www.ujat.mx/publicaciones/uciencia24(3):219-227,2008

REGENERACIÓN DIRECTA IN VITRO DEL CRISANTEMO, Dendranthema Xgrandiflorum Kitam, A PARTIR DE SEGMENTOS DE TALLO

Direct in vitro regeneration of the chrysanthemum, Dendranthema X grandiflorumKitam, from stem segments

MR Valle-Sandoval , JO Mascorro-Gallardo, I Gil-Vázquez, G Iturriaga-de la Fuente

(MRVS) Posgrado de Horticultura, Departamento de Fitotecnia. Universidad Autónoma Chapingo Km. 38.5 CarreteraMéxico-Texcoco. Chapingo, Texcoco, Estado de México, 56230. México. vallerocio2000@yahoo.com.mx

(JOMG) Programa de Investigación en Biotecnología Agrícola y Departamento de Fitotecnia. Universidad Autónoma Chapingo.México

(IGV) Laboratorio de cultivo de tejidos, AGRIBOT. Universidad Autónoma Chapingo. México(GIF) Departamento de Biotecnología Ambiental del Centro de Investigación en Biotecnología. Universidad Autónoma del

Estado de Morelos. México

Artículo recibido: 22 de octubre 2007, aceptado: 4 agosto 2008

RESUMEN. Para la aplicación de la biotecnología moderna en un programa de mejoramiento es indispensable contarcon un sistema de regeneración in vitro eficiente. Se desarrolló un protocolo reproducible y efectivo, en cuanto a laobtención de más brotes por explante, de regeneración por organogénesis directa, para dos variedades de crisantemo(Dendranthema X grandiflorum Kitam) Indianápolis y Texana, las cuales son comercialmente importantes en la regiónde Texcoco, Estado de México. Se evaluó el efecto del tipo de explante (hoja o tallo), distintos niveles y combinacionesde las auxinas ácido naftalenacético (ANA) y ácido indolacético (AIA) y la citocinina benzilaminopurina (BAP). Lavariedad Indianápolis mostró un mayor porcentaje de brotes por explante en medio de Murashige y Skoog (MS) con 2mg L−1 de BAP y 1 mg L−1 de AIA. En cambio, la variedad Texana requirió 3 mg L−1 de BAP y 1.8 mg L−1 de AIA.En ambas variedades el alargamiento de los brotes y la inducción de raíces se obtuvo en el medio MS al 100 y 50% desus sales y sin hormonas.Palabras clave: Dendranthema X grandiflorum, cultivo in vitro, regeneración de plantas, organogénesis.

ABSTRACT. An efficient in vitro regeneration system is required in order to be able to apply modern biotechnology tobreeding programmes. A protocol that was effective and reproducible with respect to the number of shoots per explant,was developed for regeneration by direct organogenesis for the two chrysanthemum varieties Indianapolis and Texana(Dendranthema X grandiflorum Kitam) that are commercially important in the region of Texcoco, state of Mexico.The effects of the type of explant (leaf or stem), of different levels and combinations of the auxins naftalenacetic acid(ANA) and indolacetic acid (IAA), and of the cytokinin benzylaminopurine (BAP) were evaluated. The Indianapolisvariety grew a greater percentage of shoots per explant in the Murashige Skoog medium (MS) with 2 mg L−1 BAPand 1 mg L−1 IAA, while the Texana variety required 3 mg L−1 of BAP and 1.8 mg L−1 of IAA. In both varieties thelengthening of the shoots and the induction of the roots were obtained in the MS medium with 100 and 50% of thesalts and without hormones.Key words: Dendranthema X grandiflorum, in vitro culture, regeneration of plants, organogenesis.

INTRODUCCIÓN

El crisantemo (Dendranthema X grandiflorumKitam) se encuentra entre los tres cultivos ornamen-tales más importantes a nivel mundial, con un enor-me valor económico y cultural (Boase et al., 1997).

Las variedades comerciales se propagan vegetativa-mente por esquejes y estaquillas o in vitro, a partirde meristemos para obtener plantas sanas. La orga-nogénesis es un proceso que comprende el desarrollode vástagos o raíces directamente de los explantes oa partir de un callo desarrollado previamente (rege-

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neración indirecta). Murashige (1974) y Narayanas-wamy (1977) describieron los factores relacionadoscon el explante (edad fisiológica y ontogénica, el ta-maño y el tejido u órgano del que es extraído) ycon la planta madre (estado fisiológico) que depen-de de la época del año en que se realiza el cultivo.Estos factores deben ser considerados para la induc-ción exitosa de la organogénesis. La regeneración decrisantemo por cultivo de tejidos en diferentes varie-dades, se ha logrado al utilizar medios basales, dife-rentes reguladores de crecimiento y concentraciones,aditivos como antioxidantes y otros. La organogé-nesis se desarrolla a partir de una gran variedad deexplantes como tallos (nodal e internodal), yemasaxilares, hojas, ápices o meristemos apicales, proto-plastos, raíces, pedicelos y floretes. Teixeira (2003)en su amplia revisión resaltó la importancia de estatecnología para efectos de un programa de mejo-ramiento, que tenga como objetivo obtener plantascon nuevas características mediante ingeniería ge-nética. La regeneración indirecta de brotes adventi-cios vía callo fue obtenida a partir de tallo, pétalo yápice, sin embargo, este tipo de regeneración pue-de resultar en variantes somaclonales y la formaciónde quimeras, mientras que la regeneración directade hoja y tallo puede eliminar tales efectos (Teixei-ra 2003). El cultivo de Chrysanthemum morifolium,ha permitido inducir una gran variación somaclonal(Pillai & Zulkifli 2000). Generalmente el tallo hamostrado mayor capacidad de regeneración que lahoja (Gao et al. 2001).

Aún cuando protocolos eficientes de regene-ración se han establecido para distintas variedades,se destaca que estos son genotipo dependientes ydifíciles de adaptar directamente a otras varieda-des (Teixeira 2003), por lo que, para desarrollar unprotocolo de transformación genética se debe esta-blecer primero un sistema de regeneración que pro-duzca un mayor porcentaje de formación de brotesde la variedad que se pretende manipular median-te esta tecnología. En este marco de referencia elobjetivo principal fue desarrollar una nueva variedadde crisantemo mediante ingeniería genética, para locual en el presente trabajo se planteó determinar lascondiciones óptimas para regenerar in vitro plantasde distintas variedades de crisantemo cultivadas co-

mercialmente en el municipio de Texcoco, Estadode México.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetalLos esquejes de crisantemo sin enraizar de tres

semanas de edad fueron de las variedades: India-nápolis, Texana, Puma, Shosmy, Eleonora y Hart-mann. Los esquejes crecieron en condiciones de in-vernadero, durante los meses de octubre a marzo.Las hojas fueron cuidadosamente eliminadas paraevitar daño en la epidermis del tallo. Después, lostallos fueron desinfectados en una solución de de-tergente al 3% (p/v) durante tres minutos, etanolal 70% (v/v) durante un minuto, 10 minutos conuna solución 1.5% de cloro activo (Cloralex R©) y 0.5ml de Tween 20. Finalmente, los tallos se enjuaga-ron tres veces con agua destilada estéril dentro dela campana de flujo laminar. Posterior a la desin-fección, a partir de los tallos se cortaron seccionesinternodales aproximadamente de 2 mm de longi-tud, las cuales fueron divididas en sección del áreaapical, media y basal para conservar la polaridad delos explantes. También, de los fragmentos de hoja seevaluó la respuesta morfogenética para determinarel efecto del explante en la organogénesis.

Medios de cultivo y condiciones experimentalesLos explantes fueron cultivados en el medio

basal de Murashige & Skoog (1962), con 3% de sa-carosa y 0.6% de agar. El medio fue suplementadocon las hormonas 6-bencilaminopurina-HCl (BAP)(SIGMA, ALDRICH) (2.0 y 3.0 mg L−1), ácido in-dolacético (AIA) (SIGMA, ALDRICH) (0.1 a 1.8 mgL−1) y ácido naftalenacético (ANA) (SIGMA, AL-DRICH) (0.1 a 1.0 mg L−1). Con los explantes fue-ron establecidos 12 tratamientos para las seis varie-dades y ocho tratamientos adicionales para Texana.Los cultivos se mantuvieron bajo un intervalo detemperatura de 24 y 32 ◦C, 16 horas de fotoperío-do y una intensidad luminosa de 96 µmol m−2 s−1

(lámparas fluorescentes de 30 W). El cultivo in vitroconstó de las fases de: inducción de brotes, subcul-tivo, alargamiento de brotes y enraizamiento. En lafase de inducción, los explantes se sembraron en ca-

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jas Petri, la polaridad de los fragmentos internodalesde tallo se conservó y los fragmentos de hoja con elhaz en contacto se colocaron con el medio de cul-tivo. El subcultivo de los explantes se desarrolló enfrascos de 125 ml con un volumen de 25 ml de me-dio. La fase de alargamiento fue en frascos de 250ml con un volumen de 30 ml de medio. Posterior-mente, los brotes se colocaron en el medio MS basalal 50% de su sales, 1.5% de sacarosa y 0.6% deagar para la formación de raíces.

Aclimatización en invernaderoEl agar fue cuidadosamente eliminado de los

brotes enraizados. Posteriormente, los brotes fue-ron transferidos a charolas que contenían Peat moss(Premier R©) como sustrato), el cual fue desinfectadocon una solución con 0.1% (p/v) de Tecto 60 R© (In-grediente activo Tiabendazol 60%) y 0.1% (p/v) deFungimycin R© agrícola (ingredientes activos 18.1%p/v de estreptomicina y 2% p/v de oxitetraciclina).Las charolas se cubrieron con domos de plástico pa-ra mantener la humedad relativa. Las plantas de 12cm de longitud fueron replantadas en macetas y seexpusieron a dos horas de luz artificial de 320 µmolm−2 s−1 (focos de 100 W) durante la noche. Lasplantas fueron fertilizadas con una solución nutritivaque contenía en mg L−1 los siguientes nutrientes: N= 250, P = 60, K = 250, Ca = 300, S = 200, Mg= 75, Fe = 3, Mn = 0.5, B = 0.5, Cu = 0.1 y Zn= 0.1. Las fuentes empleadas fueron fertilizantescomerciales (nitrato de calcio, sulfato de potasio,fosfato monoamónico, sulfato de magnesio, sulfatoferroso, ortoborato de sodio, sulfato de manganeso,sulfato de cobre y sulfato de zinc) diluidos en agua.

Análisis estadísticoPara el análisis de los datos se usó un diseño

completamente aleatorizado, el cual constó de dosrepeticiones por la cantidad tratamientos a evaluar.Una caja Petri con 15 explantes fue considerada co-mo una repetición. Las variables evaluadas fueronporciento de explantes con brotes (% B) y el núme-ro de brotes (NB) formados por explante a los 45días. La variable% B fue analizada mediante prue-bas de comparación de dos proporciones binomialespor pares de tratamiento (Infante & Zárate 1984).

La variable NB se analizó mediante la prueba no pa-ramétrica de Kruskall & Wallis, debido a que la dis-tribución de los datos no fue normal (Infante & Zá-rate 1984). Esta prueba se basa en la asignación deintervalos para comparar muestras independientes,con ajustes por empates bajo un diseño experimen-tal completamente al azar. Posterior a la asignaciónde los intervalos se efectuó la comparación múltiplede cada intervalo asignado basado en la suma depromedios (Conover 1980).

RESULTADOS

Respuesta de las seis variedades a las combi-naciones hormonales

De las seis variedades de crisantemo evalua-das con 12 combinaciones hormonales, únicamentelas variedades Indianápolis y Texana regeneraron enbrotes adventicios, a partir de segmentos internoda-les de tallo. Ambas variedades, que si regeneraron,lo hicieron bajo diferentes combinaciones de BAP(2 mg L−1 y 3 mg L−1) y AIA (1 mg L−1 y 1.8 mgL−1).

Los explantes de las variedades que no rege-neraron brotes, solamente formaron un callo somerode color amarillo y se oxidaron durante el cultivo. El80% de las secciones de tallo cercanas al ápice seoxidaron. Asimismo, el porcentaje de regeneraciónfue menor en la zona apical, por lo que se considerótomar únicamente las secciones de tallo tomadas dela parte media.

Al comparar la capacidad de regeneración delos explantes que proceden de hoja y tallo, en éstosúltimos se observó oxidación de los tejidos, mayorformación de callo y no se obtuvieron brotes.

Regeneración eficiente de la variedad Indianá-polis

De las combinaciones hormonales probadas,únicamente con las concentraciones de 2 mg L−1 y3 mg L−1 de BAP con las tres concentraciones deAIA, se obtuvieron brotes en los diferentes porcen-tajes que fluctuaron entre 11 y 55%. El porcientode explantes con brotes (% B) no resultó significa-tivamente diferente en los cinco tratamientos. Tam-poco, el número de brotes en los tratamientos que

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Tabla 1. Comparaciones múltiples de rangos para determinar el efecto de tratamientos en el porcentaje de explantes con brotes y la cantidadde brotes por explante de crisantemo variedad Indianápolis. En la columna% B (proporciones) los valores con la misma letra dentro de cadacolumna indica proporciones estadísticamente iguales de acuerdo a pruebas de hipótesis sobre parámetros p de la distribución binomial. Enla columna NB (rangos) los valores con la misma letra son iguales en la misma columna de acuerdo con la prueba de comparación múltiplede rangos a una p ≤ 0.05).Table 1. Multiple range comparisons to determine the effect of treatments on the percentage of explants with shoots and the number ofshoots per explant of the Indianapolis variety chrysanthemum. In column% B (proportions), the values with the same letter within eachcolumn indicate statistically equal proportions according to the hypothesis tests on the p parameters of the binomial distribution. In columnNB (ranges), the values with the same letter are equal in the same column in agreement with the multiple range comparison test at p ≤0.05).

Tratamientos Por ciento de explantes No. de brotes ( % B) proporciones (NB) rangosBAP (mg L−1) AIA (mg L−1) con brotes ( % B) por explante (NB)

2 0.5 44 2.4 0.51a 683a

2 1.0 55 2.4 0.71a 777a

3 0.1 11 0.4 0.37a 429b

3 0.5 50 1.8 0.35a 671a

3 1.0 28 1.6 0.14a 653ab

contenían 2 y 3 mg L−1 de BAP con 0.5 y 1.0 mgL−1 de AIA resultaron con diferencias significativas.Las cinco combinaciones tuvieron en común la pre-sencia de AIA. Aún cuando los resultados estadísti-cos no mostraron diferencias claras, los datos pro-medios permitieron establecer que la combinaciónde BAP/AIA (2:1) fue la que dio mejor respues-ta en cuanto al porciento de explantes con brotes(55%) y número de brotes por explante (2.4) encomparación con las otras combinaciones. Además,los brotes formados en este tratamiento mostraronuna morfología más uniforme (Tabla 1).

Durante el proceso de regeneración los ex-plantes mostraron una serie de cambios. Los prime-ros cambios morfogenéticos ocurrieron después deuna semana de cultivo y se manifestó con el creci-miento del explante, una coloración verde y la for-mación de callo en la zona superior del explante queno estuvo en contacto con el medio. Después dedos a tres semanas, los primeros brotes se forma-ron directamente de la zona no diferenciada de losexplantes. Posteriormente, el alargamiento y dife-renciación continuó hasta que después de 30 o 35días, los brotes con hojas en desarrollo se observa-ron (Figura 1). Una vez que se estableció la fase deinducción, se hizo un subcultivo con el mismo me-dio de inducción, ya que esto permitió que hubieraun mayor número de brotes y a su vez lo brotesalcanzaran un tamaño y vigor adecuados.

La fase de aclimatización ex vitro, es una fase

crítica en el cultivo in vitro. Para el caso del crisan-temo, utilizar como sustrato Peat moss combina-do con alta humedad relativa y la exposición de lasplantas a dos horas diarias de la luz (durante la no-che) por tres semanas (21 días) permitió que lasplantas se desarrollaran adecuadamente hasta unaaltura de 12 cm, cuando se transfirieron a macetas.Cuando las plantas tuvieron una altura de 20 cm seretiró la luz por la noche para inducir la floración ya las dos semanas, se observaron los primeros boto-nes florales y posteriormente a las dos semanas lasflores. En el presente trabajo y para el caso de la va-riedad Indianápolis, el tiempo para regenerar plantascompletas a partir de segmentos de tallo y llevarlashasta floración requirió de 17 semanas o 119 días(Figura 1).

Regeneración eficiente de la variedad TexanaEn una primera etapa, cuando fueron proba-

dos los doce tratamientos, esta variedad mostró unarespuesta muy baja, ya que se obtuvieron en prome-dio de uno a tres brotes por explante en el 20% delos mismos, con la combinación hormonal de 3 mgL−1 de BAP y 1 mg L−1 de AIA. Partiendo de esteresultado y para mejorar la respuesta se probaronotras combinaciones hormonales (Tabla 2).

En cinco tratamientos se obtuvo respuesta.La mejor la combinación fue en 3 mg L−1 de BAPy 1.8 mg L−1 de AIA, bajo la cual se logró un 80%de explantes con brotes (Tabla 2). Al igual que la

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Tabla 2. Comparaciones múltiples de rangos para determinar el efecto de tratamientos en el porcentaje de explantes con brotes y la cantidadde brotes por explante de crisantemo variedad Texana. En la columna% B (proporciones) los valores con la misma letra dentro de cadacolumna indica proporciones estadísticamente iguales de acuerdo a pruebas de hipótesis sobre parámetros p de la distribución binomial. Enla columna NB (rangos) los valores con la misma letra son iguales en la misma columna de acuerdo con la prueba de comparación múltiplede rangos a una p ≤ 0.05).Table 2. Multiple range comparisons to determine the effect of treatments on the percentage of explants with shoots and the number ofshoots per explant of the Texana variety chrysanthemum. In column% B (proportions), the values with the same letter within each columnindicate statistically equal proportions according to the hypothesis tests on the p parameters of the binomial distribution. In column NB(ranges), the values with the same letter are equal in the same column in agreement with the multiple range comparison test at p ≤ 0.05).

Tratamientos Por ciento de explantes No. de brotes ( % B) proporciones (NB) rangosBAP (mg L−1) AIA (mg L−1) con brotes ( % B) por explante (NB)

3 1.0 20 0.2 0.20c 115c

3 1.2 20 0.3 0.30c 121c

3 1.4 40 0.8 0.80b 163b

3 1.6 80 2.8 2.80a 295a

3 1.8 80 4.1 3.60a 340a

variedad Indianápolis fue necesaria una relación deBAP/AIA cercana a 2:1 para lograr la emisión debrotes. En la variedad Texana se hicieron dos sub-cultivos de dos semanas cada uno para inducir unamayor cantidad de brotes por explante (2.4 en In-dianápolis contra 4.1 en Texana).

Los brotes diferenciados fueron más pequeñosy menos vigorosos que los de la variedad Indianápo-lis. Además, una semana más fue requerida para quelas plantas regeneradas alcanzaran el tamaño ópti-mo (12 cm) para transferirse al suelo y crecer en elinvernadero (Figura 2). Sin embargo, una vez en ma-ceta mostraron un crecimiento con hojas mucho másgrandes y verdes, comparadas con las de la variedadIndianápolis. También, la floración fue más rápidaque la variedad Indianápolis. Una semana despuésde quitar la luz nocturna fue posible observar losbotones florales y las flores se obtuvieron en tres se-manas. Desde la siembra de los segmentos de tallohasta la floración, Texana requirió de 18 semanaso 126 días (Figura 2), el cual resultó mayor tiempodel invertido para Indianápolis.

DISCUSIÓN

Las diferencias en cuanto a la capacidad deregeneración de la variedad Indianápolis y Texanaconcordó con los resultados obtenidos con otras va-riedades (Teixeira 2003), en los cuales se ha determi-nado que las citocininas y auxinas jugaron un papelimportante en la obtención de brotes. Diversos estu-

dios han demostrado que no existe una combinaciónde BAP con AIA o ANA que sea estándar para todaslas variedades de crisantemo, ya que hay una fuerteinfluencia del genotipo (Teixeira 2003). Para el cri-santemo se determinó que la mejor combinación fueBAP con AIA en una relación cercana 2:1 (Karimet al. 2003). Los estudios realizados mostraron queD. indicum produjo uno a dos brotes por explantecuando se cultivaron segmentos de hoja en medioMS con 0.2 mg L−1 de AIA y 3 ó 5 mg L−1 de BAP(Ledger et al. 1991). En cambio, seis genotipos deD. morifolium regeneraron pobremente, con un pro-medio de sólo 2.5 brotes por explante (Chagas et al.2004). De 11 variedades de D. morifolium, solamen-te ocho produjeron brotes en un medio que contenía1 mg L−1 de NAA y 1 mg L−1 de BAP (Kaul et al.1990). Entonces, la capacidad de regeneración debrotes en crisantemo es genotipo dependiente y éstaha variado ampliamente de 0 a 90% de los explantes(Teixeira 2003).

Lu et al. (1990) seccionaron segmentos de ta-llo en tres partes, que clasificaron como explante detipo I (zona apical), tipo II (zona media) y tipo III(zona basal). Ellos determinaron que el explante ti-po I fue más efectivo en la formación de brotes,ya que los explantes más cercanos al ápice resulta-ron más competentes en la regeneración. De igualforma, Rout & Das (1997) establecieron que el po-tencial morfogenético varió con la etapa de madu-rez del tallo. En comparación con los datos citados,en la presente investigación obtuvo un mayor por-

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Figura 1. (A) Cultivo in vitro, después de tres semanas de subcultivo, (B) fase de enraizamiento a las dos semanas cultivo, (C y D) acli-matización en invernadero, (E) transferencia a maceta, (F) plantas de crisantemo variedad Indianápolis en floración después de 17 semanasde crecimiento a partir de segmentos de tallo.Figure 1. (A) In vitro culture, after three weeks of subculture, (B) rooting phase after two weeks, (C and D) acclimatisation in thegreenhouse, (E) transplanting to a pot, (F) flowering plants of Indianapolis variety chrysanthemum after 17 weeks of growth from stemsegments.

centaje de respuesta al cultivar segmentos tomadosde la porción media del tallo, pero no con los seg-mentos obtenidos cerca del ápice. Los segmentoscortados cerca del ápice fueron más pequeños y seoxidaron fácilmente, mientras que los de la base,aún cuando fueron de mayor tamaño, regeneraronpobremente debido probablemente a que los tejidoseran más viejos. Lu et al. (1990) establecieron que

en el crisantemo existe un gradiente de etapas dedesarrollo en el tallo, lo que determina que sea crí-tico seleccionar la etapa más adecuada del explantepara asegurar un alto porcentaje de regeneración.

En relación al tipo de explante, Gao et al.(2001) y Himstedt & Jacobsen (2001) compara-ron la capacidad morfogenética de hoja y tallo, yencontraron una mayor capacidad de regeneración

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Figura 2. (A) Cultivo in vitro, después de dos semanas, (B) fase de alargamiento a las dos semanas, (C) fase de enraizamiento, (D)aclimatización en invernadero, (E) transferencia en maceta y (F) plantas de crisantemo variedad Texana con flores después de 18 semanasde crecimiento a partir de segmentos de tallo.Figure 2. (A) In vitro culture, after two weeks, (B) elongation phase after two weeks, (C) rooting phase, (D) acclimatisation in thegreenhouse, (E) transplanting to a pot and (F) flowering plants of Texana varitey chrysanthemum after 18 weeks of growth from stemsegments.

en tejidos de tallo que de hoja. Los explantes queprovinieron de tallo han mostrado mayor capacidadde regeneración que los pecíolos y las hojas, en unintervalo de dos a 10 brotes por explante, lo quedepende de igual forma del genotipo (Teixeira &Fukai 2003). Para explicar lo anterior, Kaul et al.(1990) determinaron que existen diferentes respues-tas de los explantes cortados de tallo y hoja, debido

particularmente a la concentración de auxinas. Kaulet al. (1990) explicaron el efecto de los diferentesniveles endógenos de hormonas en los tejidos, locual afecta la respuesta a las hormonas aplicadasexógenamente. Aunado a esto, Miyazaki & Tashi-ro (1978) registraron que los segmentos de tallo deChrysanthemum morifolium cv. Kayono-sakura, ob-tenidos de plantas jóvenes de nueve semanas, pro-

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dujeron brotes adventicios con mayor facilidad quelos obtenidos de plantas más viejas (19 semanas).Asimismo, Miyazaki & Tashiro (1978) determinaronque los segmentos provenientes de esquejes crecidosdurante el invierno regeneraron más brotes que du-rante primavera o verano. En el presente trabajo,los mejores porcentajes de brotación se obtuvieronen los meses de otoño e invierno, con lo cual sedeterminó el efecto de estacionalidad.

El desarrollo de plantas completas de crisan-temo, desde los segmentos de tallo para Texana eIndianápolis hasta floración, requirió 119 y 126 días.Lu et al. (1990), registraron un período de 15 se-manas para la variedad Royal Purple, quienes em-plearon los segmentos de tallo para obtener plan-tas completas a través de regeneración directa. Encomparación, un sistema de regeneración que utili-

za como explante los meristemos, la obtención deplantas con flores es de 21 semanas según experien-cia de los productores de crisantemo de la región deTexcoco. En invernadero, el tiempo que se requierepara obtener plantas con flores desde esquejes es de15 semanas, de acuerdo al manejo de los mismosproductores de crisantemo de la región.

Con base en la amplia revisión efectuada porTeixeira (2003) no existía información previa en laliteratura sobre el manejo exitoso in vitro de las va-riedades Indianápolis y Texana bajo un esquema deregeneración directa a partir de segmentos de tallo.Con los resultados obtenidos en el presente trabajoserá posible el aplicar las técnicas de transformacióngenética para incorporar nuevas características, co-mo mayor vida postcosecha, resistencia a frío, colory morfología, a estas variedades.

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