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Análisis de la calidad del ADN genómico humano extraído a partir de parafina, mediante PCR a tiempo real

REF IMG-310

Reactivos Color Cantidad Conservación

Long Frag Master Mix Disco rosa 110 µl -20ºC

Short Frag Master Mix Disco verde 110 µl -20ºC

General Master Mix Disco blanco 360 µl 4ºC

Positive Control Tapa negra 25 µl -20ºC

Tabla 1. Componentes del QC-DNA-FFPE OncoKitDx

Sonda Receptor Quencher

Short Frag FAMTM MGB

Long Frag FAMTM MGB

Tabla 2. Información de las sondas

Campos Etapa 1

Activación enzimática

Etapa 2

PCR

Nº de Ciclos 1 ciclo inicial

50 ciclos

Desnaturalización Unión de oligonucleótidos/

Extensión

Temperatura 95ºC 95ºC 60ºC

Tiempo 10 minutos 15 segundos 1 minuto*

Tabla 3. Programa de PCR óptimo para el 7500 FAST o StepOne

𝑹𝒂𝒕𝒊𝒐 𝒅𝒆 𝒄𝒂𝒍𝒊𝒅𝒂𝒅 =𝟏. 𝟗𝟑𝑪𝒕 𝟏𝟖𝟑 (𝒄𝒂𝒍𝒊𝒃𝒓.−𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂)

𝟏. 𝟗𝟐𝑪𝒕 𝟔𝟖 (𝒄𝒂𝒍𝒊𝒃𝒓.−𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂)𝒙 𝟏𝟎

Ratio de calidad (0-100) Nivel de calidad

>-100 Grado 1 (Aceptable)

1.5 - 4 Grado 2 (Subóptima)

0- 1.5 Grado 3 (Inaceptable)

Tabla 4. Rango de calidades del ADN extraído de tejidos parafinados

Figura 1. Resultados obtenidos mediante el uso de QC-DNA-FFPE OncoKitDx

𝑹𝒂𝒕𝒊𝒐 𝒅𝒆 𝒄𝒂𝒍𝒊𝒅𝒂𝒅 =𝟏.𝟗𝟑(𝟐𝟑.𝟖𝟑−𝟐𝟑.𝟖𝟎)

𝟏.𝟗𝟐 (𝟐𝟐.𝟑𝟔−𝟐𝟒.𝟎𝟏) 𝒙 𝟏𝟎

Control Resultado

Causa Short Frag Long Frag

Control Positivo

(Calibrador)

+ + Resultado esperado

- +

Fallo de amplificación en la PCR1 + -

- -

Muestra

+ + Resultado esperado

+ - Resultado indeterminado2

- + Fallo de amplificación de la muestra3

- -

Control Negativo de

PCR

- - Resultado esperado

+ +

Contaminación de la PCR con ADN humano4 + -

- +

Tabla 5. Interpretación de los posibles resultados