Reacción en cadena de la polimerasa para la detección rápida y determinación del serotipo de virus del dengue en muestras clínicas

Delfina Rosario,1 Mayling Álvarez,1 Javier Díaz,2

Rodolfo Contreras,3 Rosmari Rodríguez,1

Susana Vázquez 1 y María G. Guzmán 1

El trabajo que aquí se presenta describe las ventajas de usar la reacción en cadena de la po-limerasa con transcriptasa inversa (RCP-TI) para detectar e identificar con rapidez virus deldengue en muestras clínicas. Se sometieron directamente a RCP-TI 27 muestras obtenidasde pacientes con fiebre de dengue y fiebre hemorrágica de dengue durante epidemias en Co-lombia, Nicaragua y Panamá. El ADN de cadena doble obtenido con la RCP-TI se identificómediante una segunda amplificación (RCP de anidación) utilizando cebadores específicospara cada tipo de virus, aislamiento vírico e inmunofluorescencia indirecta (IFI) y con elec-troinmunoensayo enzimático detector de anticuerpos IgM contra el virus del dengue. El ge-noma vírico amplificado se detectó e identificó en un máximo de 8 horas. Los parámetros cal-culados para hacer el diagnóstico por RCP-TI, usando el aislamiento vírico y la IFI comoestándar de oro, fueron una sensibilidad de 100%; una especificidad de 78%; un valor pre-dictivo positivo de 69% y un valor predictivo negativo de 100%. Cabe notar que dos de losespecímenes que dieron resultados positivos a la prueba de RCP-TI anidada y negativos alaislamiento vírico mostraron anticuerpos específicos de tipo IgM. Los resultados de la RCP-TI en general mostraron una estrecha concordancia con los del aislamiento vírico, lo cual su-giere que la RCP es un procedimiento que facilita enormemente el diagnóstico rápido y tem-prano del dengue.

RESUMEN

La fiebre del dengue (FD) y la formagrave de la enfermedad, conocida por

fiebre hemorrágica del dengue (FHD)o síndrome de choque por dengue(SCD) y producida por cuatro seroti-pos distintos de virus (1, 2, 3 y 4), sonun problema de salud importante enpaíses tropicales (1, 2). En los últimos20 años, los virus transmitidos por ar-trópodos han surgido de nuevo comocausa importante de enfermedad enseres humanos. Durante este período,la frecuencia de epidemias por FD ha

aumentado enormemente en numero-sos países americanos que no habíannotificado casos de dengue en 50 añoso más, y se han producido casos deFHD en zonas nuevas con una alta in-cidencia de dengue, tales como Brasil,Colombia, El Salvador, México, Nica-ragua y Puerto Rico. La expansión te-rritorial de las epidemias de dengue enlos años ochenta afectó a América delSur, América del Norte y Centroamé-

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1 Instituto de Medicina Tropical Pedro Kourí, LaHabana, Cuba. Toda correspondencia debe diri-girse a Delfina Rosario a la siguiente direcciónpostal: Instituto de Medicina Tropical PedroKourí, Apartado 601, Marianao 13, La Habana,Cuba. Teléfonos: 53-7-204910 al 29 y 53-7-336051.Fax: 53-7-215957 y 53-7-336051.

2 Universidad de Antioquia, Facultad de Medicina,Medellín, Colombia.

3 Centro Conmemorativo Gorgas, Ciudad de Pa-namá, Panamá.

rica, África, China y Australia, y secree que continuará en ciertos lugaresinfestados con Aedes aegypti (3), de loscuales son ejemplos varios países delcentro y sur del África, estados del surdel Brasil, Paraguay y el norte de Ar-gentina. Según la OMS, 2 000 millonesde personas en el mundo se encuen-tran en riesgo y 10 a 60 millones decasos ocurren cada año, a un costo ele-vadísimo si se suman las medidas decontrol, la atención médica y las horaslaborales perdidas.

De 1980 a 1994 aumentaron notable-mente el territorio afectado y la inci-dencia de dengue en las Américas. Du-rante este período toda actividad pordengue en la Región se debió a los se-rotipos 1, 2 y 4. No obstante, en octu-bre de 1994 el serotipo 3 volvió a apa-recer en la Región (4–6) y en abril delmismo año la OPS declaró un estadode alerta en los países y recomendó re-forzar la vigilancia del virus y las me-didas de control (3, 6).

El departamento de virología delInstituto de Medicina Tropical PedroKourí en La Habana, Cuba, que es unCentro Colaborador de la OPS/OMSen Materia de Enfermedades Víricas,suele recibir muestras de suero de mu-chos países de la Región para el diag-nóstico de dengue o su confirmación.Las técnicas estándares que se utilizanen el Instituto son el aislamiento delvirus en cultivos celulares y el inmu-noensayo enzimático (ELISA) de cap-tura para la detección de IgM. En losúltimos años también se ha usado elmétodo de la reacción en cadena de lapolimerasa con transcriptasa inversa(RCP-TI) para detectar la presencia delgenoma del virus del dengue (7–13).En el presente estudio se detectaronfragmentos del genoma de este virusmediante el uso de una RCP-TI de unsolo paso. La identificación del sero-tipo se hizo con una RCP de anidacióny una serie de cebadores antisentidoespecíficos para cada uno de los cuatroserotipos del virus del dengue. Con es-tos cebadores se obtuvieron productosde la RCP de distintos tamaños que sepudieron identificar con facilidad me-diante electroforesis en gel de agarosa.Por ser el dengue una enfermedad fe-

bril aguda, su diagnóstico tempranopodría mejorar la eficacia de su trata-miento y facilitar la aplicación de me-didas para el control del vector. Estosmotivos nos llevaron a evaluar las po-sibilidades de usar la RCP-TI para eldiagnóstico temprano y rápido de lainfección vírica usando muestras desuero recolectadas en Colombia, Nica-ragua y Panamá.4

En el presente estudio se detectaronfragmentos del genoma del virus deldengue mediante el uso de una RCP-TI de un solo paso. La identificación deserotipos se hizo con una RCP de ani-dación y una serie de cebadores anti-sentido específicos para cada uno delos cuatro serotipos del virus del den-gue. Con estos cebadores se obtuvie-ron productos de la RCP de distintostamaños que se pudieron identificarcon facilidad mediante electroforesisen gel de agarosa. Los resultados deeste estudio sugieren que esta pruebaes lo suficientemente confiable parapoder aplicarse en el diagnóstico tem-prano del dengue en varios países dela Región y en estudios de epidemiolo-gía molecular.

MATERIALES Y MÉTODOS

Sueros de pacientes

Las 27 muestras de suero usadas eneste estudio se recogieron durante lafase aguda de la enfermedad (24 horasa 5 días después de los primeros sín-tomas) de pacientes colombianos (15muestras), nicaragüenses (10 mues-tras) y panameños (dos muestras) queentre octubre de 1994 y julio de 1995recibieron un diagnóstico clínico deFD o de FHD. Las muestras de sueroprocedentes de Colombia y Panamá sesometieron a pruebas en cultivos celu-

lares en sus respectivos países y poste-riormente se enviaron a Cuba, dondese almacenaron a �70 °C hasta ser es-tudiadas en el Instituto de MedicinaTropical Pedro Kourí. El tiempo dealmacenamiento varió de 15 días a 6meses, pero en nuestra experiencia lasmuestras almacenadas a una tempera-tura estable de �70 °C o menos hansido útiles durante años, tanto para eldiagnóstico por aislamiento en cultivocelular como por RCP-TI. Las mues-tras procedentes de Nicaragua se en-viaron en refrigeración a fin de mante-ner la viabilidad de los virus y al llegara Cuba se sometieron a análisis en cul-tivos celulares. Todas las muestras sesometieron a ELISA de captura para ladetección de IgM (14), técnica que seinventó en el laboratorio de referen-cia del Instituto para la detección dearbovirus (JL Pelegrino, comunicaciónpersonal).

Cultivos y medios celulares

Una línea celular del clono C6/36 de mosquitos Aedes albopictus se cul-tivó a 28 °C en el medio mínimo esen-cial (MME) de Eagle suplementadocon suero fetal bovino (SFB) al 10% y0,2 mM de aminoácidos no esenciales.Para el medio de mantenimiento seredujo el SFB a una concentración de2%. El medio de mantenimiento se usódespués de inocular las células con losespecímenes de suero para aislar elvirus.

Cepas de virus del dengue

En el presente estudio se usaron lassiguientes cepas prototípicas de virusdel dengue: cepa cubana de virus del dengue tipo 1 (DEN-1) D1-77 (15);cepa cubana de virus del dengue tipo 2(DEN-2) A15 obtenida durante la epi-demia de 1981 (16); cepa nicaragüensede virus del dengue tipo 3 (DEN-3)NIC-24 obtenida durante la epidemiade 1994 (4), y cepa H241 de virus deldengue tipo 4 (DEN-4).

2 Rosario et al. • Reacción en cadena de la polimerasa para detección de virus del dengue

4 Esto se hizo por recomendación de funcionarios dela OPS durante el Curso Internacional sobre elDengue y la Fiebre Hemorrágica del Dengue en lasAméricas , que tuvo lugar en el Instituto de Medi-cina Tropical Pedro Kourí en 1995.

Antisueros

Se usaron para nuestro estudio loscuatro siguientes anticuerpos mono-clonales específicos contra cada sero-tipo de virus del dengue: 15F3 (DEN-1); 3H5 (DEN-2); 5D4 (DEN-3), y 1H10(DEN-4). Estos fueron proporcionadosen su totalidad por los Centros para elControl y la Prevención de Enferme-dades, Atlanta, Georgia, EUA.

Aislamiento, identificación ydeterminación de serotipos víricosmediante inmunofluorescenciaindirecta

La capa monocelular del clonoC6/36 fue inoculada con 40 �L desuero e incubada a 28 °C durante unahora. Después de la incubación se leañadieron 2 mL de medio de manteni-miento a cada tubo de cultivo, que sevolvió a incubar a 28 °C durante 10días. Los cultivos celulares se sometie-ron a inmunofluorescencia indirecta(IFI) para detectar la presencia devirus del dengue (17, 18), usando lí-quido ascítico policlonal contra elvirus tipo 3 (que a una dilución baja,como de 1:10, reacciona con los cuatroserotipos de virus del dengue). Unavez observada la fluorescencia espe-cífica, se procedió a identificar losserotipos víricos con anticuerpos mo-noclonales. En los casos en que no seprodujo inmunofluorescencia, se efec-tuó una segunda pasada por el mismocultivo celular y se repitió el tamizaje.

Extracción del ácido ribonucleico

El ácido ribonucleico (ARN) delvirus se aisló mediante una modifica-ción del procedimiento descrito porChomczynski y Sacchi (19). Básica-mente, 200 �L de cada muestra desuero o de líquido sobrenadante de cé-lulas infectadas se mezclaron con unvolumen idéntico de amortiguadorlítico de isotiocianato de guanidina abase de 8 M de isotiocianato de guani-

dina, 50 mM de citrato de sodio,100 mM de 2-mercaptoetanol, 1% desarcosil y 1 �g/mL de ARN de transfe-rencia obtenido de levadura.

Para extraer el ARN de las célulasinfectadas, utilizamos amortiguador lí-tico diluido a la mitad de su concen-tración normal. Posteriormente a la so-lución se le añadieron los siguientesconsecutivamente (las partes se dan en relación con el volumen final de lamuestra más el amortiguador lítico):1/10 de acetato sódico 2 M (a un pH de4); un volumen idéntico de fenol balan-ceado con agua, y 2/10 de cloroformo.Esta mezcla se centrifugó a 16 000 rota-ciones/minuto durante 15 minutos yla fase acuosa se recogió y combinócon un volumen idéntico de isopropa-nolol para precipitar el ARN. Despuésde la centrifugación, el botón de ARNse enjuagó con 200 µL de etanol al 75%y se disolvió en 20 µL de agua.

Reacción en cadena de la polimerasacon transcriptasa inversa

Se aplicó la técnica de la reacción encadena de la polimerasa con transcrip-tasa inversa (RCP-TI) descrita por Lan-ciotti et al. (20). Se añadieron 10 �L delARN vírico investigado a 90 �L de unamezcla de RCP-TI con los siguientescomponentes: 50 mM de KCl, 10 mMde medio Tris (a un pH de 8,5), 1,5 mMde MgCl2, 0,01% de gelatina, 200 �Mde cada uno de cuatro desoxinucleóti-dos fosfatados, 5 mM de ditiotreitol,50 pmol de cada uno de dos cebado-

res5 (D1 y D2, cuadro 1) con un gradomáximo de correspondencia nucleotí-dica con los cuatro serotipos víricos,10 U de TI-AMV (nombre comercialdel reactivo de la Boehringer que con-siste en virus de la micoblastosis avia-ria y transcriptasa inversa) y 2,5 U depolimerasa de ADN Taq (Boehringer).Se dejó que procedieran las reaccionesen un termociclador (marca MJ Re-search, Inc., Watertown, Massachu-setts, EUA) programado para unaincubación de 30 minutos a 42 °C se-guida de 35 ciclos de desnaturaliza-ción (a 94 °C durante 30 segundos),templado (annealing) con el cebador (a55 °C durante 1 minuto) y extensión (a72 °C durante 2 minutos).

Determinación del serotipo víricocon una segunda amplificación concebadores específicos para cadaserotipo (RCP de anidación)

Se inició una segunda reacción am-plificadora con 1 �L del producto de laprimera RCP. La mezcla usada para lasegunda reacción tenía todos los com-ponentes usados en la primera, con lassiguientes excepciones: se reemplazóel cebador D2 con cebadores TS1, TS2,TS3 y TS4 (cuadro 1) para serotiposvíricos específicos y se eliminaron elditiotreitol y la TI. Las muestras se so-

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CUADRO 1. Cebadores de oligonucleótidos usados para amplificar los virus del dengue ydeterminar su serotipo

Cebador Secuencia de bases Longitud del ADN producido

D1 5’ TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG 3’ 511 pba

D2 5’ TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC 3’ 511 pbTS1 5’ CGTCTCAGTGATCCGGGGG 3’ 482 pb (D1 y TS1)TS2 5’ CGCCACAAGGGCCATGAACAG 3’ 119 pb (D1 y TS2)TS3 5’ TAACATCATCATGAGACAGAGC 3’ 290 pb (D1 y TS3)TS4 5’ CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA 3’ 392 pb (D1 y TS4)

a pb = pares de bases.

5 Todos los cebadores usados en este estudio fueronproporcionados por cortesía de Eva Harris de laUniversidad de San Francisco, San Francisco, Cali-fornia, EUA.

metieron a 26 ciclos de desnaturaliza-ción (a 94 °C durante 30 segundos),templado con el cebador (a 55 °C du-rante 1 minuto) y extensión con el ce-bador (a 72 °C durante 2 minutos).Una porción de 10 �L del producto dela reacción se sometió a electroforesisen gel de agarosa al 2,5% usando unamortiguador a base de 0,4 M demedio Tris, 0,5 M de acetato sódico y0,01 M de ácido etilendiamín tetracé-tico. Debido a la posición en que actúacada uno de los cebadores para los dis-tintos serotipos de virus del dengue, el tamaño de la banda de ADN obte-nida fue distintiva para cada serotipode virus.

RESULTADOS

Hemos aplicado la RCP de anida-ción a 27 especímenes de suero reco-lectados de pacientes con un diagnós-tico clínico de FD (25 pacientes) o FHD(2 pacientes) durante la fase aguda dela enfermedad (de 24 horas a 5 díasdespués de los primeros síntomas). Seaislaron virus del dengue por cultivocelular de nueve de las muestras y seconfirmó su serotipo mediante IFI.Dos de estos sueros contenían anti-cuerpos IgM contra el virus del den-gue y hubo que volver a pasar lasmuestras por el mismo sistema de cul-tivo celular antes de poder identificarel virus con los anticuerpos monoclo-nales. De los 18 sueros que salieronnegativos al cultivo de virus, nuevemostraron anticuerpos IgM.

Al aplicarse la RCP-TI y la RCP deanidación, el ARN de virus del denguese detectó en el suero de los nueve pa-cientes en quienes se había aislado elvirus y en el de cuatro de los 18 pacien-tes con cultivos víricos negativos. Estoda una correlación de 85,1% entre losresultados del cultivo celular y los dela RCP-TI. El serotipo presente en los13 especímenes positivos en la RCP se determinó con RCP de anidaciónusando cebadores específicos paracada serotipo y se confirmó volviendoa someter las muestras originales porsegunda vez a RCP-TI y RCP de anida-ción. Cuatro muestras resultaron posi-

tivas al serotipo 1 (una de Panamá ytres de Colombia), tres al serotipo 2(todas de Colombia) y seis al serotipo 3(todas de Nicaragua). La identificaciónde los serotipos mostró concordanciacompleta con los resultados de la IFI.

Las 27 muestras de suero se sometie-ron a ELISA de captura para IgM conespecificidad contra el virus del den-gue y 15 sueros mostraron anticuerposIgM contra este virus. Solamente cua-tro de ellos fueron positivos a la RCPde anidación. Si el aislamiento en cul-tivo celular se toma como “estándar deoro”, la sensibilidad de la RCP fue de100%, su especificidad de 77% , su va-lor predictivo positivo (VPP) de 69,2%y su valor predictivo negativo (VPN)de 100%.

DISCUSIÓN

A pesar de que el método de RCPideado por Lanciotti et al. en 1992 (20)ha sido probado previamente en dis-tintos lugares y momentos con distin-tas cepas de virus del dengue obteni-das de muestras de sueros virémicos ytambién con virus prototípicos están-dar, hace falta evaluar más a fondo suutilidad, especificidad y sensibilidadpara detectar e identificar los serotiposde virus del dengue presentes enmuestras tomadas de pacientes.

Para poder identificar con exactitudlos serotipos de virus del dengue apli-cando la RCP de anidación con la mez-cla de cebadores específicos se necesitaúnicamente someter el producto am-plificado a electroforesis en gel deagarosa, mientras que el protocolo dehibridación exige que se rotulen, puri-fiquen y estandaricen sondas que sue-len ser difíciles de reproducir (7).

En nuestro estudio notificamos unabuena correlación (85,1%) con los re-sultados del cultivo celular estandari-zado, pese a que este procedimiento sellevó a cabo en tres laboratorios distin-tos de Colombia, Cuba y Panamá.

Debido al peligro de contaminacióncruzada con RCP-TI durante la libremanipulación del producto amplifi-cado, se han observado en ocasionesresultados positivos falsos al aplicar la

técnica de la RCP (7, 8, 21, 22). Se evitóeste problema mediante una serie deprecauciones (la separación física de lamanipulación antes y después de laRCP, la irradiación con luz ultravioletade las mezclas usadas en las reaccio-nes, y la inclusión de varias muestrassin ADN para llevar un control cuida-doso durante cada ensayo).

Las 15 muestras positivas a IgM es-pecífica contra virus del dengue de-muestran que es posible detectar anti-cuerpos antivíricos incluso al final dela fase aguda de la enfermedad.

Se pudo amplificar el ADN comple-mentario al ARN vírico en cuatromuestras que salieron negativas al cul-tivo de virus. Es posible que en dossueros con anticuerpos IgM los inmu-nocomplejos hayan inhibido la suscep-tibilidad de las células a la infecciónvírica. Otras razones que podrían ex-plicar los resultados negativos falsosson la presencia de títulos víricos bajosy la conservación de la muestra a unatemperatura inadecuada antes de laprueba. Nuestros resultados de sensi-bilidad, especificidad, VPP y VPN seasemejan a los notificados en otros tra-bajos publicados (7).

Estos datos ponen de relieve lamayor sensibilidad de la RCP, y parti-cularmente de la RCP de anidación,cuando se compara con la de otros mé-todos. Esta prueba puede hacerse en 8horas y usarse para complementar, yen algunos casos sustituir, a las técni-cas establecidas en muchos países dela Región. Otra posible aplicación quedebe explorarse es la de usar la RCP-TIpara detectar e identificar serotipos delvirus del dengue en familias de mos-quitos capturados al aire libre duranteactividades de vigilancia entomoló-gica. La técnica básica de amplificardirectamente el ARN hasta convertirloen ADN de doble cadena por acción dela transcriptasa inversa puede apli-carse para amplificar una región ex-tensa del genoma con objeto de se-cuenciarla rápidamente o de haceranálisis de restricción del mismo pro-ducto amplificado, procedimiento queresulta más fácil y que tiene utilidadpara hacer análisis epidemiológicos yestudios de evolución (23).

4 Rosario et al. • Reacción en cadena de la polimerasa para detección de virus del dengue

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Manuscrito recibido el 30 de abril de 1997 y aceptadopara publicación, en versión revisada, el 21 de abril de1998.

REFERENCIAS

Rev Panam Salud Publica/Pan Am J Public Health 4(1), 1998 5

This study describes the benefits of using reverse transcriptase polymerase chain re-action (RT-PCR) for the rapid detection and typing of dengue virus in clinical sam-ples. Twenty-seven serum specimens from patients with dengue fever and denguehemorrhagic fever in Colombia, Nicaragua, and Panama were directly subjected toRT-PCR for the detection of dengue virus. The resulting double-stranded DNA prod-uct was typed by a second round of PCR amplification (nested PCR) with type-specific primers, viral culture/indirect immunofluorescence (IIF), and enzyme-linkedelectroimmunoassay for IgM anti-dengue antibodies. The amplified virus genomewas detected and typed within 8 hours. Nested RT-PCR, using viral culture and IIFas the gold standard, showed 100% sensitivity; 78% specificity; 69% positive predic-tive value, and 100% negative predictive value. It is noteworthy that two of thespecimens whose results were positive with nested RT-PCR and negative with viralculture showed specific IgM antibodies. The results of the RT-PCR were in closeagreement with those obtained through viral culture. This suggests PCR can greatlyfacilitate the rapid and early diagnosis of dengue infection.

ABSTRACT

Polymerase chain reaction forrapid detection and

serotyping of dengue virusesin clinical samples