REDES TEMÁTICAS Subdirección General de DE … · Subdirección General de Investigación...

ILMO. SR. DIRECTOR DEL INSTITUTO DE SALUD CARLOS III

Subdirección General deInvestigación SanitariaFondo de Investigación Sanitaria

REDES TEMÁTICASDE INVESTIGACIÓN COOPERATIVA

SOLICITUD DE CONSTITUCIÓN Y FINANCIACIÓNDE REDES DE GRUPOS

Convocatoria del Ministerio de Sanidad y Consumo de 22-03- 2002(«B.O.E.» de 3 de abril de 2002)

Expediente Nº

TÍTULO DEL PROYECTO CIENTÍFICO:ESTUDIO GENÉTICO, METABÓLICO, CLÍNICO, TERAPÉUTICO Y EPIDEMIOLÓGICO DE LAS HIPERLIPEMIASHEREDITARIAS EN ESPAÑA.

TEMÁTICA ESPECÍFICA DE INVESTIGACIÓN DE LA RED:HIPERLIPEMIAS GENÉTICAS

RELACION DE CENTROS QUE COMPONEN LA RED

Cumplimente el siguiente cuadro por cada uno de los centros que componen la red. Añada tantos cuadrosde datos como sea preciso.

Código del CentroDATOS DEL CENTRO

Denominación: CLINICA MUESTRA SEÑORA DE LA CONCEPCION. FUNDACIÓN JIMÉNEZ DÍAZ

Domicilio: AV. REYES CATOLICOS 2

Población PROVINCIA Código postalMADRID MADRID 28040

Dependencia: Teléfono: 915504910


Denominación: INSTITUTO ARAGONES DE CIENCIAS DE LA SALUD

Domicilio: ED. PIGNATELLI Pº Mª AGUSTIN 36

Población PROVINCIA Código postalZARAGOZA ZARAGOZA 50004

Dependencia: DIPUTACIÓN GENERAL ARAGÓN Teléfono: 976-714306


Denominación: INST. CIENCIAS CARDIOVASCULARES CATALUÑA/INST. INVEST. CARDIOVASCULAR BARCELONA

Domicilio: S. ANTONI Mº CLARET 167

Población PROVINCIA Código postalBARCELONA BARCELONA 08025

Dependencia: Teléfono: 93-2919285

Impreso normalizado de solicitud de constitución y financiación de Redes TIC de Centros:Relación de centros que componen la red Página 2 de 97


Denominación: HOSPITAL UNIVERSITARIO REINA SOFIA

Domicilio: AVDA MENÉNDEZ PIDAL S/N

Población PROVINCIA Código postalCÓRDOBA CÓRDOBA 14004



Denominación: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS AUGUST PI I SUNYER

Domicilio: C/ VILLARROEL 170




Denominación: CIUDAD SANITARIA Y UNIVERSITARIA DE BELLVITGE

Domicilio: C/ FEIXA LLARGA S/N

Población PROVINCIA Código postalL'HOSPITALET DE LLOBREGAT BARCELONA 08907

Dependencia: INSTITUTO CATALAN DE LA SALUD Teléfono: 93-2607664


Denominación: FACULTAD DE FARMACIA, UNIVERSIDAD DE BARCELONA

Domicilio: AVDA. DIAGONAL 643




Denominación: HOSPITAL DE LA SANTA CREU I SANT PAU

Domicilio: SANT ANTONI Mª CLARET 167





Denominación: HOSPITAL CLÍNICO UNIVERSITARIO DE VALENCIA

Domicilio: AVDA. BLASCO IBAÑEZ 17

Población PROVINCIA Código postalVALENCIA VALENCIA 46010



Denominación: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES EN CIENCIAS DE LA SALUD

Domicilio: C/SANT JOAN S/N

Población PROVINCIA Código postalREUS TARRAGONA 43201



Denominación: FACULTAD DE MEDICINA, UNIVERSIDAD DE CANTABRIA

Domicilio: C/ CARDENAL H ORIA S/N

Población PROVINCIA Código postalSANTANDER CANTABRIA 39011



Denominación: MEDPLANT GENETICS

Domicilio: EL CARMEN 38

Población PROVINCIA Código postalBARACALDO VIZCAYA 48901



Denominación: HOSPITAL UNIVERSITARIO VIRGEN DEL ROCIO

Domicilio: AVDA. MANUEL SIUROT S/N

Población PROVINCIA Código postalSEVILLA SEVILLA 41013




Denominación: HOSPITAL RAMON Y CAJAL

Domicilio: CTRA DE COLMENAR, Km 9.1

Población PROVINCIA Código postalMADRID MADRID 28034

Dependencia: INSTITUTO MADRILEÑO DE LA SALUD Teléfono: 91-3368000


Denominación:

Domicilio:

Población PROVINCIA Código postal

Dependencia: Teléfono:


Denominación:

Domicilio:

Población PROVINCIA Código postal

Dependencia: Teléfono:

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Impreso normalizado de solicitud de constitución y financiación de Redes TIC de Grupos:Estructura organizativa de la red página 5

Expediente Nº

RTIC-GESTRUCTURA ORGANIZATIVA DE LA RED


La Red temática en Hiperlipemias Genéticas está constituida por 16 nodos, pertenecientes a 14Centros del Sistema Sanitario Nacional y Universitario. Uno de los nodos es emergente y estátutelado por el Dr. Gomez Coronado (Hospital Ramón y Cajal).

El total de nodos representan a 7 Comunidades Autónomas ( Andalucía, Aragón, Cantabria,Cataluña, Madrid, Valencia, País Vasco).

La distribución de nodos por Comunidad Autónoma es la siguiente:

Andalucía: 2 ; Aragón: 2; Cantabria: 1 ; Cataluña: 6; Madrid: 3 ( Un nodo emergente ) ;Valencia: 1; País Vasco: 1

Se dispone de un registro de filiación de los miembros de cada nodo integrante de la Red. En cadanodo hay un coordinador local que corresponde al Investigador Principal. En el apartado de Plan deTrabajo se detallan los 16 nodos y centros a los que pertenecen, así como el investigadorresponsable del grupo y el total de investigadores que componen cada uno de ellos.

El Coodinador de la red es el Dr. Pedro Mata (Madrid) , y el encargado del Programa de Docenciay Formación de la red es el Dr. Francisco Perez Jiménez (Córdoba).

La Red cuenta con el apoyo de 72 clínicas de lípidos del Sistema Nacional de Salud,distribuídas por todo el territorio nacional, que siguen protocolos comunes de recogida de datospara el diagnóstico de las hiperlipemias genéticas (Se adjunta mapa con la relación de lasUnidades). En 1999 se inició el Registro Nacional de Hipercolesterolemia Familiar, propiedadde la Fundación Hipercolesterolemia Familiar (www.colesterolfamiliar.com), una instituciónbenéfico-asistencial. El Presidente de la Fundación es el Dr. Pedro Mata, y varios miembros delcomité científico forman parte de la red de nodos (Dra. Badimón, Dr. Mata, Dr. Pocovi, Dr. PerezJiménez, Dra. Clotilde Vazquez).

La red cuenta con una Base de Datos del Registro de pacientes centralizada en Madrid(coordinadores, Dr. Pedro Mata, Dr. Rodrigo Alonso), y de un banco de ADN y seroteca únicoscentralizados en la Universidad de Zaragoza (Dr. Miguel Pocovi). Para el presente proyecto, tantola base de datos como el banco de DNA seguirán en la misma localización, y se creará unlaboratorio centralizado para los análisis bioquímicos en el Hospital Sant Pau de Barcelona(Dr.Blanco). Además, se creará un Registro Nacional para la Hiperlipemia Familiar Combinadacon la misma estructura organizativa que el anterior registro.

Para la consecución de los objetivos del Proyecto coordinado, el suministro de datos y de muestrasbiológicas se proporcionará a los diferentes nodos desde los distintos bancos de datos y muestraspreservando la confidencialidad del paciente según la legislación vigente (Ver Antecedentes).

Se trabajará de manera integrada y coordinada, utilizando criterios diagnósticas y metodologíacomúnes para toda la red. Para la consecución de los objetivos, pueden interactuar varios nodos enfunción de la complejidad metodológica.

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Expediente Nº

RTIC-GPLAN ESTRATÉGICO CONJUNTO CON PROYECTO CIENTÍFICO DE TRES AÑOS


Se presenta un Proyecto científico único de 3 años de duración con el fin de profundizar en elestudio de las hiperlipemias hereditarias en España, desde el punto de vista genético, metabólico,clínico, terapéutico y epidemiológico (ver apartado Objetivos) . Este proyecto se enmarca dentro delas prioridades del Sistema Nacional de Salud para la prevención de la enfermedadcardiovascular en estos pacientes. Su puesta en marcha tendrá un importante impacto social.

Para llevar a cabo este Proyecto, se presenta una Red cooperativa y multidisciplinaria,participada por 16 grupos pertenecientes a Centros del Sistema Nacional de Salud, deUniversidades , y con apoyo de organismos y empresas privadas farmacéuticas y de tecnología.Uno de los grupos es emergente y está tutelado por el Dr. Gomez Coronado, responsable del nodo15, del mismo centro.

Los distintos grupos que forman la red cuentan con suficiente experiencia en el diagnóstico,tratamiento e investigación en las hiperlipemias genéticas. Y algunos de sus miembros hanparticipado previamente en proyectos coordinados con financiación pública en esta area. LosCentros de Investigación representan a 7 Comunidades Autónomas .Para la consecución de los objetivos propuestos, la Red cuenta con el apoyo de la FundaciónHipercolesterolemia Familiar, y las 72 Clínicas de Lípidos que colaboran en el Registro Nacionalde Hipercolesterolemia Familiar, pertenecientes al Sistema Nacional de Salud, y representativasde todas las Comunidad Autónomas de España. Además, España a través de los datos del registroEspañol de HF colabora con el Programa Internacional MEDPED dependiente de la OMS.

Los distintos grupos participarán de forma coordinada e integrada en función a su experienciaclínica, docente e investigadora con el fin de conseguir el adecuado desarrollo del Proyecto. Lainteracción intelectual queda reflejada en el apartado de Formación en Investigación que proponela red. Se incluye un programa de formación de tercer ciclo (desarrollo de curso de doctorado ytesis doctorales), y de formación continuada a los investigadores, fomentando el intercambio deinvestigadores entre los distintos grupos. Además, la red considera necesaria la realización decursos de formación continuada para los miembros de la red de Clínicas de Lípidos que colaboranen el registro ya existente y a médicos del Sistema Nacional de Salud implicados en la detección depacientes con hiperlipemias genéticas. En el Proyecto se incluye también, el desarrollo yevaluación de un programa de educación y difusión para la población afecta de hiperlipemiagenética.La Red cuenta con los siguientes recursos que serán utilizados y compartidos por todos los gruposque lo requieran para la consecución de los objetivos:1. Un Registro nacional de pacientes con Hipercolesterolemia Familiar formado por 2050 casos

índice (un miembro por familia) incorporados en una Base de Datos protegida de acuerdoa la legislacion vigente con la aprobación de la Agencia Nacional de Protección de Datos. EsteRegistro fue creado en el año 1999 por la Fundación Hipercolesterolemia Familiar. ElPresidente de la Fundación es el Dr. Pedro Mata, y miembros del Comité Científico participanen este Proyecto integrado (L Badimón, R Carmena, P Mata, F Perez-Jiménez, J Lopez-Miranda, M Pocovi, C Vazquez).

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2. Un banco de ADN, suero y plasma de los pacientes incluidos en el registro. Previamente a la obtención de la muestra se ha firmado un consentimiento informado.

3. Un registro de filiación de todo el personal que participa en el Proyecto (se adjunta acontinuación).

Este Proyecto ampliará el registro de pacientes con HF ya existente, que se enmarca dentro delestudio de la cohorte, y creara un nuevo registro para la HFC. Así mismo se creará un banco deADN y de sueros para los pacientes con HFC.

Las distintas actuaciones necesaria para el desarrollo y consecución del proyecto seráncoordinadas por el Coordinador de la Red (Dr. Mata). Los responsables de los recursos disponiblesy de los programas a desarrollar en el proyecto son:

Base de datos y registros (Dr. Mata, Dr. Alonso)

Banco de ADN y seroteca de pacientes con HF y HFC (Dr. M. Pocovi)

Laboratorio centralizado análisis bioquímicos (Dr. F. Blanco)

Metodología Estudio no invasivo Aterosclerosis preclínica (Dr. E. Ros)

Banco de tejidos , tejido adiposo, etc. (Dr. J Ribalta, Dr. J Villar)

Docencia y Formación (Dr. F. Perez Jimenez)

Educación a Pacientes (Dra. J Panisello, Dra. Clotilde Vazquez)

Todos los resultados serán incorporados en una base de datos única para su posterior análisis ypodrán ser compartidos por todos los grupos que participan en el proyecto.

Todos los nodos participarán en el proyecto de una forma coordinada e integrada, compartiendo labase de datos y bancos de muestras o tejidos que se desarrollen durante el proyecto. La interacciónentre los grupos estará determinada en función de los objetivos y la experiencia de cada grupo (verapartado de Plan de Trabajo).

Con el fin de promover la interacción entre los grupos, se realizará al menos una reunión semestral,o cuando el desarrollo del proyecto lo precise.

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Expediente Nº

RTIC-GMEMORIA DEL PROYECTO CIENTÍFICO


RESUMEN (Objetivos y metodología del proyecto)Las hiperlipemias genéticas son un trastorno frecuente en la población general,caracterizadas por el desarrollo de enfermedad cardiovascular prematura.Objetivos: a) Estudio y seguimiento a largo plazo de una cohorte de hipercolesterolemiafamiliar(HF)con diagnóstico genético. Se determinará el riesgo y la supervivencia enfunción de las características clínicas y genéticas; b) Valorar la aterosclerosispreclínica; c)Identificar mutaciones distintas a las del receptor LDL; d)Analizar lainteracción gen-gen, gen-factores ambientales y metabólicos;e) Crear un registro depacientes con Hiperlipemia familiar combinada (HFC), y validar los criteriosdiagnósticos;f)determinar el riesgo cardiovascular de la HFC;g) identificar genesimplicados en el desarrollo de HFC. Métodos: a) Se utilizarán los datos del registroespañol de HF y se incluirán en la cohorte 4000-5000 familiares sanos y afectos de HF.Se cumplimentará un protocolo homogéneo y se extraeran muestras de ADN y suero paraanálisis bioquímicos. Los pacientes seguirán visitas cada 2 años. b)aterosclerosispreclínica: medida por ecografía carotídea; c) Bioquímica: perfil ipídico mediantemétodos enzimáticos en autoanalizador y ultracentrifugación, apo B, tamaño de LDL;d)ácidos grasos: cromatografía de gases; e) análisis genéticos: biochips, PCR, SSCP,secuenciación y análisis de restricción, PCR larga, arrays de expresión génica; f)funcionalidad: citometría de flujo; g) homocisteína: HPLC; h) factores trombogénicos yLDLox: ELISA, EIA; i) cultivos celulares; j) análisis de expresión de proteínas:isoelectroenfoque y electroforesis.

TITLE:GENETIC, METABOLIC, CLINICAL, THERAPEUTIC AND EPIDEMIOLOGYCAL STUDY ON HEREDITARYHYPERLIPIDAEMIA IN SPAIN.

SUMMARY (Objectives and methodology)Genetics hyperlipidemia are very frequent in general population and they arecharacterized by premature cardiovascular disease.Objectives: a) To study and follow up of a large cohort of families with geneticdiagnosis of Familial Hypercholesterolaemia (FH). Cardiovascular risk and survival willbe determined; b)to evaluate subclinic atherosclerosis; c) To identify mutations in lociothers than LDL-receptor gen. d)to evaluate the interactions among LDL-r mutations andother genetics, metabolic and enviromental factors. d) To establish a registry ofpatients with Familial Combined Hyperlipidaemia (FCH) and to validate the diagnosiscriteria; e) to determine cardiovascular risk factors in FCH, and to identify geneinvolved in the developmente of FCH. Methods: a)From the database of the Spanishregistry on FH, patients with genetic FH, and their first degree relatives (affected ornot) wil be included in the cohort (around 4.000-5.000 subjects). Homogeneous criteriawill be used, and blood sample will be obtained for DNA isolation and biochemicalanalyses. Subjects will be followed each 2 years; b) subclinic atherosclerois will bemeasured by carotid ultrasound; c) biochemistry: lipid profile by enzimatic methods inautoanalyzer and ultracentrifugation, apo B, LDL size; d) fatty acids by gaschromatograpgy; e) genetic analysis: biochips, PCR, SSCP, sequentiation, restrictionanalysis, large PCR, gene expresion arrays; f) Function: flow citometry; g)homocysteine: HPLC; h) Trombogenic factors and oxidized LDL: ELISA, EIA; i) cellsculture; j) protein expresion analysis: isoelectricfocusing, electrophoresis.

Impreso normalizado de solicitud de constitución y financiación de Redes TIC de Grupos:Memoria del proyecto científico: Antecedentes y estado actual del tema Página 9

Expediente Nº



Antecedentes

Las hiperlipemias de base hereditaria son un trastorno frecuente, estimándose su prevalencia en un2% de la población general. Esto significa que en España existen de 600.000 a 800.000 personascon una hiperlipeima genética. Este término engloba a la Hipercolesterolemia Familiar y otros tiposde Hipercolesterolemia Autosómica Dominante monogénica, y a la Hiperlipemia FamiliarCombinada.

HIPERCOLESTEROLEMIA FAMILIAR (HF) E HIPERCOLESTEROLEMIASAUTOSÓMICAS DOMINANTES (HAD)

Características clínicas, bioquímicas y genéticasLas HAD son desórdenes del metabolismo lipídico, que se caracterizan por un aumento plasmáticode lipoproteinas de baja densidad (LDL) y enfermedad coronaria prematura. Se calcula que laHAD acorta la esperanza de vida, en mas de 25 años, con respecto a la población general. Hace 38años Goldstein y Brown observaron que las HAD eran consecuencia de defectos en el receptor delas lipoproteínas de baja densidad (r-LDL) y la denominaron hipercolesterolemia familiar (HF,MIM 143890) habiéndose descrito en la actualidad mas de 700 mutaciones en el gen del r-LDLasociadas a HAD (1).La HF es el trastorno hereditario monogénico más frecuente. Se transmite con carácter autosómicodominante, con una penetrancia de casi el 100%. La mutación se produce en el gen que codifica elreceptor para las LDL, por lo cual hay una menor expresión de receptores funcionales para las LDLen el hígado. Esto produce un incremento en las concentraciones plasmáticas de estas lipoproteinas,y del colesterol total. En 1987 Innerarity y col (2) demostraron la heterogeneidad genética de la HAD observando quehabía pacientes con actividad normal del r-LDL y afinidad disminuida de su apolipoproteína B-100, denominando a esta hiperlipidemia apo B100 defectuosa familiar (FDB, MIM 144010). Laexistencia de una mayor heterogeneidad en las HAD nunca ha sido formulada de forma precisa.Varios estudios han encontrado familias en las cuales el defecto responsable de la HAD no estálocalizado ni en el gen del r-LDL ni en el gen de la apoB-100. En un estudio reciente se identificóun nuevo locus en el cromosoma 1, región p34.1-p32, implicado en la HAD. Se calcula que endependencia de la población estudiada entre un 15 y un 20% de las HAD están localizados en locisin identificar (3).Recientemente se ha publicado la base genética de la hipercolesterolemia autosómica recesiva(ARH) (4). Se trata de una enfermedad que cursa con hipercolesterolemia, a veces difícil dedistinguir de la propia HF. La ARH es debida a mutaciones en el gen que codifica una proteínadenominada por extensión ARH. La estructura de esta proteína se desconoce, pero un análisisdetallado de su secuencia sugiere que el gen ARH podría codificar una proteína citoplasmáticacuya principal característica es un dominio PTB de unión a fosfotirosina. PTB es un dominiocaracterístico de numerosas proteínas adaptadoras que interacciona con secuencias consensoNPXY, presentes en los dominios citoplasmáticos de receptores de la superficie celular, entre losque se encuentra el propio r-LDL, así como los receptores de insulina , EGF, TrkA etc. La proteína

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Antecedentes

ARH podría por tanto jugar un papel importante en la inducción de la expresión génica iniciada porla unión de apoE al r- LDL.Clínicamente, la HF se caracteriza por concentraciones muy elevadas de colesterol total ycolesterol en LDL (c-LDL) presentes desde el nacimiento, que afecta al menos a la mitad de losmiembros de una familia, tanto a varones como a mujeres. La exploración física puede mostrardepósitos de colesterol en los tendones (Xantomas) y en el ojo (Arco Corneal). Tiene un elevadoriesgo de desarrollar enfermedad cardiovascular (ECV) prematura, especialmente coronaria. Secalcula que el 75% de los varones y el 50% de las mujeres con HF sin tratar, sufren un eventocoronario antes de los 60 años. Por lo tanto, la HF acorta la esperanza de vida de 20 a 30 añosrespecto a la población general (5). Según los datos del Registro Español de HF, el 55% de losvarones y el 22% de las mujeres con HF incluídos en el mismo, han desarrollado algunamanifestación de ECV antes de los 60 años (6)

Diagnóstico de la HFLa gran variabilidad interindividual de la HF hace que el diagnóstico basado en las concentracionesde colesterol total o c-LDL no permita realizar una identificación inequívoca de estos pacientes. Unestudio reciente ha demostrado que el error diagnóstico al utilizar las concentraciones de c-LDL escercano al 30%, por lo que se sugiere que ante la sospecha clínica, hay que realizar un análisisgenético (7).Los metodos de diagnóstico basados en el análisis del gen son los métodos recomendados por laOMS en el programa MedPed (Make Early Diagnosis to Prevent Early Deaths in MEDicalPEDigrees) para la búsqueda de pacientes con HF (8). Sin embargo, estos métodos presentantambién una serie de inconvenientes debido a : 1) la gran heterogeneidad de las mutaciones, ya quese conocen más de 700 distintas, y la mutación responsable de la HF en una determinada familiapuede ser cualquiera de las descritas o alguna nueva autóctona de la zona, país o raza, y 2) el grantamaño del gen (45 Kb), ya que la mutación puede estar localizada en cualquier sitio del mismo oser cualquiera de los diferentes tipos.Gracias a los avances de la biología molecular hoy en día es posible abordar el diagnóstico de laHF mediante estas técnicas de polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP) oelectroforesis en geles con gradiente desnaturalizante (DGGE) que permite detectar cambiospequeños en la secuencia del DNA, de hasta una base pero tienen el inconveniente que son muylaboriosas y difíciles de aplicar al diagnóstico rutinario. Por otra parte, estas técnica no permiten ladetección de grandes deleciones o inserciones, determinación que requiere del uso de la técnica deSouthern o la realización de PCR largas. Además las técnicas de SSCP o DGGE requieren de unasecuenciación posterior para la caracterización de la mutación.En la actualidad se están desarrollando “biochips”, diseñados para detectar mutaciones de formarápida y sencilla. Sin embargo, también para la fabricación de un “biochip” es necesario disponerde la información previa del número y características de las mutaciones que se quiere determinarasí como de la tecnología y herramientas apropiadas. Hasta el momento no está disponible ningúnbiochip para el diagnóstico genético de la HF.

Actualmente, el grupo proponente de este proyecto dispone desde 1999 de un Registro Español deHF (propiedad de la Fundación Hipercolesterolemia Familiar) en el cual participan hasta estemomento 72 clínicas de lípidos del Sistema Nacional de Salud de todo el país. Este registro estáaprobado y registrado en la Agencia Nacional de Protección de Datos Informáticos LORTAD (Nºde Registro: 1982050017). Hasta la fecha, se han recibido los datos clínicos y muestras biológicasde 2050 pacientes (un caso por familia) con diagnóstico clínico de HF y se ha procedido a laidentificación de las mutaciones en el gen del r-LDL. En España, se han identificado 120mutaciones distintas en el gen del r-LDL, una mutación en el gen de la apo B-100 (R3500Q) y otra


Antecedentes

en el gen de apo E que están asociadas con HAD (9).

Factores que influyen sobre el curso de la HF y son responsables de la gran variabilidad enlas manifestaciones clínicas.

1.- Variabilidad fenotipica de la HF debida a la mutación del r-LDLNumerosos estudios han demostrado que la concentración de c-LDL “per se” es un factordeterminante para el fenotipo de la HF. Se han observado diferencias significativas en cuanto aexpresión fenotípica y respuesta a tratamiento hipolipemiante entre los sujetos afectados de HF condiferente tipo de mutación en el r-LDL (10). Un hecho importante a la hora de explicar lavariabilidad fenotipica de la HF asi como la respuesta individual al tratamiento con inhibidores dela HMGCoA reductasa en la HF es la actividad residual de la proteina mutada del r-LDL. Lamutaciones en el gen del r-LDL que dan lugar a la HF pueden afectar de distinta forma a laactividad del receptor. Estas mutaciones que causan HF se subdividen en 5 clases principales endependencia que afecten a la síntesis de la proteína (Clase 1), al transporte del receptor desde elretículo endoplásmico hasta el aparato de Golgi (Clase 2), a la unión de la partículas lipoprotéicas(Clase 3), a la formación de la vesícula endocítica (Clase 4), o al reciclado del receptor (Clase 5)(1). Por lo tanto, no es de extrañar que en dependencia del tipo de mutación heredada se produzcauna expresión fenotípica y un grado de respuesta al tratamiento hipolipemiante diferentes, quedependerá del efecto del alelo no defectuoso y de la actividad residual del alelo defectuoso. Porotra parte, el riesgo de ECV varia de forma considerable entre los diferentes tipos de mutación,siendo los portadores de alelos nulos los que presentan un mayor riesgo cardiovascular quedeterminados tipos de mutación de cambio de aminoácido o en pauta de lectura que poseen unaimportante actividad residual (10).Para el control de la hipercolesterolemia se persigue la estimulación de la actividad del r-LDL.Habitualmente esto se consigue administrando estatinas, inhibidores de la hidroximetilglutarilcoenzima A reductasa. Como respuesta a la reducción en la cantidad de colesterol en el retículoendoplásmico que ello produce, se activa SREBP, el cual estimula la transcripción de, entre otros,el gen del receptor de LDL (11). En ciertos pacientes, por razones aún desconocidas la respuesta alas estatinas no es suficientemente eficaz (10). El incremento de la dosis de estos fármacos paramejorar la respuesta puede comprometer la disponibilidad de mevalonato que, como precursor deubiquinona, dolicol, farnesol y geranilgeraniol, además de colesterol, es esencial para múltiplesfunciones celulares. Por ello, es importante profundizar en el conocimiento de otras vías deestimulación del receptor de LDL.

2.-Variabilidad debida a otros factores genéticosAparte del c-LDL, se piensa que otros aspectos del metabolismo lipídico pueden ejercer unimpacto importante sobre el fenotipo de la HF. El nivel de colesterol tranportado por las LDLdepende además de la funcionalidad de proteinas tales como la apo B100, proteinas de transporteimplicadas en la absorción intestinal y en la excreción hepática de colesterol en la bilis(ABCG5/ABCG8) y de la ARH, proteína estabilizadora del receptor LDL. La caracterización deidentificación de los mecanismos de regulación del colesterol plasmático serían de gran utilidadpara el diagnóstico y manejo clínico de pacientes con HAD.La concentración de colesterol en la población general es el resultado de complejas interaccionesentre el ambiente y múltiples genes, y es probable que lo mismo ocurra en los sujetos con HF,aunque con menor intensidad dado el efecto importante del locus del r-LDL. Sin embargo, encuanto al riesgo de ECV es probable que dado el elevado riesgo que poseen estos pacientes debidoa su elevado c-LDL, el efecto adicional de otros genes pueda ser mucho mas pronunciado que elobservado en la población general (10). Entre estos genes candidatos estan los implicados en el


Antecedentes

metabolismo lipídico y energético ABPs (muscular, cardiaca, adipocítica e intestinal) CEPT,LCAT, MTP, Apolipoproteínas (AI-II, B, CI-IV, D, E), PON1 y PON2, PPARs (alfa y gamma),ABCs (A1, C6, G1, G5 y G8), UCPs.Por otra parte, el reciente progreso de la genómica funcional está permitiendo desentrañar las basesgenéticas de enfermedades de etiología compleja. Este es muy probablemente el caso de ladiferente expresión de la ECV en estos pacientes. Las técnicas genómicas de screening de amplioespectro, como son los microarrays de cDNA, pueden permitir la identificación de genesimplicados en el riesgo, la susceptibilidad y la patogenia de la ECV. Así mismo, estos estudiosproporcionan la posibilidad de conocer cómo se asocian determinados patrones de expresión génicacon el grado de respuesta al tratamiento. Actualmente se está proponiendo la utilización demuestras de sangre, dada su accesibilidad, para los estudios sistemáticos de genética funcional endiversas enfermedades humanas, entre ellas la HF.

Expresión diferencial de proteínas en Hipercolesterolemias genéticas.La hipercolesterolemia modifica profundamente la biología de la pared vascular, y provocaalteraciones significativas en los niveles séricos de diferentes moléculas. La evolución ymanifestaciones clínicas de la aterosclerosis son muy variadas tanto en la población general comoentre los pacientes con hipercolesterolemia familiar y/o hipercolesterolemia familiar combinada enparticular que presentan hipercolesterolémia y/o hipertrigliceridémia. Actualmente es ya evidenteque más allá del postulado un gen=una proteína, defectos que afectan a un solo gen puedentraducirse en alteraciones de múltiples proteínas. La proteómica como ciencia emergente aportaun abordaje especialmente interesante en patologías multigénicas, como las enfermedadesvasculares, en las que se produce una compleja interacción entre factores genéticos y ambientales.Actualmente sólo se conoce un reducido número de proteínas del plasma que además nocaracterizan suficientemente la fisiopatología de los procesos asociados a la enfermedad ni tienenvalor predictivo sobre su evolución

3.- Factores ambientales que influyen sobre la variabilidadEl profundo trastorno metabólico existente en estos pacientes hace que la hipercolesterolemia seasu factor de riesgo fundamental. Por ello el tratamiento farmacológico hipolipemiante es hoy el ejeprincipal de su manejo. Sin embargo, datos del Registro Español muestran que factoresnutricionales, como es el sobrepeso, pueden ser claves como predictores de un mayor riesgo. Porello la alimentación saludable puede ser un elemento clave en su manejo. Existen dos hechosfundamentales en torno al efecto preventivo de la dieta: la gran variabilidad de la respuestaindividual y un nuevo paradigma, el que los nutrientes ejercen múltiples efectos biológicos, quevan más allá de su beneficio sobre el colesterol.El primer aspecto se enmarca dentro de la variabilidad dependiente de la interacción genético-ambiental en la expresión del colesterol plasmático, escasamente conocido en los pacientes con HF.Uno de los factores genéticos, sobre el que se está centrando el interés, es el de las variantes en losgenes de los transportadores ABCG5 y ABCG8. Ambos se han implicado en la absorción de losesteroles de la dieta y en la regulación del transporte lipídico intracelular(12, 13).Con respecto a los efectos pleiotrópicos de los nutrientes, es importante conocer si estos pacientesse benefician de una dieta sana (tipo mediterránea), no sólo por su efecto sobre el colesterol sinopor su potencial efecto sobre otras variables predictivas, relacionadas con la dieta. Entre ellas seincluyen, el tamaño de la LDL, la oxidación de lipoproteinas, el metabolismo postprandial detriglicéridos y factores hemostáticos.Se han propuesto distintos factores adicionales que condicionan el riesgo cardiovascular, entre ellosla homocisteína (14). Así, el exceso de homocisteína es un factor de riesgo cardiovascularindependiente y tiene un efecto sinérgico con otros factores aterogénicos. La homocisteína favorece


Antecedentes

la lipoperoxidación y la trombosis e influye en los mecanismos que regulan la biosíntesis decolesterol. Las concentraciones homocisteína dependen de la ingesta de metionina, de la actividadde las enzimas que intervienen en su metabolismo y de las vitaminas que actúan como cofactores(ácido fólico, cobalamina y piridoxina). Se han identificado distintas variantes de los genes quecodifican para estos enzimas relacionadas con concentraciones elevadas de homocisteína. Una delas más frecuentes es la mutación C677T del gen de la MTHFR, que se presenta con carácterhomocigoto en un 13 % de la población general.

HIPERLIPEMIA FAMILIAR COMBINADA (HFC)

Características clínicas y bioquímicasLa HFC es una enfermedad frecuente. Se calcula que la padece el 1-2% de la población y aunqueno hay datos específicos sobre España, esto supondría en nuestro país entre 400.000 y 800.000afectados. La HFC presenta una herencia compleja y practicamente desconocida y que confiere unagran riesgo aterotrombótico (alrededor de un 30% de pacientes con infarto agudo de miocardio lapadecen) (15). El diagnóstico de la HFC también es complejo por cuanto el paciente puedepresentar diversos fenotipos hiperlipémicos (IIa, IIB y IV) a lo largo del tiempo y se necesitandatos clínicos y bioquímicos no sólo del paciente sino de los familiares para establecer eldiagnóstico (ya que uno de los criterios diagnósticos es la presencia en éstos de un fenotipohiperlipémico diferente al del paciente). Aunque clasicamente se consideraba que la enfermedad nose manifiesta hasta los 20 años, hasta un 40% de los niños de estas familias presenta alteracioneslipídicas (16). Por otra parte, y también recientemente, diversos estudios han cuestionado laeficacia del uso de los criterios lipídicos clásicos (colesterol y triglicéridos) para distinguir entreafectos y no afectos en familias con HFC, ya que el error podría llegar a ser del 40% (15). Estosestudios han sugerido que se podría clasificar mejor a los sujetos afectos añadiendo a ladeterminación de triglicéridos, las de apoB y el tamaño de las partículas de LDL (15,17). Eltratamiento de la HFC también presenta dificultades derivadas del riesgo de tratar a la vez confibratos y estatinas la hipertrigliceridemia y la hipercolesterolemia (respectivamente) o de irvariando estos fármacos en función del fenotipo hiperlipémico que en ese momento presente elpaciente.

FisiopatologíaLa característica fisiopatológica fundamental de la HFC es la sobreproducción de VLDL (15). Estaparece ser consecuencia de una sobreproducción de apoB hepática como respuesta a una mayorllegadoa de ácidos grasos libres al hígado en ayunas (por falta de retención de los mismos a nivelde tejido adiposo) y/o en período postprandial (por defecto de captación de los mismos por el tejidoadiposo) (18).Se han descrito como alteraciones frecuentes asocidas a la HFC el enlentecimientodel catabolismo de quilomicrones y la insulino-resistencia (19,20).

GenéticaLos “scans” genómicos realizados en familias con la enfermedad de diferentes paises han dadoresultados poco consistentes, con la excepción parcial de las señales que proceden del cromosoma1q21-23 (21,22), en las cercanías de donde se encuentra el gen de la apolipoproteína A-II. Resultaespecialmente relevante que el animal modificado genéticamente por sobreexpresar esta proteínapresente las características propias de la HFC (23). En conjunto, estos estudios demuestran que estaenfermedad no es de herencia autosómica dominante, sino oligogénica. Es posible que los erroresde diagnóstico bioquímico y clínico sean responsables en parte de los resultados modestosobtenidos en la búsqueda sistemática de los genes causantes de HFC.


Antecedentes

Tratamiento de las Hiperlipemias Genéticas.

El tratamiento modifica profundamente el fenotipo clínico de las hiperlipemias genéticas. Laintroducción de los inhibidores de la hidroxy metil glutaryl coenzimo A reductasa (estatinas) harevolucionado el tratamiento de las hiperlipemias genéticas, especialmente de la HF. El impactoclínico de las estatinas fue confirmado en una cohorte de pacientes con HF. El riesgo relativo parala mortalidad coronaria disminuyó a partir de 1992, y fue especialmente manifiesto en el grupo deedad másjóven (de 20 a 59 años) (24).Además, el tratamiento con estatinas tiene otros efectosbeneficiosos en la hipercolesterolemia familiar. Un estudio reciente ha demostrado un efectobeneficioso en el tratamiento con estatinas a largo plazo sobre la función endotelial de pacientescon HF (25). Estos hallazgos enfatizan la importancia del tratamiento con estatinas en los pacientescon hipercolesterolemia familiar. Sin embargo, la respuesta al tratamiento farmacológico nosiempre es homogénea. Esto se puede deber en parte a las diferentes mutaciones en el gen del r-LDL, explicándo la disminución de la eficacia en los portadores de mutaciones más severas. Portanto, se necesitan estudios amplios en los que se analice el efecto del tratamiento en función deldefecto genético tanto a nivel individual como familiar.

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Bibliografía más relevante

1.- Goldstein, J. L., H. H. Hobbs, and M. S. Brown. 2001.Familial hypercholesterolemia. In: Themetabolic and molecular basis of inherited disease. C.R. Scriver, A.L. Beaudet, W.S. Sly, and D.Valle, editors. McGraw-Hill, New York. Vol. II, Chapter: 120: 2863-2913.

Se trata de un capítulo publicado uno de los libros de mayor prestigio sobre enfermedadeshereditarias que abarca desde la fisiopatologia, genética, diagnóstico y tratamiento de la HFpublicado por tres autores que son probablemente los que tengan un mayor conocimiento de la HF,dos de ellos Goldstein y Brown, fueron galardonados con el premio Nobel por sus trabajos sobre laHF.

2.- Innerarity TL, Weisgraber KH, Arnold KS. Mahley RW, Krauss RM, Vega GL, Grundy SM.Familial defective apolipoprotein B-100: low density lipoproteins with abnormal receptor binding.Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84: 6919-6923.

Estos autores fueron los primeros en observar que determinado pacientes con hipercolesterolemiasautosómicas dominantes tenian los r-LDL funcionales y que sus LDL tenían una capacidaddisminuida de unión a lor r-LDL, lo cual era sugestivo de que exitía un defecto genetico nolocalizado en el locus del gen r-LDL

3.- Varret M, Rabès J.P, Saint-Jore B, Cenarro A, Marioni J.C, Civeira F, et al. A third major locusfor autosomal hypercholesterolemia maps to 1p34.1-p32. Am J Hum Genet 1999; 64: 1378-1387

En este artículo del que son autores tres miembros del equipo investigador del presente proyectodemostramos que aparte de la HF cuyo defecto se encuentra localizado en el gen del r-LDL,cromosoma 19, y de la apo B defectuosa familiar (defecto en el gen de la apo B, cromosoma 2),hay otros loci genéticos que están implicados en la expresión de hipercolesterolemias detransmisión autosómicas dominantes, uno de ellos esta situado en cromosoma 1 región p34.1-p32

4.- Garcia CK, Wilund K, Arca M, Zuliani G, Fellin R, Maioli M, Calandra S,Bertolini S, Cossu F,Grishin N, Barnes R, Cohen JC, Hobbs HH. Autosomal recessive hypercholesterolemia caused bymutations in a putative LDL receptor adaptor protein. Science 2001;292: 1394-8.

Mapeo del locus ARH y descripción de las principales mutaciones que generan hipercolesterolemiaautosómica recesiva encontradas hasta la fecha.

5.- Familial Hypercholesterolemia (FH). Report of a World Health Organization Study Group.Human genetics Programme. Geneva, 1998.

6.- Alonso R, Castillo S, Civeira F, Puzo J, de la Cruz, Pocovi M, Mata M. Hipercolesterolemiafamiliar heterocigota en España. Estudio descriptivo de 819 Casos no relacionados. Med Clin(Barc) 2002; 118 :487-492



Se trata de un articulo de publicado por miembros del Equipo Investigdor en donde se analizan lascaracterísticas clínicas de la HF en un amplio grupo de pacientes no relacionados correspondientesal Registro Español de HF.

7.- Umans-Eckenhausen MAW, Defesche JC, Sijbrands EJG, Scheerder RLJM, Kastelein JJP.Review of first 5 years of screening for familial hypercholesterolemia in the Netherlands. Lancet2001; 357: 165-168

En este artículo los utores cuesionan en base de sus resultados el error (diagnóstico equivocado)que se comete utilizando como criterio de diagnóstico de HF la determinación de CT o c-LDL enplasma incluso en familias en las que previamente se sabe que hay un paciente con HF pordiagnóstico genético.

8.- WHO. Human Genetics Program. Familial Hypercholesterolaemia, a global perspective.Ginebra: WHO 1999

Se trata de un informe auspiciado por la Organización Mundial de la Salud dosnde se analiza laproblematica de la HF en su programa MedPed (Make Early Diagnosis-Prevent Early Deaths inMEDical PEDigrees) abordando temas tan diversos que abarcan desde el diagnóstico a la calidadde vida de los pacientes con HF

9.- Mata P, Alonso R, Castillo S, Pocovi M, MedPed and the Spanish FamilialHypercholesterolemia Foundation. Atherosclerosis 2002; Suppl 3: 9-11

En este artículo se presentan las caracteristicas de la Red de unidades de lípidos, de la forma defuncionamiento de Grupo Español del estudio dela HF y los tipos de mutaciones encontradas.

10.-Jansen ACM, van Wissen S, Defesche, JC, Kastelein JJP. Phenotypic variability in familialhypercholesterolemia: an update. Curr Opin Lipidol 2002;13:165-171

Se trata de un articulo de revisión publicado recientemente donde se analizan la variabilidad delfenotipo de la HF y los posibles factores que intervienen.

11.- Edwards PA, Tabor D, Kast HR, Venkateswaran A. Regulation of gene expression by SREBPand SCAP. Biochim Biophys Acta 2000; 1529: 103-113.

Este artículo discute como se regula la expresión por las proteinas que se unen a loselementos derespuesta a esteroles entre ellos el del promotor del gen del r-LDL

12- Berge KE, Tian H, Graf GA, Yu L, Grishin NV, Schultz J et al. Accumulation of dietarycholestgerol in sitosterolemia caused by mutations in adjacent ABC transporters. Science 2000;290: 1771-1775

13.- Allayee H, Bryan A, Lusis AJ. An absorbing study of cholesterol. Science 2000; 290:1709-11.

Las dos referencias anteriores se corresponden al descubrimiento de los transportadores ABCG5 y



ABCG8 y su implicación en el transporte intestinal y hepático de esteroles. La segunda referenciaes la editorial del citado articulo en la que se resalta la importancia de estos dos genes en lavariabilidad del colesterol en la población y no solo en casos raros de sitosterolemia.

14.-Tonstad S, Refsum H, Ueland PM. Association between plasma total homocysteine andparental history of cardiovascular disease in children with familial hypercholesterolemia.Circulation 1997;96:1803-8

Los autores observan que los niños conHF que tienen mas elevada la homocisteina plasmaticaproceden de familias con una mayor agregación de enfermedad coronaria.

15.- Veerkamp MJ, de Graaf J, Bredie SJH, Hendriks JCM, Demacker PNM, Stalenhoef AFH.Diagnosis of familial combined hyperlipidemia based on lipid phenotype expression in 32 families.Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 2002; 22: 274-282.

Los autores demuestran que tras una reevaluación de 32 familias con HFC, tras cinco años de unprimer estudio, la clasificación en afectos y no afectos es menos consistente de lo esperado ydeseable. El 26% de los considerados afectos no lo serían según el segundo análisis, mientras queun 14% de no afectos en elprimero pasarían a serlo en el segundo. Si a los criterios lipídicosutilizados (colesterol y triglicéridos mayores del percentil 90) se les añade la concentración deapoB y el tamaño de partículas de LDL, la consistencia del diagnóstico HFC en el tiempo aumentanotablemente.

16.-Ribalta J, La Ville AE, Plana N, Masana L. Hiperlipemia familiar combinada: detección ycaracterización del fenotipo hiperlipémico en niños y adolescentes. Medicina Clínica 1997; 109:161-164.

Trabajo de miembros del grupo investigador que demuestra que, en contra de la opinióngeneralizada previa, el 43% de los hijos de familias con HFC presentan hiperlipemia antes de los20 años.

17.-Sniderman AD, Castro Cabezas M, Ribalta J, Carmena R, de Bruin TWA, de Graaf J, ErkelensDW, Humphries SE, Masana L, Real JT, Talmud P, Taskinen MR. A proposal to redefine familialcombined hyperlipidemia. European Journal of Clinical Investigation 2002; 32: 71-73.

Los autores reunidos en un simposium internacional sugieren la necesidad de redefinir la HFCcomo una enfermedad caracterizada fundamentalmente por el aumento de la concentraciónplasmática de triglicéridos y de apoB.

18.- Arner P. Is familial combined hyperlipidemia a genetic disorder of adipose tissue?. CurrentOpinion in Lipidology 1997; 8: 89-94

Propuesta de que el defecto fisiopatológico fundamental de la HFC se encuentra a nivel del tejidoadiposo, bien por deficiencia de captación de ácidos grasos libres por los adipocitos durante elperíodo postprandial, bien por su deficiente retención en ayunas. En cualquiera de los casos, seoriginaría un aumento del flujo de ácidos grasos libres al hígado, que incrementa la síntesis ysecreción de VLDL por este órgano.



19.-Ascaso JF, Real JT, Merchante A, Rodrigo A, Carmena R. Lipoprotein phenotype and insulinresistance in familial combined hyperlipidemia. Metabolism 2000; 49: 1627-31.

Demostración, por miembros del grupo investigador, que la insulino-resistencia acompaña acualquiera de los tres fenotipos hiperlipémicos que puede presentar la HFC y que ello puede haceraconsejable el tratamiento simultáneo de la misma con el de la hiperlipemia.

20.- Meijssen S, Castro Cabezas M, Twickler TB, Jansen H, Erkelens DW. In vivo evidence ofdefective postprandial and postabsortive free fatty acid metabolism in familial combinedhyperlipidemia. Journal of Lipid Research 2000; 41: 1096-1102.

Demostración de que existe un incremento notable de triglicéridos y ácidos grasos libres en elperíodo postprandial de pacientes con HFC. Ello es una demostración de una de las hipótesis deArner (ref. número 17) si bien el número de pacientes estudiado es pequeño.

21.- Pajukanta P, Nuotio I, Terwilliger JD, Porkka KVK, Ylialo K, Pihlajamäki J, Suolalainen AJ,et al. Linkage of familial combined hyperlipidemia to chromosome 1q21-q23. Nature Genetics1998; 18: 369-372.

Primera demostración en familias con HFC finlandesas (de una alta homogeneidad étnica ycultural) de que existe un locus en el cromosoma 1q21-q23 (cerca de donde se encuentra el gen dela apoA-II) que se asocia con la enfermedad. Pese a ello, resulta evidente de que el LOD scoreobtenido demuestra que la HFC no es, como se pensaba, autosómica dominante sino oligogénica.

22.-Myers RH, Borecki IB, Arnett DK, Hunt SC, Province MA, Djousse L, Leppert MF.Replication of linkage of familial combined hyperlipidemia to chormosome 1q with additionalheterogenous effect of apolipoprotein A-I/C-III/A-IV locus. Arteriosclerosis Thrombosis andVascular Biology 2000; 20: 2275-2280

Los resultados del estudio anterior se han reproducido en la mayoría de estudios efectuados enotros países como en USA (este estudio), China, Alemania y Reino Unido.

23.-Escolà-Gil JC, Julve J, Marzal-Casacuberta À, Ordóñez-Llanos J, González-Sastre F, Blanco-Vaca F. Expression of human apolipoprotein A-II in apolipoprotein E-deficient mice inducesfeatures of familial combined hyperlipidemia. Journal of Lipid Research 2000; 41: 1328-1338.

Demostración de que los ratones transgénicos de apoA-II poseen todas las característicasBioquímicas y fisiopatológicas para ser considerados un buen modelo animal de HFC.

24.- Mortality in treated heterozygous familial hypercholesterolemia: implications for clinicalmanagement. Scientific Steering Committee on behalf of teh Simon Broome Register Group.Atherosclerosis 1999; 142:105-112.



25.- Alonso R, Mata P, De Andrés R, et al. Sustained long-term improvement of arterialendothelial function in heterozygous familial hypercholesterolemia patients treated withsimvastatin. Atherosclerosis 2001; 157:423-429.

Por primera vez, el efecto de un tratamiento a largo plazo con estatinas es estudiado en pacientescon HF. No solo el efecto hipolipemiante explican el efecto beneficioso encontrado sobre lafunción endotelial.

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Hipótesis


Hipótesis

HIPERCOLESTEROLEMIA FAMILIAR.1. Aunque la HF es un trastorno monogénico, la expresión fenotípica en términos de

comienzo y severidad de la enfermedad aterosclérotica, varía considerablemente. El tipode mutación puede explicar en parte la variabilidad en la expresión fenotípica de la HF.También, la presentación clínica de la HF difiere sustancialmente, incluso entre sujetos de lamisma familia que comparten el mismo defecto genético. La influencia de factores ambientalescomo la dieta, el tabaco, el sobrepeso y el ejercicio físico pueden ser muy importantes en laexpresión fenotípica de la HF. Otros factores genéticos y metabólicos emergentes puedentambién afectar la expresión clínica de la HF. El tamaño de la partícula de LDL, losremanentes de lipoproteinas ricas en triglicéridos, los niveles de Lp(a), la proteína C reactiva ,la homocisteína, y determinados polimorfismos de genes implicados en el metabolismo lipídicocomo lipoprotein lipasa, apolipoproteina E, proteína transferidora de ésteres de colesterol y laparaxonasa, son algunos de los factores propuestos para explicar el desarrollo de enfermedadcardiovascular en la HF. Sin embargo, el papel de muchos de estos factores necesita ser biendefinido y para esto es preciso disponer de una población numerosa. Por otra parte, ladetección de la aterosclerosis preclínica mediante la medición del engrosamiento carotídeo,junto con la caracterización de otros factores de riesgo clásicos y emergentes, pueden ayudar apredecir el riesgo cardiovacular de esta población tanto a nivel individual como familiar.

Por tanto, la hipercolesterolemia familiar es un excelente modelo para los estudios futuros de interacciones complejas entre genes y entre genes y ambiente.

2. La caracterización genética y la utilización de las modernas técnicas de genómica yproteómica aplicadas a los pacientes con HF, pueden aportar avances significativos en elmejor conocimiento de la HF. El descubrimiento de las mutaciones en el gen del receptorLDL en España, va a permitir el desarrollo de un biochip para el diagnóstico rápido de la HF yayudará a diseñar nuevas estrategias terapéuticas. El descubrimiento de otros genes implicadosen la etiología de las hipercolesterolemias familiares, permitirá un mejor conocimiento delmetabolismo lipídico y ayudará en el diseño de nuevas herramientas diagnósticas y en eldiseño de nuevos tratamientos. La determinación cuantitativa de nuevas proteínas séricas enpacientes con HF con o sin presencia de enfermedad cardiovascular, permitirá identificarnuevos biomarcadores de riesgo cardiovascular, así como nuevas dianas terapéuticas.


Hipótesis

HIPERLIPEMIA FAMILIAR COMBINADA

3. Existen deficiencias importantes en el diagnóstico clínico y bioquímico de la HiperlipemiaFamiliar Combinada y existen métodos asequibles para subsanar estas deficiencias. Enconcreto, al distinción de afectos y no afectos con HFC es mejorable incorporando lasdeterminaciones de apolipoproteina B y el tamaño de las partículas de LDL. Los estudiosgenéticos a realizar también serán analizados comparando los dos criterios bioquímicos deidentificación de afectos (el clásico y el que incorpora a la apolipoproteina B y el tamaño deLDL.

4. La aplicación de las modernas técnicas de la genómica y la proteómica aplicadas tanto apacientes con HFC como a modelos animales de la enfermedad pueden aportar avancessignificativos en la investigación de la HFC. Una aproximación de gran interés es ladeterminación cuantitativa de la expresión global de genes (bien a RNAm o a proteínas) entejido de pacientes o modelos animales, por cuanto puede servir de gran ayuda para definir losmecanisoms moleculares implicados en el desarrollo de la HFC y también para la búsqueda degenes causantes de HFC (al buscar por ejemplo, coincidencias entre genes de expresiónsuprimidas en tejidos – por ejempo el adiposo – y cuya localización cromosómica coincide conla que ha originado señales significativas en los scans cromosómicos realizados en familias conHFC). En particular se hiptetiza que existen genes/proteínas (como la apolipoproteina A-II, quese encuentra en el cromosoma 1q21-23) cuya variabilidad está involucrada en el origen y/odesarrollo de la enfermedad.

5. Es posible deteminar que pacientes con HFC tienen mayor riesgo cardiovascular y paraello es necesario caracterizar los factores de riesgo, losmecanismos por los que actuan ytratarlos siempre que sea posible. La ecografía carotídea constituye un medio para valorar elgrado de progresión de la aterosclerosis, es posible y necesario valorar el resto de factores deriesgo cardiovascular (clásicos y emergentes, genéticos y ambientales) y tratarlos siempre quesea posible. Se restará especial atención a los factores que conducen a este aumento de riesgocoom la resistencia a la insulina, la hiperhomocisteinemia y el incremento del estrés oxidativo,y el efecto del tratamiento intensivo de estos factores de riesgo debería traducirse en unadisminución de la placa carotídea valorable mediante ecografís. Se hipotetiza que puedepredecirse la respuesta al tratamiento en términos de la aterosclerosis carotídea en función de lavariación de la expresión de genes de macrófagos antes y después del tratamiento(Farmacogenética).

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Objetivos

El Proyecto estudiará desde un punto de vista multidisciplinario e integrado las hiperlipemiasgenéticas en España en el marco de la estrategia prioritaria de prevención de las enfermedadescardiovasculares. El objetivo final es avanzar en el conocimientogenético, metabólico, manejoclínico y terapéutico, así como en la epidemiología de las hiperlipemias hereditarias en España, conel fin conseguir un mejor diagnóstico y tratamiento de estos pacientes.Los objetivos se presentan como específicos para la Hipercolesterolemia Familiar y para laHiperlipemia Familiar Combinada.

A.- HIPERCOLESTEROLEMIA FAMILIAR

1. Desarrollar un programa de seguimiento y evaluación periódica a largo plazo de familiascon diagnóstico genético de Hipercolesterolemia Familiar heterocigota (HFh), y determinar laincidencia y recurrencia de enfermedad cardiovascular en España. Se utilizará y ampliará elRegistro Español de HFh y la red de Unidades de Lípidos que colaboran con la FundaciónHipercolesterolemia Familiar.1.a) En un subgrupo, se estudiará la presencia de aterosclerosis preclínica (grosor de la íntimacarotidea) mediante métodos no invasivos, y se analizará su relación con el defecto genético,otros factores de riesgo aterogénicos y el efecto del tratamiento con fármacos hipolipemiantes.1.b) Así mismo, en un subgrupo de pacientes, se evaluará la capacidad cognitiva y su relacióncon la enfermedad cardiovascular, la presencia de otros factores de riesgo y el efecto deltratamiento farmacológico.1.c) Se desarrollarán ecuaciones predictivas de riesgo cardiovascular de acuerdo con lainteracción entre genes y factores ambientales, tanto a nivel individual como familiar.1.d) Se analizará la eficacia y los determinantes clínicos, bioquímicos y genéticos de larespuesta al tratamiento médico (dieta y fármacos), y en un subgrupo de pacientes con HFh seanalizará la expresión de genes de monocitos/macrófagos antes y después del tratamiento confármacos hipolipemiantes.

2. Conocer la interacción del tipo de mutación en el gen del receptor LDL con otros factores deriesgo aterogénicos (clásicos y emergentes) de origen metabólico y genético y su influencia enla expresión fenotípica de la HFh.2.a) Estudiar el papel de una alimentación mediterránea en la expresión clínica de la HFh, yevaluar la relación entre el perfil de ácidos grasos en plasma y en lipoproteinas con eldesarrollo de enfermedad cardiovascular.2.b) En un subgrupo de pacientes con HFh, se analizará el metabolismo lipoproteicopostprandial y su influencia sobre mecanismos trombogénicos.2.c) En un subgrupo, se estudiará la interacción entre la ingesta de colesterol y las variantesgenéticas en los transportadores de colesterol ABCG5 y ABCG8, y su influencia en lasconcentraciones de colesterol en plasma2.d) Valorar el estado oxidativo y el papel predictivo de otros factores de riesgo emergentescomo la proteína C reactiva, la homocisteína, y polimorfismos genéticos en el desarrollo de la


Objetivos

enfermedad cardiovascular en pacientes con HFh.2.e) Estudiar la interacción entre la mutación en el gen del receptor LDL y otros genes en laexpresión fenotípica de la HFh

3. Se identificarán nuevos loci asociados con hipercolesterolemia de transmisión autosómicadominante del Registro Español de HF, en aquellos sujetos en los cuales se ha descartado laexistencia de mutaciones en el gen del receptor LDL y apo B 100.

4. Se caracterizarán funcionalmente las mutaciones del gen del receptor LDL, apo B 100 y de losnuevos loci identificados que se asocian a Hipercolesterolemia autosómica dominante

5. Identificar la presencia de biomarcadores y dianas terapéuticas a partir del análisis de lospatrones proteicos séricos de pacientes con hiperlipemias genéticas. Asimismo, se analizará laexpresión y/o contenido de las proteínas identificadas en lesiones ateroscleróticas de la paredvascular en distintos estadios evolutivos.

6. Desarrollo de microarrays de expresión de genes relevantes en el metabolismo lipídico, yestudio de la expresión diferencial de los mencionados genes en sangre y célulasmononucleares de pacientes con hiperlipemias genéticas.

7. Desarrollar y evaluar un programa educativo dirigido a pacientes afectos de HFh y a todos susfamiliares, tanto afectos como no afectos.

HIPERLIPEMIA FAMIILAR COMBINADA

1) Crear un registro de pacientes y familias con HFC en España utilizando la Red de Unidades deLípidos que colaboran con la Fundación Hipercolesterolemia Familiar. Simultaneamente, secreará un banco de muestras de ADN y sueros.

2) Avanzar y validar los criterios diagnósticos de la HFC. Se comparará las determinacionesclásicas (colesterol, triglicéridos y perfil lipoproteico) y las recientemente propuestas (apoB,triglicéridos y fenotipo de LDL).

3) Determinar el riesgo cardiovascular de los pacientes con HFC, sus predictores y el efecto deltratamiento médico tanto a nivel ecográfico, bioquímico, genético (Farmacogenética) y clínico3.a) En un subgrupo, se valorará la aterosclerosis preclínica (grosor de la íntima carotídea) y surelación con factores de riesgo clásicos y emergentes (homocisteína, proteína C reactiva,polimorfismos genéticos que confieren riesgo cardiovascular, como por ej. los relacionados conla insulino-resistencia y los sistemas antioxidantes).3.b) se analizará la eficacia y los determinantes clínicos y bioquímicos de la respuesta altratamiento médico (dieta, fármacos) y en un subgrupo de pacientes con HFC se analizará laexpresión de genes de monocitos/macrófagos antes y después del tratamiento con fármacoshipolipemiantes.

4) Identificar genes y proteínas implicados en el desarrollo de HFC.4.a) se estudiará la influencia de la variabilidad genética del cromosoma 1q21-q23, y másespecificamentre la presente en el gen de la apoA-II y genes colidantes, en la presenciacualitativa de la enfremedad y en la expresión fenotípica de la HFC.


Objetivos

4.b) se estudiará la expresión de genes y proteínas en tejido adiposo de enfermos con HFC y secomparará con la de controles, al tiempo que se estudiará la expresión en hígado, músculo y grasade genes y proteínas de un modelo animal de la enfermedad (ratón transgénico de apoA-II)

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Metodología

La metodología que proponemos para la consecución de los objetivos es la siguiente:

1.- Metodología para consecución del objetivo A.1:Programa de seguimiento y evaluación periódica de una cohorte de HF.

I) A partir del Registro de la Fundación Hipercolesterolemia Familiar, RFHF ( propiedad de laFundación Hipercolesterolemia Familiar, responsable Dr. Pedro Mata) ya existente de casos índicede pacientes con hipercolesterolemia familiar (HF) identificados y remitidos por Unidades deLípidos de toda España (n= 72), se localizará y contactará con todos los familiares de primer gradovivos en el momento de iniciarse el programa (padres, hijos y hermanos) de aquellos condiagnóstico genético. Se calcula como media que el número de familiares de primer grado por casoíndice es de 4-5, con lo que la cohorte estará constituida por unos 4.000-5.000 individuos.Todos los familiares de primer grado de cada caso índice identificados y localizados, seráninvitados a una visita en la Unidad de Lípidos de su zona correspondiente, la cual incluirá unaentrevista médica estructurada, un examen clínico estandarizado y una analítica del perfil lipídicopara descartar o confirmar la presencia de hipercolesterolemia y evaluar su riesgo CV global.Con la estrategia de búsqueda de nuevos casos familiares aquí propuesta, y en base a experienciasprevias, se estima que sería posible identificar alrededor de 2.000 nuevos casos de HF (50% de losfamiliares de primer grado de los casos índice). Por tanto, el nº final de expuestos (con HF) en lacohorte estaría constituida por unos 3.000 sujetos y el de no expuestos (sin HF) por unos 2.000.Dado que la tasa de complicaciones cardiovasculares en los sujetos expuestos (con HF) se estimaque es 5 veces superior a la de la población general, el tamaño de esta cohorte se consideraadecuado para proporcionar un número suficiente de eventos cardiovasculares mayores (ACVs eIAMs letales y no letales) para estimar con precisión tasas de incidencia y de riesgo en un máximode 5 años. Igualmente dicha cohorte tendrá la potencia estadística suficiente para calcular lasfrecuencias de distribución de los principales genotipos a nivel individual y familiar, así comoestimar su contribución a la ecuación de riesgo CV.

II) Las muestras de sangre de los familiares de los casos índices serán enviadas por las distintasUnidades de Lípidos participantes al Laboratorio de Bioquímica, Biol Mol y Celular de laUniversidad de Zaragoza, responsable Dr. M Pocoví (Laboratorio Centralizado de Recepción deMuestras, LCRM) para su fraccionamiento, alicuotado, obtención de ADN y distribución a losotros nodos de la Red.

III) Una alicuota de suero y otra de plasma de cada individuo se enviarán desde el LCRM alLaboratorio Centralizado de Bioquímica del Hospital San Pablo de Barcelona(LCB), responsableDr F. Blanco para las determinaciones bioquímicas (CT, TG, c-HDL, apoAI. Apo B, Lp(a), TSH,..)correspondientes. Todos los resultados serán remitidos al RFHF.

IV) Los datos demográficos, de evaluación clínica y “outcomes” (desenlaces y eventos) serán


Metodología

enviados desde las Unidades de Lípidos a la Fundación Hipercolesterolemia Familiar en Madrid,donde se establecerá una Oficina Central de Coordinación (OCC) del proyecto de la cohorte,responsable Dr P. Mata. Posteriormente, todos los datos (demográficos, clínicos, analíticos ygenéticos) se incorporarán a la base central y única de datos. El cuaderno de recogida de datos sebasará y se ajustará a las directrices del programa Internacional Med-Ped, lo que permitirá lacomparación de los datos españoles con otros internacionales actualmente en marcha.V) En el examen inicial y periódicamente en los sucesivos, se hará especial hincapié en lainformación sobre la historia familiar de hipercolesterolemia (pedigree genético familiar), en lascomplicaciones cardiovasculares precoces individuales y familiares, en la evaluación exhaustiva delos FRCV clásicos (dislipemia, diabetes, hipertensión, tabaquismo, obesidad, etc.) y emergentes(serología frente a agentes infecciosos, marcadores y reactantes biológicos, niveles plasmáticos deantioxidantes, vitaminas, homocisteinemia, etc), en los hábitos y patrones nutricionales delindividuo, en el estudio de “clusters” familiares y geográficos de los distintos genotipos de HF, endistintos parámetros de funcionalidad endotelial y de expresión molecular, así como en laevaluación objetiva de la afectación de los distintos territorios arteriales (coronarias, carótidas)mediante cuantificación objetiva de la extensión y severidad de las lesiones ateroscleróticas contécnicas no invasivas como la resonancia magnética y la ecografía arterial.

VI) En todos los miembro de la familias cuyo caso índice ya tenga identificada la mutación del r-LDL, la mutación se analizará con el biochip prototipo (si es una de las 20 que analiza el biochip).Si es una mutación conocida pero no analizable por el biochip prototipo, se analizarán mediantePCR y análisis de restriccón y/o heteroduplex (Mozas P y col. Hum Mutat 2000 15:483-4;Cenarro A y col.. Methods in Molecular Medicine. Molecular Biology of Vascular Disease.Humana Press 1999. Totowa NJ, USA .VII) En las familias en que no se conozca la mutación responsable de la HAD se analizará en elcaso índice:- La mutación R3500Q en el gen de apoB y el análisis de su región de unión al receptor sedeterminará según Castillo S. et al. Clin Invest. Arteriosclerosis 1999,11:205. - El gen del r-LDL. Las mutaciones puntuales del r-LDL se identificarán: 1) Utilizando el biochipHF prototipo disponible(Med Plant Genetics). 2) De no identificarse la mutación con el biochipprototipo se analizará por PCR, SSCP, secuenciación y análisis de restricción según (Cenarro A etal Hum.Mutat 1998,11:413) y los grandes reordenamientos por PCR larga y análisis de restricción.

VIII) Seguimiento y evaluación de la cohorte de HFEl seguimiento clínico de los casos índices y familiares se plantea a largo plazo. La periodicidad delas visitas y exámenes médicos será en principio bianual y tras la aparición de cualquier evento ocomplicación CV. La citación y visitas de los participantes (casos índices y familiares) serealizarán en cada una de las 72 Unidades de Lípidos colaboradoras. Dichas unidades contarán conel apoyo de la OCC para el contacto con los participantes, recuerdo de citas y recopilación deinformación epidemiológica.Al mismo tiempo se pondrá en marcha un sistema de vigilancia epidemiológico activo para laindagación de eventos cardiovasculares (desarrollo de angor de reciente comienzo, IAM, ictus,revascularización de cualquier territorio arterial, hospitalizaciones y muerte de cualquier causa).La identificación y notificación de eventos cardiovasculares (IAM, Angina, Ictus y AIT) que seproduzcan, se realizará a través de un sistema mixto de búsqueda activa (“en caliente”) y denotificación pasiva (“periódico, en frío”) siguiendo metodología MONICA-OMS.El estatus vital de los participantes (información sobre fallecimiento, fecha y causa) se obtendráanualmente a través del INE.Para todo ello será necesario la colaboración estrecha y continuada entre la OCC y las unidades


Metodología

participantes, así como el establecimiento de un comité independiente de confirmación de eventosde acuerdo a los criterios OMS-MONICA internacionalmente aceptados.El programa permitirá calcular los riesgos relativos para diferentes eventos cardiovasculares a lolargo de los años según la presencia o ausencia de HF, el genotipo de la misma y la concomitanciaotros factores que pueden afectar la expresión de la HF (comorbilidad, presencia de otros Factoresde Riesgo Cardiovascular (FRCV) asociados o penetrancia familiar de la mutación.Además del riesgo de desarrollo de eventos clínicos, este diseño hará posible evaluar mediantemétodos objetivos el grado de afectación y extensión de lesiones ateroscleróticas del árbol arterial(afectación subclínica arteriosclerótica), así como la respuesta a distintas intervencionesfarmacológicas, particularmente de los distintos agentes hipolipemiantes.

2 Metodología para la consecución del objetivo A 1.aEstudio transversal de factores de riesgo cardiovascular y aterosclerosis preclínica en pacientes conHF, seguido de estudio prospectivo de la evolución de la aterosclerosis preclínica en función de laeficacia del tratamiento hipocolesterolemiante.

I) Se seleccionaran 300 pacientes con HF y 100 voluntarios sanos de ambos sexos sinhipercolesterolemia. Tanto los pacientes como los voluntarios sanos procederán de varios nodos dela red. El entrenamiento para una metodología común en ecografía arterial, y la lectura secentralizará en el nodo a cargo del Dr. E. Ros.

II) En situación basal se obtendrá muestras de sangre periférica y se remitirá al LCRM paradeterminación de esteroles vegetales y precursores de la síntesis de colesterol (medida indirecta deabsorción intestinal y síntesis hepática de colesterol) para genotipo apo E, polimorfismos de genesABCG5 y ABCG8 y estudio de mutaciones del gen r-LDL y Apo B 3500Tras al menos dos determinaciones lipídicas con el tratamiento con estatinas a la dosis máximaprescrita y habiendo comprobado con los datos recibidos desde el RFHF la estabilidad de larespuesta del cLDL, se obtendrá plasma de nuevo que se remitirá de nuevo al LCRM para ladeterminación de esteroles vegetales y precursores de la síntesis de colesterol.En situación basal y anualmente tras instituir tratamiento hipolipidemiante con el intento deconseguir los objetivos de cLDL según riesgo individual, se obtendrán:- Datos antropométricos y presión arterial. Historia de tabaquismo. Encuesta dietética. Perfillipídico, incluyendo Lp(a) y apos AI y B, Ac anti ox-LDL, RLP-C, homocisteína, ácido fólico,vitamina B12 y PCR-hs. Los datos clínicos y demográficos serán enviados de la base de datoscentral.- Ecografía de carótidas y femorales, junto con medidas y estructura del tendón de Aquiles.Estudio morfológico por imagen de la pared arterial de las carótidas:El estudio morfológico se realizará en el territorio carotídeo (carótida primitiva, bifurcacióncarotídea y carótida interna en su porción proximal, 1-2 cm. distal a la bifurcación) de ambos lados,según método publicado (Med Clin 1995;105:761-767). Posteriormente se realizará el examen condoppler color (alta energía/direccional) ajustando los parámetros técnicos (ganancia, rango develocidades) según las velocidades existentes en el vaso. Se evaluarán los siguientes parámetros:Diámetro de la carótida primitiva, Grosor del complejo íntima-media (CIM) en la carótidaprimitiva, Placas de ateroma, Grado de estenosis vascular, En las secciones transversales y en lassecciones longitudinales.

3. Metodología para la consecución del objetivo A 1.bEnsayo clínico longitudinal y prospectivo en un subgrupo de pacientes, para evaluar la relaciónentre el Deterioro Cognitivo Leve (DCL) y la HF con el tratamiento de un inhibidor de la HMG -


Metodología

CoA reductasa. Los pacientes se dividirán en dos grupos:

- Prevención Primaria (pacientes que no han tenido ningún evento vascular pero presentan unfactor de riesgo y niveles de LDL = ó <160-130).- Prevención Secundaria (Pacientes que ya han presentado un evento vascular y presentan 2 omás factores de riesgo y niveles de LDL < 100).Estos pacientes recibirán tratamiento farmacológico necesario para conseguir objetivo en c-LDL.

Todos los pacientes deberán acudir a 6 visitas durante un periodo de 1 año (visita basal, al mes, alos 2 meses, a los 3 meses, a los 6 meses y a los 12 meses de la visita basal).Para detectar una diferencia mínima de 3 puntos en el cuestionario Mini-Mental, con 11desviaciones estándar, un nivel de significación de 0,05 y un poder estadístico de 0,80, se requiereuna muestra de 107 pacientes, suponiendo un 10% de pérdidas de seguimiento o pacientes noválidos se deberían evaluar 118 pacientes que cumplan con los siguientes criterios de selección:Criterios de inclusión:- Hombres y mujeres con edades superiores a 50 años- cLDL comprendida entre 130 - 300.- Nivel de triglicéridos inferior ó igual a 600 mg/ml.- Obtener una puntuación mayor o igual a 24 en el MMSE (Mini Mental State Examination).- Obtener una puntuación en el GDS (Global Deterioration Scale) menor o igual a 3.- Que de su consentimiento escrito.- Presencia de Deterioro Cognitivo Leve.

Criterios de exclusión:Los habituales para este modelo de estudio. Se excluyen por causas médicas, por presencia devariables concomitantes y por causas psiquiátricas.Valoración neuropsicológica:La aplicación de las pruebas cognitivas las realizará un neuropsicólogo especialista enenvejecimiento previo entrenamiento. Las pruebas se centralizaran en centros especializados de laRed.Pruebas neuropsicológicas:MMSE (Mini mental State Examination)BNT (Boston Naming Test)GDS (Global Deterioration Scale)RAVLT (Rey Auditory Verbal Learning Test)7 Minute Neurocognitive Screening BatteryVerbal Paired Associated (Wechsler Memory Scale)Logical Memory (Wechsler Memory Scale)Set TestTMT (Trail Making Test): Parte B4.- Metodología para la consecución del objetivo A 1.cDado que la tasa de complicaciones cardiovasculares en los sujetos expuestos (con HF) se estimaque es 5 veces superior a la de la población general, el tamaño de esta cohorte se consideraadecuado para proporcionar un número suficiente de eventos cardiovasculares mayores (ACVs eIAMs letales y no letales) para estimar con precisión tasas de incidencia y de riesgo a partir de losdatos del RFHF (Responsable Dr. Pedro Mata). Igualmente dicha cohorte tendrá la potenciaestadística suficiente para calcular las frecuencias de distribución de los principales genotipos anivel individual y familiar, así como estimar su contribución a la ecuación de predicción del riesgoCV.


Metodología

5.- Metodología para la consecución del objetivo A 1.dI)Analizaremos por cromatografía de gases la concentración plasmática de esteroles vegetales(sitosterol, campesterol, avenasterol) y colestanol según (Meittinen y col Arterioscl Thromb VascBiol. 2000, 20:1340) en un subgrupo de pacientes hiporrespondedores (n= 50) ehiperrespondedores (n=50) al tratamiento hipolipemiante con estatinas . Ambos subgrupos seránseleccionados del estudio de la cohorte (apartado A-1)

II) Determinaremos en plasma la concentración de precursores de la síntesis de colesterolincluidos escualeno, colestenol, desmosterol y latosterol por cromatografía de gases (Meittinen ycol Arterioscl Thromb Vasc Biol. 2000, 20:1340) en el mismo subgrupo de pacientes descritos enel apartado anterior.

III) Analizaremos estadísticamente los resultados de para conocer si existen determinadossubgrupos de pacientes con HF cuya respuesta hipolimemiante dependa de mecanismos dehiperabsorción intestinal o sobreproducción hepática de colesterol.

IV) Se determinará la modificación de la expresión génica en cultivos de célulasmonocíticas/macrófagos tras la adición de LDL oxidadas y fármacos hipolipemiantes, estatinas yfibratos, en forma aislada o en combinación. En una primera fase se utilizarán células THP-1 deorigen humano, realizándose las incubaciones con fármaco de forma simultánea o en combinacióna la adición de LDL oxidadas. Se utilizarán arrays, de expresión. U133 Affymetrix. Aquellosgenes cuya expresión se modifique de forma significativa, se verificaran mediante técnicas de RT-PCR o northern. En una segunda fase, se realizarán estudios similares en monocitos/macrófagosaislados de 25 pacientes con HF seleccionados del RFHF, obteniéndose las muestras antes delinicio del tratamiento farmacológico y al cabo de seis semanas del mismo. Paralelamente, paracada diseño experimental, se comprobará la carga celular de colesterol libre y esterificado mediantecromatografía de gases

V) Se comparará el patrón de expresión y actividad de las distintas isoformas de PPAR y SREBP yde genes diana de los mismos en muestras hepáticas, musculares y de tejido adiposo de ratonescontrol wild type y ratones transgénicos para la apo AII humana, en dos condiciones dietéticas:dieta control, de mantenimiento, y dieta aterogénica tipo western o cafetería. Se utilizarán técnicasclásicas de RT-PCR, western blots, y ensayos de retardación y superretardación electroforética.Igualmente, se determinará el perfil lipídico plasmático completo de los animales en estudio por lastécnicas habituales, así como la actividad de síntesis hepática de ácidos grasos y esteroles mediantemarcadores radioactivos.

6.- Metodología para la consecución del objetivos A 2.a , 2b y 2c

I) Diseño del estudio de intervención dietética. Se trata de un estudio transversal. La poblacióninicial consistirá en 100 pacientes con HF heterocigota, pertenecientes al RFHF con una edadcomprendida entre 18 y 75 años y sin padecer otras enfermedades que afecten al metabolismolipoproteico. Se seleccionaran por tener todos una mutación de similar significado funcional apartir del RFHF

II) Estudio de la interacción entre ingesta de colesterol y la presencia de distintas variantesgenéticas en los transportadores ABCG5 y ABCG8, como determinante de los niveles de LDLcolesterol, en pacientes con HF y con una mutación de similar efecto funcional.


Metodología

Si los pacientes seleccionados se dividirán en dos grupos, según exista o no la mutación en eltransportador ABCG5 y en todos ellos se hará un estudio de su modelo de alimentación con uncuestionario dietético semicuantitativo.. En todos se harán uso de los niveles de colesterol LDL yse analizarán las siguientes variables del estudio.-Determinación de los polimorfismos Q604E y Y54C en los genes de los transportador ABCG5 yABCG8 respectivamente. Se realizaran mediante PCR y análisis de restricción-Determinación del tamaño de las LDL por electroforesis en geles de poliacrilamida. Los gelesserán escaneados y analizados mediante el programa Scion Image para Windows (ScionCorporation, USA). Los tamaños de las LDL de los sujetos serán determinados interpolando lamigración de las LDL en una curva de regresión, tamaño de los patrones (nm) vs migración.Resistencia a la oxidación “in vitro” de las LDL. Se determinará en las LDL aisladas de cada unode los sujetos sometidos a intervención dietética al final de cada uno de los periodos de dieta segúnel método de Esterbauer.Determinación de los anticuerpos anti-LDL oxidada. Se determinará mediante ELISA.Determinación de la homocisteína plasmática mediante HPLC en fase inversa y detección defluorescencia de los derivados SBDF.Determinación del cociente fibrinolítico de plasma (tPA/PAI-1): el tPA se determinará por ELISAcon un kit comercial y el PAI-1 por ensayos inmunoenzimáticos.

III) Diseño experimental e intervención dietética postprandial en un subgrupo de 40 pacientes conHF:- Durante los 7 días previos a la curva postprandial, los participantes serán informados para seguiruna alimentación donde la fuente grasa principal deberá ser aceite de oliva virgen extra; la cena deldía anterior a la experiencia será sin grasas. No podrán consumir alcohol durante los 3 díasanteriores al estudio.- Tras 12 h de ayuno, se administrará un desayuno consistente en una rebanada de pan yaproximadamente 80 g de aceite de oliva virgen.- Antes (tiempo cero) y cada hora durante 8 h tras el desayuno se tomarán muestras de sangrevenosa.Se utilizará un aceite de oliva virgen cuya composición en ácido olecico sea igual o superior al80% y cuyo contenido de componentes “minoritarios” el mayor del mercado.Aislamiento y caracterización de las TRL remanentes postprandiales: Tras la obtención del suerolas TRL remanentes postprandiales se separarán mediante inmunoafinidad, utilizando anticuerposmonoclonales humanos anti-Apo AI y anti-Apo B100. En estas lipoproteínas se determinará lacomposición lipídica y proteica.Determinaciones analíticas en suero/plasma antes y durante el metabolismo postprandial:Composición en ácidos grasos de los ésteres de colesterol en plasma.Lípidos y lipoproteínas: separación mediante ultracentrifugación de las fracciones y determinaciónde colesterol y triglicéridos por métodos enzimáticos.PAI-1 y t-PA, Factor Tisular y moléculas de adhesión de monocitos mediante inmunoensayo.

7.- Metodología para la consecución del objetivo A 2.d

Se estudiará en un subgrupo de pacientes con diagnóstico de certeza de HF incluidos en el estudiode la cohorte de HF. Todos estos pacientes pertenecerán al grupo de pacientes con HF que se lesha hecho el estudio de aterosclerosis preclínica (apartado A1.a) y se dispondrá de todas susvariables clínicas, factores de riesgo cardiovascular convencionales y de las variables deenfermedad cardiovascular, así como de las determinaciones bioquímicas de rutina incluidas en laanalítica general del RFHF.


Metodología

.- Se efectuará la determinación de la concentración de homocisteína mediante HPLC en faseinversa y detección de fluorescencia de los derivados SBDF , Las concentraciones de vitamin B12y folato se determinarán mediante radioensayo (Simultrac, Becton Dickinson and Co.) y las depiridoxal fosfato mediante HPLC y detección de fluorescencia (Chromsystem kit). Determinaciónde las concentraciones de tocoferol, ubiquinol y ubiquinona mediante HPLC con detecciónelectroquímica y de malondialdehido con detección ultravioleta..- Además, se estudiarán los polimorfismos genéticos a partir de las muestras de DNA del LCRMEl DNA se amplificará mediante PCR y se analizará mediante digestión con el correspondienteenzima de restricción y electroforesis. Se estudiarán las variantes relativamente comunes de losgenes CBS: 699 C->T, 844ins68 y 1080 C->T (Krauss et al., Genomics 52: 312-324, 1998),MTHFR: 677 C->T (Frost et al., Nat Genet 1995;10:111-3) y 1298 C->A (van der Put et al Am JHum Genet, 62: 1044-51, 1998), MS: 2756 A->G (Brody et al. Mol Genet Metab, 67: 324-333,1999), MSR: 66 A->G (Wilson et al., Mol Genet Metab, 67: 317-323, 1999) y GCPII: H475Y(Devlin et al. Hum Mol Genet, 9: 2837-44, 2000), asociadas a la hiperhomocisteinemia y al riesgocardiovascular.Estudio de los polimorfismos genéticos a partir de las muestras de DNA del LCRM . El DNA seamplificará mediante primers según el método de Frosst et al (Frost P, et al. Nat Genet1995;10:111-3). Se emplearán enzima de restrición específicos para el estudio de las mutaciones delos distintos genes y los productos resultantes se analizarán mediante electroforesis en gel depoliacrilamida.Se realizará un análisis estadístico descriptivo sobre las concentraciones de homocisteína,vitaminas y de la prevalencia de los polimorfismos de los genes relacionados en la población delestudio. Se analizará la relación entre las concentraciones de homocisteína y vitaminas, y de lospolimorfismos genéticos con la presencia de enfermedad cardiovascular clínica y subclínica concarácter transversal y prospectivo.

8 Metodología para la consecución del objetivo A.2.eSe estudiaran los pacientes pertenecientes al RFHF haciendo uso de los datos clínicos de dichoregistro , del material genético . Se realizaran nuevos estudios de tolerancia a glucosa y resistenciaa insulina en aquellos individuos que se estudien a lo largo del estudio.Tipo de estudio: estudio transversal.Parámetros bioquímicos:En situación de 12-14horas de ayuno, se determinará por métodos estandarizados los ácidos grasoslibres, la glucosa e insulina basal (definición de RI por HOMA IR).Parámetros genéticos:Se analizaran los siguientes polimorfismos:-Angiotensinogeno: C-532T y A-6G-Renina: BglI (intrón 1)-Proteína de Unión a la Renina: T61C.-Enzima conversor de la angiotensina (ACE): I/D y A-240T-Receptor 1 de la angiotensina II (AT1): C-521T, C573T y A1166C-Receptor 2 de la angiotensina II (AT2): A-1332G y G+1675A- UCP1: A-3826G y Met229Leu- UCP2: Ala55Val y polimorfismo de Inserción/deleción.- UCP3: C-55T- PON1: C(-107)T, Leu55Met y Gln192Arg- PPAR alfa: Leu162Val- PPAR gamma: Pro12Ala y Pro115Gln- R1268Q en ABCC6, G2457A en ABCG1, D19H y 400K en ABCG8.


Metodología

- Ala54-Thr en FABP intestinal,Se buscarán y caracterizarán polimorfismos en los genes ABCG5, ABCC6, ABCA1, FABPcardiaca, hepatica y adipocitica. La detección se realizará mediante secuenciación directa deregiones “interesantes” de cada uno de los genes (promotor y exones, incluyendo regionesintronicas contiguas, en un grupo de 10 individuos de cada patología), dando prioridad a aquellaszonas donde haya polimorfismos posibles en las bases de datos públicas. Se seleccionaran para suestudio aquellos que se localicen en el promotor, supongan un cambio de aminoácido o esten muypróximos a las regiones consenso de “splicing”Los polimorfismos se analizaran mediante el sistema de multiplex por PCR y detección de lospolimorfismos mediante ASO PCR o LDR aplicado a SNPs e inserciones y deleciones, para suestudio en un secuenciador automático

9.- Metodología para la consecución del objetivo A 3

I)En las familias del RFHF en que no se identifique la mutación ni en el gen de apo B ni en el gendel r-LDL se realizará un análisis de ligamiento “linkage analysis” a través de los polimorfismosdel gen del r-LDL polimorfismos : SfaNI en exon 2, TaqI en intron 4, StuI en exon 8, Hinc II enexon 12, AvaII en exon 13, MspI en exon 15, y NcoI in exon 18 según (Mozas P y col. HumMutat 2000 15:483-4) . Gen de apo E (polimorfismos del promotor ) región codificante (genotiposde apoE) y de la intergénica entre apo E y apoCI . Gen de apo B con los polimorfismos XbaI,MspI, EcoRI y 3HVR según (Castillo et al Atherosclerosis 2002)

II) En aquellos casos en que se observe segregación con alguno de los genes se procederá: a)Secuenciación de todo el gen del r-LDL(promotor , exones y nexos exón-intrón), región de unión alr-LDL del gen de apo B y todo el gen de apo E según resultados de análisis de segregación. B) Enel caso de no identificarse la mutación se realizará el estudio de RNAm del r-LDL, procedente delos linfocitos de los pacientes por si fuera consecuencia de una mutación que hubiese creado unsitio de críptico de ayuste, para ellos se obtendrá el cDNA y se clonara en se secuenciará.

III) En un total 50 casos índice de HAD cuyo defecto genético no esté asociado a loci conocidosDeterminaremos en plasma la concentración de esteroles vegetales (sitosterol, campesterol,avenasterol) y colestanol así como la concentración precursores de la síntesis de colesterolincluidos escualeno, colestenol, desmosterol y latosterol por cromatografía de gases (Meittinen ycol Arterioscl Thromb Vasc Biol. 2000, 20:1340) con objeto de ver si su hipercolesterolemia sedebe a mecanismos de hiperabsorción intestinal o síntesis hepática de colesterol .

IV) Caso de no observarse segregación con r-LDL, apoB , apo E y no estén implicados deficienciasen los mecanismos de absorción y síntesis hepática de colesterol) se realizará un estudio de lafuncionalidad del r-DL y de capacidad de unión de partículas LDL de este tipo de pacientes (verapartado10)

V). Identificación de nuevos genes.La identificación de nuevos genes causantes de la HAD se llevará a cabo analizando los perfiles deSNPs en los pacientes de HAD y sus familiares. La herramienta empleada para el análisis de losSNPs da cada una de las muestras será la amplificación por PCR de cada una de las regionesgenómicas en las que se localice el SNP, su marcado con un fluoróforo y su detección posterior enun DNA-chip (Affymetrix Genechip) donde están representadas todas las sondas que identificancada uno de los alelos de cada SNP. De este modo, en un único experimento, se puede determinarel perfil genético de un individuo.


Metodología

Alternativamente, aquellos SNPs que no aparezcan representados en el DNA-chip y que se deseenanalizar debido a que se describan con posterioridad al diseño del DNA-chip, se pueden procesarempleando la herramienta de Pyrosequencing. En este caso se secuencian unos pocos nucleótidosque comprenden el SNP empleando una unidad robótica que puede procesar hasta 20.000-25.000SNPs en 24 horas. Al incorporar cada deoxinucleótido la polimerasa que extiende la hebra generapirofosfato. Este pirofofosfato es transformado en ATP, que en presencia de luciferasa emite luz.De este modo es posible averiguar qué nucleotido se incorpora y, por tanto, el alelo de cada SNP

10.- Metodología para la consecución del objetivo A 4I ) En el RFHF hay en este momento de 23 mutciones del r-LDL, todavía sin caracterizar. Parallevar a cabo esta caracterización se clonarán los genes mutantes en un vector de expresión bajo elcontrol del promotor de citomegalovirus (CMV) y las construcciones se utlizarán para transfectarcélulas ldlA7 (una línea celular derivada de CHO que carece de LDLr). Los transfectantes establesse utilizarán en estudios de tipo funcional ( apartado 10.II)Por otra parte el grupo que propone este proyecto ha descrito una mutacion en el gen de apoE(delta149L) asociada con HAD. Los mutantes de esta apo E se expresarán en un sistema deexpresión en Drosophila consistente en cultivos de la línea celular SL-2, que ya hemos utilizado enestudios previos (Mozas y cols 2002). Los cDNAs correspondientes a las apoE mutantes seclonarán en el vector pAc5/V5-His y los plásmidos se transfectarán a cultivos de células SL-2utilizando el plásmido pCoHygro para seleccionar con higromicina. Las proteínas expresadas sepurificarán en columnas de afinidad utlizando las colas de histidinas y se realizarán los estudiosfuncionales. (apartado 10.b)

II) Caracterización funcional de proteínas mutantes causantes de HAD.Actividad funcional de las formas mutantes del receptor de LDL.- Se estudiará la actividad del receptor de LDL en linfocitos de pacientes portadores de mutacionesde cambio de aminoácido o en pauta de lectura no caracterizadas previamente en dicho receptor. Seobtendrán las células mononucleadas de la sangre de los pacientes para el estudio de la unión ycaptación de DiI-LDL en células viables y la expresión del receptor en la membrana mediantecitometría de flujo, así como la proliferación en respuesta a LDL mediante incorporación de[3H]timidina. Asimismo, se caracterizará funcionalmente la actividad del receptor de LDL encélulas CHO-ldl A (deficientes de receptor de LDL) transfectadas con el gen para el receptormutantes- Distribución subcelular de las formas mutantes del receptor de LDL.Se estudiará mediante la utilización de anticuerpos específicos y microscopía confocal, y secomparará con la distribución subcelular de DiI-LDL mediante el mismo método descrito en elapartado anterior.III) Caracterización funcional de las formas mutantes de la apo E y la apo B-100.Se determinarán la unión y captación de las lipoproteínas portadoras de formas mutantes de la apoE o la apo B-100 por células HL-60. Se realizará una caracterización lipídica y apolipoproteica delos plasmas correspondientes, que incluirá el perfil (FPLC) y la composición de las lipoproteínas ylas concentraciones de distintos esteroles precursores del colesterol y de fitosteroles (HPLC ycromatografía de gases). Las formas recombinantes de los mutantes de apo E (producidas en10 b)que se consideren más interesantes se incorporarán a liposomas para proceder a los antedichosestudios funcionales.

IV) Estimulación de la actividad del receptor de LDL mediante la manipulación de la homeostasisintracelular del colesterol.


Metodología

Se estudiarán los efectos de la inhibición del tráfico intracelular de colesterol con agentes comotamoxifeno y fitoestrógenos, y de la activación de los factores de transcripción LXR yPPAR�amma, con oxiesteroles y glitazonas respectivamente, en combinación o no con lovastatina,sobre la actividad del receptor de LDL y su expresión en membrana y la del mRNA (Northern blot)en líneas celulares con diferentes demandas de colesterol (promielocitos HL-60, monocitos THP-1,macrófagos J774, etc.). Se determinarán distintos parámetros de homeostasis intracelular decolesterol, como contenido en esteroles, colesterogénesis, etc.Las células control y tratadas se utilizan en el apartado 12 para determinar la expresión diferencialde distintos genes mediante microarrays de espresión.V) Estudio en células de individuos heterozigotos para la hipercolesterolemia familiar.En función de los resultados obtenidos en el apartado anterior, se abordará el estudio de los efectosde aquellos agentes y sus combinaciones en linfocitos de pacientes heterozigotos para lahipercolesterolemia familiar, portadores de distintas mutaciones en uno de los alelos para elreceptor de las LDL.

VI) La purificación de la proteína ARH se llevará a cabo utilizando dos estrategias de expresiónalternativas. En primer lugar se intentará la expresión en vectores bacterianos pET29c y posteriorpurificación en columnas de afinidad. Además se llevará a cabo la expresión en cultivos de SL-2utilizando al misma metodología descrita para el objetivo 3. Una vez optimizados los procesos deexpresión, uno de nosotros se se finalizará la purificación y se comenzarán los estudiosestructurales en colaboración con el Dr.Javier Sancho del Depart Bioquim, Biol Mol y Cel ,Zaragoza.

11. Metodología para la consecución del objetivo A 5Identificacion de biomarcadores y dianas terapèuticas a partir de los analisis de los patronesprotéicos de pacientes con HF

I) 2-DE : Los sueros serán pretratados para eliminar los lípidos y proteínas mayoritarias como laalbumina mediante columnas de afinidad. Alícuotas de dichos sueros (≅200 mg de proteína) sedesnaturalizarán y se someterán a isoelectroenfoque utilizando geles comerciales con gradientesinmovilizados de pH (Immobiline DryStrip gel, Amersham) en cubetas especiales (IPGphor IEFSystem, Amersham). Posteriormente la electroforesis en segunda dimensión se realizará en gelesde poliacrilamida comerciales utilizando un sistema de electroforesis vertical (Ettan DALT IISystem, Amersham). De acuerdo con los patrones obtenidos se seleccionará los rangos de pH asícomo los tiempos del isoelectroenfoque y los porcentajes de acrilamida necesarios para optimizarla separación de las proteínas diferenciales (Hanash SM. Electrophoresis 2000;21:102-109). Paravisualizar las proteínas los geles serán teñidos con un colorante fluorescente (SYPRO Ruby,Molecular Probes). Este sistema permite resolver prácticamente el espectro completo de proteínasbásicas y ácidas con fines analíticos o preparativosLos geles serán escaneados a diferentesresoluciones con un densitómetro. Las imágenes digitalizadas serán analizadas (ImageMaster 2D,Amersham) para detectar y cuantificar los proteínas diferenciales presentes en los sueros. Elanálisis de mapas de referencia permitirá determinar diferencias cualitativas y cuantitativas en losperfiles proteícos y la identificación de proteínas expresadas diferencialmente.Aquellas proteínas de interés serán escindidas de los geles, digeridas y analizadas medianteespectrometría de masas (MS). Eventualmente, cuando sea necesario para identificar las proteínas,tambien se realizará microsecuenciación. La identificación se llevará a cabo en el Servicio deProteómica y Bioinformática del instituto de Biotecnología y Biomedicina de la UniversidadAutónoma de Barcelona, que dispone de los equipos necesarios para ello. La MS es la técnica delección para obtener la “huella digital” de las proteínas separadas mediante 2-DE por su gran


Metodología

capacidad de análisis y porque detecta modificaciones post-traducionales como la fosforilación o laglicosilación, que in vivo pueden tener importantes consecuencias fisiopatológicas.

II) Análisis de bancos de datos: Se establecerá la identidad de las proteínas expresadasdiferencialmente a partir de la información de bancos de datos como SWISS-PROT y TrEMBL, yde las secuencias tag (secuencias proteícas parciales traducidas a partir de secuencias de DNA) delas cuales hay más de 2 millones en la actualidad, número que se incrementa constantemente. Todaesta información permiten identificar prácticamente cualquier proteína detectada mediante 2-DE(Neubauer G et al. Nat Genet 1998;20:46-50).

III) Obtención de anticuerpos: Las secuencias de aminoácidos de las proteínas identificadas en elobjetivo 1, determinada mediante MS, será la información utilizada para la síntesis de péptidossintéticos para la elaboración de anticuerpos específicos de acuerdo con protocolos desarrolladospreviamente (Royo T, Vidal M, Badimon L. Thromb Haemost 1998;80:667-685).

IV) Inmunohistoquímica de lesiones coronarias humanas: Los anticuerpos específicosdesarrollados contra las proteínas identificadas en el objetivo 1 se utilizarán para el análisisinmunohistoquímico de lesiones ateroscleróticas de coronarias humanas, de acuerdo con protocolosdesarrollados previamente (Badimon JJ, et al. Circulation 1999;99:1780-1787; Martínez-GonzálezJ, et al . Eur J Clin Invest 2001; 31: 939-949.). Brevemente, a partir de bloques de arteriascoronarias humanas con diferentes grados de lesión, fijadas y congelados en OCT (Miles Inc.), segenerarán mediante un criostato secciones consecutivas (5 �m) que se montarán sobre portaobjetostratados con gelatina, sobre los que se efectuará las incubaciones con los anticuerpos primarios. Seutilizarán anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia (FITC o TRITC) o ligados asistemas enzimáticos (fosfatasa alcalina o peroxidasa) según la sensibilidad requerida para unacorrecta detección de las entidades antigénicas analizadas. Para identificar estructuras vasculares serealizará la tinción tricrómica de Mason; para localizar lípidos la tinción Oil red O; einmunotinciones con anticuerpos contra marcadores celulares específicos [anti-�-actina demusculo liso (célula muscular lisa), anti-CD31 (célula endotelial); CD68 (monocito/macrófago) yanti-CD45RO (linfocitos T)] para identificar los tipos celulares secretores de tales proteínas.

V) Captación y análisis de imagen: Los cortes histológicos teñidos con los anticuerpos se evaluaránmediante microscopio de fluorescencia (Vanos AHBT3, Olympus), las imágenes se digitalizarán(cámara Sony 3CCD) y se cuantificarán las áreas ocupadas por las proteínas analizadas medianteun sistema de análisis de imagen (Visilog 4.1.5, Noesis).

VI)Validación : Los anticuerpos específicos obtenidos contra las proteínas de interés identificadasen el objetivo 1 se utilizarán para determinar mediante ensayos de proteínas (EIAs, etc.) los nivelesde estas proteínas en los sueros de los pacientes sometidos a transplante cardíaco

12.- Metodología para la consecución del objetivo A 6En primer lugar estudiaremos la expresión diferencial de genes en “pool de monocitos” de ungrupo reducido de pacientes HF, con y con HFC y en controles sanos utilizando microarrayscomerciales U133 de 20.000 genes de Affymetrix. Se seleccionarán aquellos genes cuya expresiónvaríe significativamente respecto a los controles.Una vez seleccionados aquellos genes candidatos generaremos chips de DNA que los contengan,utilizando librerías comerciales de cDNA o alternativamente oligonucleótidos de 50 bases delextremo 3´ según secuencia del Genebank. Además, a estas colecciones de genes se añadirán, de noencontrarse ya incluidos, los siguientes genes de interés en el metabolismo lipídico: Enzimas de la


Metodología

ruta de síntesis de colesterol DHCR24, HMG-CoA reductasa, DHCR7, esterol C5desaturasa.Factores de transcripción como SREBP-1, SREBP-2, LXR, FXR, RXR. PPAR.Transportadores de esteroles como ABCA1, ABCG1, ABCG4, OSBP. Receptores paralipoproteínas como el de LDL, LRP y receptores scavenger (SR-A, CLA-1/SR-BI, CD36, etc.).Apolipoproteínas como apo B-100, apo E, apo Cs, apo A-I. Otras proteínas implicadas en elmetabolismo lipídico cómo LPL, HSL, adipofilina, perilipina, ACAT1 y ACAT2.Estas sondas se obtendrán mediante sintesis de los oligos de 50 bases correspondientes de la zona3´. Se estima que el microchip contendrá un número total de entre 400 y 600 genes.El RNA se extraerá de sangre total preservada mediante “PAXgene Blood RNA System” de Gibco yde células mononucleadas de sangre periférica aisladas mediante gradiente de percoll. De estasmuestras de extraerá el RNA total con Trizol (Gibco). El RNA se amplificará utilizandotranscriptasa reversa marcándose fluorescentemente con dUTP conjugado con los fluoroforos Cy3o Cy5. El cDNA así marcado se hibridará con los microarrays siguiendo los protocolosrecomendados. A continuación se procederá a la lectura de los micrroarays y a su análisisutilizando el adecuado soporte informático.

13.- Metodología para la consecución del objetivo A 7Metodología del programa educativo: Estudio prospectivo para evaluar la utilidad de un programaeducativo. Se estudiarán los pacientes del RFHF (considerados casos índice) del área de Anoia ytodos sus familiares, tanto los afectos como los no afectos de HF. Cada nuevo paciente serárandomizado en uno de dos diferentes grupos: un grupo control (G1) y un grupo de intervención(G2) sujeto al programa educativo. Este programa consta de una primera parte teórica (con soporteaudiovisual) de dos horas de duración, en la que se imparten conocimientos teóricos sobre laaterosclerosis, sobre los factores de riesgo cardiovascular, en especial las hiperlipemias, y sobre lahipercolesterolemia familiar heterocigótica.La parte práctica consta de dos talleres de 2,5 horas de duración cada uno. En el primero seexponen las recomendaciones dietéticas para la prevención de la aterosclerosis en este subgrupopoblacional de alto riesgo. En el segundo se instruye a los pacientes en cómo gestionar el carrito dela compra y en cómo deben juzgar los ingredientes y la composición de los alimentos elaborados osemielaborados. Este segundo taller se realiza en un supermercado simulado a tales efectos en lasdependencias adscritas a nuestra unidad de lípidos. Anualmente se hará una charla de dos horas deduración con la finalidad de recordar los principales conceptos y de aclarar dudas.Se estudiara a los pacientes y a sus familiares basalmente, a los 3-6 meses y al año y, a partir de esemomento, anualmente. Y se correlacionarán los resultados con los datos demográficos, clínicos yanalíticos del registro central. Posteriormente, se hará una extensión del programa a otros nodos dela red y a la red de Unidades de Lípidos. Un análisis comparativo se realizará a los 3 años.

14.- Metodología para la consecución del objetivo B.1Creación de un registro (banco de muestras) de pacientes y familias de HFC en España utilizandola Red de Unidades de Lípidos de la Fundación para la Hipercolesterolemia Familiar. Este registroal y gual que el RFHF estará centralizado en la Fundación Hipercolesterolemia familiar y seráresponsable del mismo el Dr Pedro Mata. El registro contendrá datos de los pacientesdiagnosticados en base a unos criterios diagnósticos consensuados y comunes para todos losmiembros de la red. Se solicitarán los permisos correspondientes a la Agencia Nacional deProtección de Datos.Se hará una genoteca, plasmateca y seroteca (banco de muestras ) de pacientes y familias con HFCcentralizada y ubicado en el LCRM .


Metodología

15.- Metodología para la consecución del objetivo B.2Avanzar y validar en los criterios de diagnóstico de la HFC. Para ello, por una parte, secentralizarán los análisis bioquímicos en el laboratorio LCB ( Resposable Dr Blanco)., con elobjetivo de confirmar el diagnóstico bioquímico realizado en las diferentes unidades de la red. Porotra, se analizará la concordancia (o discordancia) de los resultados al clasificar como afectos o noafectos a los miembros de las familias con HFC utilizando determinaciones clásicas (colesterol ytriglicéridos) y las propuestas más recientemente (apoB, triglicéridos y fenotipo de LDL).

16.- Metodología para la consecución del objetivo B.3Determinar el riesgo cardiovascular de los pacientes con HFC, sus predictores y el efecto deltratamiento médico tanto a nivel ecográfico, bioquímico, genético (Farmacogenética) y clínico

I) Se estudiará la aterosclerosis preclínica en 75 de pacientes con HFC (utilizando la mismametodologia que en el apatado 2 de esta sección).y su relación con factores de riesgoconvencionales y no convencionales (homocisteína, proteína C reactiva, polimorfismos genéticosque confieren riesgo cardiovascular, como los relacionados con la insulino-resistencia y lossistemas antioxidantes presentes en los enfermos con HFC (utilizando la misma metodología quehemos descrito en los apartados 2,7 y 8 de esta sección).

II) se analizará la eficacia y los determinantes clínicos y bioquímicos de la respuesta al tratamientomédico (dieta, ejercicio, fármacos) y en 100 de pacientes con HFC se analizará la expresión degenes de monocitos/macrófagos aislados de pacientes con HFC antes y después de ser tratados confármacos hipolipemiantes y se verificará si el grado de mejoría ecográfica conseguida se relacionacon alguno de estos parámetros(utilizando la misma metodología que la que hemos descrito en los apartados 2,5 y 6 de estasección).

17.- Metodología para la consecución del objetivo B.4Identificar genes y proteínas implicados en el desarrollo de HFC (Genómica/Proteómica).I) Se estudiará la variabilidad del gen de la apoA-II humana en miembros afectos y no afectos(clasificados por los criterios clásicos o por de concentración de apoB y triglicéridos) de familiascon hiperlipemia familiar combinada. Estableceremos haplotipos y su relación cualitativa(afecto/no afecto) o cuantitativa con diferentes parámetros (concentraciones de apoA-II, apoB,triglicéridos, glucosa, insulina, índice cadera/cintura etc). Pretendemos hacer un análisis inicial conno menos de 50 familias de al menos tres personas y también comparar los casos índices conpacientes con diabetes tipoIIII) Se estudiará la expresión de genes hepáticos en ratones transgénicos de apoA-II de ratón yapoA-II humana. Los ratones a estudiar habrán pasado una noche en ayunas o estarán en unmomento bien determinado del período postprandial (2 h. después de ingerir 100 µl de aceite deoliva). Se emplearán microchips de Affymetrix y este estudio e interpretación se hará con lelsoftware que dispone la empresa Medplant Genetics.

III) Se obtendrá mediante biopsia muestra de tejido adiposo de pacientes HFC (n=20) y deindividuos normolipémicos (n=20) del mismo sexo, edad y características antropométricas . Seobtendrá el RNA total de cada una de las muestras y se analizará la expresión génica mediante unarray que contiene todos los genes catalogados más los ESTs provenientes de RNA mensajero(unos 22.000 en total) (según metodologia descrita en apartado 12). Se agruparan las muestras deRNA en dos pools de 10 muestras cada uno que se analizaran en dos experimentos separados. Seintentará que el grupo de pacientes FCH sea lo más homogéneo y "puro" posible. Por puro


Metodología

entendemos que el defecto primario esté lo menos enmascarado posible por alteracionesadaptativas (individuos relativamente jóvenes, del mismo sexo-varones, sin sobrepeso, sin diabetes,etc).Las diferencias en los niveles de expresión génica detectadas serán posteriormente validadasindividualmente, es decir para cada gen e individuo, mediante RT-PCR y PCR a tiempo real.Se contrastarán los resultados obtenidos con los valores lipídicos de estos pacientes,clínicos y losparámetros referentes a la acción insulínica

IV) Siguiendo el mismo diseño del objetivo 2, se procederá al análisis de las proteínas expresadasen el tejido adiposo de estos pacientes mediante electroforesis bidimensional ( utilizando la mismametodología descrita en el apartado 11). Está aproximación permitirá diferencias en la expresión dedeterminadas proteínas o la identificación de nuevas proteínas relacionadas con la FCH

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Expediente Nº



Plan de trabajo

La Red está constituida por 16 nodos, de 14 centros distintos que se detallan a continuación. Paracumplir los objetivos del Proyecto único se han asignado las tareas a cada nodo de acuerdo a laexperiencia de los investigadores que forman parte de cada uno. Se presenta la asignación detareas por nodo en tres años. Será el coordinador del centro el que vele por el cumplimiento de lastareas asignadas por parte de los investigadores de su centro. Se mantendrá informadopermanentemente al Coordinador de la Red.

RELACIÓN DE NODOS INTEGRANTES DE LA RED. COORDINADOR DEL CENTRO YNÚMERO DE INVESTIGADORES POR CENTROS.

NODO 1: Clínica Nstra Señora de la Concepción. Fundación Jiménez Díaz (FJD) Dr Pedro Mata Investigadores: 3

NODO 2: Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud (UNIZAR 1). Dr Miguel Pocovi Investigadores: 3

NODO 3: Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud (UNIZAR2) Dr. Fernadno Civeira Investigadores: 3NODO 4: Instituto Ciencias Cardiovasculares de Cataluña. (IICB) Dra. Lina Badimón Investigadores: 4 + 1 Becaria predocNODO 5 : Hospital Reina Sofía, Córdoba (HRS) Dr. Francisco Perez Jiménez Investigadores: 7 + 2 BecariasNODO 6: Instituto de Ciencias Biomedicas de Barcelona (HCB) Dr. Emili Ros Invesigadores: 5NODO 7: Hospital de Bellvitge, Barcelona (Hbel) Dr. Xavier Pintó Investigadores: 2 + 5 colaboradoresNODO 8: Facultad de Farmacia, Universidad de Barcelona (FarmaBna) Dr. Juan Carlos Laguna Investigadores: 4NODO 9: Hospital de Santa Creu y Sant Pau Barcelona (HSP) Dr.Francisco Blanco Investigadores: 4NODO 10: Hospital Clínico Universitario de Valencia (HCV)

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Plan de trabajo

Dr. Felipe Chaves Investigadores: 7 + 1 enfermeraNODO 11: Instituto de Investigación en Ciencias de la Salud (HSJ) Dr. Jusep Ribalta Investigadores: 12NODO 12: Facultad de medicina, Universidad de Cantabria (UNICAN) Dr. José Carlos Rodriguez Rey Investigadores: 3NODO 13: Medplant Genetics (MedPlant) Dr. Antonio Martinez Investigadores: 4NODO 14: Hospital Universitario Virgen del Rocío (HVR) Dr. José Villar Investigadores: 6NODO 15: Hospital Ramón y Cajal (HRyC1) Dr. Diego Gomez Coronado Investigadores: 3NODO 16: Hospital Ramón y Cajal (HRyC2) GRUPO EMERGENTE Dr. Javier Martinez-Botas Investigadores: 3

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Expediente Nº



Experiencia de los grupos integrantes de la red

La red de Hiperlipemias hereditarias esta formada por 16 nodos interdisciplinares formados porinvestigadores de los campos clínico y básico-aplicado.Cinco nodos de la Red tienen experiencia previa de colaboración en proyectos de investigación ,ya que han participado en varios proyectos coordinados (DGES/ FEDER Cod 2FD97-2142-CO3 yPGE/FEDER cod SAF 2001-2466-CO5) que han conducido a importantes avances en eldiagnóstico, clínica y tratamiento de la hipercolesterolemia familiar.

La experiencia de cada grupo en la investigación en hiperlipemias hereditarias se puede resumir dela siguiente forma:

El grupo de la Fundación Jiménez Díaz (Nodo 1), dirigido por el Dr. Pedro Mata cuenta con unaamplia experiencia en registros de pacientes y fue pionero en España en la elaboración de unRegistro de pacientes de Hipercolesterolemia Familiar, coordinando una red de 72 Unidades deLípidos distribuidas por todas las Comunidades Autónomas. A su vez este grupo posee una granexperiencia en la investigación clínica de pacientes con hiperlipemias hereditarias y ha llevado acabo numerosos estudios de intervención con dieta y fármacos sobre el metabolismo lipídico y lafunción vascular.

El grupo de investigación del Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud (Nodo 2), dirigido por elDr Miguel Pocoví es especialista en el estudio de marcadores genéticos asociados a trastornos delmetabolismo lipídico. Ha caracterizado 48 mutaciones en el receptor LDL (no descritas conanterioridad) que son responsables de hipercolesterolemia familiar, siendo pionero en el estudio delgen del r-LDL en la población española. Conjuntamente con el grupo de la FundaciónHipercolesterolemia Familiar , Med Plant Genetics y la empresa Lacer SA estan desarrollando un“biochip” para el diagnóstico de HF en España, contando ya en la actualidad con un prototipo queanaliza las 20 mutaciones mas frecuentes del r-LDL en nuestro país.

El grupo de investigación del Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud que dirige el Dr FernandoCiveira (Nodo 3) es un grupo interdisciplinar que estudia marcadores genéticos asociados tanto aenfermedad coronaria como a trastornos del metabolismo lipídico. Este grupo posee una ampliaexperiencia en genética molecular de dislipemias y e interaciones gen –gen.

El grupo del Instituto de Investigación Cardiovascular de Barcelona (Nodo 4) que dirige la DraLina Badimón es el grupo español de referencia en estudios de función vascular y ha estudiadotanto in vitro (cultivos de células musculares lisas y células endoteliales, humanas y de modelos deexperimentación animal) como in vivo (arterias humanas y de modelos animales dehipercolesterolemia e hiperlipemia combinada (conejo y cerdo) el efecto de la hipercolesterolemiay/o hipertrigliceridemia produce sobre los niveles/actividad de diferentes proteínas relevantes anivel de la pared vascular.

El grupo del Hospital Reina Sofía de Córdoba (Nodo 5) que dirige el Dr Francisco Pérez Jiménez



posee una amplia experiencia en estudios de la interacción entre genes y dieta, comodeterminantes de los niveles de colesterol plasmático y de la expresión de otros factores de riesgocardiovascular, incluyendo estudios de función endotelial, oxidación de LDL, tamaño de LDL

El grupo del Hospital Clínico de Barcelona (Nodo 6) dirigido por el Dr. Emili Ros tiene unaamplia experiencia en la evaluación y tratamiento de pacientes dislipémicos. Este grupo esespecialista en la valoración de la aterosclerosis subclínica, metabolismo lipídico, epidemiologíaclínica, estudios de intervención farmacológica y dietética.

El grupo del Hospital de Bellvitge (Nodo 7) que dirige el doctor Xavier Pinto, posee una ampliaexperiencia en el área la epidemiología cardiovascular, el diagnóstico y tratamiento de los factoresaterogénicos, y ha identificado de las mutaciones causantes de la homocistinuria en pacientesespañoles Este grupo mantienen una estrecha colaboración con el Laboratorio de Metabolopatíasdel Hospital de San Juan de Dios y con el Departamento de Genética de la Facultad de Biología dela Universidad de Barcelona. A su vez realiza actividades docentes en relación con los factores deriesgo cardiovascular

El grupo de la Unidad de Farmacología (Nodo 8) de la Facultad de Farmacia de Barcelona, quedirige el Dr. Juan Carlos Laguna posee una amplia experiencia en estudios del efecto de derivadosfíbricos sobre enzimas lipogénicas, activación de PPAR�, por fibratos, modificación de lacomposición y oxidabilidad de las lipoproteínas plasmáticas por fibratos y de los mecanismosimplicados en el efecto hipotrigliceridemiante de estatinas.

El grupo del Hospital de Sant Pau (Nodo 9) , Barcelona que dirige el Dr. Francisco Blanco hadestacado por su contribución al estudio de las defiencias hereditarias de HDL, de lahiperquilomicronemia familiar y de la hipercolesterolemia familiar. Por otra parte, ha desarrolladoun ratón transgénico de apoA-II que constituyen un buen modelo animal de hiperlipemia familiarcombinada. y han propuesto que la zona cromosómica donde se encuentra la apoA-II (1q21-23)puede estar relacionada con el desarrollo de hiperlipemia familiar combinada. Como parte de losmiembros del grupo desarrollan actividad asistencial en la especialidad de Bioquímica Clínica, enel área de los análisis de lípidos y lipoproteínas, su experiencia puede ser utilizada para constituir ellaboratorio de referencia de Bioquímica Clínica para la red.

La Unidad Mixta de Investigación del Hospital Clínico Universitario de Valencia (Nodo 10) quecoordina el Dr. Chaves tiene una amplia experiencia en el estudio de las hiperlipemias primarias.Esta Unidad realiza pruebas funcionales metabólicas y posee un Laboratorio que se dedica deforma exclusiva al estudio de las lipoproteínas. Trabaja conjuntamente con la Unidad de GenéticaMolecular del Instituto de Investigaciones Citológicas de Valencia; mediante esta colaboración seinició el estudio genético de las hiperlipemias primarias, permitiendo diseñar procedimientos ymétodos para realizar un diagnóstico genético de la HF y del DFB en nuestro país.

El grupo del Instituto de Ciencias de la Salud de Reus y Facultad de Medicina de la UniversidadRovira i Virgili (Nodo 11), que coordina el Dr Josep Ribalta se dedica al estudio del metabolismode los lípidos, las hiperlipemias y su relación con el riesgo vascular abordando los aspectos debalance oxidativo y arteriosclerosis, y bases genéticas de hiperlipemias hereditarias.

El grupo de la Facultad de Medicina de la Universidad de Cantabria (Nodo 12) que dirige el Dr.



José C. Rodríguez Rey se dedica al estudio de la expresión de los genes involucrados en eldesarrollo de la placa de ateroma. También aborda el estudio de las regiones reguladoras y decaracterización funcional de de mutaciones del receptor de LDL

El grupo de la empresa de biotecnología Medplant Genetics (Nodo 13) que dirige el Dr. AntonioMartínez es especialista en el diseño y fabricación de microarrays tanto para estudios de expresióncomo para el diagnóstico de mutaciones. Este grupo ha desarrollado microarrays de genesimplicados en cáncer de vejiga, cáncer de páncreas o esclerosis múltiple. Algunos de estos genesestán siendo validados clínicamente como marcadores en sistemas de diagnóstico no invasivo, ocomo potenciales dianas terapéuticas Conjuntamente la Fundación Hipercolestereolemia Familiar,Medplant genetics y la empresa Lacer SA, con el apoyo del grupo del Dr M Pocoví estándesarrollando un biochip para el diagnóstico de HF, contando ya en la actualidad con unprototipo que analiza las 20 mutaciones mas frecuentes del r-LDL en nuestro país.

El grupo del Hospital Virgen del Rocío (Nodo 14) que dirige el Dr. José Villar es un equipomultidisciplinar que colabora con el Instituto de la Grasa (CSIC) y es pionero en abordar estudiosde composición y distribución asimétrica de lípidos en membrana celular. Este grupo ha realizadonumerosos estudios del metabolismo postprandial en humanos y de la interacción de lipoproteinascon células vasculares humanas, determinado rutas de señalización intracelular asociadas conrespuestas mitogénicas y apoptóticas.

El grupo del Hospital Ramón y Cajal de Madrid ( Nodo 15) que coordina el Dr. Diego GómezCoronado es especialista en la caracterización funcional de formas mutantes del r-LDL, la apo A-Iy LCAT. Desarrolla estudios acerca de la utilización del colesterol lipoproteico para finesmetabólicos y, en especial, para la proliferación celular. Ha colaborado en la caracterizaciónfuncional de los receptores scavenger CLA-1 y CD36.

El grupo “emergente” del Hospital Ramón y Cajal (Nodo 16), está dirigido por el Dr. JavierMartínez-Botas, con contrato de investigador del Programa Ramón y Cajal. Este grupo es dereciente formación y el Dr Martínez Botas durante su estancia posdoctoral en el laboratorio del Dr.Lawrence Chan en Baylor College of Medicine (Houston, Texas), se ha familiarizado con lastécnicas básicas de biología molecular y especialmente aquéllas relacionadas con la generación ycaracterización de ratones knockout y en expresión génica diferencial del metabolismo lipídicomediante microarrays.

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Expediente Nº



Aplicabilidad de la configuración de la Red al Sistema Nacional de Salud

En un reciente informe de la OMS sobre la HF, se describieron una serie de medidas prácticas conel fin de mejorar la identificación, el tratamiento y el seguimiento crónico de personas con HF.Estas medidas pueden utilizarse para sentar las bases de una Red dedicada al estudio de la HF anivel nacional:

1. Identificación de casos índice con HF2. Detección de nuevos casos en los familiares.3. Creación de un registro nacional4. Educación a los pacientes y médicos para un correcto tratamiento5. Seguimiento adecuado a los pacientes.6. Crear una organización y asociación de pacientes.7. Implicación y apoyo de las autoridades sanitarias.8. Coordinación y promoción de la investigación en todos las áreas (básica, clínica, educativa, etc)

en HF.

La Red temática en Hiperlipemias Genéticas, con el apoyo de la Fundación HipercolesterolemiaFamiliar, cumple las premisas descritas. La Fundación cuenta con una Asociación de más de 5000pacientes a quienes se les envía periodicamente un boletín de difusión e información.Recientemente, la Fundación ha establecido un Convenio de Colaboración tripartito con el CentroNacional de Investigación Cardiovascular (CNIC) y el Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) parapromover la investigación en la HF. Además, la importancia socio-sanitaria de la HF ha sidoreconocida por el Parlamento Español, aprobándose por unanimidad la aportación reducida altratamiento farmacológico crónico que necesitan los pacientes con diagnóstico de certeza de HF(ver Diario de Sesiones del Congreso de los Diputados con fecha 10 de abril de 2002).

ANÁLISIS DE ESTIMACIÓN COSTE-EFICIENCIA DEL PROYECTO Y DE LA RED

Cualquier intervención que tenga un impacto sobre la salud es susceptible de ser analizada desdeun punto de vista económico, a fin de evaluar el impacto de ésta sobre el bienestar de la sociedad.Su objetivo último es el de ayudar a la toma de decisiones para apoyar o rechazar la derivación defondos públicos para la financiación de estas intervenciones, de tal forma que esta decisión searacional y coherente, en función de los objetivos y de los recursos disponibles.Dado que el bienestar de la sociedad es un objetivo público que no se puede medir directamente yque los recursos siempre son limitados, la evaluación económica debe centrarse en la identificaciónde los efectos que se esperan de una determinada intervención sobre la salud y compararla conotras opciones, en términos de EFICIENCIA (beneficio sobre la salud a un coste asumible por lacomunidad) y EFICACIA CLÍNICA (beneficio clínico basado en evidencias científicascontrastadas). Por tanto, sería razonable destinar fondos públicos a la financiación deintervenciones sobre la salud que hayan demostrado ser eficaces y que además, los costes quesupongan sean asumibles por la comunidad.

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Aplicabilidad de la configuración de la Red al Sistema Nacional de Salud

A continuación se plantea la rentabilidad para el Sistema Nacional de Salud de la decisión deapoyo a esta red temática y al proyecto propuesto de detección, seguimiento e investigación dehiperlipemias genéticas en España, con el objetivo final de un mejor tratamiento y prevención de laenfermedad cardiovascular.

BENEFICIOS PREVISTOS:Disminución del riesgo de ECV precozDisminución del riesgo de muerte por ECV.

BENEFICIO SOCIALMuertes evitadas y años de vida ganados en cantidad y en calidad.Se calcula que si todos los pacientes con HF de nuestro país estuviesen diagnosticados y tratados de formacorrecta, los años de vida anados serían “teoricamente” 2.000.000 de años.

BENEFICIO ECONÓMICOTeniendo en cuenta que la población incluída en el Registro Español tiene una edad media inferior a 50años, y que hay evidencia de ECV a partir de los 30 años de edad, las medidas de prevención aplicadas aeste grupo poblacional, evitándo la ECV, generaría una “riqueza-país” a través de 2 vías significativas:- De una parte, lo que corresponde a la propia vida cotidiana de las personas en la que se incluye tanto elrendimiento personal y empresarial.- Aumento de la población activa.

Los beneficios mencionados justifican plenamente los recursos que requiere la Red para eldesarrollo del Proyecto. Además, con el programa de formación propuesto, se contribuirá amodificar la actitud de la clase médica en general en la aproximación y tratamiento de lashipercolesterolemias familiares. Esto es importante, ya que existe una escasa formación médica enel tema de las hiperlipemias genéticas tanto en la formación del pre como del postgrado.

En Conclusión, La consecución de este Programa permitiría a una parte de la población españolaexpuesta a un elevado riesgo cardiovascular a:

- conocer su condición predisponente a la incapacidad o muerte prematura- conocer las posibilidades terapéuticas de reducir este riesgo- colaborar en la difusión de este tipo de enfermedades en la población general, a fin de favorecer

la detección de errores genéticos (mutaciones) aún no detectadas- conocer la posibilidad de que su riesgo se incremente debido a su condición genética y la

concomitancia con otras enfermedades.- Conocer si, dada su información genética, podría responder mejor a un tipo de tratamiento u

otro.

Esta Red temática permitirá realizar una investigación competitiva a nivel Europeo y repercutirá enla Salud de los ciudadanos aumentando su calidad de vida . En definitiva, la inversión realizada ensalud retorna en el bienestar de la sociedad.

Impreso normalizado de solicitud de constitución y financiación de Redes TIC de Grupos:Relación de Registros, B. de datos, Bancos de tejidos,... compartidos por la red Página 53

Expediente Nº

RTIC-GRELACIÓN DE REGISTROS, B. DE DATOS, BANCOS DE TEJIDOS,.... COMPARTIDOS POR LA RED


La Red cuenta para el desarrollo de este Proyecto de:

1. Un Registro y base de datos de 2050 pacientes con HF (casos índice). Este registro y la base dedatos cumpen la normativa vigente en cuanto a protección de datos de acuerdo a la AgenciaNacional de Protección de datos. El presente proyecto ampliará este registro y base de datosmediante el estudio de cohorte. Los responsables del registro y de la base de datos (Dr. Mata yDr. Alonso) velarán en todo momento en las medidas de seguridad de las mismas. La base dedatos única estará a disposición de los grupos integrantes de la red con el fin de cumplir losobjetivos propuestos en el mismo, siempre cumpliendo las normativas vigentes en cuanto altratamiento y traspaso de datos y muestras biológicas.

2. Un Banco de ADN y seroteca (4 alicuotas de cada paciente con HF) incluídos en el Registro.Las muestras están almacenadas en el Lab. Biología Molecular, Universidad de Zaragoza, acargo del Dr. Pocoví, y estarán a disposición de los nodos integrantes de la red en función delos objetivos, y manteniendo los controles legales y de seguridad en cuanto a la transferenciade material biológico.

3. En este proyecto se creará un registro de pacientes con HFC, y un banco de muestras de ADN yseroteca (centralizado en Lab Biología molecular, Universidad de Zaragoza). Los datos delregistro HFC y las muestras estarán a disposición de los nodos integrantes de la red para laconsecución de los objetivos, cumpliendo la normativa vigente en seguridad.

Impreso normalizado de solicitud de constitución y financiación de Redes TIC de Grupos:Plan de formación en investigación Página 54

Expediente Nº

RTIC-GPLAN DE FORMACIÓN EN INVESTIGACIÓN


PLAN DE FORMACION EN INVESTIGACIONLa red elaborará un programa formativo, dirigido tanto a alumnos del tercer ciclocomo a la formación continuada de los investigadores de los distintos grupos. Se desarrollará con el siguienteesquema:

PROGRAMA DE TERCER CICLO:En el momento de constitución de la red existen distintos programas de tercer ciclo, ya establecidos. En ellosse incluyen alumnos de primero y segundo año, además de los que están en la fase de elaborar sutesis doctoral. Desde la red se potenciará el intercambio entre los grupos, a lo largo de todo elproceso, de acuerdo con el siguiente diseño:

1.- Primer año del programa: Los investigadores de cada grupo impartirán 1 crédito enotro programa distinto al propio, lo que supondrá un intercambio total de 16 créditos.2.- Desarrollo de la tesis doctoral: Cada año se establecerá un turno rotatorio, para que 8doctorandos realicen una estancia de tres meses en otro grupo de la red, para la realizaciónde un trabajo complementario a su tesis doctoral.

FORMACION CONTINUADA DE LOS INVESTIGADORES:La formación continuada y el intercambio de información, entre los miembros de la red, se desarrollará a dos niveles:

1.- Programa de intercambio de tipo virtual: Se elaborará una página web,especificamente destinada a incluir toda la información científica producida por la propiared, así como una selección mensual de las publicaciones afines, de otros grupos. Además, se pondrá en marcha un servicio de alerta, que difundirá por correo la información más relevantes relacionada con las líneas de investigación de la red.2.- Programa de intercambio de investigadores: Se establecerá un turno rotatorio, entretodos los centros, para que un total de 8 investigadores hagan, cada año, una estancia mínima de 3 meses en otro nodo de la red.3.- Reunión anual: Cada año se celebrará una reunión conjunta, de todos los investigadores de la red, para presentar los progresos científicos que se hayan producido durante ese tiempo, discutiendo las nuevas líneas de trabajo y promoviendo la interacción entre los grupos.

FORMACION CONTINUADA A MEDICOS.Se desarrollará un programa de formación en Hiperlipemias genéticas para los médicos que

conforman la red de Unidades de Lípidos y a otros médicos del SNS implicados en la detección depacientes con hiperlipemias genéticas. En este sentido, algunos miembros de la Red Temática(Drs Mata, Alonso, Pocovi, Civeira, Perez Jiménez, López Miranda, Panisello) han participado conanterioridad en cursos de formación en Hipercolesterolemia Familiar avalados por el Ministerio deSanidad y Consumo con 2.7 créditos.

Impreso normalizado de solicitud de constitución y financiación de Redes TIC de Grupos:Historial científico de la red Página 55

Expediente Nº

RTIC-GHISTORIAL CIENTÍFICO DE LA RED


Proyectos de investigación financiados por Agencias externas, artículos científicos y patentes en los últimos5 años

La Red de grupos en Hiperlipemias genéticas cuenta con 16 nodos, de los cuales uno es emergente(Nodo nº 16).Se incluyeron aquellos nodos o grupos de investigación con experiencia en el tema de lashiperlipemias genéticas, y que tuviesen un índice de impacto en las publicaciones en revistasindexadas de los últimos 5 años superior a 30. El índice de impacto total de la red en los úlitmosaños es de: 1451,082.

El nivel de excelencia científica de la red queda avalado por las Ayudas externas, publicacionesrecientes y patentes obtenidas en los últimos 5 años como se muestra a continuación y másdetallademente en los curriculum vitae adjuntos para cada investigador:

PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN FINANCIADOS POR AGENCIAS EXTERNAS :

TOTAL 110

FIS: 39CICYT: 28EUROPEAS (FEDER, etc): 10DGA: 3OTRAS (CCAA, FUNDACIONES, INDUSTRIA): 30

PUBLICACIONES EN LOS ULTIMOS 5 AÑOS: 478(Revistas indexadas, según se detalla a continuación)

PATENTES : 4



AYUDAS EXTERNAS DE LOS DISTINTOS NODOS QUE COMPONEN LA RED TEMÁTICAEN LOS ÚLTIOMS AÑOS.

NODO 1

1. Beca del FISS, exp.93/0428. Efecto del Diferente Grado de Saturación de la Grasa de la Dietasobre la Modificación Oxidativa de las LDL y la Trombogénesis (1993-1995). InvestigadorPrincipal: Pedro Mata

2. Beca del FISS , exp. 95/0838. Papel del Grado de Oxidación de las LDL en la Adhesión deMonocitos al Endotelio Vascular.(1995). Investigador Principal: Pedro Mata.

3. Beca del Ministerio, exp OLI96/2210. Comparación en sujetos sanos de tres dietas enriquecidasen ácidos grasos monoinsaturados y poiinsaturados n-6 y n-3 sobre las propiedadesaterogénicas y trombóticas del endotelio vascular. (1997-1999) Investigadro responsbale: PedroMata.

4. Proyecto 30604/00108 (MSD - España ). Marcadores Clínicos y biológicos de disfunciónendotelial en la hipercolesterolemia familiar. Efecto del tratamiento con simvastatina. ( 1998)Investigador Responsable: Pedro Mata.

5. Proyecto Coordinado FEDER 2FD97-2142-C03-03. Mapa de mutaciones del receptor LDL ydesarrollo de un sistema de diagnóstico de las hipercolesterolemias familares. (2000-2001)Investigador Responsable: Pedro Mata.

6. SAF 2001-2466-C05-02. Estudio de Intervención Farmacológica en función del genotipo delreceptor LDL y del transportador ABCG5. (2002-2004) Investigador Responsable: Pedro Mata.

NODO 2 y 3 .

7. CICYT SAF 96-0264-CO2-01. Estudio genético y funcional de mutaciones asociadas ahipoalfalipoproteinemia y riesgo aterogénico (1996-1999). Investigador Principal: MiguelPocoví Mieras

8. FIS 97/0527. Estudio clínico, enzimático y genético de la enfermedad de Gaucher.(1997-1999). Investigador Principal: Juan I. Pérez Calvo

9. DGA. PCM 1094. Estudio enzimático y genético de la enfermedad de Gaucher en laComunidad Autónoma de Aragón. (1997-1999). Investigador Principal: Pilar GiraldoCastellanos

10. FIS 99/0048-01. Estudio de los factores genéticos antiaterogénicos asociados a la expresión dela apolipoproteína E. (1999-2001).Investigador Principal: Miguel Pocoví Mieras

11. FIS 00/0546. Análisis de factores genéticos que modifican la expresión y la respuesta altratamiento enzimático sustitutivo en pacientes con la enfermedad de Gaucher-. (2000-2002).Investigador Principal: Pilar Giraldo Castellanos

12. DGES/FEDER 2FD97-2142-CO3. Mapa de Mutaciones del receptor LDL y desarrollo de unsistema de diagnóstico de las Hipercolesterolemias Familiares(1999-2001). Investigador Principal: Miguel Pocoví Mieras

13. PGE/FEDER SAF 2001-2466-Co5-01. Estudios genéticos en hipercolesterolemias familiaresautosómicas dominantes. (2001 –2004). Investigador Principal: Miguel Pocoví Mieras



NODO 4

2 Proyectos de Investigación BIOMED II - C.E.E.6 Proyectos de Investigación Nacionales (FIS, PNS)

NODO 5

14. Junta de Andalucía, 1997, NºR. 57. Acción de la dieta mediterránea (dieta rica en grasamonoinsaturada) sobre diversos factores de la coagulación de riesgo trombogénico.

15. Junta de Andalucía,1997, NºR: 58.Efecto de las variaciones genéticas en los genes de lasapolipoproteinas AI y AIV sobre los cambios inducidos por la dieta en la proteína transferidorade ésteres de colesterol.

16. FIS, 98/1531. Efecto de las variaciones en los locus genéticos de las apolipoproteinas AI, CIII,AIV, B y lipoprotein lipasa sobre la susceptibilidad a las LDL.

17. Junta de Andalucía, 1998. NºR: 132. Efecto de una dieta rica en grasa monoinsaturada sobre laexpresión de factor tisular en monocitos en personas sanas.

18. Junta de Andalucía, 1998, NºR: 126. Efecto de una dieta rica en grasa monoinsaturada sobre lafunción endotelial in vitro.

19. Junta de Andalucía,1999, NºR: 165. Interacción genes-dieta como determinante de laresistencia a la insulina en personas sanas de ambos sexos.

20. Junta de Andalucía, 1999. NºR: 116. Efecto de la dieta Mediterránea rica en aceite de olivasobre la función endotelial en enfermos con hiperlipemia primaria.

21. FIS 99/0949. Efecto de las variaciones genéticas en la región promotora del PAI-1 sobre lasmodificaciones plasmáticas de estas proteínas tras el consumo de una dieta rica en aceite deoliva (dieta Mediterránea).

22. AECI 99/26. Los polifenoles del aceite de oliva virgen. Su papel contra las enfermedadescardiovasculares.

23. Junta de Andalucía, CTS-212. Estudio de la influencia genética en la expresión de los factoresy mecanismos principales relacionados con la arteriosclerosis.

24. Junta de Andalucía, 2000. NºR: 39Las variaciones en los locus genéticos de lasapolipoproteinas AI,CIII, AIV, B y lipopreotin lipasa pueden influir en la susceptibilidad a laoxidación de las LDL durante el consumo de una dieta mediterránea rica en aceite de oliva.

25. Junta de Andalucía, 2000, NºR: 212 Efecto de la dieta mediterránea rica en aceite de olivasobre la captación "in vitro" de las LDL oxidadas por macrófagos.

26. CGICYT. SAF2001-2466-C05-04. Interacción entre la mutación en el receptor LDL y elpolimorfismo en el gen del transportador ABCG8, sobre el riesgo aterogénico en pacientes conhipercolesterolemia.

27. CGICYT. SAF2001-0366. Efecto de la dieta Mediterránea rica en aceite de oliva sobre lascaracterísticas aterogénicas de las lipoproteinas de baja densidad (LDL).

28. FIS, 2001/ 0449. Efecto de la alimentación mediterránea sobre la respuesta lipémicapostprandial y sus repercusiones sobre la función endotelial.

29. Junta de Andalucía,2002. NºR: 239. Efecto de la alimentación mediterránea sobre la respuestalipémica postprandial.

30. Junta de Andalucía, 2002. NºR: 243. Efecto de la dieta Mediterránea rica en aceite de oliva ypolifenoles sobre la función endotelial y la producción de óxido nítrico.



NODO 6

31. CICYT OLI96/2132. "Lipemia postprandial, subfracciones lipoproteicas, oxidación de laslipoproteínas de baja densidad y control glucémico en la diabetes mellitus no insulino-dependiente. Efectos de una dieta rica en ácidos grasos monoinsaturados a base de aceite de olivavirgen frente a una dieta baja en grasa y con un alto contenido en carbohidratos" InvestigadorPrincipal: E. Ros.

32. CICYT 97/0215. "Susceptibilidad humana a la proliferación peroxisómica por fibratoshipolipidemiantes. Relación con la activida delta-9 desaturasa". Investigador Principal: JC.Laguna

33. Telemaratón TV3 1999 Diabetes. Proyecto 2 años: “Estudi pilot de la lipèmia i glucèmiapostprandials domiciliàries en persones amb xifres de triglicèrids entre 100 i 200 mg/dl, amb isense glucèmia alterada en dejú. Relació amb el fenotip de les VLDL i LDL, l’oxidabilitat deles LDL, i la disfunció endotelial i la presència d’aterosclerosi carotídea mesurades perecografia.” Investigador Principal: E. Ros.

34. FISS 00/0992. Proyecto 3 años: “Estudio piloto de la lipemia y glucemia postprandialesdomiciliarias en personas con cifras de triglicéridos entre 100 y 200 mg/dl. Relación consensibilidad a la insulina, oxidación de LDL y disfunción endotelial.”. Investigador Principal:E. Ros.

NODO 7

35. Marató TV3/2000/Coordinado. Homocisteína y enfermedad: estudios genéticos, bioquímicos yclínicos de la homocistinuria y del riesgo cardiovascular. (2000-2002) .Investigador Principal:Susana Balcells/MªAntònia Vilaseca/Xavier Pintó

36. FIS 95/0040-01. Diagnóstico y seguimiento de las enfermedades del metabolismo energéticomitocondrial en la infancia. Investigado Principal: Mercedes Pineda Marfa.

37. Fundación Areces, 1995-1998. Caracterización molecular de las mutaciones en los genes de lahmg-coa liasa, acil-coa deshidrogenasa de cadena media y hmg-coa sintasa mitocondrial, quecausan deficiencias geneticas hereditarias. Investigador Principal: Fausto García Hegardt.

38. FIS 2000. Implicación de la ubiquinona-10 en la fisiopatología de la fenilcetonúria. Invetigador Principal. Jaume Campistol Plana39. DGICYT SAF 97-0074. Análisis molecular de la enfermedad de Gaucher y de la enfermedad

de Sanfilippo (tipos A y B). Correlación entre los datos genéticos, bioquímicos y clínicos.Estudios de expresión y optimización de vectores para terapia génica. (1997-2000).Investigador Principal: Lluïsa Vilageliu

40. Fundació La Marató de TV3. 98-1220. Expresión y caracterización de alelos mutantescausantes de la enfermedad de Gaucher, de la leucodistrofia metacromática y de lagangliosidosis GM2. Estudios preliminares para terapia génica. (1999-2001). InvestigadorPrincipal: Daniel Grinberg/Amparo Chabás

41. DGICYT SAF2000-0200. Caractarización molecular de la enfermedad de Gaucher,leucodistrofia metacromatica y las mucopolisacaridosis I y IIIA. Detección, expresión ycaractarización de alelos mutados. Optimización de vectores adenos y retrovíricos para terapiagénica. (2000-2003). Investigador Principal: Daniel Grinberg



42. FIS P102084 (en fase de evaluación). Estudio controlado con placebo, doble ciego, de gruposparalelos y aleatorizado para evaluar el efecto del tratamiento con ácido fólico-vitamina B12,con vitamina B6 y con la combinación de ambos sobre el metabolismo de la homocisteína.(2002-2003). Investigador Principal: Dra. María J. Castiñeiras Lacambra

NODO 8.

43. CICYT SAF97-0215. Susceptibilidad humana a la proliferación peroxisómica por fibratoshipolipemiantes. Relación con la actividad delta-9 desaturasa (2000). Investigador Principal:Juan Carlos Laguna.

44. CICYT SAF98-0105. Implicación de la MTP en la reducción de la secreción hepática detriglicéridos inducida por estatinas y fibratos (2000) Investigador Principal: Rosa M. SánchezC .

45. FIS 2000/1124 . Regulación del metabolismo lipídico por agonistas del receptor PPARαβ entejido hepático, adiposo, muscular y en monocitos/macrófagos. El receptor PPARβ comomodulador de la actividad PPARα. (2002). Investigador Principal: JC Laguna.

46. CICYT SAF2000-0201Efecto de los fibratos sobre el metabolismo lipídico en músculo, tejidoadiposo, hígado y monocitos /macrófagos. Nuevas posibilidades terapéuticas de los agonistasPPAR. (2003). Investigador Perincipal: � M. Vázquez

47. FIS 01/0075-01 C. Estudio mediante técnicas de array del efecto de estatinas y activadoresPPAR sobre el patrón de modificación génica inducido por LDL oxidadas en células THP-1(2003). Investigador Principal: M. Alegret.

NODO 9.

48. Telemaratón TV3-Enfermedades cardiovasculares. "Susceptibilidad a la arteriosclerosis deratones transgénicos para apoA-II humana y su descendencia tras cruzarlos con otros tipos deratones modificados geneticamente y que desarrollan arteriosclerosis masiva (knock-outs deapoE y receptor de LDL y transgénicos de PTEC)". (1997-1999). Investigador principal: F.Blanco Vaca .

49. CICYT. "Prevención y regresión de la arteriosclerosis mediante tratamiento condifenilhidantoína, un fármaco que aumenta las HDL, y evaluación de los mecanismosmoleculares implicados utilizando ratones geneticamente modificados que desarrollanarteriosclerosis masiva".(1988-2001). Investigador principal: F. González Sastre.

50. CICYT. "Papel de las HDL en la prevención de la modificación oxidativa de las LDL y de laarteriosclerosis: estudios en ratones transgénicos para apoA-II humana y en pacientes conarteriosclerosis coronaria". (1999-2002). Investigador principal: F. Blanco Vaca

51. Telemarató de TV3. "Caracterización fisicoquímica y funcional de la subfracción modificada,electronegativa de las lipoproteínas de baja densidad (LDL(-)) en la diabetes mellitus.Influencia del perfil glicémico". (2000-2002). Investigador principal: J. Ordóñez Llanos.

52. Telemarató TV3 Trasplantes. "Estudio comparativo de los efectos y mecanismos por los quelos inmunosupresores ciclosporina A, tacrolimus, y mofetil micofenolato actuan sobre eldesarrollo de hiperlipemia, hiperhomocisteinemia, arteriosclerosis común y post-trasplante".(2001-2003). Investigador principal: F. Blanco Vaca



53. FIS 2001-2004. “Patología molecular de la hiperlipemia familiar combinada: continuación delanálisis de un modelo animal (ratones transgénicos de apoA-II humana) y estudio de genes"candidato". Investigador principal: F. Blanco Vaca.

54. CICYT .. “Lipoproteínas circulantes modificadas (LDL electronegativa, LDL(-)) y respuestainflamatoria endotelial. Bases estructurales y mecanismos celulares implicados”. (2001-2003).Investigador principal: Jordi Ordóñez Llanos

55. FIS 2002. “Identificación de genes implicados en el metabolismo de triglicéridos y en lasensibilidad a la insulina en animales modificados geneticamente mediante la utilización debiochips”. Investigador principal: Josep Julve Gil.

NODO 10.

56. FIS 96/2063: “Dislipemias primarias: Diagnóstico y epidemiología de factores genéticos queinfluyen en la cardiopatía isquémica. Investigador principal: Dra. M.E. Armengod.

57. FIS 99/0300. “Estudio de la resistencia a la insulina en sujetos no obesos y no diabéticos, surelación con la grasa abdominal y el consumo de oxígeno. Modificación con el ejerciciomoderado. Investigador principal: Dr. Juan F. Ascaso Gimilio.

58. FIS 99/0008-01: “ Estudio de diferentes factores genéticos y bioquímicos de riesgo cardiovascularen las dislipemias primarias: hipercolesterolemia familiar e hiperlipemia familiar combinada”.(1999 –2001). Investigador principal: Dr. Carmena Rodríguez.

59. FIS 01/0056-02.: “ Parámetros antropométricos y bioquímicos que influyen en el fenotipolipoproteico y en la respuesta terapéutica a estatinas en la hipercolesterolemia familiarheterocigota”. (2001-2003). Investigador Principal: F. Javier Chaves Martinez

60. Generalitat de Valencia.GV01-46: “Defecto familiar de unión de apo B 100: efecto fundador,fenotipo lipoproteico y diferencias clínico-biológicas con la hipercolesterolemia familiarheterocigota. (2002-2004). Investigador principal: Jose T. Real Collado

61. Generalitat de Valencia. GV00-074-12. “Estudio del impacto sobre daño renal de lospolimorfismos presentes en los genes que codifican la sintasa de oxido nitrico, nadh oxidasa yxantin oxidasa. (2001-2002). Investigador principal: Dr. F. Javier Chaves Martínez.

62. FIS 01/0069-01.: “Estudio de la relación entre estrés oxidativo, hipertensión esencial y dañoorgánico: efecto de polimorfismos genéticos, niveles de expresión y actividad de los sistemassuperóxido dismutasa, catalasa y glutation”. (2001-2003).Investigador Principal: F. JavierChaves Martinez

63. FIS 01/3047: “Genes reguladores de la respuesta al estrés oxidativo en enfermedades con altoriesgo cardiovascular”. (2002- 2004). Investigador Principal: F. Javier Chaves Martinez

NODO 11

64. Direcció General de Recerca 1995SGR-00336. Unitat de Lípids i Nutrició.(1995 – 1997). Investigador Principal: Lluis Masana Marin65. Fundación La Marató TV3. Estudio del papel regulador de los ácidos grasos en la expresión de

los genes que controlan el metabolismo lipoproteico y la proliferación celular (1996 – 1998).Investigador Principal: Lluis Masana Marin



66. Direcció General de Recerca1997PIR-74 . Equipo de infraestructura (1997). Investigador Principal: Lluis Masana Marin67. CICYT SAF98-0081. Caracterización, clonaje y expresión génica de una nueva familia de receptores lipoproteicos implicados en la regulación de la trombogenicidad de la lesión aterotrombótica. (1998 – 2001). Investigador Principal: Javier Pedreño Egea68. Instituto de Cooperación con el Mundo Árabe. Estudio molecular de la Hipercolesterolemia

Familiar. Aplicación clínica en la enfermedad cardiovascular.(1999 – 2000). Investigador Principal: Lluis Masana Marin

69. Instituto de Cooperación con el Mundo Árabe.Efectos hipolipemaintes y antioxidantes delaceite (l'huile d'argan) en pacientes con enfermedad cardiovascular. (1999 – 2000) InvestigadorPrincipal: Rosa Solà Alberich

70. FIS 98/0228. Papel de los aldehidos derivados de la oxidación de los ácidos grasos en lapatogénia de la arteriosclerosis. Estudio in vitro e in vivo. 1998-2001. Investigador Principal:Luis Masana Marín

71. FIS 99/0945. Análisis de la secuencia de los genes de los receptores nucleares PPAR alfa,PPAR gamma y RXR alfa en pacientes con hiperlipemia familiar combinada y estudio de laregulación de su funcionalidad por la vitamina A.(1999 – 2002). Investigador Principal: JosepRibalta Vives

72. Comisión de la Comunidad Europea QLK1-1999-CT-00830. Vitamin A, vitamin E andcarotenoid status metabolism during ageing: Fuctional and metabolism during ageing:Functional and nutritional consequences (VITAGE). (2000 – 2003). Investigador Principal:Josep Ribalta Vives

73. FIS 01/398. Estudio de las variaciones genéticas en las regiones promotora y catalítica de los genes de enzimas antioxidantes y su relación con la enfermedad vardiovascular en la diabetes mellitus tipo 2. (2001-2003). Investigador Principal: Luis Masana Marín

NODO 12

74. CICYT SAF96- 0264- C02-02 "Estudio genético y funcional de mutaciones asociadas ahipoalfalipoproteinemia y riesgo aterogénico”.

75. FIS 99/0048-02 “Estudio de factores genéticos antiaterogénicos asociados a la expresión de apoE”.

NODO 13

76. Unión Europea. V Programa Marco QLRT-2001-00435 Solvent-tolerant bacteria allowing abroader perfomance of biotransformation of organic compounds in two-phases fermentationSystems (2002-2005)

77. Unión Europea. V Programa Marco GRD1-2001-41861. Development of Smart Nanorobot forSensor-based Handling in a Scanning Electron Microscope. Applications inPharmacogenomics. (2002-2005)

78. Unión Europea. Programa Marie Curie MCFI-2001-0068. A functional genetic approach tounderstanding the plant hypersensitive response.(2002-2003)

79. Ministerio de Ciencia y Tecnología. Programa PROFIT FIT-010000-2000-87. Desarrollo de DNA-chips para el diagnóstico precoz y tratamiento del cáncer (2000)



80. Ministerio de Ciencia y Tecnología. Programa PROFIT IBEROEKA. FIT-010000-2001-62.Desarrollo de sistemas de diagnóstico precoz e identificación de dianas terapéuticasmediante tecnología DNA-Chip.(2001-2003)

81. Ministerio de Ciencia y Tecnología. Programa PROFIT. FIT-010000-2001-96.Diseño de unmicrochip de cDNA para la detección de resistencia a la Quimioterapia en pacientes con cáncerde pulmón. (2001-2003)

82. Ministerio de Ciencia y Tecnología. Programa PETRI95-0538-OP Sistema de transfecciónbasado en un péptido sintético (2002-2003)

83. Ministerio de Ciencia y Tecnología. Plan Nacional (P4) AGL2000-0394-P4-04. Desarrollo dechips de DNA para la detección específica y simultánea de agentes pitopatógenos y genes derespuesta a la infección en Solanum tuberosum. (2001-2004).

84. Ministerio de Ciencia y Tecnología. Plan Nacional (P4) AGL2000-0067-P4-03Producción y técnicas de formulación de Penicillium oxalicum para el control biológico deenfermedades.(2001-2004)

NODO 14

85. CICYT ALI96-0456. Influencia de los triglicéridos y los componentes menores del aceite deoliva virgen y girasol alto-oleico sobre el metabolismo lipídico: estudios in vitro e in vivo.(1996-1998)

86. FIS 96/0447. Influencia del polimorfismo de la Apo E en la hipercolesterolemia y composiciónlipídica de la membrana celular en la hipertensión arterial esencial.(1996-1998)

87. CICYT OLI96-2126. Modificaciones de la membrana de células endoteliales y vasculares, surespuesta a factores de crecimiento y citoquinas, por la fracción glicerídica del aceite de oliva.(1997-1999)

88. Junta de Andalucía 1997, REF 5. Influencia de la composición de esfingomielina de lamemberana plasmática sobre factores celulares predictores de riesgo cardiovascular (1998).

89. FIS 99/00305. Modificación del estrés oxidativo en pacientes hipertensos tratados consimvastatina y/o enalapril. (1999-2000)

90. INIA CA99-006. Efectos beneficiosos de las dietas ricas en aceite de oliva virgen sobremodelos de inflamación aguda y crónica. Influencia sobre el sistema inmunológico.Modificación de la respuesta y función de leucocitos polimorfonucleares. (1999-2001)

91. FEDER 1FD97-2288. Modificación por la dieta de factores de riesgo cardiovascular enancianos. Importancia de los triglicéridos del aceite de oliva virgen. (2000-2002)

92. FIS 99/ .Determinantes genéticos de la hipertrofia del ventrículo izquierdo en la hipertensiónarterial esencial. (2000-2002).

93. CICYT ALI99-0863. Efecto de lipoproteínas postprandiales procedentes de la ingesta rica enácidos grasos monoinsaturados sobre mecanismos celulares implicados en la arteriosclerosis.(2000-2003).

94. CICYT AGL2001-0584. Aterotrombogenicidad de las lipoproteínas remanentes ricas entriglicéridos y su modulación por factores nutricionales.(2001-2004)

NODO 15

95. CICYT SAF96-0011. Acción antioxidante de los flavonoides. Aproximación a su efecto protectorde la arteriosclerosis y la proliferación celular.(1996-1998). I.P.: M.A. Lasunción.



96. FIS, 97/0389. Repercusión del metabolismo lipídico sobre la respuesta del macrófago en relacióncon la aterogénesis: efecto de los hipolipemiantes. (1997-1999). I.P.: D.Gómez-Coronado.

97. Comunidad Autónoma de Madrid 08.4/0006/1997. Dieta, lípidos y antioxidantes en plasma enpoblación infantil de la Comunidad de Madrid.(1998-1999). I.P.: M.A. Lasunción.

98. FIS 99/0286. Efecto de la inhibición de la síntesis de colesterol sobre la secreción de citocinasproinflamatorias: Estudio en células en cultivo y en pacientes con hipercolesterolemiafamiliar..(1999-2001). I.P.: M.A. Lasunción.

99. FIS, 00/0229. Papel de la vía del mevalonato en la respuesta inmune Th1 en relación con laaterogénesis. Efecto regulador de las estatinas.(2000-2002). I.P.: D.Gómez-Coronado.

100. Ministerio de Ciencia y Tecnología (INIA), VIN00-0004. Efecto del suplemento dietéticocon antioxidantes de la uva en pacientes con insuficiencia renal.(2000-2002). I.P.: M.A.Lasunción.

101. Consejería de Educación de la CAM 08.4/0037/2001.Acciones del colesterol y sus análogosestructurales sobre el ciclo celular. (2002-2003). I.P.: M.A. Lasunción.



ARTICULOS CIENTÍFICOS PUBLICADOS EN REVISTAS INDEXADAS, ÚLTIMOSAÑOS.

NODO 1

1. Ordovás JM, López-Miranda J, Mata P, Perez-Jimenez F, Lichtenstein AH, Schaefer EJ. Gene-diet interaction in determining plasma lipid response to dietary intervention. Atherosclerosis1995;118:S11-S27.

2. Carmena R, De Oya M, Gómez-Gerique J, Mata P, et al. Pravastatin, Cholestyramine, andBezafibrate in patients with heterozygous familial hypercholesterolemia: The SpanishMulticenter Pravastatin Study. Cardiovasc Risk Factors 1996;6:55-61.

3. Mata P, Alonso R, López-Farré A, et al. Effect of dietary fat saturation on low densitylipoprotein oxidation and monocyte adhesion to human endothelial cells in vitro. ArteriosclerThromb Vasc Biol 1996;16:1347-1355.

4. Alvarez-Sala LA, Mata P, Blazquez E, Garrido JA, Ordovás JM, Rubio MJ, De Oya M.Pravastatina aumenta la actividad de receptores LDL en linfocitos de individuos conhipercolesterolemia familiar heterocigota. Rev Clin Esp 1997;197:317-322.

5. Mata P, Varela O, Alonso R, Lahoz C, De Oya M, Badimon L. Monounsaturated andpolyunsaturated n-6 fatty acid-enriched diets modify LDL oxidation and decrease humancoronary smooth muscle cell DNA synthesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997;17:2088-2095.

6. Lahoz C, Alonso R, Ordovás JM, López-Farré A, De Oya M, Mata P. Effects of dietary fatsaturation on eicosanoid production, platelet aggregation and blood pressure. Eur J Clin Invest1997;27:780-787.

7. Sanchez L, Casado S, Farré J, Garcia M, Rico L, Monton M, Romero J, Bellver T, Sierra M,Guerra J, Mata P, Esteban A, López-Farré A. Comparison of in vitro effects of trifusal andacetysalicylic acid on nitric oxide synthesis by human neutrophils. Eur J Pharmacol1998;343:57-65.

8. Gonzalez F, Lopez-Farré A, Rodriguez-Feo JA, Mata P, Millas I, Garcia-Duran M, et al.Expression of inducible nitric oxide synthase after endothelial denudation of rat carotid artery:role of platelets. Circulation Research 1998;83:1080-87.

9. Lahoz C, Alonso R, Porres A, Mata P. Efecto de la saturación de la grasa de la dieta sobre laconcentración plasmática de la lipoproteina (a) y de los lípidos plasmáticos. Med Clin (Barc)1998;110:641-645.

10. Ordovas JM, Lopez-Miranda J, Mata P, Perez-Jimenez F. Gene-environment interactions inlipoprotein metabolism. Nutr Metab Cardiovasc Dis 1998;8:47-61.

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