamífero

hospedador (doméstico o salvaje, incluyendo al hombre) y consta de varias formas de

desarrollo. Los tripomastigotes sanguíneos (Figura I.1.B) son las formas circulantes,

infectivas, no replicativas, presentes en el hospedador mamífero, y consumidas por el

insecto hematófago durante la ingesta de sangre. En el tracto digestivo anterior, se

diferencian extracelularmente a epimastigotes (Figura I.1.C), forma replicativa no

infectiva. Los epimastigotes se adhieren a la pared de la ampolla rectal, donde se

diferencian a tripomastigotes metacíclicos (bioquímica y morfológicamente distintos a los

tripomastigotes sanguíneos) (Figura I.1.B), forma no replicativa que transmite la infección

al hospedador mamífero al depositarse junto con la excreta en la herida resultante de la

picadura o en las mucosas. Los tripomastigotes metacíclicos infectan una amplia variedad

de células nucleadas en el hospedador [4] donde se diferencian intracelularmente a

amastigotes (Figura I.1.A), forma replicativa que tras varias rondas de división binaria se

transforman nuevamente en tripomastigotes sanguíneos. Estos se liberan al medio

extracelular, a la circulación sanguínea y a la circulación linfática siendo capaces de

invadir nuevas células o son eventualmente ingeridos por un insecto, cerrando así el ciclo


8

[5]. La repetición de esta ronda de invasión y replicación intracelular desencadena la fase

aguda de la enfermedad, caracterizada por alta parasitemia y parasitismo de tejidos,

mientras que la fase crónica se alcanza 45-60 días después de la infección original, cuando

la primera es controlada pero falla la eliminación completa de los parásitos [6] y se

caracteriza por un espectro de secuelas patológicas que incluyen complicaciones

gastrointestinales y/o cardíacas desde subclínicas hasta mortales.

A lo largo de las transformaciones sufridas por el parásito durante de su complejo ciclo

de vida hay cambios en los caracteres morfológicos, fisiológicos y bioquímicos [7], siendo

de los más remarcables la organización del aparato flagelar.

Figura I.1: Microscopía de contraste de fases donde se observan las formas amastigotes

(A), tripomastigotes (B) y epimastigotes (C) de T. cruzi. Imagen extraída de [8].

Trypanosoma cruzi - Flagelo

Una característica propia de T. cruzi, y tripanosomátidos en general, es la presencia de

un único flagelo. En tripomastigotes, éste se origina en el extremo posterior y posee una

porción que se encuentra anclada a lo largo de todo el cuerpo celular mientras otra,

pequeña, emerge libre al final. Esta disposición flagelar es la base morfológica de la

llamada ‘membrana ondulante’, típica del estadio tripomastigote [7]. En epimastigotes, por

el contrario, el flagelo se origina en el extremo anterior donde una pequeña fracción se

ancla al cuerpo y luego emerge como una organela libre. En amastigotes solo se

encuentran un flagelo incipiente y no funcional en términos de motilidad [7].

El flagelo es una estructura tipo cola que emerge del cuerpo celular a través del bolsillo

flagelar [9] y se encuentra unida lateralmente mediante la zona de anclaje flagelar, una

especialización de microtúbulos compleja conectada al citoesqueleto a través de 2

membranas de localización basal. Consiste en un axonema con configuración de 9 pares de

microtúbulos periféricos y 1 par central (9+2, conservado en eucariotas) y un bastón

paraflagelar [9,10].


9

La principal función del flagelo está asociada a la propulsión, aunque también se

demostró que, en tripanosomátidos, juega roles clave en la morfogénesis celular [11], la

interacción con el insecto vector [12], la segregación del ADN mitocondrial [13], la

división celular [14] y los mecanismos de endo- y exocitosis [9]. Existen múltiples

evidencias de que los componentes flagelares son muy antigénicos [15,16] y que se

asociarían a la inducción de respuestas inmunoprotectivas en infecciones experimentales

[17]. También se los ha vinculado al desarrollo de patologías del tipo autoinmune [18]

durante la enfermedad de Chagas.

Figura I.2: Micrografía electrónica de barrido de un epimastigote de T. cruzi. El

flagelo (puntas de flecha), el cual emerge del bolsillo flagelar (flecha), está anclado

al cuerpo celular a lo largo de la zona de anclaje flagelar. Imagen extraída de [19].

TolT

En el año 1990, en un intento de identificar nuevos antígenos del parásito, el grupo de

Jerry Manning produjo hibridomas derivados de células de bazo de ratones infectados con

la cepa Perú de T. cruzi y evaluó la reactividad de los anticuerpos monoclonales

producidos. Uno de estos, denominado mAb20H1, reconoció un antígeno (20H1) cuya

expresión resultó exclusiva del estadio tripomastigote (Figura I.3.A) y su localización

restringida a la superficie del flagelo en contacto con el cuerpo celular (Figura I.4).

Mediante WB se observó que este anticuerpo reconocía varias bandas de peso molecular

aparente similar, entre 34 y 45 kDa dependiendo de la cepa estudiada (Figura I.3.B),

sugiriendo que se trataba de una familia de antígenos relacionados con polimorfismos de

secuencia y/o modificaciones post-traduccionales distintas [16]. Más tarde, el mismo grupo

describió en la cepa Esmeraldo que estos antígenos estaban codificados por al menos 3

genes altamente relacionados (>97% de identidad nucleotídica) en el genoma de T. cruzi y

que las proteínas deducidas a partir de estos genes tenían homología con las proteínas

TolA de Escherichia coli (32% de identidad en una superposición de 229 aminoácidos) y

Pseudomonas aeruginosa (34% de identidad en una superposición de 195 aminoácidos)

por lo que les fue asignado el nombre de TolT [20]. Las proteínas TolT, además, resultaron


10

ser blanco de la respuesta inmune celular durante la infección experimental, por lo que se

evaluó su potencial como reactivo vacunal [20]. Posteriormente, un miembro de la familia

TolT, aunque levemente divergente a las proteínas TolT1-3 descriptas originalmente, fue

postulado como potencial reactivo para el diagnóstico serológico de la enfermedad de

Chagas [21].

Figura I.3: Análisis de WB revelados

con el anticuerpo mAb20H1. A: (a)

marker de peso molecular; (b) lisado de

epimastigotes cepa Peru; (c) lisado de

tripomastigotes cepa Peru. B: (a) marker

de peso molecular; (b) lisado de

epimastigotes y lisado de tripomastigotes

cepa CL (c), Esmeraldo (d), Peru (e),

Silvio (f) e Y (g) de T. cruzi. Imagen

extraída de [16].


11

Figura I.4: Localización del antígeno 20H1 por inmunofluorescencia indirecta en

tripomastigotes de la cepa Peru de T. cruzi. Las puntas de flecha marcan la posición

del flagelo. Imagen extraída de [16].

En el año 2005 se reportó el primer genoma de T. cruzi, cepa CL Brener, [22] al que

luego se le incorporaron otras cepas (Sylvio X10/1 [23], Dm28c [24]) y otros

tripanosomátidos relacionados como T. cruzi marinkellei [25], Trypanosoma rangeli [26],

T. brucei [27] y distintas especies de Leishmanias [28]. Ante la magnitud de la nueva

información disponible, y la identificación recurrente de proteínas tipo TolT en bases de

datos proteómicas del parásito [29-31], en la presente Tesina de Licenciatura decidimos

reevaluar la complejidad de la familia TolT de T. cruzi. Para ello realizamos una

caracterización detallada a nivel de dosaje y complejidad génica, la delineación de grupos

coherentes dentro de la familia basados en criterios estructurales y el análisis de la

expresión, localización subcelular, y perfil antigénico de los polipéptidos codificados.


12

Objetivos

I. Caracterizar in silico a la familia génica TolT en T. cruzi.

II. Determinar la expresión de ARNm y proteínas TolT durante el ciclo de vida de T.

cruzi.

III. Identificar, mapear y validar los epitopes B de TolT.

Trabajo Final - Lobo Maite Materiales y métodos

13

Materiales y Métodos

Análisis de secuencias

Se llevaron a cabo búsquedas de similitud de secuencias utilizando BLASTN, la cual

explora una base de datos nucleotídica utilizando como señuelo una secuencia nucleotídica

en TriTrypDB (http://tritrypdb.org/tritrypdb/) con la configuración definida por default. En

nuestro caso, usamos como señuelo la secuencia completa del gen TolT1 (GenBank:

AF099099.1) Se definieron como significativos aquellos resultados con un E-value menor

que 10-5. Las secuencias codificantes de TolT en CL Brener fueron descargadas de

TriTrypDB. Con ellas se llevó a cabo un alineamiento múltiple utilizando el programa T-

Coffee [32] y, tras el curado manual, la construcción de un árbol filogenético basado en el

método de distancias Neighbor-Joining [33] con un análisis de bootstrap [34] de 1000

repeticiones lo que permitió la separación de las proteínas TolT en 3 grupos robustos.

Luego se procedió a realizar nuevas búsquedas, utilizando ahora como señuelo un

miembro representativo de cada uno de los grupos definidos (TolT-A: TcCLB.508767.20,

TolT-B: TcCLB.510433.20, TolT-C: TcCLB.506815.20), se agregaron los nuevos matches

significativos al alineamiento (Figura S.1) y se reconstruyó el árbol tal como se describió

previamente. El árbol final obtenido fue visualizado y editado gráficamente para su

presentación con el programa iTOL [35]. Para cada grupo se definió el porcentaje de

identidad con TolT1 y la ubicación en el genoma, así como la masa, el pI y la presencia de

SP a partir de información provista por TriTrypDB, mientras que las señales de anclaje por

GPI se predijeron usando el algoritmo PredGPI [36]. Además se realizaron predicciones de

modificaciones post-traduccionales: fosforilación, N-glicosilación, O-glicosilación y

palmitoilación utilizando los algoritmos NetPhos 3.1 [37], NetNGlyc 1.0, NetOGlyc 4.0

[38] y CSS-Palm 3.0 [39] respectivamente. También se evaluó la homología a las TolA

bacterianas mediante búsquedas de tipo BLASTP desde el servidor UniProt

(http://www.uniprot.org/blast/) utilizando como señuelo cada una de las secuencias de

TolT identificadas, con restricción a la base de datos de Bacteria y la configuración

determinada por default. Para la generación de logos se utilizó WebLogo (disponible en

http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi).

Stock de parásitos y líneas celulares

Diferentes estadios de desarrollo de parásitos de la cepa CL Brener se obtuvieron y

purificaron como se describió previamente [40]. Brevemente, los epimastigotes se

http://tritrypdb.org/tritrypdb/

http://www.uniprot.org/blast/

http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi


14

crecieron a 28°C en medio BHT suplementado con 10% de FCS (Gibco) inactivado por

calor. Los tripomastigotes y amastigotes derivados de células se cosecharon (a distintos

tiempos post-infección) del sobrenadante de células Vero libres de micoplasmas (ATCC)

crecidas a 37°C y 5% de CO2 en MEM suplementado con 10% de FCS, 0.292 g/L de L-

glutamina, 100 IU/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina (de Laboratorios

Gibco). En todos los casos cada estadio tenía un nivel de pureza ≥ 90%.

Purificación de proteínas ancladas por GPI

Pellets compuestos por 1x108 tripomastigotes de T. cruzi CL Brener fueron

homogeneizados en 2 ml de buffer GPI [Tris/HCl 10 mM pH 7.4, NaCl 150 mM, Triton

X-114 2%, PMSF 1 mM y un cocktail inhibidor de proteasas (Sigma)] en hielo por 1 hora

[41]. El homogenato se centrifugó a 8800 g y 0°C por 10 minutos y el sobrenadante (S1) se

guardó a -20°C durante 24 horas. El pellet (P1) se lavó con 1 ml de buffer A (Tris-HCl 10

mM pH 7.4, NaCl 150 mM, TX-114 0.06%, PMSF 1 mM) y se guardó. El S1 fue

descongelado y sometido a una separación de fases a 37°C por 10 minutos seguida de una

centrifugación a 3000 g por 3 minutos a temperatura ambiente. Se recolectó la fase

superior (S2) y a la fase rica en detergente se le realizó una re-extracción con 1 ml de

buffer A. La fase superior (S3) se recolectó y la fase rica en detergente se sometió a una re-

extracción con 1 ml de buffer A, se homogeneizó, se incubó a 0°C durante 30 minutos y se

centrifugó a 18000 g por 10 minutos a 0°C. El pellet (P2) se lavó con 1 ml de buffer A y se

guardó mientras el sobrenadante (S4) se sometió a una nueva fase de separación. La fase

superior (S5) fue recolectada y la inferior, fase rica en detergente y enriquecida con

proteínas ancladas a GPI, se recolectó como la fracción GPI (GPI). Las distintas fracciones

(P1, S1, S2, S3, S4, S5 y GPI) se analizaron por WB.

Ensayo de secreción

Se cosecharon 3x108 tripomastigotes derivados de células y se eliminó el medio por

centrifugación. Se resuspendieron en 5 ml de PBS suplementado con 2% de glucosa estéril

y se incubaron en estufa a 37°C durante 2 horas. Luego se centrifugó a 7000 rpm durante

10 minutos, se separó el sobrenadante (S) del pellet (P) y el primero se filtró con una

membrana de 2 µm y se precipitó con Ácido Tricloroacético (TCA) [40]. Brevemente, se

agregó 1 volumen (100% p/v) de TCA cada 4 volúmenes de muestra, se incubó 10 minutos

a 4°C, se centrifugó a 14000 rpm durante 5 minutos y se removió el sobrenadante. Se lavó

el pellet con 200 µl de acetona fría, se centrifugó a 14000 rpm durante 5 minutos, dos


15

veces y por último se dejó secar el pellet a 95°C durante 10-15 minutos. Pellet y

sobrenadante se analizaron mediante WB.

Diseño y validación de oligonucleótidos para Real time qPCR

Se diseñaron 3 pares de oligonucleótidos en regiones específicas de TolT-A, TolT-B y

TolT-C. Para el diseño se utilizaron las secuencias TcCLB.506617.10. TcCLB.510433.20

y TcCLB.504277.30 respectivamente, las cuales se alinearon y se buscaron las regiones

más divergentes entre ellas. A su vez, se cargaron las secuencias de los genes completos en

el software PerlPrimer v1.1.21 para el diseño de oligonucleótidos de Real Time. Se

eligieron aquellos que hibridaban en las secuencias de interés para minimizar

amplificación cruzada. Cada par de oligonucleótidos fue utilizado en reacciones de PCR a

punto final para evaluar la amplificación de un solo producto de tamaño esperado en geles

de agarosa y la ausencia de producto en el control sin templado. Los productos obtenidos

en cada reacción fueron clonados en un plásmido pGEM-Teasy (Promega) y secuenciados

usando los primers T7 y SP6, los cuales flanquean al MCS (Figura S.2). Luego de esta

validación se procedió con la realización y cuantificación de la Real-Time qPCR.

Extracción de ARN y retrotranscripción

El ARN total de tripomastigotes, amastigotes extracelulares y epimastigotes de T. cruzi

CL Brener (4x108 de parásitos en cada caso) se extrajo utilizando el reactivo TRIzol

(Invitrogen, USA) y se trató con ADNasa I (Sigma-Aldrich, USA) [40]. La cantidad y

pureza del ARN se estimó mediante espectrofotometría a 260/280 nm utilizando un

espectrofotómetro UV-VIS Micro-volumen (Thermo Scientific™ NanoDrop™). La

integridad se verificó por electroforesis en gel de agarosa 2.5% (p/v). Todas las reacciones

de transcripción reversa partieron de 3 µg de ARN utilizando primer oligo-dT 10 µM,

dNTPs 10 mM y la transcriptasa reversa SuperScript™ II (Sigma), de acuerdo a [40].

Cuantificación de la expresión génica por Real-Time qPCR

El ensayo de Real-Time qPCR se realizó en el Sistema de PCR en tiempo real

7500 de Applied BioSystems, utilizando la Master Mix KAPA SYBR® FAST qPCR

(Kapa Biosystems, USA). Las condiciones para la Real-Time qPCR fueron: tras una pre

incubación de 2 minutos a 50°C, un paso inicial de desnaturalización a 95°C por 10

minutos, seguidos por 40 ciclos de desnaturalización, alineamiento y extensión a 95°C por

15 segundos y 63°C por 1 minuto. Para monitorear la especificidad de los oligonucleótidos


16

se realizaron las curvas de disociación (melting curve) al finalizar cada experimento

(Figura S.3). Las reacciones se hicieron por triplicado utilizando 2 µl de ADNc de

tripomastigotes, amastigotes y epimastigotes como templado en un volumen total de 10 µl.

Los oligonucleótidos utilizados se muestran en la Tabla M.1 La cuantificación relativa de

los genes de interés se realizó considerando la eficiencia de la reacción la cual se calculó

utilizando el approach matemático LinReg PCR V12.17 [42,43]. Éste calcula la eficiencia

de cada curva de fluorescencia vía regresión lineal en la parte exponencial de la misma.

Como control endógeno se usaron los genes Calmodulina y GAPDH de T. cruzi. Para

calcular la relación entre el gen de referencia y el gen target, incluyendo la corrección de la

eficiencia, se utilizó la fórmula modificada de Pfaffl, 2001 [44].

Tabla M.1: Oligonucleótidos utilizados para el análisis de expresión génica de TolT

mediante Real-Time qPCR.

Nombre Gen target

(TcCLB.) Secuencia (5’-3’)

Producto

amplificado

(pb)

TcTolTART Fw

TcTolTART Rv

TolT-A

506617.10

506617.20

CTGGGCTTGAGAAAGAAGCAG

CTGGAATTCCTGCTCCTCCT 229

TcTolTBRT Fw

TcTolTBRT Rv

TolT-B

508767.10

510433.20

AGGCTACAAGGATGAGCAGG

CCAACCTTAGTCTTCTCGTCC 175

TcTolTCRT Fw

TcTolTCRT Rv

TolT-C

504277.30

CCAAGAAATACGCCGAAGAG

TTTGTCAGTCGAATCTGCAGAG 241

TcCalm Fw

TcCalm Rv

TcCalmodulina

506391.10

506391.20

507483.30

507483.39

507483.50

CCCGACGGAGGCGGAGCTGC

GTCCACGTCGGCCTCGCGGA

268


17

Extracción de ADN y amplificación génica por PCR

El ADN genómico de T. cruzi (cepa CL Brener) se purificó por el método de fenol-

cloroformo [45].

Los fragmentos génicos de interés, descriptos en la tabla M.2 y representados en la

Figura R.9, se amplificaron por PCR utilizando 1-10 ng de ADN como templado, Taq

ADN polimerasa de alta fidelidad (Invitrogen) y los oligonucleótidos correspondientes

detallados en la tabla M.3. Los oligonucleótidos se diseñaron tratando de evitar los

polimorfismos existentes entre las distintas secuencias de una misma subfamilia de TolT.

Tabla M.2: Fragmentos de interés para la generación de proteínas recombinantes.

Gen

target Fragmento Desde - Hasta*

Producto

(pb)

GST-Producto

(kDa)

TolT-A TolT-A N-terminal F54 - T174 360 39

TolT-B

TolT-B N-terminal

TolT-B Centro

TolT-B C-terminal

TolT-B Full

Q61 - S103

S97 - L162

G155 - R260

Q61 - R260

126

195

315

597

31

33

38

48

TolT-C TolT-C A83 - D313 690 51

*Se utiliza el código de una letra para definir el aminoácido.

Tabla M.3: Oligonucleótidos utilizados para la amplificación de los fragmentos de interés.

Nombre Descripción* Secuencia nucleotídica (5’ a 3’)**

TolT-A Fw Fw para amplificar

TolT-A desde F54,

con sitio BamHI.

GCggatccTTTGACTGGGCATTCAAG

TolT-A Rv Rv con Stop para

amplificar TolT-A

hasta T174, con

sitio XhoI.

GActcgagCTAAGTATGATTTGCCGCCTT

TolT-B Fw

Fw para amplificar

TolT-B desde Q61,

con sitio BamHI.

CGggatccCAGGAGTACGCTGATGAGGCT

TolT-B Rv Rv para amplificar

TolT-B hasta S103,

CGgaattcGCTCATCCTTGTAGCCTCAGA

TcGAPDH Fw

TcGAPDH Rv

TcGAPDH

506943.50

506943.60

509065.60

509065.70

GTGCGGCTGCTGTCAACA

AAAGACATGCCCGTCAGCTT

178


18

con sitio XhoI.

TolT-B 2 Fw Fw para amplificar

TolT-B desde S97,

con sitio BamHI.

CGggatccTCTGAGGCTACAAGGATGAGC

TolT-B 2 Rv Rv para amplificar

TolT-B hasta L162,

con sitio XhoI.

CGgaattcCAACAGCTCCGGTCCACTTCC

TolT-B 3 Fw Fw para amplificar

TolT-B desde G155,

con sitio BamHI.

CGggatccGGAAGTGGACCGGAGCTGTTG

TolT-B 3 Rv Rv para amplificar

TolT-B hasta A260,

con sitio XhoI.

CGgaattcGCGCTGCGTCATTCCCCTTCT

TolT-C Fw Fw para amplificar

TolT-C desde A83,

con sitio BamHI.

GAggatccGCGACAATGCAATGCATG

TolT-C Rv Rv con Stop para

amplificar TolT-C

hasta D313, con

sitio XhoI.

GActcgagCTAACTCCCACTGCGTCTGACTC

pGEX Fw Universal pGEX Fw GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGT

pGEX Rv Universal pGEX Rv CCGGGAGCTGCATGTGTCAGA

T7 Universal T7 Fw AATACGACTCACTATAGGG

SP6 Universal SP6 Rv ATTTAGGTGACACTATAG


** Los sitios blanco de las enzimas de restricción se muestran subrayados.

Clonado

Los amplicones obtenidos fueron purificados de acuerdo al protocolo de desalado

QIAEX II, clonados en el vector pGEM-Teasy y utilizados para transformar células DH5α

F’IQ™. Además del rastreo por color (azul/blanco), las colonias se chequearon por PCR

utilizando oligonucleótidos que se unen a las regiones codificantes de los promotores de

las ARN polimerasas SP6 y T7 (Figura S.2).

Los amplicones clonados en el vector pGEM-Teasy se liberaron tras la digestión con las

enzimas BamHI y XhoI (Fermentas) y se ligaron a un vector pGEX2T con el MCS

modificado con los sitios necesarios para la compatibilidad con los insertos. Los plásmidos


19

de la línea pGEX permiten expresar proteínas como fusión al extremo Carboxilo terminal

de la proteína Glutatión-S-Transferasa de Schistosoma japonicum (GST). Se transformaron

bacterias competentes DH5α F’IQ™ con los distintos plásmidos y se realizó el rastreo de

las colonias por PCR utilizando los oligonucleótidos pGEX Fw y pGEX Rv. Los

plásmidos se purificaron a partir de cultivos de colonias positivas crecidos toda la noche a

37°C en agitación y se analizaron por secuenciación. Para evaluar la especificidad de los

antisueros generados (ver debajo), los constructos también se clonaron en el plásmido

pET28, que provee fusión N-terminal a un tag de 6 residuos histidina en tándem. La

inducción y purificación de estas proteínas se realizó de acuerdo a lo descripto [46].

Secuenciación

La secuenciación de ADN fue realizada por Macrogen, por el método de Sanger.

Preparación de células competentes

Las células competentes de las cepas E. coli DH5α F’IQ™ y E. coli BL21-CodonPlus

(DE3)-RP fueron preparadas por el método Inoue [47].

Condiciones de cultivo bacteriano

Las cepas de E. coli fueron cultivadas a 37ºC en agitador rotatorio (200-250 rpm) o en

placas de Petri con 1.5% de agar en medio LB. Según la cepa, el medio se suplementó con

los siguientes antibióticos: ampicilina 100 μg/mL o cloranfenicol 34 μg/mL.

Expresión de proteínas TolT recombinantes en bacterias

Se transformaron bacterias competentes E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RP con los

plásmidos resultantes. La cepa usada posee genes extra que codifican para los ARN de

transferencia menos representados en el genoma bacteriano, permitiendo mayores niveles

de expresión de proteínas codificadas por genes heterólogos. Se cultivaron hasta llegar a

una OD600 nm de 0.6, luego se indujo la expresión de las proteínas con IPTG (Fermentas)

250 µM y se incubó 16 horas a 28ºC en agitación. La purificación se realizó a partir de la

fracción soluble por cromatografía de afinidad hacia el dominio GST de fusión, utilizando

columnas de Glutatión-Sefarosa, siguiendo las indicaciones del fabricante (Glutathione

Sepharose 4 Fast Flow, GE Healthcare). Las proteínas se dializaron contra PBS 0.5 X en

columna NAP10 y se concentraron en SpeedVac (Savant ISS110) alcanzando

aproximadamente la mitad del volumen de elución. Se verificó la pureza e integridad de

las proteínas obtenidas en geles de poliacrilamida 12% teñidos con Coomassie Blue


20

(Figura S.4). La cuantificación se realizó por Bradford según las indicaciones del

fabricante (BioRad) usando como estándar soluciones de concentraciones conocidas de

BSA [48].

Técnicas de biología molecular

Las técnicas de restricción, ligación y purificación de ADN plasmídico, PCR,

generación y transformación de bacterias competentes por el método Inoue son de uso

corriente en el laboratorio. Se realizaron según se indica en Sambrook, J. & Russell, D. W.

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2001 y las indicaciones de los fabricantes de los

diferentes kits y/o insumos utilizados para cada caso.

Péptidos

El péptido correspondiente a los residuos K144 a H163 de TolT-C (5’-

©KAAVDADTAALAALLEVLQH-3’) se mandó a sintetizar a GenScript. Se agregó un

residuo de cisteína en el extremo N-terminal para el acoplamiento a la proteína KLH

(maleimide) (Sigma), lo cual se realizó según las instrucciones del fabricante [49].

Inmunización

Para la obtención de antisueros (Tabla M.4), 100 µg de cada proteína GST-TolT o del

péptido-KLH fueron emulsionados en adyuvante completo de Freund e inyectados

intraperitonealmente en ratones BALB/c (de entre 60 y 90 días de edad) [50]. A los 30 y

45 días post inmunización se realizaron boosters usando 50 µg del correspondiente

inmunógeno emulsionado en adyuvante incompleto. Finalizado el protocolo, se sangraron

los ratones a blanco, se preparó el suero y se midió el título contra cada proteína en un

ensayo de ELISA (utilizando proteínas fusionadas a Histidina para no considerar los títulos

de anticuerpos contra la proteína GST).

Tabla M.4.: Antisueros utilizados para el estudio de la expresión a nivel proteico de TolT

y análisis de seroprevalencia.

Nombre Descripción*

α TolT-A N-terminal Antisuero de ratón inmunizado con TolT-A F54 a T174

fusionada a GST

α TolT-B N-terminal Antisuero de ratón inmunizado con TolT-B Q61 a S103

fusionada a GST

α TolT-B Centro Antisuero de ratón inmunizado con TolT-B E97 a L162


21

fusionada a GST

α TolT-B C-terminal Antisuero de ratón inmunizado con TolT-B G155 a A260

fusionada a GST

α TolT-B Full Antisuero de ratón inmunizado con TolT-B Q61 a A260

fusionada a GST

α TolT-C Antisuero de ratón inmunizado con TolT-C K144 a H163

acoplado a KLH: ©KAAVDADTAALAALLEVLQH


Declaración de ética

La inmunización, sangrado y manejo de los animales se llevó a cabo en estricta

conformidad con las recomendaciones del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de

Animales de Experimentación (CICUAE-UNSAM). El protocolo fue aprobado por el

mismo y se hizo todo el esfuerzo para minimizar el número y sufrimiento de los animales.

Electroforesis en gel de poliacrilamida y Western blot

Las electroforesis en gel se realizaron utilizando SDS-PAGE 12% donde se corrieron

las muestras de interés. Para WB, la corrida se transfirió a una membrana de PVDF (GE

Healthcare), se la incubó durante toda la noche a 4°C en agitación con el antisuero

correspondiente (dilución 1:500 en PBST 0.05% con 5% leche) seguido por el anticuerpo

secundario, anti IgG de ratón, conjugado a HRP (Sigma) (dilución 1:5000 en PBST 0.05%

con 5% leche) y por último se reveló usando el sustrato quimioluminiscente SuperSignal

West Pico (Pierce).

Ensayos de Inmunofluorescencia indirecta (IFI)

Para los ensayos de IFI, formas extracelulares de parásitos se cosecharon y lavaron en

PBS, se adhirieron 1x106 a cubreobjetos cubiertos con poli-L-lisina (Sigma), se fijaron por

30 minutos en PFA 4% en PBS, se bloquearon por 30 minutos en BSA (Sigma) 4% en

PBS (PBSA) suplementado con saponina al 0.5% y se incubó con el anticuerpo

correspondiente diluido en PBSA [51]. Tras extensivos lavados en PBS, se agregó el

anticuerpo secundario conjugado a Alexa Fluor (Molecular Probes) y DAPI (10 µg/ml)

para la tinción de los núcleos por último se montó sobre un portaobjetos con el reactivo

FluorSave (CalBiochem). Para evaluar la reactividad en estadios intracelulares, 10000

células Vero se colocaron en cubreobjetos y tras incubarlas toda la noche se las infectó con

1x106 tripomastigotes CL Brener por cubreobjeto. Tras 16 horas, las células infectadas se

lavaron con PBS, se fijaron y procesaron para IFI. En ambos casos, previo al bloqueo, se


22

incubó con cloruro de amonio 25 mM en PBS para disminuir la fluorescencia basal. Los

antisueros para TolT-A y TolT-B se utilizaron en diluciones 1:50 y 1:25, respectivamente.

Las imágenes se obtuvieron con un microscopio de epi-fluorescencia Nikon Eclipse 80i

acoplado a una cámara DS-Qi1 CCD y fueron procesadas con el programa ImageJ [51].

Población en estudio

El panel de sueros de pacientes infectados (entre 10 y 65 años de edad, de ambos sexos,

cursando la fase crónica de la enfermedad, sin sintomatología asociada) fue provisto por el

Instituto Nacional de Parasitología “Dr. Mario Fatala Chabén” (Buenos Aires, Argentina)

[50]. Las muestras de sangre se obtuvieron por venipuntura y se analizó la presencia de

anticuerpos específicos contra T. cruzi por dos kits comerciales disponibles: ELISA,

utilizando homogenato total de parásito y HAI (ambos de Wiener lab, Argentina). Los

sueros de individuos no infectados con T. cruzi se obtuvieron de distintos bancos de

sangre: Fundación Hemocentro Buenos Aires (Buenos Aires, Argentina, Hospital de

Enfermedades Infecciosas ‘Dr. Francisco Javier Muñiz’ (Buenos Aires, Argentina),

Hospital Italiano de Buenos Aires (Buenos Aires, Argentina) y Hospital Municipal ‘Dr.

Diego E. Thompson’ (San Martín, Buenos Aires, Argentina).

Microarreglo de péptidos

En el contexto de un proyecto tendiente a la identificación y mapeo de epitopes B en las

proteínas de T. cruzi a gran escala [52], se probó con sueros de pacientes Chagásicos

crónicos la secuencia de distintos miembros de la familia TolT (TolT-A:

TcCLB.506617.10; TolT-B: TcCLB.510433.20 y TolT-C: TcCLB.504277.30) en

microarreglos peptídicos, los cuales presentaban la totalidad de la secuencia anotada de

estas proteínas representada por péptidos de 15 aminoácidos, con un solapamiento parcial

de 14. Cada muestra se conformó por IgG purificadas a partir del suero de 5 individuos

distintos (3 μl de cada uno). Los arreglos de péptidos se ensayaron secuencialmente,

primero con una muestra negativa (IgG purificada a partir de 5 individuos sanos) y luego

con la muestra positiva (IgG purificada a partir de 5 individuos infectados con T. cruzi).

Con este diseño experimental, se obtuvieron 2 conjuntos de datos para cada experimento:

uno correspondiente a la lectura de individuos sanos (control negativo) y uno

correspondiente a la señal acumulada de las muestras negativas + positivas, a partir de los

cuales se determinó la señal “definitiva” por sustracción. Integrando todas las señales del

microarreglo (que incluía controles positivos y negativos) se puntuó la reactividad para


23

cada péptido. Se graficaron los valores medios de fluorescencia obtenidos luego de la

sustracción de cada uno de los péptidos [48].

ELISA

Se realizó la adsorción del antígeno a placas de 96 pocillos (Nunc MaxiSorp) en buffer

bicarbonato 0.05 M pH 9.6 a 4°C durante 16 horas. A continuación se bloqueó por una

hora a 37°C, se lavó y se incubó con el anticuerpo primario una hora a 37ºC. Pasado el

tiempo de incubación, se lavó y se incubó una hora con el anticuerpo secundario

correspondiente. Finalmente se lavó el anticuerpo secundario y se procedió con el revelado

y finalización de la reacción para luego hacer la lectura de absorbancia a 450 nm. En todos

los casos los sueros se analizaron por duplicado. Para el análisis de reactividad de las

proteínas de fusión a GST o de los péptidos sin acoplar en muestras de pacientes con

infección crónica, se usó 0.2 μg de antígeno por pocillo. Se bloqueó con leche descremada

4% en PBS-T 0.05% y se incubaron los sueros diluidos 1:500 en esta misma solución. Se

reveló con anticuerpos anti-IgG humanos acoplados a HRP (Sigma) 1:2500, en solución de

bloqueo. Las soluciones de revelado (1 mg de TMB (Sigma-Aldrich)), 333 μl de DMSO y

120 μl de H2O2 (30 vol) en 10 ml de buffer citrato 0.1 M pH 4.2 y finalización (Ácido

sulfúrico 2 M) fueron idénticas para todos los ensayos de ELISA. La detección

colorimétrica en los ensayos ELISA se realizaron con el sistema FilterMax F5 Multimode

Microplate Reader (Molecular Devices) [48]. Todos los valores de absorbancia se

relativizaron al valor de un suero positivo analizado en cada ensayo.

Criterios de positividad y negatividad en los ensayos de ELISA: en todos los ensayos se

usaron muestras de sueros de pacientes infectados crónicos y se incluyeron sueros

negativos de individuos no infectados con T. cruzi con características similares a los del

muestreo. Los sueros analizados se consideraron:

- positivos para cierto antígeno si la media de la absorbancia de las muestras, menos 3

SD, es mayor a la media del valor obtenido para el mismo antígeno con los sueros

negativos, más 3 SD.

- negativos si la media de la absorbancia de la muestra, menos 3 SD, es menos a la

media del valor obtenido para el mismo antígeno con los sueros negativos, más 3 SD.

Análisis estadístico


24

Los distintos test estadísticos se realizaron con GraphPad Prism versión 5 (GraphPad

software, San Diego, CA). El ensayo de Real-Time qPCR se analizó utilizando el test

estadístico ANOVA de dos vías con corrección de Bonferroni. Los resultados de ELISA se

analizaron con la prueba t-Student no pareado. Para todos los casos se consideró

significativo un valor de p<0.05.

Trabajo Final - Lobo Maite Resultados

25

Resultados

Identificación y caracterización in silico de la familia génica TolT en T. cruzi

Familia génica TolT

Para analizar la complejidad de los genes tipo TolT y sus productos en T. cruzi se

llevaron a cabo búsquedas en la base de datos genómica de kinetoplástidos, TriTrypDB,

utilizando como secuencia señuelo el marco de lectura abierto de TolT1 [20]. Un total de

22 secuencias diferentes mostrando similitud significativa (44-99% de identidad

nucleotídica) con TolT1 se obtuvieron a partir de distintos aislamientos de T. cruzi (17

secuencias), el parásito de murciélagos T. cruzi marinkellei (4 secuencias) y el patógeno

humano Trypanosoma rangeli (1 secuencia). Ninguna secuencia con alta identidad a TolT1

se encontró en los genomas de otros patógenos humanos relevantes como T. brucei o

Leishmanias. Un árbol filogenético basado en el método de Neighbor-Joining definió 3

grupos principales de secuencias cercanas a TolT1, a los cuales definimos como TolT-A,

TolT-B y TolT-C (Figura R.1).

Figura R.1: Árbol filogenético basado en el método de Neighbor-Joining donde se

discrimina por colores los 3 grupos de secuencias asociados a TolT1 definidos como TolT-

A (rojo), TolT-B (verde) y TolT-C (azul) en base a las 3 principales ramas observadas. Se

muestran los valores de Boostrap en cada rama. TcCLB: T. cruzi CL Brener. TCDM: T.

cruzi clon Dm28c. Tc_MARK: T. cruzi clon marinkellei. Tc_SYL: T. cruzi clon Sylvio

X10/1. TRSC58: T. rangeli clon SC58. *Secuencias anotadas como pseudeogén.


26

El primer grupo, denominado TolT-A mostró 96-99% de identidad con el marco de

lectura abierto de TolT1 e incluye 5 secuencias completas del clon híbrido de referencia

CL Brener1 [22] (TcCLB.508767.20, TcCLB.506617.10, TcCLB.506617.20,

TcCLB.504157.130 y TcCLB.511109.10) y una secuencia parcial (TcCLB.506617.5) con

el C-terminal truncado aparentemente debido a problemas de ensamblado del genoma

(Figura R.1 y S.1). Como originalmente se describió para los genes TolT1-3 de la cepa

Esmeraldo [20], 5 de los genes putativos de TolT-A están arreglados en tándem en

orientación cabeza-cola de a 3 y 2 unidades en el cromosoma 23 haplotipo No-Esmeraldo

(P) y Esmeraldo (S), respectivamente, mientras que la sexta secuencia también se localiza

en el cromosoma 23 No-Esmeraldo, pero por fuera del cluster conteniendo los 3 genes

antes mencionados (Figura R.2). TcCLB.511109.10 está anotado como pseudogen debido

a la deleción de un nucleótido que origina un corrimiento del marco de lectura dentro del

péptido N-terminal predicho. Río abajo de esta mutación, sin embargo, esta secuencia es

~98% y 96% idéntica a TcCLB.508767.20 a nivel de ADN y proteína respectivamente

(Figura R.3).

1 Distintas tipificaciones bioquímicas y moleculares realizadas sobre múltiples aislamientos o cepas del

parásito han permitido delinear al menos 6 linajes evolutivos o unidades discretas de tipificación (UDT)

dentro de la especie T. cruzi, llamados TcI a TcVI. CL Brener pertenece a la UDT TcVI, la cual es un

híbrido resultante de un cruzamiento entre un parental TcII y otro TcIII.


27

Figura R.2: Esquema representativo de la disposición de los miembros de la familia TolT

en el genoma de CL Brener. Se indica en código de colores la subfamilia a la que

pertenece: TolT-A (rojo), TolT-B (verde) y TolT-C (azul). En la parte superior, número de

acceso en GeneDB, abajo, la localización y orientación en el cromosoma y alelo

correspondientes. Las zonas tramadas indican las porciones de Tc.CLB.506815.20 con un

alto porcentaje de identidad nucleotídica con Tc.CLB.504277.20 y Tc.CLB.504277.30.

Las líneas verticales en los extremos indican que el gen se encuentra truncado.


28

Figura R.3: Alineamiento de secuencias nucleotídicas y aminoacídicas (corregida) de

TolT-A TcCLB.508767.20 y TcCLB.511109.10 donde se observa un nivel de identidad

del 98% y 96%, respectivamente, río debajo de la deleción del nucleótido 46.

El segundo grupo, denominado TolT-B, tiene 76-90% de identidad con TolT1 y está

compuesto por 4 secuencias en el genoma de CL Brener, 2 completas (TcCLB.510433.20

y TcCLB.504277.20) y 2 secuencias parciales (TcCLB.504277.11 y TcCLB.508767.10),

ambas con el N-terminal truncado probablemente debido a problemas de ensamblado del

genoma (Figura R.1 y S.1). Tres de estas secuencias se localizan en el cromosoma 35, 1 en

el haplotipo No-Esmeraldo y 2 en el Esmeraldo, mientras que TcCLB.508767.10 se ubica

río abajo de TcCLB.508767.20 dentro del cluster genómico de TolT-A en el cromosoma

23 Esmeraldo, antes mencionado (Figura R.2). TcCLB.510433.20 y TcCLB.504277.20 son

secuencias casi idénticas excepto por su C-terminal, donde se vuelven altamente

divergentes (Figura R.4).


29

Figura R.4: Alineamiento de secuencias aminoacídicas de TolT-B TcCLB.510433.20 y

TcCLB.504277.20 donde se observa que ambas secuencias son casi idénticas hasta su C-

terminal donde divergen y la segunda carece de su señal de anclaje por GPI (marcado en

verde). ω indica el residuo predicho de adición del GPI en TcCLB.510433.20.

De acuerdo a esta nueva clasificación, los ortólogos de los productos de los genes

TolT1-3 originales [20] formarían parte del grupo TolT-A, mientras que la mezcla utilizada

para serodiagnóstico [21] correspondería a dos miembros de TolT-B (TcCLB.510433.20 y

TcCLB.504277.11) y uno de TolT-A (TcCLB.504157.130).

El tercer grupo, denominado TolT-C está compuesto solamente por 2 alelos

(TcCLB.504277.30 y TcCLB.506815.20) (Figura R.1 y S.1) localizados en los

cromosomas Esmeraldo y No-Esmeraldo dentro del cluster genómico de TolT-B, en el

cromosoma 35 (Figura R.2). TcCLB.506815.20 está anotado como el pseudogen de una

MASP. A pesar de su localización genómica y las características tipo TolT predichas

(péptido señal N-terminal y señal de anclaje por GPI C-terminal y composición

aminoacídica en general), los genes de TolT-C muestran muy baja similitud con TolT1

(~46.8-47.1% de identidad nucleotídica). La Figura R.5 esquematiza las distintas variantes

dentro de las subfamilias de TolT.


30

Figura R.5: Esquema representativo de la estructura general de los miembros de la

familia TolT. En código de colores se representa el grado de identidad. TolT-A

completas: TcCLB.508767.20, TcCLB.506617.10, TcCLB.506617.20,

TcCLB.504157.130 y TcCLB.511109.10, TolT-A con C-terminal truncado:

TcCLB.506617.5; TolT-B completas: TcCLB.510433.20 (con señal de anclaje por GPI)

y TcCLB.504277.20 (sin señal de anclaje por GPI), TolT-B con N-terminal truncado:

TcCLB.504277.11 y TcCLB.508767.10; TolT-C: TcCLB.504277.30 y

TcCLB.506815.20. Círculos superiores indican los sitios de N-glicosilación predichos.

A: Alanina, C: Cisteína, R: Arginina, E: Ac. Glutámico.

Proteínas TolT

Las proteínas codificadas por TolT-A, TolT-B y TolT-C contienen 310, 305/284 y 344

aminoácidos, respectivamente, con masas de ~30.9-37.1 kDa y pI de 7.2-8.4. Todas

muestran un péptido señal N-terminal y una señal de anclaje por GPI en el extremo C-

terminal (excepto TcCLB.504277.20 que carece de la última) (Figura R.5 y R.7). Estas

señales serían responsables del tráfico intracelular y localización en membrana plasmática

de las proteínas TolT. El anclaje por GPI fue confirmado experimentalmente por

fraccionamiento en Triton X114 (Figura R.6.A) y además se evaluó la potencial secreción


31

espontánea de los productos TolT, la cual no sucede o sucede a niveles no detectables

(Figura R.6.B).

Figura R.6: Purificación de proteínas ancladas por GPI mediante el

método con Tritón X-144 (A) y ensayo de secreción (B). Las muestras de

cada paso de purificación (A), así como el pellet y el sobrenadante filtrado

(en algunos casos, B), se analizaron con el antisuero indicado mediante

WB. P: pellet, S: sobrenadante, Sf: sobrenadante filtrado. Se sembraron

1x106 y 6x106 parásitos y, su equivalente en extracto de secreción,

respectivamente.

Los polipéptidos presentan un alto contenido de Ala (18.8 a 24.4%), Glu (9.0 a 11.9%),

Leu (8.1 a 9.9%), Lys (6.3 a 10.4%) y Arg (4.9 a 8.1%), con estos residuos no igualmente

distribuidos a lo largo de las proteínas (Figura R.7.).

Dentro de las moléculas de TolT, la única característica común y reconocible fue la

presencia de 2 regiones ricas en Ala con estructura secundaria no definida y la presencia de

varios residuos Cys conservados. Los productos de TolT-A y TolT-B, además, contienen


32

un motivo Cys-X7-Cys3 en su SP, así como una región particular hacia su señal de anclaje

por GPI que está enriquecida en residuos de Arg (R) y Glu (E) (Figura R.5 y R.7).

Análisis bioinformáticos sobre las modificaciones post-traduccionales putativas de las

secuencias predichas de TolT, mostró que tendrían también de 17 a 41 sitios potenciales

para fosforilación, de 2 a 5 para N-glicosilación (Figura R.5 y R.7) y de 27 a 36 para O-

glicosilación. Las secuencias de los grupos TolT-A y TolT-B, además, presentan una

cisteína altamente conservada en posición C-terminal (ver Figura R.7) que constituye un

sitio de palmitoilación según los algoritmos utilizados. Este residuo, sin embargo, no se

encontraría en la proteína madura ya que forma parte de la señal clivable de adición de

GPI, por lo que desestimamos la significancia biológica de esta predicción.

La región N-terminal madura de 135 aminoácidos predicha (del residuo 40 al 175)

mostró el menor grado de identidad entre TolT-A y TolT-B (Figura R.7 y S.1).

Predicciones de topología, de acuerdo a otras moléculas de superficie de T. cruzi ancladas

por GPI [53], sugieren que esta región constituye el extremo distal a la membrana de las

moléculas de TolT mientras que el extremo proximal a la membrana sería el C-terminal

altamente conservado.


33

Figura R.7: Logo de secuencias TolT representativo del grado de identidad entre TolT-A

y TolT-B y sus características en común. Se incluyeron 4 secuencias de TolT-A

(TcCLB.508767.20, TcCLB.506617.10, TcCLB.506617.20 y TcCLB.504157.130) y 2 de

TolT-B (TcCLB.504277.20 y TcCLB.510433.20). Las flechas indican los sitios de N-

glicosilación predichos para las secuencias representadas.

Por último se evaluó la similitud de las TolT con las TolA bacterianas que le dieron su

nombre [20]. En la base de datos de kinetoplástidos, TriTryp, TolA es mencionada como

BLASTP Hit para 9 de las 12 proteínas de T. cruzi CL Brener que resultaron del análisis

BLAST con un rango de 29 a 39% de identidad. Esta información se confirmó mediante

búsquedas de tipo BLASTP, donde para todas las proteínas de la familia TolT (incluyendo

al grupo TolT-C más divergente) se encontró niveles de identidad aminoacídica de hasta

33.5-44% con proteínas TolA de numerosas especies bacterianas (Tabla R.1).

La información descripta anteriormente se encuentra resumida en la Tabla S.1.


34

Tabla R.1: Proteínas bacterianas con máximo porcentaje de identidad, resultantes de una

búsqueda de tipo BLASTP, para cada uno de los miembros de la familia TolT de T. cruzi

CL Brener.

Nro de

acceso

GeneDB

(TcCLB.)

Grupo

TolT

% identidad con TolA (aa)

Especie

508767.20 A

37.4 Proteína TolA

Yersinia enterocolitica subsp. Palearctica serotype

511109.10 33.5 Proteína TolA

Enterobacter cloacae S611

506617.5 41.7 Proteína TolA, proteína de integridad de la envoltura

celular, proteína de integridad de la membrana interna de la

envoltura celular, proteína anclada a membrana en complejo

TolA-TolQ-TolR

Serratia sp.

506617.10 39.2 Proteína anclada a membrana en complejo TolA-TolQ-

TolR

Serratia proteamaculans

506617.20

39.2 Proteína anclada a membrana en complejo TolA-TolQ-

TolR


504157.130 39 Proteína anclada a membrana en complejo TolA-TolQ-TolR


508767.10 B

36.8 Proteína TolA

Salmonella bongori N268-08


Enterobacter cloacae UCICRE 12


Paracoccus sp. MKU1


Dickeya zeae strain Ech586

506815.20 C 34.5 Familia de proteínas TolA

Obesumbacterium proteus ATCC 12841


Edwardsiella piscicida


35

Expresión de ARNm y productos de TolT durante el ciclo de vida de T. cruzi

Expresión génica de TolT

De acuerdo a resultados observados en un experimento de hibridación de microarreglos

[54], el nivel de expresión de ARNm de TcCLB.504277.20 (TolT-B) y TcCLB.504277.30

(TolT-C) es mayor en tripomastigotes derivados de células mientras el nivel de expresión

de TcCLB.511109.10 (TolT-A) es mayor en epimastigotes. Estos resultados no son

consistentes con el hecho de que las proteínas TolT originales (TolT-A de acuerdo a

nuestra clasificación) fueron descriptas como moléculas restringidas a la forma

tripomastigote derivado de células [16].

Para abordar esta cuestión, se purificaron muestras de ARN total de los distintos

estadios de T. cruzi y se analizó la expresión génica de miembros representativos de las 3

subfamilias de TolT (A, B y C) mediante Real-time qPCR. Se observa, en general, una

mayor expresión de TolT-A, seguida por TolT-B y una mínima expresión de TolT-C,

obteniendo diferencias estadísticamente significativas solo entre la expresión de TolT-A y

TolT-C en tripomastigotes. Entre estadios, la expresión de TolT-A es claramente mayor en

tripomastigotes, mientras que la de TolT-B y TolT-C resulta más homogénea, siendo

estadísticamente significativa la diferencia de expresión de TolT-A entre tripomastigotes y

epimastigotes (Figura R.8.). En general las curvas de disociación resultaron en un pico

único a la temperatura correspondiente para cada producto (excepto para TolT-B) (Figura

S.3) mientras que no se observó amplificación en los controles sin templado. Los

productos de amplificación fueron secuenciados confirmando su identidad.


36

Figura R.8: Análisis de la expresión a nivel de ARN mediante Real-Time qPCR de

cada uno de los grupos de TolT en los principales estadios de T. cruzi. La

cuantificación se relativizó al nivel de expresión de TolT-C en epimastigotes y se

normalizó al de los genes GAPDH y Calmodulina.

Expresión de las proteínas TolT

Respecto a la expresión a nivel proteico, y más allá de los datos originales del grupo de

Jerry Manning [16,20] diferentes sets de datos proteómicos revelaron expresión de

diferentes miembros de TolT, particularmente en estadios que se desarrollan en el

hospedador mamífero (tripomastigotes derivados de células y/o tripomastigotes

sanguíneos) [29-31]. Para obtener más información sobre la expresión y caracterización de

los productos de TolT, se produjeron antisueros en ratón contra proteínas recombinantes

fusionadas a GST, conteniendo regiones particulares de un miembro representativo de los

distintos grupos de TolT definidos (Figura R.1 y S.1) Para minimizar la reacción cruzada

entre TolT-A y TolT-B, el inmunógeno se limitó a la región N-terminal divergente, aunque

también se generaron antisueros contra la región C-terminal común (TolT-B/A). Para

TolT-C, los animales fueron inmunizados con un péptido específico, que surgió como el


37

epitope más importante de toda la familia TolT en un estudio de antígenos derivados de T.

cruzi realizado recientemente (Figura R.9) [52].

Figura R.9: Esquema representativo de las proteínas recombinantes y el péptido

generados para el estudio de TolT mediante WB y ELISA.

Con los antisueros generados se llevó a cabo un ensayo de WB para evaluar la

expresión de los productos de TolT en los tres estadios principales de T. cruzi. En

tripomastigotes se visualiza expresión a nivel proteico de TolT-A y TolT-B, mientras que

para amastigotes solo se observa la expresión de TolT-A, aunque en niveles mucho

menores que los detectados en tripomastigotes. No se verificó expresión a nivel proteico de

ninguna de estas variantes en epimastigotes. El mismo análisis no presentó reactividad

para TolT-C en ninguno de los estadios del parásito. Para TolT-A y TolT-B, los productos

se muestran como un conjunto de bandas de tamaño esperado (aproximadamente 30.9-37.1

kDa), observándose distinto rango de tamaños entre TolT-A y TolT-B así como diferencias

en el patrón de bandeo para TolT-A en tripomastigotes y amastigotes. (Figura R.10).


38

Figura R.10: Análisis de la expresión a nivel proteico por

WB de TolT-A y B sobre lisado total de parásitos en cada

uno de los principales estadios de T. cruzi. Se sembraron

2x107 de parásitos de cada estadio por calle. T:

tripomastigote, A: amastigote, E: epimastigote.

Localización subcelular de las proteínas TolT

Con el fin de profundizar el estudio de los productos de TolT, se analizó su localización

subcelular mediante Inmunofluorescencia indirecta (IFI) en los distintos estadios de T.

cruzi CL Brener. Las microscopías muestran que TolT-A se localiza en el flagelo de

tripomastigotes derivados de células y en el extremo posterior de amastigotes

intracelulares. TolT-B también tiene localización predominante en flagelo de

tripomastigotes, aunque también puede observarse señal en el extremo anterior de los

amastigotes (indetectable en el WB). Para TolT-C, en cambio, no se observó marca

específica en ninguno de los estadios (el nivel de fluorescencia en los parásitos fue

equivalente al de las células por lo que se consideró inespecífica), coincidente con los

datos de WB. Análisis similares no mostraron señal para ninguno de los antisueros en

epimastigotes (Figura R.11).


39

Figura R.11: Microscopías de fluorescencia mostrando la localización subcelular de

TolT-A, TolT-B y TolT-C en tripomastigotes y amastigotes de la cepa CL Brener de T.

cruzi a 115 hs. post infección de células Vero. Azul: DAPI, verde: anti-GST-TolT.

Identificación y mapeo de los epitopes B de TolT

Los epitopes B lineales presentes en las secuencias de TolT fueron analizados

inicialmente como parte de un proyecto tendiente a la identificación de péptidos para

serodiagnóstico utilizando microarreglos peptídicos de alta densidad [52]. Se incluyeron en


40

el arreglo 3 productos diferentes de TolT-A (TcCLB.506617.10, TcCLB.504157.130 y

TcCLB.508767.20), 3 de TolT-B (TcCLB.510433.20, TcCLB.504277.20 y

TcCLB.504277.11) y uno de TolT-C (TcCLB.504277.30) (Figura R.1).

En general, los productos de TolT no mostraron reactividad a lo largo de su SP y señal

de GPI, lo que resulta consistente con que estas regiones son procesadas y escindidas

previo a su exposición y anclaje en la superficie del parásito. Dentro de la región de la

proteína madura, las señales obtenidas fueron muy homogéneas para los distintos

miembros de una misma subfamilia, consistente con su altísima identidad aminoacídica,

así que sólo se grafica un miembro de cada una. TolT-A muestra solo un pico de

reactividad débil, localizado cerca de su C-terminal:

261GNDAALGRNSTSTRLQRTRPRVD, secuencia que se encuentra también conservada

en TolT-B: 256GNDAAPGRNSTATRIQRTRPRVD, pero muestra un pico más fuerte,

posiblemente debido a los polimorfismos entre ambas secuencias. TolT-C muestra un

perfil completamente diferente con un pico antigénico único:

141EAEKAAVDADTAALAALLEVLQHSKF (Figura R.12). En términos relativos, esta

secuencia fue la que presentó mayor reactividad de toda la familia en los micro-chips, y

sobre ella se derivó posteriormente el péptido sintético utilizado para generar anticuerpos

anti-TolT-C.


41

Figura R.12: Microarreglos de péptidos de alta

densidad de miembros representativos de cada

subfamilia de TolT (se grafica un miembro de

cada subfamilia ya que los perfiles obtenidos

entre miembros de la misma fueron similares). Se

muestra la reactividad de 3 pooles de sueros

distintos (1, 2 y 3).

El perfil antigénico de los productos de TolT durante la infección por T. cruzi fue

además evaluado usando proteínas recombinantes como se describió previamente [48].


42

Con ese fin se generaron y purificaron de sistemas bacterianos una serie de constructos. Se

utilizaron proteínas recombinantes fusionadas a GST específicas de cada subfamilia: TolT-

A (desde F54 hasta T174), TolT-B (desde Q61 hasta S103) y TolT-C (desde A83 hasta

D313). Además, se incluyó en el análisis a la proteína TolT-B/A desde G157 hasta A260

(Figura R.9), que tiene un ~80.2% de identidad aminoacídica con TolT-A, para buscar

anticuerpos específicos en pacientes Chagásicos crónicos mediante ELISA. Las 31

muestras de suero fueron heterogéneas, incluyendo individuos que viven en áreas

endémicas y no endémicas, probablemente infectados por distintas cepas de T. cruzi. A su

vez, se incluyeron 19 sueros provenientes de individuos sanos. Se analizó la reactividad de

todos los sueros contra GST como control y la reactividad se normalizó a un suero positivo

incluido en todos los ensayos. Las regiones N-terminales divergentes entre TolT-A y TolT-

B no resultan antigénicas mientras que se observa un reconocimiento, estadísticamente

significativo, por parte de los sueros hacia la región C-terminal conservada (residuos

G157-A260 de TolT-B), (Figura R.13). TolT-C fue únicamente reconocida por 2 sueros

(no significativo). La prevalencia de los anticuerpos dirigidos a la zona conservada entre

TolT-A y B entre sueros argentinos potencialmente chagásicos resultó del 0%, 2.9%,

42.9% y 5.7% para N-terminal de TolT-A, N-terminal de TolT-B, C-terminal de TolT-B/A

y TolT-C, respectivamente. Ninguna muestra de suero de individuos no infectados con T.

cruzi (n=19) resultó reactiva para TolT.


43

Figura R.13: Perfil antigénico de TolT-A, B y C en 31 individuos infectados

(+) y 19 no infectados con T. cruzi (-) evaluado mediante un ensayo de ELISA.

La reactividad se expresa como porcentaje con respecto a un suero positivo

usado como normalizador entre ensayos. En la parte superior se muestran los

valores de prevalencia correspondientes para cada antígeno analizado. * p<0.05

Prueba T de Student no pareado.

La antigenicidad restringida al C-terminal conservado entre TolT-A y TolT-B (Figura

R.13) se confirmó con el uso de mutantes delecionales de TolT-B analizadas mediante WB

con 4 sueros positivos distintos. Se observa para la porción G157-A260 de TolT-B una

reactividad similar que para la proteína completa (Q61-A260) por parte de los 4 sueros

analizados, mientras que las porciones del N-terminal no fueron reconocidas (Figura R.14).


44

Figura R.14: Mapeo delecional de TolT-B mediante WB con 4 sueros chagásicos

distintos. Se sembraron 0.5 µg de cada proteína recombinante por calle.

Trabajo Final - Lobo Maite Conclusiones y Discusión

45

Conclusiones y Discusión

Identificación y caracterización in silico de la familia génica TolT en T. cruzi

Como paso inicial de esta tesina, se reevaluó la complejidad de la familia génica TolT a

la luz de la disponibilidad de nuevos datos genómicos. Un total de 22 secuencias diferentes

mostraron similitud significativa con TolT1, las cuales se dividieron en 3 grupos

coherentes y robustos, a los que denominamos TolT-A, TolT-B y TolT-C. Los resultados

de esta nueva búsqueda expandieron 5-6 veces el número de secuencias TolT reconocidas

y permitió definir grupos robustos dentro de la familia.

TolT-A, grupo más cercano a TolT1, incluye 5 secuencias completas y una parcial en la

cepa CL Brener. Estas se encuentran arregladas en tándem en orientación cabeza-cola y

localizadas en el cromosoma 23 por lo que serían los ortólogos de TolT1-3 de la cepa

Esmeraldo [20]. Una de las secuencias se encuentra anotada como pseudogen debido a una

deleción en su N-terminal. En general, tras la mutación que origina un pseudogen las

secuencias quedan liberadas de presión selectiva y comienzan a acumular mutaciones; pero

en este caso, la falta de divergencia indicaría un evento de pseudogenización reciente o una

secuencia anotada incorrectamente, problema recurrente en el genoma de T. cruzi. TolT-B

está conformado por 4 secuencias de CL Brener, 2 completas y 2 parciales, todas

localizadas en el cromosoma 35, excepto TcCLB.508767.10 que lo hace en el cromosoma

23. TcCLB.510433.20 y Tc.CLB.504277.20 son secuencias similares, excepto por su C-

terminal donde la segunda carece de su señal de anclaje por GPI, lo cual podría tener

impacto en el tráfico y/o disposición final de las proteínas ya que, en T. cruzi (a diferencia

de mamíferos) el carecimiento de ésta parece promover la retención de las proteínas en el

RE [55]. El tercer grupo, TolT-C, incluye solo dos alelos con muy baja homología a TolT1

ubicados dentro del cluster genómico de TolT-B, uno de ellos anotado como pseudogen de

una MASP. Esto último fue analizado con más profundidad y se determinó que el N-

terminal de esta secuencia contiene una porción con similitud con el extremo C-terminal

de la secuencia TolT-B que carece de la señal de anclaje por GPI mientras que su C-

terminal es casi idéntico al otro alelo de TolT-C. Interesantemente, en cada uno de los

cromosomas 35 (Esmeraldo y No-Esmeraldo) se observa la siguiente disposición: TolT-B

con señal de anclaje por GPI -TcCLB.510433.20/TcCLB.504277.11 (N-terminal

truncado)- + TolT-B sin señal de anclaje por GPI -N-terminal de

TcCLB.506815.20/TcCLB.504277.20- + TolT-C -C-terminal de

TcCLB.506815.20/TcCLB504277.30-, conformando un arreglo en tándem en orientación


46

cabeza-cola de 3 genes tal como las secuencias TolT-A (Figura R.2, regiones con trama).

Todos estos datos nos permiten hipotetizar que esta variedad de secuencias y su

disposición en el genoma es el resultado de duplicaciones génicas seguidas por

diversificación y eventual pseudogenización aunque se requiere de un análisis más

profundo de las regiones intergénicas y flanqueantes de estos genes para poder detallar el

proceso [56].

Respecto a las características de los productos de TolT, se determinó que en general

despliegan SP y señal de anclaje por GPI y que se caracterizan por un alto contenido de

Ala, Glu, Leu, Lys y Arg. Presentan 2 regiones ricas en Ala con estructura secundaria no

definida y varios residuos Cys con posición conservada los que serían importantes para su

plegamiento final. TolT-A y B también contienen una región enriquecida en Arg y Glu

hacia la señal de anclaje por GPI así como un motivo Cys-X7-Cys3 en su SP que también se

encuentra conservado en otras moléculas expresadas en tripomastigotes como TcMUC

[53,57] y varias MASPs [58], por lo que podría estar asociado a la expresión de estos

genes en tripomastigotes.

TolT sufriría además modificaciones post-traduccionales ya que se predijeron sitios

para fosforilación, N-glicosilación y O-glicosilación, aunque solamente se confirmó

experimentalmente la presencia de N-glicanos anclados a proteínas TolT-A y TolT-B [20].

En general, TolT-A y TolT-B son muy parecidas entre sí, diferenciándose de TolT-C.

Estas presentan menor grado de identidad hacia su región N-terminal la cual según

predicciones de topología constituiría el extremo distal a la membrana y estaría

involucrada en mediar interacciones con ligandos y/o servir como señuelo inmune,

mientras que el extremo proximal a la membrana, altamente conservado, provee la señal

para anclaje por GPI participando en la orientación y unión de la proteína a la superficie

del parásito. Este escenario es similar al de otras familias de proteínas ancladas por GPI

como los antígenos tipo mucina TcMUC, donde la parte distal a la membrana de su

secuencia es muy diversa probablemente debido a presión selectiva del sistema inmune del

mamífero [53,59,60].

El nombre de este grupo de proteínas deviene de su identidad de secuencia

aminoacídica y sus características físicas y biológicas en común con las proteínas TolA de

E. coli y P. aeruginosa, de acuerdo a lo reportado por Manning [20]. Si bien en la base de

datos TriTryp TolA aparece como resultado de un análisis BLASTP, esta información se

corroboró realizando un análisis más amplio mediante una búsqueda manual donde se


47

observó, en general, niveles de identidad aminoacídica similares a lo reportado, pero frente

a proteínas TolA de una población más diversa de bacterias (Serratia, Yersinia,

Enterobacter, Salmonella, etc.). Las proteínas TolA son parte del sistema Tol de la

mayoría de las bacterias gram negativas, participan en la secreción de factores y están

involucradas en la preservación de la estabilidad de la membrana bacteriana [61-63].

Confirmar este parecido, sumado a que el bolsillo flagelar cumple un rol clave en los

procesos endo-exocíticos en tripanosomátidos [9], abre camino a la futura búsqueda de una

función relacionada para TolT.

Expresión de ARNm y productos de TolT durante el ciclo de vida de T. cruzi

Como primer paso hacia la caracterización de TolT, se llevó a cabo un análisis de

expresión a nivel de ARNm de las 3 subfamilias de TolT mediante ensayos de Real-time

qPCR. En términos generales, en todos los estadios se observa una mayor expresión de

TolT-A, seguida por TolT-B y una mínima expresión de TolT-C. Entre estadios, la

expresión de TolT-A es evidentemente mayor en tripomastigotes mientras que la de TolT-

B y C es más homogénea. Esta homogeneidad observada la cual se ve acompañada por un

alto nivel de error podría esclarecerse con un mayor número de ensayos. El análisis de las

curvas de disociación demostró, en general, una amplificación específica, determinada por

un único pico estrecho a la temperatura correspondiente para cada producto y ausencia de

amplificación en los controles sin templado. Solo para TolT-B se observa un pico de

menor altura a una temperatura inferior, lo que corresponde con artefactos como dímeros

de primers,

Los resultados obtenidos por Real-Time qPCR concuerdan con la descripción original

de las proteínas TolT y, particularmente TolT-A, como moléculas restringidas a la forma

tripomastigote [16].

En segunda instancia se analizó la expresión de TolT a nivel proteico mediante WB e

IFI donde se obtuvieron algunos resultados discordantes. Por IFI se observa la localización

de TolT-A en el flagelo de la forma tripomastigote tal como lo describió Manning [16] así

como en el extremo posterior de amastigotes intracelulares, mismos estadios en los que se

observa expresión por WB, sin embargo, TolT-B se localizaría, al igual que TolT-A, en el

flagelo de tripomastigotes y en el extremo anterior de amastigotes intracelulares, estadio en

el que no se observa expresión por WB. No se observó expresión de ninguna de las

subfamilias en epimastigotes, lo cual concuerda con lo observado por Manning [16] para

TolT-A (en ese trabajo no se analizan amastigotes). En WB se presentó una banda para


48

TolT-A la cual sería inespecífica dado que la masa predicha para TolTs es de 30.9-37.1

kDa.

Identificación y mapeo de los epitopes B de la familia TolT

Como parte de un proyecto tendiente a la identificación de péptidos para

serodiagnóstico utilizando microarreglos peptídicos de alta densidad [52], se analizaron los

epitopes B lineales presentes en 3 secuencias distintas de TolT. TolT-A presentó un único

pico de reactividad débil hacia su C-terminal el cual es compartido con las secuencias de

TolT-B. Para TolT-C también se identificó un pico antigénico hacia su C-terminal, aunque

con un perfil distinto. Si bien los picos antigénicos obtenidos para TolT no presentan la

magnitud de intensidad (12-15 veces menores) observada para otros antígenos de T. cruzi

validados para el serodiagnóstico (TSSA, MASPs, TcMUC), estos estudios fueron de

utilidad para dar una idea general de la zona antigénica de las proteínas TolT.

Se profundizó el análisis del perfil antigénico de los productos de TolT buscando

anticuerpos específicos en pacientes chagásicos mediante ELISA, donde, si bien el epitope

predicho por el CHIP para TolT-A y TolT-B se incluyó parcialmente (G256-A260) debido

a que se encuentra muy cerca de la señal de anclaje por GPI y su inclusión generaría

problemas para la expresión en bacterias, se confirmó que la inmunogenicidad está dirigida

hacia el C-terminal compartido entre TolT-A y TolT-B y que los anticuerpos dirigidos

hacia esta región tienen una prevalencia del 42.9%. Esto se confirmó además con el

análisis por WB de mutantes delecionales de TolT-B.

En términos generales TolT constituye una familia multigénica mucho más compleja

que la originalmente descripta, la cual se divide en tres subfamilias que a pesar de su alto

grado de similitud de secuencias tendrían distintos perfiles de expresión, localización sub-

celular y, probablemente, función.

Trabajo Final - Lobo Maite Información suplementaria

49

Información suplementaria

Figura S.1: Alineamiento múltiple de las secuencias aminoacídicas de los miembros de la

familia TolT de T. cruzi cepa CL Brener. A la izquierda se muestra en código de colores el

número de acceso en GenDB de cada proteína, indicando la subfamilia a la que pertenece:

TolT-A (rojo), TolT-B (verde) y TolT-C (azul).


50

Figura S.2: Mapa del vector pGEM®-T y puntos de referencia de

secuencia. En verde se señalan las regiones codificantes de los

promotores de las ARN polimerasas SP6 y T7, que flanquean al MCS,

y a las cuales se unen los oligonucleótidos utilizados para el chequeo

por PCR de los clonados en este vector.


51

Figura S.3: Curvas de disociación de los productos de Real-Time PCR (TolT-A, TolT-B,

TolT-C, TcGAPDH y TcCalmodulina). En el eje Y representa la fluorescencia (derivative

reporter (∆Rn)) mientras que el eje X representa la temperatura (°C). Las figuras muestran

la temperatura de disociación correspondiente para cada gen, con dímeros de primers

detectados solo en TolT-B.


52

Figura S.4: SDS-PAGE de proteínas TolT con fusión a GST purificadas.


53

Tabla S.1: Resumen detallado de características de los distintos miembros de la familia

TolT en T. cruzi CL Brener.

Nro de

acceso

GeneDB

(TcCLB.)

Grupo

TolT

Cromo-

soma

% ident

TolT-1

(nt-aa)

Características

proteicas

% ident TolA

(aa)

Especie

Anotación

508767.20 A

23 E

99-99.4 SP, GPI, Cys

palmitoilable

en C-term,

hélice

superenrollada,

motivo

C7CCC en SP

37.4

Proteína

TolA

Yersinia

enterocolitica

subsp.

Palearctica

serotype

511109.10 98-73.9 33.5

Proteína

TolA

Enterobacter

cloacae S611

Pseudogen,

deleción

simple de T

en SP N-

term

506617.5 98-95.6 41.7

Proteína

TolA

Proteína de

integridad de

la envoltura

celular

Proteína de

integridad de

la membrana

interna de la

envoltura

celular

Proteína

anclada a

membrana en

complejo

TolA-TolQ-

TolR

Serratia sp.

Secuencia

parcial (C-

term

truncado)

506617.10 23 nE

97-92.9 39.2

Proteína

anclada a


54

membrana en

complejo

TolA-TolQ-

TolR

Serratia

proteamacu-

lans

506617.20

96-92.6

39.2

Proteína

anclada a

membrana en

complejo

TolA-TolQ-

TolR

Serratia

proteamacu-

lans

504157.130 96-91.3 39

Proteína

anclada a

membrana en

complejo

TolA-TolQ-

TolR

Serratia

proteamacu-

lans

508767.10 B

23 E

90-77.5 36.8

Proteína

TolA

Salmonella

bongori

N268-08

Secuencia

parcial (N-

term

truncado)

504277.11 35 E


palmitoilable,

en C-term,

hélice

supererollada

40.4

Proteína

TolA

Enterobacter

cloacae

UCICRE 12

Secuencia

parcial (N-

term

truncado)

510433.20 35 nE


palmitoilable

36.9

Proteína


55

en C-term,

hélice

superenrollada,

motivo

CX7CCC en

SP

TolA Para-

coccus sp.

MKU1

504277.20 35 E 76-62.1 SP, hélice

superenrollada,

motivo

CX7CCC en

SP

37.1

Proteína

TolA

Dickeya zeae

strain

Ech586

C-term

altamente

divergente

506815.20 C 35 nE 81

(47)-

28.1

SP, GPI, Cys

palmitoilable

en C-term,

hélice

superenrollada

34.5

Familia de

proteínas

TolA

Obesumbac-

terium

proteus

ATCC 12841

Anotado

como

pseudogen

de MASP

(inserción

en N-term)

504277.30 35 E 47-31 SP, GPI, Cys

palmitoilable

en C-term,

hélice

superenrollada,

SLN bipartita

40.6

Proteína

TolA

Edwardsiella

piscicida

Trabajo Final - Lobo Maite Bibliografía

56

Bibliografía

1. Yaeger RG (1996) Protozoa: Structure, Classification, Growth, and Development. In:

Baron S, editor. Medical Microbiology. 4th ed. Galveston (TX).

2. Stanaway JD, Roth G (2015) The burden of Chagas disease: estimates and challenges.

Glob Heart 10: 139-144.

3. Rassi A, Jr., Rassi A, Marcondes de Rezende J (2012) American trypanosomiasis

(Chagas disease). Infect Dis Clin North Am 26: 275-291.

4. Caradonna KL, Burleigh BA (2011) Mechanisms of host cell invasion by Trypanosoma

cruzi. Adv Parasitol 76: 33-61.

5. Tyler KM, Engman DM (2001) The life cycle of Trypanosoma cruzi revisited. Int J

Parasitol 31: 472-481.

6. Coura JR, Borges-Pereira J (2010) Chagas disease: 100 years after its discovery. A

systemic review. Acta Trop 115: 5-13.

7. de Souza W (1984) Cell biology of Trypanosoma cruzi. Int Rev Cytol 86: 197-283.

8. Cadavid-Restrepo G, Gastardelo TS, Faudry E, de Almeida H, Bastos IM, et al. (2011)

The major leucyl aminopeptidase of Trypanosoma cruzi (LAPTc) assembles into a

homohexamer and belongs to the M17 family of metallopeptidases. BMC Biochem

12: 46.

9. Field MC, Carrington M (2009) The trypanosome flagellar pocket. Nat Rev Microbiol 7:

775-786.

10. Sunter JD, Gull K (2016) The Flagellum Attachment Zone: ‘The Cellular Ruler’ of

Trypanosome Morphology. Trends Parasitol 32: 309-324.

11. Kohl L, Robinson D, Bastin P (2003) Novel roles for the flagellum in cell

morphogenesis and cytokinesis of trypanosomes. EMBO J 22: 5336-5346.

12. Tetley L, Vickerman K (1985) Differentiation in Trypanosoma brucei: host-parasite

cell junctions and their persistence during acquisition of the variable antigen coat. J

Cell Sci 74: 1-19.

13. Robinson DR, Gull K (1991) Basal body movements as a mechanism for mitochondrial

genome segregation in the trypanosome cell cycle. Nature 352: 731-733.

14. Moreira-Leite FF, Sherwin T, Kohl L, Gull K (2001) A trypanosome structure involved

in transmitting cytoplasmic information during cell division. Science 294: 610-612.

15. Paulin JJ, Keith CH, Tarleton RL (1988) A monoclonal antibody to alpha tubulin

recognizes host cell and Trypanosoma cruzi tubulins. J Protozool 35: 123-129.

16. Saborio JL, Wrightsman RA, Kazuko SG, Granger BS, Manning JE (1990)

Trypanosoma cruzi: identification of a surface antigen restricted to the flagellar

region of the infective form of the parasite. Exp Parasitol 70: 411-418.

17. Segura EL, Vazquez C, Bronzina A, Campos JM, Cerisola JA, et al. (1977) Antigens

of the subcellular fractions of Trypanosoma cruzi. II. Flagellar and membrane

fraction. J Protozool 24: 540-543.

18. Van Voorhis WC, Eisen H (1989) Fl-160. A surface antigen of Trypanosoma cruzi that

mimics mammalian nervous tissue. J Exp Med 169: 641-652.

19. Rocha GM, Teixeira DE, Miranda K, Weissmuller G, Bisch PM, et al. (2010)

Structural changes of the paraflagellar rod during flagellar beating in Trypanosoma

cruzi. PLoS One 5: e11407.

20. Quanquin NM, Galaviz C, Fouts DL, Wrightsman RA, Manning JE (1999)

Immunization of mice with a TolA-like surface protein of Trypanosoma cruzi

generates CD4(+) T-cell-dependent parasiticidal activity. Infect Immun 67: 4603-

4612.


57

21. Cooley G, Etheridge RD, Boehlke C, Bundy B, Weatherly DB, et al. (2008) High

throughput selection of effective serodiagnostics for Trypanosoma cruzi infection.

PLoS Negl Trop Dis 2: e316.

22. El-Sayed NM, Myler PJ, Bartholomeu DC, Nilsson D, Aggarwal G, et al. (2005) The

genome sequence of Trypanosoma cruzi, etiologic agent of Chagas disease.

Science 309: 409-415.

23. Franzen O, Ochaya S, Sherwood E, Lewis MD, Llewellyn MS, et al. (2011) Shotgun

sequencing analysis of Trypanosoma cruzi I Sylvio X10/1 and comparison with T.

cruzi VI CL Brener. PLoS Negl Trop Dis 5: e984.

24. Grisard EC, Teixeira SM, de Almeida LG, Stoco PH, Gerber AL, et al. (2014)

Trypanosoma cruzi Clone Dm28c Draft Genome Sequence. Genome Announc 2.

25. Franzen O, Talavera-Lopez C, Ochaya S, Butler CE, Messenger LA, et al. (2012)

Comparative genomic analysis of human infective Trypanosoma cruzi lineages

with the bat-restricted subspecies T. cruzi marinkellei. BMC Genomics 13: 531.

26. Stoco PH, Wagner G, Talavera-Lopez C, Gerber A, Zaha A, et al. (2014) Genome of

the avirulent human-infective trypanosome—Trypanosoma rangeli. PLoS Negl

Trop Dis 8: e3176.

27. Berriman M, Ghedin E, Hertz-Fowler C, Blandin G, Renauld H, et al. (2005) The

genome of the African trypanosome Trypanosoma brucei. Science 309: 416-422.

28. Ivens AC, Peacock CS, Worthey EA, Murphy L, Aggarwal G, et al. (2005) The

genome of the kinetoplastid parasite, Leishmania major. Science 309: 436-442.

29. Nakayasu ES, Sobreira TJ, Torres R, Jr., Ganiko L, Oliveira PS, et al. (2012) Improved

proteomic approach for the discovery of potential vaccine targets in Trypanosoma

cruzi. J Proteome Res 11: 237-246.

30. Brunoro GV, Caminha MA, Ferreira AT, Leprevost Fda V, Carvalho PC, et al. (2015)

Reevaluating the Trypanosoma cruzi proteomic map: The shotgun description of

bloodstream trypomastigotes. J Proteomics 115: 58-65.

31. Lantos AB, Carlevaro G, Araoz B, Ruiz Diaz P, Camara Mde L, et al. (2016) Sialic

Acid Glycobiology Unveils Trypanosoma cruzi Trypomastigote Membrane

Physiology. PLoS Pathog 12: e1005559.

32. Notredame C, Higgins DG, Heringa J (2000) T-Coffee: A novel method for fast and

accurate multiple sequence alignment. J Mol Biol 302: 205-217.

33. Saitou N, Nei M (1987) The neighbor-joining method: a new method for reconstructing

phylogenetic trees. Mol Biol Evol 4: 406-425.

34. Efron B (2011) The bootstrap and Markov-chain Monte Carlo. J Biopharm Stat 21:

1052-1062.

35. Letunic I, Bork P (2016) Interactive tree of life (iTOL) v3: an online tool for the

display and annotation of phylogenetic and other trees. Nucleic Acids Res 44:

W242-245.

36. Pierleoni A, Martelli PL, Casadio R (2008) PredGPI: a GPI-anchor predictor. BMC

Bioinformatics 9: 392.

37. Blom N, Gammeltoft S, Brunak S (1999) Sequence and structure-based prediction of

eukaryotic protein phosphorylation sites. J Mol Biol 294: 1351-1362.

38. Julenius K, Molgaard A, Gupta R, Brunak S (2005) Prediction, conservation analysis,

and structural characterization of mammalian mucin-type O-glycosylation sites.

Glycobiology 15: 153-164.

39. Zhou F, Xue Y, Yao X, Xu Y (2006) CSS-Palm: palmitoylation site prediction with a

clustering and scoring strategy (CSS). Bioinformatics 22: 894-896.


58

40. Durante IM, Camara Mde L, Buscaglia CA (2015) A Novel Trypanosoma cruzi Protein

Associated to the Flagellar Pocket of Replicative Stages and Involved in Parasite

Growth. PLoS ONE 10: e0130099.

41. Urban I, Santurio LB, Chidichimo A, Yu H, Chen X, et al. (2011) Molecular diversity

of the Trypanosoma cruzi TcSMUG family of mucin genes and proteins. Biochem

J 438: 303-313.

42. Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, Karlen Y, Bakker O, et al. (2009)

Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative

PCR data. Nucleic Acids Res 37: e45.

43. Tuomi JM, Voorbraak F, Jones DL, Ruijter JM (2010) Bias in the Cq value observed

with hydrolysis probe based quantitative PCR can be corrected with the estimated

PCR efficiency value. Methods 50: 313-322.

44. Pfaffl MW (2001) A new mathematical model for relative quantification in real-time

RT-PCR. Nucleic Acids Res 29: e45.

45. Campo V, Di Noia JM, Buscaglia CA, Aguero F, Sanchez DO, et al. (2004)

Differential accumulation of mutations localized in particular domains of the mucin

genes expressed in the vertebrate host stage of Trypanosoma cruzi. Mol Biochem

Parasitol 133: 81-91.

46. Buscaglia CA, Alfonso J, Campetella O, Frasch AC (1999) Tandem amino acid repeats

from Trypanosoma cruzi shed antigens increase the half-life of proteins in blood.

Blood 93: 2025-2032.

47. Inoue H, Nojima H, Okayama H (1990) High efficiency transformation of Escherichia

coli with plasmids. Gene 96: 23-28.

48. Balouz V, Camara Mde L, Canepa GE, Carmona SJ, Volcovich R, et al. (2015)

Mapping Antigenic Motifs in the Trypomastigote Small Surface Antigen from

Trypanosoma cruzi. Clin Vaccine Immunol 22: 304-312.

49. Campo VA, Buscaglia CA, Di Noia JM, Frasch AC (2006) Immunocharacterization of

the mucin-type proteins from the intracellular stage of Trypanosoma cruzi.

Microbes Infect 8: 401-409.

50. Di Noia JM, Buscaglia CA, De Marchi CR, Almeida IC, Frasch AC (2002) A

Trypanosoma cruzi small surface molecule provides the first immunological

evidence that Chagas’ disease is due to a single parasite lineage. J Exp Med 195:

401-413.

51. Canepa GE, Degese MS, Budu A, Garcia CR, Buscaglia CA (2012) Involvement of

TSSA (trypomastigote small surface antigen) in Trypanosoma cruzi invasion of

mammalian cells. Biochem J 444: 211-218.

52. Carmona SJ, Nielsen M, Schafer-Nielsen C, Mucci J, Altcheh J, et al. (2015) Towards

High-throughput Immunomics for Infectious Diseases: Use of Next-generation

Peptide Microarrays for Rapid Discovery and Mapping of Antigenic Determinants.

Mol Cell Proteomics 14: 1871-1884.

53. Buscaglia CA, Campo VA, Frasch AC, Di Noia JM (2006) Trypanosoma cruzi surface

mucins: host-dependent coat diversity. Nat Rev Microbiol 4: 229-236.

54. Minning TA, Weatherly DB, Atwood J, 3rd, Orlando R, Tarleton RL (2009) The

steady-state transcriptome of the four major life-cycle stages of Trypanosoma cruzi.

BMC Genomics 10: 370.

55. Canepa GE, Mesias AC, Yu H, Chen X, Buscaglia CA (2012) Structural Features

Affecting Trafficking, Processing, and Secretion of Trypanosoma cruzi Mucins. J

Biol Chem 287: 26365-26376.


59

56. Cerqueira GC, Bartholomeu DC, DaRocha WD, Hou L, Freitas-Silva DM, et al. (2008)

Sequence diversity and evolution of multigene families in Trypanosoma cruzi. Mol

Biochem Parasitol 157: 65-72.

57. Buscaglia CA, Campo VA, Di Noia JM, Torrecilhas AC, De Marchi CR, et al. (2004)

The surface coat of the mammal-dwelling infective trypomastigote stage of

Trypanosoma cruzi is formed by highly diverse immunogenic mucins. J Biol Chem

279: 15860-15869.

58. Bartholomeu DC, Cerqueira GC, Leao AC, daRocha WD, Pais FS, et al. (2009)

Genomic organization and expression profile of the mucin-associated surface

protein (masp) family of the human pathogen Trypanosoma cruzi. Nucleic Acids

Res 37: 3407-3417.

59. Di Noia JM, D’Orso I, Aslund L, Sanchez DO, Frasch AC (1998) The Trypanosoma

cruzi mucin family is transcribed from hundreds of genes having hypervariable

regions. J Biol Chem 273: 10843-10850.

60. Mucci J, Lantos AB, Buscaglia CA, Leguizamon MS, Campetella O (2017) The

Trypanosoma cruzi Surface, a Nanoscale Patchwork Quilt. Trends Parasitol 33:

102-112.

61. Lazzaroni JC, Dubuisson JF, Vianney A (2002) The Tol proteins of Escherichia coli

and their involvement in the translocation of group A colicins. Biochimie 84: 391-

397.

62. Anderluh G, Hong Q, Boetzel R, MacDonald C, Moore GR, et al. (2003) Concerted

folding and binding of a flexible colicin domain to its periplasmic receptor TolA. J

Biol Chem 278: 21860-21868.

63. Goemaere EL, Cascales E, Lloubes R (2007) Mutational analyses define helix

organization and key residues of a bacterial membrane energy-transducing

complex. J Mol Biol 366: 1424-1436.

Trabajo Final - Lobo Maite

Carlos A. Buscaglia

Director

Di

Virginia Balouz

Codirectora

Lobo Maite M.

Alumna

Reglamento Trabajo Final - IIB-INTECH · Maite Lobo, Giannina Carlevaro, Luciano Melli*, ......

Documents

Transcript of Reglamento Trabajo Final - IIB-INTECH · Maite Lobo, Giannina Carlevaro, Luciano Melli*, ......

Reglamento Trabajo Final - IIB-INTECH · Maite Lobo*, Giannina Carlevaro*, Luciano Melli*, ......

Documents

Transcript of Reglamento Trabajo Final - IIB-INTECH · Maite Lobo*, Giannina Carlevaro*, Luciano Melli*, ......

Reglamento Trabajo Final - IIB-INTECH · Maite Lobo, Giannina Carlevaro, Luciano Melli*, ......

Transcript of Reglamento Trabajo Final - IIB-INTECH · Maite Lobo, Giannina Carlevaro, Luciano Melli*, ......