INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERÍA QUÍMICA E

INDUSTRIAS EXTRACTIVAS

SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

““EELLIIMMIINNAACCIIÓÓNN DDEE CCLLOORROOFFEENNOOLLEESS MMEEDDIIAANNTTEE LLAA CCOOMMBBIINNAACCIIÓÓNN DDEE OOZZOONNAACCIIÓÓNN PPRREEVVIIAA YY

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TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRO EN CIENCIAS EN INGENIERÍA QUÍMICA

PRESENTA: PAMELA GUERRA BLANCO

DIRECTOR DE TESIS: DRA. TATIANA TIMOSHINA LUKIANOVA

MÉXICO, D.F. JUNIO 2010

CONTENIDO CONTENIDO RESUMEN ABSTRACT ÍNDICE DE TABLAS ÍNDICE DE FIGURAS LISTA DE ABREVIATURAS INTRODUCCIÓN CAPÍTULO 1 GENERALIDADES....................................................................... 1

1.1 Clorofenoles como contaminantes del agua .............................................. 1 1.1.1. Propiedades físicas y químicas ......................................................... 2 1.1.2. Toxicidad de los clorofenoles ............................................................. 3 1.1.3. Normatividad respectiva a los fenoles ............................................... 4

1.2 Procesos de tratamiento de agua para eliminar clorofenoles .................... 6 1.2.1. Procesos de tratamiento no destructivos (Recuperación) .................. 6 1.2.2. Procesos de tratamiento destructivos ................................................ 7

1.3 Ozonación ................................................................................................. 8 1.3.1. Propiedades oxidativas del ozono ..................................................... 8 1.3.2. Ventajas y desventajas del ozono aplicado a tratamiento de agua ... 9

1.4 Procesos de Oxidación Avanzada (POAs) .............................................. 10 1.4.1. Definición de POAs .......................................................................... 10 1.4.2. POAs no fotoquímicos ..................................................................... 11 1.4.3. POAs fotoquímicos .......................................................................... 13

1.5. Ozonación y Procesos de Oxidación Avanzada aplicados en la descomposición de fenoles ........................................................................... 14 1.6 Biodegradación ....................................................................................... 18

1.6.1. Definición de biodegradación ........................................................... 18 1.6.2. Ventajas y desventajas de la biodegradación en el tratamiento de agua ........................................................................................................... 20

1.7. Biodegradación de clorofenoles ............................................................. 20 1.8. Combinación de tratamientos químicos y biológicos para la eliminación de contaminantes .......................................................................................... 24

CAPÍTULO 2 DESARROLLO EXPERIMENTAL...............................................29 2.1 Materias primas ....................................................................................... 29 2.2 Esquema experimental a nivel laboratorio............................................... 29

2.2.1 Proceso de ozonación ...................................................................... 31 2.2.2 Proceso de Biodegradación .............................................................. 33 2.2.3. Métodos analíticos ........................................................................... 38

CAPÍTULO 3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................41 3.1 Ozonación previa de clorofenoles ........................................................... 41

3.1.1 Saturación de ozono en agua .......................................................... 42 3.1.2 Descomposición del 4-Clorofenol con ozono ................................... 43

3.1.3 Descomposición del 2,4-Diclorofenol con ozono ............................. 52 3.2 Biodegradación de clorofenoles sin pre-tratamiento químico .................. 62

3.2.1 Aclimatación de microorganismos a fuentes de carbono no ozonadas ................................................................................................................... 62 3.2.1 Biodegradación del 4-Clorofenol ....................................................... 63 3.2.2 Biodegradación del 2,4-Diclorofenol ................................................. 64 3.2.3 Biodegradación de los principales intermediarios del proceso de ozonación de clorofenoles ......................................................................... 66

3.3 Selección de las condiciones de ozonación para el tratamiento acoplado (químico-biológico) ........................................................................................ 70

3.3.1 Selección de los tiempos para suspender la ozonación previo a la biodegradación .......................................................................................... 70 3.3.2 Aclimatación de los microorganismos a clorofenoles ozonados ...... 76

3.4 Biodegradación de los clorofenoles pre-ozonados. ............................... 84 3.4.1 Biodegradación del 4-clorofenol previamente ozonado bajo pH 7. .. 85 3.4.2 Biodegradación del 4-clorofenol previamente ozonado bajo pH 12. 94 3.4.3 Biodegradación del 2,4-diclorofenol previamente ozonado bajo pH 7 ................................................................................................................... 96 3.4.4 Biodegradación del 2,4-diclorofenol previamente ozonado bajo pH 12. ............................................................................................................ 100

CONCLUSIONES ............................................................................................105 RECOMENDACIONES ....................................................................................107 BIBLIOGRAFÍA ...............................................................................................108 ANEXOS ..........................................................................................................114

ANEXO A. CURVAS DE CALIBRACIÓN DEL ESPECTROFOTÓMETRO UV-VIS .............................................................................................................. 114 ANEXO B CURVAS DE CALIBRACIÓN DEL HPLC ................................... 116 ANEXO C. DISTRIBUCIÓN DE PRODUCTOS DE LA OZONACIÓN DE CLOROFENOLES NO IDENTIFICADOS. ................................................... 121 ANEXO D. DINÁMICAS DE LA BIODEGRADACIÓN DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS Y ÁCIDOS ORGÁNICOS FORMADOS EN LA OZONACIÓN DE LOS CLOROFENOLES. .............................................................................. 125

RESUMEN

En el presente trabajo se estudió la combinación de ozonación y

biodegradación aerobia como esquema de tratamiento para soluciones modelo

contaminadas con dos clorofenoles: el 4-Clorofenol (4CF) y el 2,4-Diclorofenol

(24DCF).

La ozonación se llevó a cabo en un sistema semi-batch, esta reacción se

estudió bajo dos valores de pH: 7 y 12; para el subsecuente proceso de

biodegradación se empleó un consorcio microbiano previamente aclimatado a la

fuente de carbono a degradar. Es estudio se compone de dos etapas

principales, en la primera se estudiaron ambos tratamientos individualmente,

con el fin de obtener criterios para el acoplamiento de ambos tratamientos en

una segunda etapa.

El estudio de la ozonación de los clorofenoles comprendió la identificación de

subproductos de reacción por la técnica de Cromatografía de Líquidos de Alta

Resolución (HPLC), así como la determinación de las dinámicas (variación de la

concentración con respecto al tiempo) de descomposición de los contaminantes

y las de acumulación y/o descomposición de los eventuales subproductos; en

función de estas dinámicas se eligieron tiempos para suspender la ozonación y

acoplar el proceso de biodegradación.

Una parte importante de este trabajo fue la aclimatación de los

microorganismos a las diferentes fuentes de carbono que se pretendía

degradar. Se aclimató un consorcio para cada fuente de carbono específica, es

decir, cada uno de los clorofenoles sin ozonar, así como los productos de

ozonación de éstos (bajo los diferentes valores de pH de trabajo) en los tiempos

elegidos para suspender la ozonación y acoplar el proceso biológico.

Una vez que se llevó a cabo el proceso combinado, se determinaron mediante

HPLC las dinámicas de descomposición de los productos de ozonación en el

bioproceso. Así mismo, se utilizó la técnica de UV-Vis para obtener información

cualitativa de la degradación obtenida en ambos procesos.

Las mejores condiciones de ozonación para aumentar la eficiencia del

tratamiento biológico se obtuvieron cuando la descomposición del compuesto

inicial fue total (>99%) y cuando las concentraciones de los compuestos

fenólicos formados en la ozonación fue mayor al 60%; bajo estas condiciones el

tratamiento conjunto arrojó mayores niveles de eliminación.

ABSTRACT

In this wok the aerobic bioremediation of pre-ozonated artificially aqueous

solutions involving two chlorophenols: 4-clorophenol (4-CPh) and 2,4-

dichlorophenol (2,4-DCPh) was studied. Ozonation was carried out in a semi

batch reactor at the pH 7 and 12; for biotreatment, a microbial consortium

previously acclimated (to the specific carbon source) was used.

Both treatments were separately studied in a first investigation step. When

enough knowledge of each one was achieved, chlorophenols previous

ozonation and biodegradation were combined.

Ozonation by-products identification was made by HPLC. Chlorophenols

decomposition as well as by-products formation/decomposition dynamics during

chemical oxidation were determined. Those dynamics were used for choosing

the ozonation times to stop chemical oxidation before biological treatment.

Microbial acclimation was a key step in this work. It was really necessary to

ensure the substrates degradation and to reduce biological treatment times.

After combined treatment the assimilation of ozonation by-products during

biotreatment was measured by HPLC. UV-Vis was also used to obtain

qualitative information.

Best results were achieved when total decomposition of chlorophenols was

developed during ozonation process and when phenolic compounds

concentrations were low.

ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1.1 Concentraciones típicas de fenoles en efluentes industriales ............ 2 Tabla 1.2. Propiedades físicas y químicas de los clorofenoles de estudio ......... 3 Tabla 1.3. Límites máximos permisibles para aguas de consumo humano y uso doméstico que únicamente requieran desinfección ............................................ 5 Tabla 1.4. Criterios de calidad admisibles para la preservación de la flora y fauna en aguas dulces, frías o cálidas, y en aguas marinas y de estuario. ........ 6 Tabla 1.5. Potenciales redox (E0) de algunos agentes oxidantes (21) ............... 11 Tabla 2.1. Reactivos utilizados en la experimentación ..................................... 29 Tabla 2.2 Condiciones de ozonación de los clorofenoles. ................................ 33 Tabla 2.3. Composición del medio de cultivo .................................................... 35 Tabla 2.4. Consorcios adaptados a compuestos sin ozonar ............................. 36 Tabla 2.5. Longitudes de onda características de los compuestos estudiados. 39 Tabla 3.1 Constantes de reacción de la ozonación de los clorofenoles ........... 41 Tabla 3.2 Concentración máxima de los compuestos identificados en la ozonación del 4-Clorofenol ............................................................................... 51 Tabla 3.3 Concentración máxima de los compuestos identificados en la ozonación del 2,4-Diclorofenol .......................................................................... 59 Tabla 3.4 Concentrado de los compuestos formados a lo largo de la ozonación que no fueron identificados. .............................................................................. 60 Tabla 3.5 Tiempos de ozonación donde se presentan las concentraciones máximas y mínimas de los compuestos no identificados .................................. 61 Tabla 3.6 Compuestos capaces de degradar por los consorcios adaptados a fuentes de carbono sin ozonar .......................................................................... 63 Tabla 3.7 Tiempos de ozonación previa a la biodegradación ........................... 72 Tabla 3.8. Concentración de los productos de ozonación identificados antes del proceso de biodegradación ............................................................................... 74 Tabla 3.9. Concentración relativa (normalizada) de los compuestos fenólicos no identificados, presentes en los clorofenoles ozonados ..................................... 74 Tabla 3.10. Concentración relativa (normalizada) de los ácidos orgánicos no identificados, presentes en los clorofenoles ozonados ..................................... 75 Tabla 3.11. Fuentes de inóculo para la adaptación de los consorcios a los clorofenoles ozonados ...................................................................................... 78 Tabla 3.12. Consorcios adaptados a fuentes de carbono ozonadas ................ 78

ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1.1. Estructuras químicas del 4-Clorofenol (1) y 2,4-Diclorofenol (2). ..... 2 Figura 1.2. Mecanismos de reacción del ozono en solución acuosa (18) ............. 9 Figura 1.3. Esquema de reacción propuesto en la literatura para clorofenoles con ozono. ........................................................................................................ 15 Figura 2.1. Tratamientos empleados para las soluciones problema. ................ 30 Figura 2.2. Diagrama del desarrollo experimental. ........................................... 31 Figura 2.3. Diagrama esquemático del sistema de ozonación: (R) reactor, (T) tanque de oxígeno, (G) generador de ozono, (EV1, EV2 EV3) by-pass con electroválvulas, (S) analizador de ozono, (M) sistema de adquisición de datos (C) PC. .............................................................................................................. 32 Figura 2.4. Diagrama del proceso de biodegradación a nivel laboratorio. ........ 34 Figura 2.5. Diagrama del proceso de adaptación de los microorganismos (fill-and-draw). ......................................................................................................... 37 Figura 3.1. Comportamiento del ozono a la salida del reactor durante su saturación en agua bajo pH 7 y 12. .................................................................. 43 Figura 3.2. Comportamiento del ozono a la salida del reactor para el 4-clorofenol (120 ppm), pH 7. .............................................................................. 44 Figura 3.3. Comportamiento del ozono a la salida del reactor para el 4-clorofenol (120 ppm), pH 12. ............................................................................ 45 Figura 3.4 Distribución de compuestos fenólicos identificados a lo largo del proceso de ozonación del 4-CF (pH 7). ............................................................ 46 Figura 3.5 Distribución de compuestos fenólicos no identificados a lo largo del proceso de ozonación del 4-CF (pH 7). ............................................................ 46 Figura 3.6 Distribución de ácidos orgánicos identificados a lo largo del proceso de ozonación del 4-CF (pH 7). .......................................................................... 47 Figura 3.7 Distribución de orgánicos no identificados a lo largo del proceso de ozonación del 4-CF (pH 7) ................................................................................ 48 Figura 3.8 Distribución de compuestos fenólicos a lo largo del proceso de ozonación del 4-CF (pH 12). ............................................................................. 49 Figura 3.9 Distribución de compuestos ácidos orgánicos a lo largo del proceso de ozonación del 4-CF (pH 12). ........................................................................ 50 Figura 3.10 Comportamiento del ozono a la salida del reactor para el 2,4-diclorofenol (120 ppm) a pH 7. .......................................................................... 52 Figura 3.11 Comportamiento del ozono a la salida del reactor para el 2,4-diclorofenol (120 ppm) a pH 12. ........................................................................ 53 Figura 3.12 Comparación de los ozonogramas de ambos clorofenoles (pH 7). 54 Figura 3.13 Comparación del los ozonogramas de ambos clorofenoles (pH 12). .......................................................................................................................... 54 Figura 3.14 Distribución de compuestos fenólicos identificados a lo largo del proceso de ozonación del 2,4-DCF (pH 7). ....................................................... 55

Figura 3.15 Distribución de ácidos orgánicos identificados a lo largo del proceso de ozonación del 2,4-DCF (pH 7). .................................................................... 56 Figura 3.16 Distribución de compuestos fenólicos identificados a lo largo del proceso de ozonación del 2,4-DCF (pH 12). ..................................................... 57 Figura 3.17 Distribución de ácidos orgánicos identificados a lo largo del proceso de ozonación del 2,4-DCF (pH 12). .................................................................. 58 Figura 3.18 Perfil de biodegradación del 4-clorofenol (120 ppm)...................... 64 Figura 3.19 Perfil de biodegradación del 2,4-Diclorofenol (120 ppm). .............. 65 Figura 3.20 Perfil de biodegradación de compuestos fenólicos formados en la ozonación. ........................................................................................................ 67 Figura 3.21 Perfil de biodegradación de ácidos orgánicos formados en la ozonación. ........................................................................................................ 68 Figura 3.22 Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA4_7_10. .......................................................................................................................... 79 Figura 3.23. Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA4_7_15. .......................................................................................................................... 80 Figura 3.24. Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA4_7_30. .......................................................................................................................... 80 Figura 3.25. Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA4_12_5. .......................................................................................................................... 81 Figura 3.26. Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA2_7_05. .......................................................................................................................... 82 Figura 3.27 Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA2_7_08. .......................................................................................................................... 82 Figura 3.28. Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA2_12_5. .......................................................................................................................... 83 Figura 3.29 Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 7, 10 min). .................................................................. 86 Figura 3.30. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 7, 10 min). ................................................................................... 86 Figura 3.31. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la biodegradación del 4-CF pre-ozonado (pH 7, 10 min). ..................................... 88 Figura 3.32. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 4-CF ozonado 10 min (pH 7). ............................................................................... 89 Figura 3.33. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la biodegradación del 4-CF pre-ozonado (pH 7, 15 min). ..................................... 90 Figura 3.34 Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 4-CF ozonado 15 min (pH 7). .................................................................................... 91 Figura 3.35. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la biodegradación del 4-CF pre-ozonado (pH 7, 30 min). ..................................... 92 Figura 3.36. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 4-CF ozonado 30 min (pH 7). ............................................................................... 93 Figura 3.37. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la biodegradación del 4-CF pre-ozonado (pH 12, 5 min). ..................................... 94 Figura 3.38. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 4-CF ozonado 5 min (pH 12). ............................................................................... 95

Figura 3.39. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la biodegradación del 2,4-DCF pre-ozonado (pH 7, 5 min) .................................. 97 Figura 3.40. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 2,4-DCF ozonado 5 min (pH 7). .............................................................................. 98 Figura 3.41. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la biodegradación del 2,4-DCF pre-ozonado (pH 7, 8 min). ................................. 99 Figura 3.42. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 2,4-DCF ozonado 8 min (pH 7). ............................................................................ 100 Figura 3.43. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la biodegradación del 2,4-DCF pre-ozonado (pH 12, 5 min). ............................. 101 Figura 3.44. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 2,4-DCF ozonado 5 min (pH 12). .......................................................................... 102 Figura 3.45. Áreas cromatográficas obtenidas al final del bioproceso. ........... 103 Figura A0.1. Curva de calibración para el 4-Clorofenol (279.9 nm). .............. 114 Figura A0.2. Curva de calibración para el 2,4-Diclorofenol (284.4 nm) ........... 115 Figura B0.3. Curva de calibración (HPLC) para 4-clorofenol. ......................... 116 Figura B0.4. Curva de calibración (HPLC) para 2,4-diclorofenol. ................... 117 Figura B0.5. Curva de calibración (HPLC) para el fenol. ................................ 117 Figura B0.6. Curva de calibración (HPLC) para el catecol. ............................. 118 Figura B0.7. Curva de calibración (HPLC) para la hidroquinona. ................... 118 Figura B0.8. Curva de calibración para el ácido oxálico. ................................ 119 Figura B0.9. Curva de calibración para el ácido fórmico. ................................ 119 Figura B0.10. Curva de calibración para el ácido fumárico. ............................ 120 Figura B0.11. Curvas de calibración para el ácido maleico. ........................... 120 Figura C0.1. Distribución de compuestos fenólicos no identificados a lo largo del proceso de ozonación del 4-CF (pH 12). .................................................. 121 Figura D0.2. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 7, 15 min). ................................................................................. 125 Figura D0.3. Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 7, 30 min). ................................................................ 126 Figura D0.4. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 7, 30 min). ................................................................................. 126 Figura D0.5. Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 12, 5 min). ................................................................ 127 Figura D0.6. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 12, 5 min). ................................................................................. 127 Figura D0.7. Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 7, 5 min). ............................................................. 128 Figura D0.8. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 7, 5 min). .............................................................................. 128 Figura D0.9. Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 7, 8 min). ............................................................. 129 Figura D0.10. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 7, 8 min). ............................................................. 129 Figura D0.11. Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 12, 5 min). ........................................................... 130

Figura D0.12. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 12, 5 min). ........................................................... 130

LISTA DE ABREVIATURAS

24DCF 2,4-diclorofenol 4-CF 4-clorofenol

CA2_12_5 Consorcio adaptado al 2,4-diclorofenol ozonado 5 minutos (pH 12) CA2_7_05 Consorcio adaptado al 2,4-diclorofenol ozonado 5 minutos (pH 7) CA2_7_08 Consorcio adaptado al 2,4-diclorofenol ozonado 8 minutos (pH 7) CA24DCF Consorcio Adaptado a 2,4-diclorofenol CA4_12_5 Consorcio adaptado al 4-clorofenol ozonado 5 minutos (pH 12) CA4_7_10 Consorcio adaptado al 4-clorofenol ozonado 10 minutos (pH 7) CA4_7_15 Consorcio adaptado al 4-clorofenol ozonado 15 minutos (pH 7) CA4_7_30 Consorcio adaptado al 4-clorofenol ozonado 30 minutos (pH 7)

CA4CF Consorcio Adaptado a 4-clorofenol CAA Consorcio Adaptado a Ácidos Oxálico y Fórmico CAF Consorcio Adaptado a Fenol COT Carbón Orgánico Total DBO Demanda Bioquímica de Oxígeno

DHHS Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU DO600 Densidad Óptica (absorbancia) a λ = 600 nm DQO Demanda Química de Oxígeno EPA Agencia de Protección del Medio Ambiente de EE. UU.

HPLC Cromatografía de Líquidos de Alta Eficiencia HTR Tiempo de Retención Hidraúlico

NIOSH Instituto Nacional de Salud y Seguridad Ocupacional de EE. UU. OSHA Administración de Seguridad y Salud Ocupacional de EE. UU. POAs Procesos de Oxidación Avanzada UPIBI Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología WHO Organización Mundial de la Salud

INTRODUCCIÓN

Los clorofenoles son contaminantes altamente tóxicos que se encuentran en las

aguas residuales de la industria papelera, cafetalera, refinerías, entre otras. La

mayoría se usan como pesticidas, biocidas o antisépticos. Dada la toxicidad de

estos compuestos, representan un riesgo para la salud y es necesario darles

tratamiento para eliminarlos de las aguas residuales.

Los tratamientos destructivos, tales como la oxidación química se destacan por

su alta eficiencia en la remoción de contaminantes, sin embargo, la aplicación

de los mismos puede resultar relativamente costosa. Por otro lado, los procesos

biológicos son de las alternativas más económicas para el tratamiento de

aguas, sin embargo, éstos presentan básicamente 2 inconvenientes: requieren

largos periodos de tiempo y cuando están presentes compuestos altamente

tóxicos en concentraciones relativamente altas, se inhibe el proceso, por lo que

estos métodos (por sí solos) no son efectivos para aguas residuales con altas

concentraciones de xenobióticos.

El ozono es un oxidante muy fuerte y es altamente efectivo en la degradación

de una gran variedad de compuestos orgánicos, si se aplica como etapa previa

a la biodegradación se pueden obtener mejores resultados en la degradación

de altas concentraciones de xenobióticos al oxidarlos parcialmente y

convertirlos en compuestos más fáciles de eliminar en un tratamiento biológico.

En el presente trabajo se estudió el tratamiento combinado de ozonación y

biodegradación (usando las células libres de un consorcio microbiano) aplicado

a soluciones modelo contaminadas con dos clorofenoles: 4-clorofenol (4-CF) y

2,4-diclorofenol (2,4-DCF). En los tratamientos biológicos se incluyó la etapa

previa de aclimatación del consorcio a la fuente de carbono a degradar

(clorofenoles con o sin ozonación previa).

Este trabajo se dividió en tres partes principales. En el capítulo 1 se presenta la

recopilación de la investigación bibliográfica acerca de las propiedades de los

clorofenoles estudiados, así como la toxicidad de los mismos. Posteriormente

se presenta información sobre la ozonación y los procesos de oxidación

avanzada y un resumen del tratamiento de fenoles en fase acuosa con este tipo

de procesos. También se presenta información sobre biodegradación y su

aplicación en la eliminación de fenoles, así mismo se escribe acerca de la

combinación de tratamientos químicos con tratamientos biológicos y la

efectividad conjunta que han demostrado tener para degradar contaminantes.

En el capítulo 2 se hace una descripción de los materiales y métodos usados a

lo largo de la investigación en las 3 partes que conformaron el desarrollo

experimental: ozonación de los clorofenoles bajo condiciones controladas,

biodegradación de los mismos sin ozonación previa; así como la combinación

de ambos tratamientos.

En el capítulo 3 se describen los resultados obtenidos de las tres partes antes

mencionadas; en el estudio de ozonación se hizo la determinación de

subproductos acumulados a lo largo del proceso; posteriormente en la sección

de biodegradación se demuestra que éste no es un tratamiento efectivo para los

clorofenoles; el 2,4-DCF sólo se logró remover un 60% en 10 días, mientras que

del 4-CF no se observó una remoción significativa; por otro lado, se realizó la

biodegradación de los principales compuestos identificados en la ozonación y

éstos sí pudieron ser eliminados en el bioproceso en el rango de uno a tres

días.

Una vez realizados estos tratamientos, se analizaron los resultados obtenidos

en ambos y se eligieron condiciones de ozonación para suspenderla y acoplar

el tratamiento biológico subsecuente. En cuanto al tratamiento combinado, se

dio seguimiento a la descomposición de los productos formados en la

ozonación a lo largo del bioproceso y se encontró que las mejores condiciones

de ozonación para aumentar la eficiencia del tratamiento biológico

corresponden a la descomposición total del compuesto (>99%) y cuando las

concentraciones de los compuestos fenólicos formados en la ozonación sea

mayor al 60%; bajo estas condiciones el tratamiento conjunto arrojó mayores

niveles de eliminación. Finalmente se presentan las conclusiones, así como las

recomendaciones respectivas para la continuación de un trabajo futuro.

1

CAPÍTULO 1. GENERALIDADES Desde los inicios del siglo XX, las actividades humanas han causado

importantes problemas de contaminación en el agua. De acuerdo a la

Organización Mundial de la Salud (WHO, por sus siglas en inglés) la escasez

de agua afecta a más del 40 % de la población mundial debido a razones

políticas, económicas, climatológicas, etc. Además, más del 25% de la

población mundial sufre de problemas de salud e higiene debido al agua

contaminada.(1)

1.1 Clorofenoles como contaminantes del agua

Los clorofenoles constituyen un grupo particular de contaminantes prioritarios

enlistados por la Agencia de Protección del Medio Ambiente de E.U.A. (EPA,

por sus siglas en inglés) (2,3) ya que son compuestos tóxicos y es difícil

removerlos del ambiente. Por ejemplo, la vida media del pentaclorofenol en

ambientes acuosos (aerobios) puede llegar a 3.5 meses, y puede perdurar

durante años en sedimentos orgánicos.(4)

Los clorofenoles son un grupo de sustancias químicas que se producen

añadiendo cloro al fenol. La mayoría son sólidos a temperatura ambiente.

Tienen un fuerte sabor y olor a medicamento. Se usan como preservadores de

madera, pesticidas, herbicidas, biocidas, colorantes ó como antisépticos. Así

mismo, se producen en el blanqueamiento de la pulpa de madera con cloro, en

la producción de papel, ó bien en la cloración del agua potable, si es que ésta

se encuentra contaminada con fenol. (5)

Debido a los múltiples orígenes de los clorofenoles, se pueden encontrar en

aguas subterráneas, superficiales y suelos. Producen olor y sabor desagradable

2

en el agua en concentraciones por debajo de 0.1 mg/L. (6) Éstos se han

encontrado en por lo menos 166 de los 1,467 sitios de la Lista de Prioridades

Nacionales (de Estados Unidos) identificados por la EPA. (5) Las

concentraciones de compuestos fenólicos en desechos industriales varían

según el tipo de actividad proveniente, lo cual se especifica en la tabla 1.1.

Tabla 1.1 Concentraciones típicas de fenoles en efluentes industriales (7)

Actividad industrial Concentración de compuestos

fenólicos (mg/L)

Producción de resinas fenólicas 400

Refinerías 50

Producción de ácido naftalénico 12

En la literatura se han reportado ambientes naturales contaminados con

clorofenoles en rangos de concentraciones que van desde 150 µg/L(8) hasta

100-200 mg/L. (9) Así mismo, las aguas residuales pueden contener hasta 190

mg/L de estos compuestos. (10,11)

1.1.1. Propiedades físicas y químicas

En la tabla 1.2 se presentan las propiedades físicas y químicas de los

compuestos estudiados. Las estructuras químicas del 4-Clorofenol y 2,4-

Diclorofenol se muestran en la figura 1.1.

Figura 1.1. Estructuras químicas del 4-Clorofenol (1) y 2,4-Diclorofenol (2).

3

1.1.2. Toxicidad de los clorofenoles

Los clorofenoles se absorben rápidamente a través de la piel en cantidades

tóxicas; irritan lo ojos y la piel, además, el polvo que producen es muy irritante

para el tracto respiratorio. La exposición a altos niveles de clorofenoles puede

causar daño al hígado y al sistema inmunitario.

Tabla 1.2. Propiedades físicas y químicas de los clorofenoles de estudio(7)

Propiedad Compuesto

4-Clorofenol 2,4-Diclorofenol

Fórmula Química C6H5ClO C6H4Cl2O

Peso Molecular 128.56 163.00

Color Cristal blanco ó rosa Blanco

Estado físico Sólido Sólido

Punto de fusión 43.1 – 43.7°C 45.0 °C

Punto de ebullición 220.0 °C 210.0 °C

Densidad relativa @

20°C 1.2238 1.383

Umbral de olor en el

agua 0.33 µg/L 0.35 µg/L

Umbral de olor en el aire 0.0189 mg/m3 1.4 mg/m3

Solubilidad en agua @

25°C 27 g / L 4.5 g / L

Solubilidad en otros

solventes

Muy soluble en

etanol, cloroformo,

éter, glicerol y

benceno

Etanol, éter

etílico, benceno

y cloroformo

Presión de vapor @ 25°C 0.23 mm Hg 0.14 mm Hg

Hay evidencia que sugiere que hay una tasa mayor de cáncer en gente

expuesta a clorofenoles por largo tiempo, sin embargo, las personas estudiadas

4

también estuvieron expuestas a otras sustancias químicas. El Departamento de

Salud y Servicios Humanos de EE. UU. (DHHS, por sus siglas en inglés) ha

determinado que es razonable predecir que el 2,4,6-triclorofenol es

carcinogénico. (6)

Todos los clorofenoles poseen actividad bactericida, fitotoxicidad, así como la

capacidad de bioacumularse en organismos vivos, lo cual se incrementa

conforme aumenta la cloración y la sustitución se aleja de la posición orto. Este

aumento en la toxicidad puede ser debido a un incremento en la lipofilicidad

(afinidad con las grasas), lo cual facilita que se introduzcan en el organismo. El

orden de toxicidad según la posición del cloro (con respecto al grupo OH) es

para>meta>orto. Por otro lado, la toxicidad depende de qué tan disociada se

encuentre la molécula de clorofenol; las formas no-disociadas de mayor

toxicidad predominan a menor pH, entonces, cuando el pH disminuye hay un

incremento en la toxicidad. (12)

1.1.3. Normatividad respectiva a los fenoles

La EPA recomienda un límite (advertencia de salud) de 2 mg/L para fenol en

agua potable y que el nivel de fenol en aguas superficiales (lagos, arroyos) no

exceda 3.5 mg/L para evitar consumir agua o peces contaminados. Para

proteger a los trabajadores, la Administración de Seguridad y Salud

Ocupacional de EE. UU. (OSHA, por sus siglas en inglés) ha establecido un

límite de 5 ppm para fenol en el aire del trabajo durante una jornada diaria de 8

horas. Por otro lado, el Instituto Nacional de Salud y Seguridad Ocupacional de

EE. UU. (NIOSH) recomienda un límite de 5 mg/L para fenol en el aire del

trabajo durante una jornada de 10 horas diarias y un límite de 16 mg/L durante

un período de no más de 15 minutos. (13)

5

Así mismo, la EPA recomienda que el agua potable no contenga más de 0.04

mg/L de 2-Clorofenol para adultos expuestos de por vida, y 0.05 mg/L para

exposiciones de 1 a 10 días o más en niños. Para el 2,4-Diclorofenol la EPA

recomienda que el agua potable no contenga más de 0.03 mg/L para

exposiciones de 1 a 10 días o más en niños. (12)

La normatividad mexicana con respecto a los compuestos fenólicos está

dispuesta de la siguiente manera:

La NOM-CCA-031-ECOL/1993 establece que el límite máximo permisible de

fenoles para descargas de aguas residuales provenientes de la industria,

actividades agroindustriales y de servicios, que se pueden desechar a los

sistemas de drenaje y alcantarillado urbano o municipal es de 5 mg/L (promedio

diario); mientras que para agua potable, la NOM-127-SSA1-1994 establece que

el contenido de compuestos fenólicos presentes no debe sobrepasar los 0.3

mg/L.

Por otro lado, la “Norma de calidad ambiental y de descarga de efluentes:

“Recurso Agua" establece límites para este tipo de compuestos en aguas para

consumo humano, aguas dulces (frías o cálidas), así como en aguas marinas y

de estuario. Lo anterior se puede observar en las tablas 1.3 y 1.4.

Tabla 1.3. Límites máximos permisibles para aguas de consumo humano y uso doméstico que únicamente requieran desinfección

Parámetros

Expresado

Como Unidad Límite Máximo

Permisible

Compuestos fenólicos Fenol mg/L 0,002

6

Tabla 1.4. Criterios de calidad admisibles para la preservación de la flora y fauna en aguas dulces, frías o cálidas, y en aguas marinas y de estuario.

Parámetros Expresados

como Unidad

Límite máximo permisible

Agua fría dulce

Agua cálida dulce

Agua marina y

de estuario

Clorofenoles - mg/L 0,5 0,5 0,5

Fenoles

monohídricos Fenol mg/L 0,001 0,001 0,001

1.2 Procesos de tratamiento de agua para eliminar clorofenoles

Ya que, a pesar de su alta toxicidad, los compuestos fenólicos están presentes

en una gran diversidad de efluentes industriales, se han desarrollado diferentes

métodos de tratamiento para eliminarlos del agua, ya sea recuperando el

contaminante, o bien destruyéndolo. A continuación se describen estos

métodos de tratamiento.

1.2.1. Procesos de tratamiento no destructivos (Recuperación)

Extracción líquido-líquido

Se utiliza industrialmente para efluentes con concentraciones elevadas de

contaminantes. La ventaja de estos procesos es que se recuperan los

compuestos, sin embargo, requiere la utilización de disolventes para aumentar

el coeficiente de partición con una cinética de extracción rápida. (14)

Adsorción

Utilizan materiales porosos, como el carbón activado o resinas poliméricas, con

una alta área superficial que tengan gran tendencia a retener los compuestos

7

deseados. El problema de este método es el elevado costo de regeneración del

adsorbente. Por ejemplo, el carbón activado tiene una capacidad de adsorción

de entre 0.09 y 0.4 g de fenol/g de adsorbente, y una vez saturado se regenera

mediante un lavado con sosa, tratamiento con disolventes o bien con un

tratamiento térmico. (14)

1.2.2. Procesos de tratamiento destructivos Incineración

Es un proceso utilizado para tratar efluentes con elevadas concentraciones de

contaminantes, los cuales se oxidan con un exceso de aire a elevada

temperatura hasta obtener CO2 , agua y compuestos inorgánicos. Cuando se

utiliza este proceso para la eliminación de clorofenoles se pueden generar

dibenzofuranos y dibenzodioxinas.(15) Además que algunos factores como el

costo energético del proceso, los problemas de corrosión y la negativa

percepción ecológica del sistema hacen que éste no sea un método atractivo de

tratamiento.

Oxidación química

La oxidación química destruye los contaminantes con diversos agentes

oxidantes como peróxido de hidrógeno, persulfato de potasio, permanganato de

potasio, cloro, ozono, reactivo de Fenton, entre otros. Estos procesos son

altamente efectivos para eliminar compuestos orgánicos, pero si se busca la

mineralización de los mismos, es necesario emplear grandes dosis del oxidante,

lo que eventualmente aumenta el costo de aplicación de los mismos.

Oxidación biológica (Biodegradación)

Consiste en el uso de microorganismos para descomponer o degradar

compuestos peligrosos en sustancias de carácter menos tóxico o bien, inocuas

para el medio ambiente y la salud humana. Estos métodos son relativamente

8

económicos y ampliamente usados, pero cuando la toxicidad de los

contaminantes a tratar es muy alta, el proceso se ve inhibido y la calidad del

efluente no es satisfactoria, además de que la duración de los tratamientos es

alta (entre días y meses).

1.3 Ozonación

1.3.1. Propiedades oxidativas del ozono

En los últimos años, se ha incrementado el interés de utilizar el ozono para dar

tratamiento a efluentes contaminados. El ozono es un oxidante muy poderoso,

el cual puede participar en un gran número de reacciones con compuestos

orgánicos e inorgánicos en agua, tales como pesticidas, fenoles, aminas, etc.

En solución acuosa, se pueden considerar 2 posibles mecanismos de reacción

del ozono: la reacción directa con ozono molecular, y la reacción con los

radicales hidroxilo generados en la descomposición del ozono. La combinación

de estos mecanismos para la remoción de diferentes compuestos depende de

factores tales como: naturaleza de los compuestos en cuestión, tipo de

impurezas presentes en los compuestos, pH del medio, temperatura, dosis de

ozono y carácter iónico de la solución (16-18). En la Figura 1.2 se muestran estos

mecanismos.

9

Figura 1.2. Mecanismos de reacción del ozono en solución acuosa (18)

1.3.2. Ventajas y desventajas del ozono aplicado a tratamiento de agua

Las principales ventajas del uso del ozono son: (16, 19)

• Es uno de los agentes oxidantes y desinfectantes más fuerte disponibles.

• No se producen residuos en su descomposición, el oxígeno es el único

producto de su degradación.

• Es usado en Procesos de Oxidación Avanzado (POAs) para la

generación de especies más oxidantes.

• Es capaz de disminuir los costos globales de los procesos si se utiliza en

las primeras etapas del proceso.

Las principales desventajas del ozono son:

• Es inestable, y su solubilidad en agua es baja.

Reacción directa

Reacción con los radicales OH

10

• El costo de producción por kg de ozono es más alto que el de otros

oxidantes ó desinfectantes.

• Los equipos y sistemas que utilizan ozono se deben diseñar con

materiales resistentes, al igual que los equipos de seguridad para los

operadores expuestos al ozono.

1.4 Procesos de Oxidación Avanzada (POAs)

1.4.1. Definición de POAs

Los procesos de oxidación avanzada se definen como procesos que “involucran

la generación de radicales hidroxilo en cantidad suficiente para llevar a cabo la

purificación de agua”. Estos radicales no son selectivos y rápidamente atacan

de manera agresiva a los compuestos orgánicos. Estos radicales se pueden

generar por medios fotoquímicos (incluida la luz solar) o por otras formas de

energía. (20) Los POAs han demostrado ser altamente eficientes en la remoción

de contaminantes tanto en agua como en suelo, debido a que el potencial de

reducción del radical hidroxilo es muy alto, tal como se puede observar en la

tabla 1.5.

11

Tabla 1.5. Potenciales redox (E0) de algunos agentes oxidantes (21)

Especie

E0 (V)

25C) Flúor (F2) 3.03

Radical hidroxilo (∙OH) 2.80 Oxígeno atómico 2.42 Ozono (O3) 2.07 Peróxido de hidrógeno (H2O2) 1.77 Permanganato de potasio

(KMnO4)

1.67 Ácido hipobromoso (HBrO) 1.59 Dióxido de cloro (ClO2) 1.50 Ácido hipocloroso (HClO) 1.49 Cloro (Cl2) 1.36 Bromo (Br2) 1.09

Los radicales hidroxilo son capaces de oxidar a casi todos los compuestos

orgánicos a CO2 y H2O, salvo algunos de los compuestos orgánicos más

simples como lo son los ácidos acético y oxálico, así como la acetona ó bien,

compuestos clorados derivados del cloroformo. (20)

1.4.2. POAs no fotoquímicos Estos POAs originan especies reactivas potentes, principalmente el radical

hidroxilo, a través de la transformación de especies químicas o mediante la

utilización de distintas formas de energía, con excepción de la irradiación

luminosa.

Ozonación en medio alcalino

Conforme se incrementa el pH de la solución acuosa, se genera un aumento en

la descomposición de ozono en agua, debido a que el ion hidroxilo actúa como

un iniciador en el mecanismo de descomposición. Bajo estas condiciones, el

ozono reacciona en forma directa con un sustrato orgánico a través de una

12

reacción lenta y selectiva, en combinación con una reacción rápida y no

selectiva vía radicales (radicales hidroxilo) (Figura 1.2).

El camino indirecto es menos selectivo, ya que las especies formadas tienen

gran capacidad oxidante. Debe tenerse cuidado de no elevar excesivamente el

pH, debido a la acción atrapadora de HO• competitiva de los iones bicarbonato

y carbonato (esta competencia ocurrirá en todo POA cada vez que se formen

HO• en soluciones carbonatadas). (19, 23)

Combinación de ozono/H2O2

El uso de dos o más oxidantes combinados permite aprovechar los posibles

efectos sinérgicos entre ellos, lo que produce una destrucción adicional de la

carga orgánica. Sin embargo, como existe una gran dosis de empirismo en el

uso de mezclas oxidantes, es difícil prever el rendimiento.

La ozonación transforma los contaminantes en compuestos más simples. Se

logra una mejoría cuando se le agrega agua oxigenada. El H2O2 es un ácido

débil, poderoso oxidante y un compuesto inestable. Entre las posibles mezclas

de agentes oxidantes, la combinación O3/H2O2 es una de las más usadas. El

proceso pretende combinar la oxidación directa (y selectiva) del ozono con la

reacción rápida y poco selectiva de los radicales HO• con los compuestos

orgánicos. El proceso es caro pero rápido, y puede tratar contaminantes

orgánicos presentes en muy altas concentraciones (<5000 ppm). (23)

Reactivo de Fenton

Desde finales del siglo XIX, los conocidos ensayos de Fenton demostraron que

las soluciones de peróxido de hidrógeno y sales ferrosas eran capaces de

oxidar los ácidos tartárico y málico, y otros compuestos orgánicos. El proceso

Fenton se lleva a cabo por la reacción:

Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + HO- + HO•

13

Las sales de hierro actúan como catalizador para la descomposición del

peróxido de hidrógeno. El proceso es potencialmente útil para destruir

contaminantes, ya que es muy efectivo para la generación de HO•, (19.23) sin

embargo, durante este tratamiento se produce lodo que contiene complejos de

hierro con compuestos orgánicos.

1.4.3. POAs fotoquímicos Los procesos fotoquímicos involucran radiación UV; la excelente capacidad del

radical hidroxilo de oxidar compuestos orgánicos sugiere explorar su generación

fotoquímica. El sistema UV/oxidante involucra una excitación directa de un

sustrato debido a la radiación con una posterior reacción de oxidación.

Fotólisis del agua en el ultravioleta de vacío (UVV)

El uso más importante de la radiación UVV es la fotólisis del agua (en presencia

de luz), que produce radicales hidroxilo y átomos de hidrógeno. La técnica se

utiliza para la degradación de contaminantes en aguas y en corriente de aire

con alto contenido de humedad, para la obtención de agua pura. El proceso

posee alta eficiencia, sin embargo requiere el suministro de oxígeno, el uso de

material de cuarzo y la provisión de alta potencia. (18, 23)

Combinación de UV/H2O2

La fotólisis del H2O2 se realiza casi siempre utilizando lámparas de vapor de

mercurio de baja o media presión. Cerca del 50% del consumo energético se

pierde en forma de calor. Generalmente se usan lámparas de 254 nm. El uso de

UV/peróxido ofrece grandes ventajas: el oxidante muy accesible, es

térmicamente estable y puede almacenarse; como posee solubilidad infinita en

agua, no existen problemas de transferencia de masa asociados a gases. En

contraposición, dada la baja sección eficaz de absorción de H2O2 a 254 nm, se

necesitan altas concentraciones del oxidante. (17, 23)

14

Combinación de UV/O3

La irradiación del ozono en agua produce H2O2 en forma cuantitativa. El

peróxido de hidrógeno así generado da lugar a radicales hidroxilo por medio de

fotólisis, y reacciona con el exceso de ozono, generando también estos

radicales. En realidad, se trata de una combinación de UV/H2O2 y O3/H2O2. La

eficiencia es superior a la de O3 o UV directa. Adicionalmente, puede utilizarse

la combinación UV/H2O2/O3. La adición de luz al proceso H2O2/O3 produce un

aumento neto de la eficiencia. (17)

Foto-Fenton

El proceso Fenton es fuertemente acelerado por irradiación con luz UV-VIS, por

lo que se presenta un aumento en la velocidad de degradación de

contaminantes orgánicos. El método es eficiente, pero tiene la desventaja de

que debe agregarse H2O2 continuamente y mantener condiciones ácidas. (23)

Fotocatálisis heterogénea

La fotocatálisis heterogénea es un proceso que se basa en la absorción directa

o indirecta de energía radiante (visible o UV) por un sólido. Esta oxidación se

realiza en presencia de un catalizador (semiconductor) y radiación UV, que

fotoexita al mismo, usando oxígeno. En la región interfacial entre sólido excitado

y la solución tienen lugar las reacciones de destrucción o de remoción de los

contaminantes, sin que el catalizador sufra cambios químicos. (18,23)

1.5. Ozonación y Procesos de Oxidación Avanzada aplicados en la descomposición de fenoles

La descomposición de compuestos fenólicos por métodos químicos ha sido

ampliamente estudiada. Ya sea ozonación simple, ó combinada con otros

POAs, diversos estudios han demostrado que este tipo de procesos son muy

eficientes, ya que es posible descomponer rápidamente compuestos fenólicos y

15

dar lugar a productos menos tóxicos como los ácidos orgánicos. (16, 24-41) El

esquema de reacción reportado en la literatura del fenol y clorofenoles con

ozono (16,24, 25-30) sugieren el esquema de reacción mostrado en la figura 1.3.

Figura 1.3. Esquema de reacción propuesto en la literatura para clorofenoles con ozono.

Como se puede observar en la figura 1.3, el primer ataque del ozono se

produce sobre los cloros de los clorofenoles (1), hasta producir fenol (2),

después continúa con la introducción de un grupo OH ya sea en posición orto ó

para, lo que deriva en la formación de catecol (3) e hidroquinona (4).

Posteriormente se rompe el anillo aromático y se pierden carbonos, que

involucran a los ácidos mucónico (5), fumárico y maléico (6), hasta obtener los

productos finales que son los ácidos oxálico (7) y fórmico (8).

Diferentes estudios acerca de la oxidación química de este tipo de compuestos

muestran que uno de los parámetros más importantes que influyen en la

descomposición de éstos con ozono, es el pH, (16, 23, 26-29) afectando tanto la

velocidad de degradación de los contaminantes, como en los productos

intermediarios y finales que se presentan. Estos trabajos revelan que si la

reacción se lleva a cabo bajo pH neutro ó ácido predomina la reacción directa

con ozono molecular. Por otro lado, si se trabaja bajo pH básico se presenta

una combinación de mecanismos, es decir, vía ozono molecular y vía radicales

hidroxilo, por lo que la velocidad de degradación de estos compuestos es más

16

alta (ya que el poder oxidante del radical hidroxilo es mayor que el del ozono;

ver tabla 1.5) y en consecuencia, el tiempo requerido para la descomposición

de los mismos es menor que si la reacción se lleva a cabo a pH neutro ó ácido.

(16,24,28,29)

En la literatura se encuentran diversos estudios referentes al tratamiento

químico de aguas contaminadas con clorofenoles. A continuación se describen

algunos de los trabajos más relevantes donde participa el ozono como oxidante.

Canton y col.(31) estudiaron la descomposición de fenol (100 mg/L) en diferentes

sistemas, O3, O3/Fe3+, O3/UV, O3/UV/Fe3+. El mejor sistema fue

O3/UV/Fe3+(pH3), a pesar de que la degradación del fenol fue más rápida con

ozonación simple, con el sistema antes mencionado se logra un 97% de

remoción de COT (Carbón Orgánico Total). La combinación del ozono con

UV/Fe3+ favorece la formación de radicales hidroxilo que da lugar a ese nivel

tan importante de mineralización.

Gimeno y col.(32) estudiaron la descomposición de fenol, 4-Nitrofenol y 4-

Clorofenol (200 mg/L) bajo diferentes sistemas como : O3, UV, O3/UV, TiO2/UV,

O3/UV/TiO2 y O3/TiO2. Las mejores combinaciones para la eliminación de los

tres fenoles fueron O3/UV y O3/UV/TiO2. La presencia del TiO2 favoreció la

eliminación de COT y DQO.

Kidak e Ince (33) estudiaron la descomposición de fenol (235 mg/L) bajo

diferentes sistemas UV, US, O3 (diferentes valores de pH), US/UV, O3/US,

O3/UV, O3/UV/US; la mejor combinación fue O3/UV/US independiente del pH

de ozonación. Para O3, simple se logran los mejores resultados a pH básico.

La sonólisis favorece la producción de radicales hidroxilo, por lo que se acelera

la degradación del fenol.

17

Hua Xiao y col. (34) estudiaron la ozonación catalítica (Mn2+) del 2,4-Diclorofenol;

la adición de Mn2+, incluso en trazas acelera la mineralización del 2,4-DCF

(10mg/L), la remoción de COT aumenta del 40% (sin Mn2+) al 80% (con Mn2+).

El producto final de la ozonación sin catalizador fue ácido oxálico, mientras que

con el Mn2+, se llegó a CO2.

Chaudhary y Grimes (35) estudiaron la descomposición del fenol y del 4-

Clorofenol (50 mg/L) en varios sistemas: UV, electrólisis, UV/electrólisis (en

presencia y ausencia de Cu2+ y TiO2); el mejor sistema fue UV/electrólisis,

utilizando un cátodo de carbón activado para concentrar carbón. Con este

sistema de logra recuperar un 99% del cobre y la destrucción de los fenoles en

8h.

Amat et. al. (36) estudiaron la ozonación de una mezcla de ácidos fenólicos

(1mM de cada uno); la pre-ozonación de la mezcla inicial favoreció la

biodegradabilidad de la misma en función de la reducción del valor de DQO

(Demanda Química de Oxígeno). Se encontró que entre 3 y 5 min de ozonación

es el tiempo en que se alcanza el valor máximo para la relación DBO5/DQO.

De acuerdo a estos trabajos se puede observar el ozono es eficaz para la

remoción de compuestos fenólicos, así mismo favorece el aumento en la

biodegradabilidad expresada en términos de DBO5/DQO, sin embargo, en

términos de mineralización, la aplicación de ozono por sí solo resulta

insuficiente. Cuando se logran altos niveles de remoción de COT es porque en

el proceso se inducen las condiciones para la generación de los radicales

hidroxilo, es decir se cuenta con el reactivo de Fenton, catalizadores, luz UV o

ultrasonido. Cuando se hacen diferentes combinaciones entre éstos y el ozono,

se genera suficiente cantidad de especies oxidantes que dan lugar a grados

importantes de mineralización.

18

Tomando en cuenta la información presentada en esta sección, es evidente que

cuando se aplica la ozonación sin la combinación con otro agente químico ó

fotoquímico que induzca fuertemente la generación de radicales hidroxilo, es

difícil oxidar los compuestos orgánicos hasta CO2, ya que a lo largo de la

reacción se van formando compuestos cuyas constantes de reacción con ozono

son muy bajas y tienden a acumularse, tales como los ácidos orgánicos; oxidar

estos ácidos hasta CO2 implicaría tiempos de tratamiento muy grandes que

inminentemente se verían reflejados en un aumento significativo de los costos

operativos. (20,22)

El esquema de reacción de los clorofenoles con el ozono (Figura 1.3) puede

darle una idea al lector de cuáles son los compuestos que se encuentran

presentes después de la ozonación de los clorofenoles estudiados en este

trabajo, y tal como fue descrito en la introducción, después de la oxidación

química fueron sometidos al proceso de biodegradación.

1.6 Biodegradación

Los métodos biológicos han sido altamente estudiados para la descomposición

de contaminantes debido a que su aplicación resulta menos costosa en

comparación con los tratamientos químicos.

1.6.1. Definición de biodegradación

Las medidas biocorrectivas o los sistemas de biorremediación consisten

principalmente en el uso de microorganismos (levaduras, hongos o bacterias)

existentes en el medio, para descomponer o degradar sustancias peligrosas en

sustancias de carácter menos tóxico o bien inocuas para el medio ambiente y la

salud humana. La biodegradación se refiere al proceso natural mediante el cual

19

bacterias u otros microorganismos alteran y convierten moléculas orgánicas en

otras sustancias, como ácidos grasos y CO2. (37, 38)

La satisfactoria eliminación de los xenobióticos (compuestos químicos

altamente tóxicos) por métodos biológicos requiere una comprensión detallada

de los factores que afectan la biodegradación. Los factores ambientales, claves

para que se produzca la biodegradación de estos compuestos son:

1. La concentración del xenobiótico – si ésta es muy alta, pueden existir

problemas de toxicidad, que pueden inhibir el proceso.

2. El pH del ambiente y la temperatura del mismo, ya que los dos

factores afectan al crecimiento y al metabolismo.

3. La disponibilidad de agua, de forma que se equilibre el potencial

osmótico en el interior y exterior celular.

4. La disponibilidad de otros nutrientes necesarios para el crecimiento

(sales inorgánicas u otros co-metabolitos).

5. La presencia de otro material orgánico.

El medio ambiente ideal es aquel en el que las condiciones son constantes o, al

menos, predecibles y, por lo tanto, permiten el crecimiento y metabolismo de los

microorganismos. Esta situación facilita la realización de estudios a nivel de

laboratorio para poder determinar el régimen de tratamiento óptimo para la

destrucción de los xenobióticos.

Una situación con estas condiciones definidas y constantes ocurre rara vez en

la naturaleza, pero puede darse fácilmente en el caso del tratamiento de

20

efluentes industriales, en cuyo proceso se pueden controlar las condiciones

físicas y ambientales. (37-39)

1.6.2. Ventajas y desventajas de la biodegradación en el tratamiento de agua

Algunas de las ventajas y desventajas de la biodegradación aplicada en

tratamiento de aguas residuales son:

Ventajas:

• Son más económicos que los tratamientos químicos

• Generan pocos subproductos

• Es posible llegar a la mineralización total de los contaminantes (hasta

CO2 y H2O).

Desventajas:

• Se presenta inhibición por altas concentraciones y/o acumulación de

metabolitos tóxicos para los microorganismos.

• Se requieren tiempos considerablemente mayores (de días a meses) a

los requeridos por otro tipo de tratamientos, como los químicos.

• Se generan lodos derivados del crecimiento microbiano.

1.7. Biodegradación de clorofenoles Se ha reportado la eliminación de clorofenoles por métodos biológicos, pero

debido a su toxicidad, el tratamiento de altas concentraciones de estos

contaminantes se vuelve difícil, y en general los tiempos que se requieren para

21

lograr la degradación, son muy grandes. Diversos autores han reportado que

las células inmovilizadas y cultivos de hongos de la “pudrición blanca”

inmovilizados resultan más estables para el tratamiento de fenoles comparado

con células dispersas libres. (40, 41)

El mecanismo general de desestabilización del anillo aromático desarrollado por

los microorganismos aerobios implica una oxidación progresiva de la estructura

resonante. Actualmente se tiene un gran conocimiento de algunas rutas

catabólicas microbianas de compuestos aromáticos, especialmente de las

pertenecientes al género Pseudomonas. Estas rutas metabólicas indican que el

primer paso consiste en la incorporación de dos grupos hidroxilo en el anillo

aromático, para lo cual los microorganismos han desarrollado una serie de rutas

periféricas de oxidación, deshalogenación, desnitración, ó desulfuración, que

dan lugar a un intermediario susceptible a la acción de dioxigenansas (enzimas)

específicas que provocarán la apertura del anillo. Estos derivados dihidroxilados

pueden ser canalizados por la ruta del catecol, en la que los intermediarios

catecólicos pueden ser metabolizados a su vez mediante la ruta meta ó bien la

ruta orto, dependiendo de la posición en que se efectúe la apertura del anillo.

Los metabolitos finales de esta ruta entran directamente en el metabolismo

intermediario de la célula. (42)

En general, los compuestos aromáticos alifáticos son degradados por la ruta

meta, en contraposición a los compuestos aromáticos clorados que,

normalmente, son metabolizados por la ruta orto. (42) La degradación de estos

sustratos en mezcla es común que se vea inhibida por la acumulación de

metabolitos letales como son: clorocatecoles y semialdehídos hidroximucónicos

clorados. (43,44) La acumulación de estos metabolitos tóxicos para los

microorganismos es en gran medida responsable de que los clorofenoles

resulten difíciles de eliminar por biodegradación.

22

Los tratamientos de biodegradación se pueden llevar a cabo ya sea con cepas

puras, o bien utilizando cultivos mezclados (consorcios microbianos), es decir

que varios tipos de especies se cultivan simultáneamente. Éstos se dividen en

tipos indefinidos y definidos. Los primeros se ven claramente ejemplificados por

los lodos activados. En este caso, no se tiene totalmente identificado al tipo de

microorganismos que coexisten, pero por pruebas y un tratamiento de

aclimatación previo se sabe que descomponen los contaminantes deseados. (45)

En la biodegradación de xenobióticos con cultivos puros se ha reportado la

acumulación de metabolitos tóxicos porque un microorganismo sólo no tiene la

capacidad de mineralizar el contaminante. (46) Una de las ventajas de usar

consorcios microbianos es que la interacción entre las especies presentes

puede favorecer el proceso. Adicionalmente, la capacidad de biodegradación se

puede mejorar si previamente se adaptan los microorganismos a la fuente de

carbono que se desea degradar.

Se han realizado diversos trabajos referentes a la biodegradación de los

clorofenoles en agua, en las siguientes líneas se describen algunos de ellos.

Bollag y col.(47) estudiaron la biodegradación de tres clorofenoles: 4-Clorofenol,

2,4-Diclorofenol y 2,4,6-Triclorofenol tanto individuales como en mezcla. Para el

biotratamiento se empleó la enzima laccase proveniente del hongo Trametes

villosa; se observó que la enzima en cuestión fue capaz de degradar los

clorofenoles individuales (0.5mM en 24h.) bajo el siguiente orden de facilidad:

2,4-DCF(96%)>2,4,6-TCF(85%)>4-CF(59%). Las mezclas binarias y ternarias

fueron más difíciles de degradar y se presentó inhibición a menores

concentraciones. El 4-CF (0.5mM) individual ó en mezcla no pudo ser

degradado más allá del 60%.

Stoilova y col. (40) estudiaron la biodegradación del fenol, catecol, 2,4-

Diclorofenol y el 2,6-Dimetoxifenol con la cepa fúngica Aspergillus awamori;

23

Este hongo fue capaz de mineralizar todos los compuestos individuales (1g/L),

bajo el siguiente orden de facilidad: catecol, 2,4-DCF, fenol, 2,6-DMF en 82h, 5

días, 7 días y 8 días, respectivamente.

Salmerón-Alcocer et. al. (48) estudiaron la biodegradación de los siguientes

compuestos fenólicos: fenol, 4-Clorofenol, 2,4-Diclorofenol, 2,6-Diclorofenol,

2,4,6-Triclorofenol usando las cepas puras: Burkholderia, Microbacterium

phyllosphaerae y Candida tropicalis, así como la mezcla de ellas. En este

estudio se usó el fenol (300mg/L) como sustrato y los clorofenoles como

cosustratos en un biorreactor continuo. Bajo estas condiciones el consorcio fue

capaz de degradar los clorofenoles (50mg/L), así como el fenol. Para todos los

casos el consorcio mostró mejores resultados que las cepas puras.

Sahinkaya y Dilek (49) estudiaron la biodegradación del 4-Clorofenol y del 2,4-

Diclorofenol de forma individual y en mezcla usando un consorcio microbiano

previamente aclimatado a estas fuentes de carbono. En este trabajo se logró la

degradación total del 2,4-DCF (104mg/L) en 20h usando el consorcio que

previamente se adaptó a una mezcla de 2,4-DCF y 4-CF; por otro lado, con el

consorcio adaptado sólo a 2,4-DCF, se presentó inhibición del proceso.

Sahinkaya y Dilek (2007b) (50) estudiaron la biodegradación del 4-clorofenol y el

2,4-diclorofenol en reactores batch y SBRs. Cuando la reacción se llevó a cabo

en el sistema batch en ambos contaminantes se presentaron problemas de

inhibición a 53 y 25 mg/L, respectivamente. En la operación del SBRs (tiempo

de residencia de 10 días), la fuente de carbono preferida por los

microorganismos fue el 2,4-diclorofenol con respecto al 4-clorofenol, bajo esta

configuración de reactor se logró la completa remoción de los contaminantes y

se demostró que los parámetros de operación que más influyen para una buena

remoción son el tiempo de alimentación de los sustratos y la presencia de un

sustrato biogénico (peptona).

24

De la revisión bibliográfica concerniente a la biodegradación de clorofenoles

destacan algunos aspectos como la toxicidad de los clorofenoles que se ve

evidenciada en la inhibición de los procesos biológicos. Tal problema ha sido

atacado modificando algunos factores del bioproceso a realizar, entre La

medidas se encuentra el realizar la degradación de los clorofenoles por

cometabolismo con sustancias biogénicas (glucosa o peptona) o especies

menos tóxicas y químicamente similares como el fenol. Otro factor es el uso de

consorcios microbianos en lugar de cultivos puros, ya que los diferentes

microorganismos interactúan entre sí y se obtienen mayores tasas de

degradación de compuestos xenobióticos.

Así mismo, la aclimatación previa a la fuente de carbono específica a degradar,

se ha demostrado que es un factor es de suma importancia para reducir los

problemas de inhibición por toxicidad del sustrato. Por otro lado, el uso de

microorganismos inmovilizados en diferentes configuraciones de reactores con

diferentes tipos de soportes microbianos, donde se aumente el tiempo de

residencia y se mejore el contacto entre el influente contaminado y los

microorganismos es un factor que mejora los resultados obtenidos en un

bioproceso.

Como se pudo verificar en la revisión bibliográfica, la aplicación de estos

factores (individualmente o combinados) se ven reflejados en una inminente

mejoría de los procesos biológicos.

1.8. Combinación de tratamientos químicos y biológicos para la eliminación de contaminantes Recientemente, la combinación de oxidación química con biodegradación, como

método de tratamiento del agua residual, ha concentrado el interés de algunos

25

investigadores. (35-37) La combinación de la oxidación química seguida de

biodegradación ha demostrado ser efectiva para la eliminación de

contaminantes en agua, ya que compuestos xenobióticos pueden ser

convertidos en especies más fáciles de degradar por métodos biológicos. Así

mismo, se ha reportado en la literatura que la oxidación química seguida de

biodegradación es una opción viable en casos tales como:

1) El efluente es biorecalcitrante, o bien no-biodegradable por la enzimas

intracelulares. La oxidación química parcial puede mejorar la biodegradabilidad

de estos efluentes transformando a los compuestos iniciales en especies más

fáciles de biodegradadar. (51)

2) Los compuestos a tratar son insolubles. Weng y colaboradores (52)

demostraron que el benzo[a]pireno (insoluble en agua y cancerígeno) se puede

tratar con ozono para oxidarlo parcialmente y producir productos más solubles

en agua, de menor peso molecular, que resultaron más biodegradables

4) De manera similar, si el peso molecular de compuestos poliméricos, por

ejemplo, dificulta el tratamiento biológico de éstos, se puede mejorar con un

pretratamiento químico. Mantzavionos y colaboradores (53) demostraron que la

oxidación catalítica con aire y temperatura del polietilenglicol (PM= 10,000) da

como resultado subproductos sustancialmente más biodegradables.

La combinación de tratamientos químicos con procesos biológicos para

degradar contaminantes se ha estudiado tanto para compuestos individuales

como para sistemas reales, a continuación se presentan algunos de estos

trabajos.

Contreras y col. (54) estudiaron el sistema O3/biodegradación aerobia con lodos

activados para la degradación del 2,4-Diclorofenol (10mg/L); el contaminante

no pudo ser degradado sólo por el tratamiento biológico, pero con pre-

26

ozonación se logró un 70% de remoción del COT en un biorreactor continuo con

un HTR (Tiempo de Retención Hidraúlico) entre 12 y 48h.

Essam T., y col., 2006 (55) estudiaron la combinación de radiación UV (durante

40 h) y biodegradación (28 días) para dar tratamiento a una mezcla de

clorofenoles, encontraron que la combinación de ambos tratamientos reduce la

toxicidad de la mezcla (la mayor degradación se logra en el pretratamiento

químico), así mismo, la actividad microbiana aumenta con la pre-irradiación,

pero no hay información clara sobre los subproductos de la irradiación y cuál es

su dinámica durante el bioproceso.

Essam T., y col., 2007 (56) estudiaron la descomposición de la misma mezcla de

clorofenoles descrita en el párrafo anterior, pero con tres diferentes sistemas de

combinación que incluían radiación UV, TiO2, H2O2 y biodegradación en

diferentes arreglos: radiación UV (40h)/TiO2 más biodegradación (28 días), así

como UV (40h)/H2O2 más biodegradación (28 días) y UV (40h)/H2O2/TiO2 más

biodegradación (28 días). El sistema más efectivo fue UV/H2O2/TiO2 más

biodegradación; los autores mencionan que algunos de los productos formados

durante la fotodegradación son tóxicos y podrían ser causantes de la inhibición

microbiana que observan en su trabajo. Sin embargo, en éste no se hace un

estudio detallado sobre qué productos se forman en este tratamiento químico y

el efecto que tienen sobre biotratamiento.

Sangave, y col., 2007 (57) estudiaron el sistema O3/biodegradación aerobia

(cepa pura aislada de una plata de tratamiento de aguas) para dar tratamiento a

el agua residual proveniente de una licorera. La pre-ozonación favoreció la

biodegradación, después del pretratamiento químico se pudo observar

crecimiento celular, así como una disminución del DQO. Para esta mezcla

específica no es recomendable ozonar más de 1h.

27

El-Gohary, y col., 2008 (58) estudiaron en sistema Fenton/biodegradación

aerobia para el tratamiento de un agua residual proveniente de la producción de

aceite de oliva. Se adicionó el reactivo de Fenton durante 2h en un reactor

CSTR y se continuó el mezclado otras 2h. Posteriormente el efluente se

alimentó a una batería de dos biorreactores con un HTR de 24h para cada uno.

El efluente del pretratamiento Fenton pudo ser degradado en el biorreactor con

altas eficiencias de remoción de DQO y compuestos de control como fenol y

lignina.

La combinación de tratamientos químicos y biológicos ha dado buenos

resultados para degradar diferentes contaminantes en fase acuosa ya que es

posible obtener mayores eliminaciones de compuestos tóxicos. Sin embargo los

estudios realizados no son muy precisos en cuanto a la formación de

subproductos en el pretratamiento químico, así como su respectiva

descomposición en la subsecuente etapa biológica. Por otro lado, en los

trabajos revisados no se toma en cuenta la adaptación de los microorganismos

a las respectivas mezclas de compuestos formadas en el pretratamiento

químico ni se presentan criterios para decidir en qué momento es adecuado

cortar el tratamiento químico y acoplar el biológico.

De la información recabada en la investigación bibliográfica presentada

previamente, se puede observar que los tratamientos químicos son muy

eficientes para la remoción de compuestos tóxicos (más no para llegar a la

mineralización de los mismos), mientras que los tratamientos biológicos no son

tan efectivos porque dependiendo de la concentración del contaminante se

presenta la inhibición del proceso. Para contrarrestar este efecto se pueden

usar consorcios microbianos (sobre todo si el agua a tratar tiene más de un

contaminante) y adicionalmente someter a estos microorganismos a una etapa

previa de adaptación.

28

En función de lo anterior, en el presente trabajo se pretende combinar la pre-

ozonación de clorofenoles (4-Clorofenol, 2,4-Diclorofenol) en solución acuosa

con biodegradación aerobia utilizando un consorcio microbiano previamente

adaptado (células libres), para mejorar la eficiencia de biodegradación de estos

compuestos, bajo la premisa de que los productos de ozonación de estos

compuestos son más fáciles de biodegradar que los compuestos iniciales.

29

CAPÍTULO 2. DESARROLLO EXPERIMENTAL

2.1 Materias primas Las Materias Primas utilizadas en el desarrollo experimental fueron reactivos

analíticos adquiridos en diferentes casas comerciales, tal como se puede

apreciar en la tabla 2.1.

Tabla 2.1. Reactivos utilizados en la experimentación

Reactivo MM (g/gmol)

Pureza (%) Compañía

Fenol fundido 94.1 98 J. T. Baker 4 – Clorofenol 128.6 99 Sigma Chemical Co. 2.4 – Diclorofenol 163.0 98 Sigma Chemical Co. Catecol 110.1 99 Sigma Chemical Co. Hidroquinona 110.1 99 Sigma Chemical Co. Ácido Oxálico 90.0 99 Aldrich Chemical Co. Inc. Ácido Fórmico 46.0 88 J. T. Baker Ácido trans-Mucónico 142.1 97 Fluka Chemika Ácido Fumárico 116.1 99 Aldrich Chemical Co. Inc. Ácido Maléico 116.1 99 Aldrich Chemical Co. Inc. Sulfato de amonio 132.1 99 Teqsiquim Fosfato de potasio monobásico 136.1 99 Teqsiquim Fosfato de potasio dibásico 174.2 98 Teqsiquim Sulfato de magnesio 246.5 98 Teqsiquim Sulfato de Calcio 136.1 98 Teqsiquim Sulfato ferroso 278.0 99 Teqsiquim Acetonitrilo 41.0 99.97 Teqsiquim Ácido Fosfórico 98.0 85 J. T. Baker

2.2 Esquema experimental a nivel laboratorio

El desarrollo de este trabajo se dividió en tres partes principales: se realizaron

individualmente los tratamientos de ozonación y biodegradación así como la

30

combinación de ambos tratamientos para la degradación de dos clorofenoles: 4-

Clorofenol (4-CF) y 2,4-Diclorofenol (2,4-DCF), éstos se estudiaron de manera

individual, en solución acuosa a una concentración inicial de 120 mg/L (Figura

2.1).

Figura 2.1. Tratamientos empleados para las soluciones problema.

En la figura 2.2 se presenta de manera esquemática y general el camino a

seguir a lo largo de la experimentación. En la sección de ozonación individual

se incluyó la identificación de subproductos por Cromatografía de Líquidos

(HPLC). En la secciones de biodegradación de los compuestos individuales se

antepuso la etapa de adaptación del consorcio microbiano a la fuente de

carbono a degradar, además de la biodegradación de los clorofenoles, se

realizó la biodegradación de los principales productos identificados en la

ozonación. Cuando se terminaron estas secciones se hizo un análisis de los

resultados obtenidos en ambas y en función de éstos se eligieron las

condiciones de ozonación para realizar el tratamiento combinado. Se realizó la

ozonación y se aclimataron consorcios acorde a las condiciones de ozonación y

se realizó el tratamiento biológico.

31

Figura 2.2. Diagrama del desarrollo experimental. En todos los casos, el pH fue ajustado con una solución de NaOH 0.05N ó

H3PO4 0.05N, según lo ameritara el caso.

2.2.1 Proceso de ozonación Los experimentos se llevaron a cabo a presión y temperatura ambiente

(23±3°C) en un reactor de tipo semi-continuo con una capacidad de 1.5L. En la

parte inferior del reactor se encuentra una placa de cerámica porosa (difusor),

32

así mismo cuenta con una toma de muestras, para extraer alícuotas y una

salida en la parte superior, para monitorear el ozono que sale del reactor.

2.2.1.1 Descripción del proceso

El ozono es generado a partir de oxígeno seco con una pureza del 99.5%

proveniente de un tanque (T), por medio de un generador de ozono “AZCO” (G). Las condiciones de trabajo fueron: concentración inicial de ozono: 28±2 mg/L, a

un flujo de: 0.5mLl/min (el diagrama de la ozonación se muestra en la figura

2.3).

Figura 2.3. Diagrama esquemático del sistema de ozonación: (R) reactor, (T) tanque de oxígeno, (G) generador de ozono, (EV1, EV2 EV3) by-pass con electroválvulas, (S) analizador de ozono, (M) sistema de adquisición de datos (C) PC.

33

La mezcla ozono/oxígeno proveniente del generador es introducido al reactor

(R) por la parte inferior, y es distribuido uniformemente en la solución acuosa

por medio del difusor. En la parte superior del reactor se encuentra una salida

que se conecta a un analizador de ozono en fase gaseosa BMT-930 (S)

conectado a un equipo de cómputo (C) que recibe los datos procesados para

ser en “MATLAB”, mediante un módulo de adquisición de datos National

Instruments Modelo USB 6008 (M), y genera una gráfica de la concentración de

ozono a la salida del reactor contra tiempo (ozonograma). El sistema cuenta

con tres electroválvulas (EV1, EV2, EV2), por medio de este arreglo es posible

medir la concentración inicial de ozono antes de ser introducido al reactor.

La selección de las condiciones del proceso se hizo tomando como referencia

los resultados obtenidos en trabajos previos (16) y se presentan en la tabla 2.4.

La ozonación se llevó a cabo bajo dos condiciones de pH inicial (7 y 12), el cual

no se controló durante la reacción.

Tabla 2.2 Condiciones de ozonación de los clorofenoles.

Compuesto Concentración (mg/L)

pH de solución

4-Clorofenol 120

7 12

2,4-Diclorofenol 7 12

2.2.2 Proceso de Biodegradación

2.2.2.1 Descripción del proceso Para los tratamientos biológicos se llevaron a cabo cultivos en lote; se

colocaron 50 mL de solución a tratar en matraces de 250 mL y se inocularon al

10%v (5 mL) con el cultivo correspondiente, acto seguido se incubaron a

34

temperatura ambiente y agitación controlada (120 rpm). A lo largo del tiempo se

tomaron muestras que posteriormente fueron sometidas a los análisis

correspondientes. El diagrama experimental del proceso de biodegradación a

nivel laboratorio se presenta en Figura 2.4.

Figura 2.4. Diagrama del proceso de biodegradación a nivel laboratorio.

Microorganismos utilizados.

La fuente de microorganismos usados en este trabajo fue un consorcio

microbiano proveniente de una planta de tratamiento de aguas industriales, el

cual fue adaptado durante tres meses al fenol como única fuente de carbón y

energía en los laboratorios de Biotecnología Ambiental de la (Unidad

Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología) UPIBI. Después de ese periodo

de adaptación dicho consorcio fue proporcionado para esta investigación. Los

microorganismos se encontraban suspendidos en medio de cultivo apropiado

para su crecimiento, el cual fue preparado con agua destilada y diferentes sales

inorgánicas con la concentración indicada en la tabla 2.3.

Antes de llevar a cabo los tratamientos biológicos, el pH de las soluciones

problema se ajustó a 7±0.5 y se añadieron las respectivas sales del medio de

cultivo.

35

Tabla 2.3. Composición del medio de cultivo

Compuesto Concentración (g / L)

(NH4)2SO4 3.0

KH2PO4 0.6

K2HPO4 2.4

MgSO4 .7H20 1.5

CaSO4 .2H20 0.15

FeSO4 .7H20 0.03

Como se puede observar en la figura 2.2, los tratamientos biológicos se llevaron

a cabo tanto para los clorofenoles sin ozonar como para los productos

resultantes de la ozonación de los mismos. Es importante mencionar que para

cada proceso de biodegradación se cultivó un consorcio específicamente

adaptado a la fuente de carbono a degradar; todos éstos se derivaron a partir

del consorcio adaptado a fenol (CAF).

Se utilizó el CAF como fuente de microorganismos para contar con diversidad

microbiana que fuera capaz de consumir los diferentes sustratos suministrados

en este trabajo. Cabe resaltar que el hecho de que el consorcio inicial fuera

capaz de consumir fenol facilitó que los consorcios derivados se pudieran

adaptar a compuestos fenólicos (clorofenoles) y derivados resultantes del

proceso de ozonación, ya que algunos de éstos compuestos se encuentran

dentro de la ruta metabólica seguida por los microorganismos para degradar

fenol.

Aclimatación de los microorganismos a fuentes de carbono no ozonadas

36

Con el fin de cultivar y adaptar los consorcios para degradar los compuestos sin

ozonar se tomaron 50 mL del CAF (suspendido en medio de cultivo), se

contaminaron con el compuesto de interés de tal forma que éste constituyera su

única fuente de carbono y energía y se incubaron a 120 rpm. Se dio

seguimiento periódico a la concentración de sustratos en los diferentes medios

contaminados hasta que se verificó que éstos eran consumidos por los

consorcios respectivos, lo cual confirmó que los microorganismos se habían

adaptado y era viable utilizarlos en el bioproceso deseado.

En la tabla 2.4 se muestran los consorcios que se cultivaron con fuentes de

carbono no ozonadas, así como la concentración de éstas en el consorcio

correspondiente.

Tabla 2.4. Consorcios adaptados a compuestos sin ozonar

Consorcio Fuente de carbono adaptada Concentración (mg/L)

CAF Fenol 200

CA4CF 4-Clorofenol 40

CA24DCF 2,4-Diclorofenol 40

CAA Mezcla de ácidos oxálico y fórmico 100 (cada ácido)

Debido a la alta toxicidad de los Clorofenoles, la concentración con que se

adaptó al CA4CF y al CA24DFC fue baja con respecto a las usadas en el CAF y

CAA, que son compuestos de menor toxicidad.

Aclimatación de los microorganismos a fuentes de carbono previamente

ozonadas

La adaptación del consorcio a fuentes de carbono previamente ozonadas se

llevó a cabo por el método fill-and-draw(59), el cual consiste en poner en

contacto a los microorganismos con el sustrato a concentraciones crecientes en

37

ciclos semi-continuos diarios, es decir, a 50 mL de solución (efluente del reactor

de ozonación) se le ajusta el pH a 7 y se añaden las sales del medio de cultivo,

se inocula al principio del ciclo y se incuba a 200 rpm y 25°C durante 23 horas,

posteriormente la solución se deja sedimentando por 45 min y se elimina el

sobrenadante.

El objetivo de este método de adaptación es aumentar gradualmente la

concentración de sustratos a los cuáles se pretende aclimatar al consorcio; ya

que la fuente de carbono la constituye el efluente de ozonación, se hicieron

diluciones de éste de tal forma que se tuviera en solución del 10%-100% de la

concentración de los productos de ozonación. En el primer ciclo del proceso se

utiliza la solución que contiene 10% de sustrato (productos de ozonación),

cuando se elimina el sobrenadante correspondiente, en el sedimento se

encuentran contenidos los microorganismos, a los cuáles se les agrega

nuevamente 50 mL de solución, pero a una mayor concentración a la previa

(20%-100% de sustrato) y así sucesivamente (Figura 2.5).

Figura 2.5. Diagrama del proceso de adaptación de los microorganismos (fill-and-draw).

38

Los inóculos para los consorcios adaptados a los clorofenoles ozonados bajo

diferentes condiciones se constituyeron por mezclas de CA4CF, CA24DCF,

CAF y CAA, con el fin de tener en el medio microorganismos capaces de

degradar tanto los clorofenoles, así como compuestos fenólicos y ácidos

orgánicos que forman parte de los productos de reacción de los clorofenoles

con el ozono, lo cual se discutirá más a fondo en el siguiente capítulo.

Mantenimiento de los cultivos

Los microorganismos se mantuvieron suspendidos en el medio de cultivo antes

descrito con agitación permanente, a temperatura ambiente. Periódicamente se

realizaron labores de mantenimiento de los consorcios, tales como el

resembrado, es decir, tomar una parte del consorcio y añadir solución

contaminada con los compuestos a los cuáles se encontraba adaptado el

consorcio e incubar.

Por otro lado, para evitar el agotamiento de los nutrientes, así como la oxidación

celular, periódicamente se cambió el medio de cultivo en los cultivos. Éstos se

filtraron con membranas de 0.45 micras de tamaño de poro; los sólidos (que

contienen las células) se suspendieron en medio de cultivo fresco contaminado

con los compuestos de interés.

Los tiempos de resembrado y cambio de medio de cultivo dependen de los

ciclos de consumo de sustrato y crecimiento de cada consorcio en particular.

2.2.3. Métodos analíticos

Espectrofotometría UV-Vis

39

Esta técnica se utilizó para obtener las dinámicas de descomposición de los

clorofenoles sin ozonar. Las muestras se filtraron con acrodiscos de 0.2 micras

y posteriormente fueron analizadas con un equipo UV-VIS de Perkin Elmer

Lambda 2S; se hizo el barrido en el rango de 190-320 nm.

La cuantificación se realizó a las longitudes de onda características de los

compuestos de estudio, como se observa en la tabla 2.5.

Tabla 2.5. Longitudes de onda características de los compuestos estudiados.

Compuesto λmáx

4-Clorofenol 279.9

2,4-Diclorofenol 284.4

También, se utilizó esta técnica para el monitoreo de la formación de biomasa

en el proceso de biodegradación. Se tomaron muestras del bioproceso, las

cuales no se filtraron y se midió su Densidad Óptica (absorbancia) a una λ =

600 nm (DO600) con el mismo equipo UV-VIS.

Cromatografía de los líquidos de alta eficiencia (HPLC)

Esta técnica se utilizó para la identificación de los subproductos formados, así

como la cuantificación de la descomposición y/o acumulación de los mismos,

para ello se utilizó un Cromatógrafo de Líquidos de Alta Eficiencia (HPLC) Serie

2000 de Perkin Elmer; la identificación se hizo por comparación de tiempos de

retención de los compuestos observados y estándares de referencia. Se

utilizaron dos condiciones de análisis, según el tipo de compuestos a identificar

(tabla 2.6).

40

Tabla 2.6 Condiciones de análisis por HPLC

Condiciones de operación

Tipo de compuestos

Fenólicos Ácidos orgánicos

Columna Platinum C-18 (Marca

Alltech), 250 x 4.6mm

Prevail Organic Acid (Marca

Grace), 150 x 4.6mm

Fase móvil

60:40

(H2O:Metanol)

Solución KH2PO4 25 mMol

(pH =2.5)

λ (nm) 210

Flujo 1mL / min

Volumen de

Inyección 30 µL

De aquí en adelante, se considerarán compuestos fenólicos, aquellos que

fueron observados a partir de la separación lograda con la columna C-18, por

otro lado, se considerarán ácidos orgánicos aquellos observados a partir de la

separación obtenida con el otro método, ambos especificados en la tabla 2.6.

Lo anterior, por la afinidad de los compuestos en cuestión con las fases móviles

usadas.

41

CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1 Ozonación previa de clorofenoles

Se realizó la ozonación de los clorofenoles con el fin de obtener las dinámicas

de descomposición de los clorofenoles con el ozono, así como la de

acumulación y/o descomposición de los respectivos intermediarios formados en

el proceso para seleccionar las condiciones del acoplamiento posterior con los

tratamientos biológicos. De aquí en adelante el término dinámica referirá a la

variación de la concentración del compuesto en cuestión con respecto al

tiempo.

Las condiciones experimentales (concentración inicial y flujo volumétrico de

ozono, pH de la reacción) se eligieron tomando como referencia los resultados

previos (16). Las constantes de reacción de la ozonación de los clorofenoles

fueron determinadas por Poznyak y col. (29) y se presentan en la tabla 3.1

Tabla 3.1 Constantes de reacción de la ozonación de los clorofenoles

Compuesto pH ozonación k, L/mol s

4-Clorofenol 7 3.091 x 103 12 8.474 x 103

2,4-Diclorofenol 7 6.173 x 103 12 17.032 x 103

A pesar de contar en bibliografía con estudios tan sólidos acerca de la

ozonación de estos compuestos fue necesario hacer un estudio particular de la

misma para confirmar lo reportado en la literatura y para recabar toda la

42

información requerida para seleccionar las condiciones, bajo las cuales llevar a

cabo la ozonación en el tratamiento combinado propuesto en este trabajo.

Se llevó a cabo la ozonación (en un sistema semi-continuo) del 4-clorofenol y

del 2,4-diclorofenol individualmente (ambos a una concentración inicial de 120

mg/L), el pH inicial de trabajo fue de 7 y 12 para cada compuesto. Las

condiciones de operación se llevaron a cabo de acuerdo a lo expuesto en el

capítulo 2.

A lo largo del proceso se tomaron muestras para obtener las dinámicas de

descomposición de los contaminantes y las de formación y/o descomposición

de los productos de reacción, la identificación de éstos se realizó por HPLC.

Cabe mencionar que se observaron algunos compuestos que no fue posible

identificar por esta técnica, sin embargo se presentan sus dinámicas

(normalizadas con respecto a la concentración máxima) a lo largo del proceso

de ozonación.

A continuación se muestran los ozonogramas respectivos (variación de la

concentración de ozono a la salida del reactor con respecto al tiempo), así

como las dinámicas de los compuestos involucrados a lo largo de la ozonación.

Los primeros segundos del ozonograma corresponden a la concentración inicial

de ozono, la caída súbita corresponde a la alimentación del ozono al reactor.

3.1.1 Saturación de ozono en agua

Antes de llevar a cabo la ozonación de los contaminantes se determinó la

descomposición de ozono en medio acuoso bajo las condiciones de trabajo.

Como se explicó en el capítulo 1, el ozono en solución acuosa puede

descomponerse en radicales OH, los cuales tienen un poder oxidante mayor al

primero; esta descomposición se favorece en medio alcalina.

43

Para verificar este efecto, se llevó a cabo la ozonación del agua sin

contaminante bajo pH 7 y 12, en ambos casos se verificó la saturación (cuando

la concentración de ozono a la salida del reactor es constante), así como la

descomposición de ozono (diferencia entre la concentración de entrada y salida

del reactor). Esta información se presenta en la figura 3.1, donde se puede

apreciar que a pH neutro no se presenta una descomposición significativa del

ozono; ya que la concentración de éste a salida del reactor se iguala con la de

entrada una vez alcanzada la saturación del agua. Mientras que bajo

condiciones básicas, la concentración de ozono a la salida del reactor no se

iguala a la de entrada ya que parte del ozono que entra al reactor se

descompone en radicales OH, obteniéndose una diferencia de concentraciones

de ozono (a la entrada y salida) del 26%.

Figura 3.1. Comportamiento del ozono a la salida del reactor durante su

saturación en agua bajo pH 7 y 12.

3.1.2 Descomposición del 4-Clorofenol con ozono

44

En las figuras 3.2 y 3.3 se presentan los ozonogramas del 4-Clorofenol bajo pH

7 y 12. En cada caso se presentan dos curvas, la primera corresponde a la

saturación de ozono en agua bajo el pH de trabajo y la segunda describe el

comportamiento del ozono en la reacción con el 4-Clorofenol bajo las

condiciones descritas. La diferencia entre ambas curvas es proporcional al

consumo de ozono en cada reacción.

Figura 3.2. Comportamiento del ozono a la salida del reactor para el 4-clorofenol (120 ppm), pH 7.

45

Figura 3.3. Comportamiento del ozono a la salida del reactor para el 4-

clorofenol (120 ppm), pH 12. Se puede observar que a pH 7 la concentración de salida iguala a la de entrada

hasta después de 4500 segundos (75 minutos), mientras que cuando la

reacción se lleva bajo pH 12, a los 1400 segundos (23 minutos) la

concentración de salida se iguala con la saturación de ozono en agua (ausencia

de contaminante).

3.1.2.1 Dinámica de descomposición del 4-clorofenol en el proceso de ozonación bajo pH 7 y distribución de productos de reacción En las figuras 3.4 – 3.7 se muestra la dinámica de descomposición del

4-clorofenol a lo largo del proceso de ozonación (bajo pH 7), así como las

dinámicas de formación y/o descomposición de los compuestos fenólicos y

ácidos orgánicos observados por HPLC. Se muestran por separado las

dinámicas de los compuestos identificados, así como las respectivas tendencias

resultantes de la normalización (con respecto al valor máximo) de la altura de

los picos observados en los cromatogramas correspondientes a los compuestos

no identificados. En dichas figuras se indican con flechas los tiempos de

46

descomposición y/o acumulación máximas de los compuestos involucrados en

la reacción, lo cual se explica posteriormente.

Figura 3.4 Distribución de compuestos fenólicos identificados a lo largo del

proceso de ozonación del 4-CF (pH 7).

Figura 3.5 Distribución de compuestos fenólicos no identificados a lo largo del

proceso de ozonación del 4-CF (pH 7).

47

De acuerdo a las figura 3.4 se puede observar que el tiempo de

descomposición (mayor al 99%) del 4-clorofenol bajo esas condiciones es de 15

minutos, tiempo que coincide con la máxima acumulación de hidroquinona (8

mg/L) que es el compuesto fenólico identificado que se acumula en mayor

cantidad a lo largo del proceso, ésta se descompone totalmente a los 30

minutos. También se observan trazas de fenol y catecol.

Así mismo se aprecia en la figura 3.5 que se forman algunos otros compuestos

que no se identificaron los cuáles tienen un máximo de acumulación a los 10

minutos, a partir de ese tiempo, su tendencia es a descomponerse, cuando han

transcurrido 30 minutos, la mayoría de estos compuestos han sido

descompuestos en su totalidad, o bien, de manera significativa (más del 60%

con respecto a la cantidad máxima acumulada).

Figura 3.6 Distribución de ácidos orgánicos identificados a lo largo del proceso

de ozonación del 4-CF (pH 7).

48

Figura 3.7 Distribución de orgánicos no identificados a lo largo del proceso de

ozonación del 4-CF (pH 7)

En la figura 3.6 se observa que el ácido oxálico es el producto final de la

reacción, ya que es el que mantiene una tendencia de acumulación a lo largo

del proceso (se alcanzan 64 mg/L), por otro lado, el ácido fórmico se acumula

en concentraciones importantes; a los 10 minutos alcanza su concentración

máxima (154 mg/L) y posteriormente tiende a descomponerse.

También se forman pequeñas cantidades de ácidos como el maleico y el

fumárico, sin embargo, las concentraciones de éstos siempre se mantienen en

el nivel de trazas (menos de 0.3 mg/L). Recordando el esquema de reacción de

los clorofenoles con ozono presentado en el capítulo 1 (figura 1.3), los

productos finales de la reacción (ácido oxálico y fórmico) se forman a partir de

los ácidos fumárico y maleico, pero la reacción de éstos últimos con ozono es

muy rápida, razón por la cual no se acumulan en cantidades significativas en la

reacción.

Con respecto a los ácidos orgánicos no identificados (figura 3.7) se puede

apreciar que su tendencia es muy similar a la de los compuestos fenólicos no

49

identificados, presentando un máximo en los 10 minutos y después de los 30

minutos la mayoría se han descompuesto completamente o bien, de manera

significativa (más del 60% con respecto a la cantidad máxima acumulada).

El análisis detallado de los subproductos identificados y no identificados se

realizó para todas las condiciones diferentes de ozonación planteadas en el

capítulo 2 (tabla 2.4). Por cuestiones de espacio, en adelante se omitirán las

figuras correspondientes a los compuestos fenólicos y ácidos orgánicos no

identificados, éstas pueden ser consultadas en el Anexo C. Sin embargo, más

adelante se presenta un resumen de los tiempos de acumulación y/o

descomposición de los compuestos involucrados en la ozonación bajo las

diferentes condiciones presentadas.

3.1.2.2 Dinámica de descomposición del 4-clorofenol en el proceso de ozonación bajo pH 12 y distribución de productos de reacción En las figuras 3.8 y 3.9 se muestran las dinámicas del 4-Clorofenol a lo largo del

proceso de ozonación (bajo pH 12), así como las dinámicas de formación y/o

acumulación de los compuestos fenólicos y ácidos orgánicos identificados.

Figura 3.8 Distribución de compuestos fenólicos a lo largo del proceso de

ozonación del 4-CF (pH 12).

50

De acuerdo a las figuras 3.8 se puede apreciar que cuando la ozonación se

lleva a cabo bajo pH 12 la descomposición del 4-clorofenol es más rápida que

en el caso anterior. Se requieren de 8 minutos para degradar más del 99% del

contaminante (contra 15 que se requieren para descomponerlo bajo pH 7). En

cuanto a los productos fenólicos, el compuesto que se acumula

mayoritariamente, al igual que bajo pH 7, es la hidroquinona, sólo que bajo

estas condiciones se acumula en concentraciones menores (máximo 1 mg/L),

así mismo, no se observa catecol y la acumulación de fenol también se

mantiene a nivel de trazas (menos de 0.3 mg/L).

Figura 3.9 Distribución de compuestos ácidos orgánicos a lo largo del proceso

de ozonación del 4-CF (pH 12).

Tomando en cuenta la figura 3.9, se observa que el compuesto que tiende a

acumularse es el ácido oxálico, al igual que cuando la reacción se lleva a cabo

bajo pH 7. Así mismo, la acumulación de éste es mayor (151 mg/L). Al principio

del proceso también se acumula el ácido fórmico, sin embargo a los 10 minutos

llega a su máximo (71 mg/L) y tiende a descomponerse hasta los 30 minutos.

Se observan algunas trazas (menos de 0.3 mg/L) de los ácidos fumárico y

maleico.

51

Conclusiones previas de la ozonación del 4-clorofenol bajo pH 7 y 12

Cuando la ozonación se lleva a cabo bajo pH 12 se observa una menor

cantidad de subproductos (tanto fenólicos como ácidos orgánicos), así mismo

las concentraciones de éstos son más pequeñas. En ambos casos, el producto

final de la reacción es el ácido oxálico, sin embargo, la formación de éste se

favorece más cuando la reacción se lleva bajo pH 12. Bajo estas condiciones se

forman 151 mg/L de este ácido, mientras que cuando se lleva a cabo bajo pH 7,

se acumulan hasta 64 mg/L. Así mismo, en ambos casos se acumulan

cantidades significativas de ácido fórmico y su tendencia en ambos procesos es

similar (se acumula desde el principio y luego se descompone). De manera

opuesta al ácido oxálico, la formación de éste se favorece bajo pH neutro y se

llega acumular hasta 154 mg/L, mientras que bajo pH 12 se acumulan hasta 71

mg/L.

En la tabla 3.2 se muestra de las concentraciones máximas de los productos de

ozonación identificados que se acumularon a lo largo del proceso.

Tabla 3.2 Concentración máxima de los compuestos identificados en la

ozonación del 4-Clorofenol

Intermediario Concentración (mg/L) según el pH

de ozonación 7 12

Catecol Trazas ND

Hidroquinona 8 1

Fenol Trazas Trazas

Ácido Fumárico Trazas Trazas

Ácido Maléico Trazas Trazas

Ácido Oxálico 60.0 160.0

Ácido Fórmico 154.0 71.0 */ND=No se detectó

52

3.1.3 Descomposición del 2,4-Diclorofenol con ozono

En las figuras 3.10 y 3.11 se presentan los ozonogramas del 2,4-diclorofenol

bajo pH 7 y 12. De manera similar a lo presentado para el 4-clorofenol, se

muestran las curvas de saturación de ozono en agua y la del comportamiento

del ozono en la reacción con el 2,4-diclorofenol bajo las condiciones de

operación. La diferencia entre ambas curvas es proporcional al consumo de

ozono en cada reacción.

Figura 3.10 Comportamiento del ozono a la salida del reactor para el 2,4-diclorofenol (120 ppm) a pH 7.

53

Figura 3.11 Comportamiento del ozono a la salida del reactor para el 2,4-diclorofenol (120 ppm) a pH 12.

De acuerdo a las figuras 3.10 y 3.11, para la ozonación del 2,4-diclorofenol bajo

pH 7, la concentración de salida es igual a la de entrada hasta después de 3000

segundos (50 minutos), mientras que cuando la reacción se lleva bajo pH 12, a

los 1400 segundos (23 minutos) la concentración de salida se iguala con la

saturación de ozono en agua (ausencia de contaminante).

Se puede apreciar que el perfil de ozonación para ambos clorofenoles es

similar (Figuras 3.12 y 3.13), de acuerdo a lo observado en sus respectivos

ozonogramas. El regreso de la concentración final al valor inicial (pH 7) es más

rápido en el 2,4-Diclorofenol (50 minutos) que en el 4-clorofenol (75 minutos),

sin embargo para el caso de la ozonación bajo pH 12, en ambos clorofenoles se

iguala la concentración de salida con la de saturación de ozono en agua a los

23 minutos. La comparación entre los ozonogramas de cada clorofenol bajo las

condiciones de trabajo se presenta en las figuras 3.12 y 3.13.

54

Figura 3.12 Comparación de los ozonogramas de ambos clorofenoles (pH 7).

Figura 3.13 Comparación del los ozonogramas de ambos clorofenoles (pH 12). A pesar de que el comportamiento de los ozonogramas de ambos clorofenoles

es similar, cualitativamente se puede observar que con el 2,4-diclorofenol es

menor el ozono consumido durante la reacción (bajo ambos pH), ya que el área

comprendida entre el ozonograma de la saturación y el de la reacción es

visualmente menor que la representada por el 4-clorofenol.

55

3.1.3.1 Dinámica de descomposición del 2,4-diclorofenol en el proceso de ozonación bajo pH 7 y distribución de productos de reacción

A continuación se presentan las dinámicas del 2,4-diclorofenol en el proceso de

ozonación (bajo pH 7), así como las dinámicas de formación y/o acumulación

de los compuestos fenólicos y ácidos orgánicos identificados a lo largo de la

reacción (figuras 3.14 y 3.15).

Figura 3.14 Distribución de compuestos fenólicos identificados a lo largo del

proceso de ozonación del 2,4-DCF (pH 7).

En la figura 3.14 se puede observar que el tiempo de descomposición (mayor al

99%) del 2,4-diclorofenol bajo esas condiciones es de 8 minutos (menor tiempo

que el 4-clorofenol ozonado bajo las mismas condiciones), tiempo que coincide

con la máxima acumulación de hidroquinona (2.8 mg /L), lo cual se observa

también en el 4-clorofenol. Además de la hidroquinona (que es el compuesto

fenólico identificado que se acumula en mayor cantidad), se observan algunas

trazas de catecol, fenol, así como 4-clorofenol.

56

Figura 3.15 Distribución de ácidos orgánicos identificados a lo largo del proceso

de ozonación del 2,4-DCF (pH 7).

En la figura 3.15, al igual que en el 4-clorofenol (ozonado bajo pH7), se

observa que el ácido oxálico es el producto final de la reacción, ya que

mantiene una tendencia de acumulación, alcanzando los 38 mg/L. Por otro lado,

el ácido fórmico también se acumula en concentraciones importantes: a los 10

minutos alcanza su concentración máxima (52 mg/L), la cual es

significativamente menor a la alcanzada con el 4-Clorofenol (154 mg/L),

después de esto, de manera similar, tiende a descomponerse. Cabe resaltar

que las dinámicas de estos ácidos en ambos compuestos son muy similares. En

este caso, también se observan trazas de ácidos fumárico y maleico.

3.1.3.2 Dinámica de descomposición del 2,4-diclorofenol en el proceso de ozonación bajo pH 12 y distribución de productos de reacción

De manera similar a las secciones anteriores, en las figuras 3.16 y 3.17 se

muestran las dinámicas del 2,4-Diclorofenol a lo largo del proceso de ozonación

57

(bajo pH 12), así como las dinámicas de formación y/o acumulación de los

compuestos fenólicos y ácidos orgánicos identificados.

Figura 3.16 Distribución de compuestos fenólicos identificados a lo largo del

proceso de ozonación del 2,4-DCF (pH 12).

Cuando la ozonación del 2,4-diclorofenol se lleva a cabo bajo pH 12, se observa

que la reacción es más rápida, en este caso se requieren 5 min para

descomponer más del 99% del contaminante, contra 8 minutos que se

requieren para hacerlo bajo pH 7. Al igual que todos los anteriores, el

compuesto fenólico que se acumula mayoritariamente es la hidroquinona (3

mg/L). Adicionalmente, se acumulan algunas trazas de fenol y 4-Clorofenol

(menos de 0.5 mg/L).

58

Figura 3.17 Distribución de ácidos orgánicos identificados a lo largo del proceso de ozonación del 2,4-DCF (pH 12).

En la figura 3.17, se observa que el ácido oxálico también es el producto que

tiende a acumularse a lo largo del proceso. Bajo estas condiciones se alcanza

una concentración de 128 mg/L. Por otro lado, el comportamiento del ácido

fórmico es similar al observado bajo pH 7, sin embargo, la dinámica de éste es

más rápida, en los primeros cinco minutos se acumula la máxima concentración

(54 mg/L) y a los 30 minutos ha sido descompuesto casi en su totalidad.

También se observan trazas de ácido fumárico y maleico (menos de 1 mg/L).

Conclusiones previas de la ozonación del 2,4-diclorofenol bajo pH 7 y 12

Cuando la ozonación del 2,4-Diclorofenol se lleva a cabo bajo pH alcalino, la

cantidad de productos de reacción (fenólicos y ácidos orgánicos) es menor, que

bajo pH neutro. Así mismo, bajo ambas condiciones de reacción, el ácido

oxálico es el compuesto que tiende a acumularse hasta el final del proceso, sólo

que bajo pH 12 se acumula en mayor cantidad (128 mg/L), mientras que bajo

pH 7 se acumulan 38 mg/L. En ambas condiciones de reacción se acumulan

59

trazas de ácidos fumárico y maleico, que de acuerdo al esquema de reacción

de los clorofenoles con ozono presentado en el capítulo 1, son los predecesores

de los productos finales, que son los ácidos oxálico y fórmico.

En la tabla 3.3 se muestra un resumen de las concentraciones máximas de los

productos de ozonación identificados que se acumularon a lo largo del proceso.

Tabla 3.3 Concentración máxima de los compuestos identificados en la ozonación del 2,4-Diclorofenol

Intermediario Concentración (mg/L) según el pH

de ozonación 7 12

Catecol 0.5 ND

Hidroquinona 3.0 3.0

Fenol Trazas Trazas

4-clorofenol Trazas Trazas

Ácido Fumárico Trazas Trazas

Ácido Maléico Trazas Trazas

Ácido Oxálico 38.0 128.0

Ácido Fórmico 53.0 54.0 */ND=No se detectó

Comparación de la ozonación de ambos clorofenoles

Tal como se puede apreciar en la tabla 3.1, el 2,4-Diclorofenol es más reactivo

con ozono, lo cual se ve reflejado en su constante de reacción que es mayor

que la del 4-Clorofenol, es por ello que el tiempo de descomposición del 2,4-

Diclorofenol es menor. Así mismo, en ambos casos las constantes de reacción

son mayores bajo pH 12 que bajo pH 7, lo cual se ve reflejado en una inminente

disminución de los tiempos de descomposición en cada caso.

60

En la tabla 3.4 se muestra un resumen de los compuestos no identificados que

se observaron en la ozonación de ambos clorofenoles, 4-Clorofenol (4-CF) y

2,4-Diclorofenol (2,4-DCF), bajo las condiciones estudiadas (pH 7 y 12). Estos

compuesto se clasifican según las condiciones cromatográficas bajo las cuales

fueron identificados (compuestos fenólicos o ácidos orgánicos). En dicha tabla

se presentan todos los compuestos, la “x” indica que el compuesto fue

observado en el caso marcado.

Tabla 3.4 Concentrado de los compuestos formados a lo largo de la ozonación que no fueron identificados.

Compuesto/ Tiempo de Retención

(min)

Tipo de compuestos

Condiciones de ozonación

4-CF, pH 7

4-CF, pH 12

2,4-DCF, pH 7

2,4-DCF, pH 12

AF / 2.0

Fenólicos

x x x x BF / 2.3 x x x x CF / 2.5 x x DF / 2.8 x x EF / 3.0 x x FF / 3.6 x GF / 7.3 x x HF / 1.7 x x IF / 4.3 x

KF / 15.8 x AA /1.7

Ácidos Orgánicos

x x BA / 2.7 x x x x CA / 3.1 x x x x DA / 3.3 x x x x EA / 3.6 x x x FA / 4.7 x x JA / 8.2 x x KA / 8.4 x LA / 10.3 x MA / 14.6 x x HA / 5.5 x IA / 7.1 x

61

Tal como se puede apreciar en la tabla 3.4, hay compuestos que se forman en

los cuatro casos de ozonación estudiados: AF, BF, BA, CA, DA. Así mismo, es

muy claro que bajo condiciones alcalinas se forman menos compuestos. Como

se mencionó previamente, las tendencias de éstos compuestos a lo largo de la

ozonación es similar; se comienzan a formar en los primeros minutos de la

ozonación y se acumulan hasta llegar a un máximo. A partir de ese punto su

abundancia en el medio comienza a disminuir hasta ser descompuestos

completamente o bien perdurar en una concentración constante (menor a la

máxima).

En la tabla 3.4 se muestran los tiempos de ozonación (bajo las diferentes

condiciones de operación estudiadas), en los cuales se acumulan las

concentraciones máximas de los compuestos no identificados, así como los

tiempos correspondientes a la descomposición máxima de éstos que se logra

en la ozonación.

Tabla 3.5 Tiempos de ozonación donde se presentan las concentraciones máximas y mínimas de los compuestos no identificados

Los tiempos especificados en la tabla 3.3 son de gran importancia para la

selección de las condiciones de ozonación, bajo las cuales se llevará a cabo

tratamiento combinado propuesto en este trabajo. A pesar de que no todos los

productos de ozonación fueron identificados se puede inferir el efecto de su

presencia en el efluente de ozonación a lo largo del tratamiento combinado, y

Compuesto pH

Tiempos de ozonación observados (min) Descomposición Acumulación máxima

Clorofenol inicial

(>99%)

Compuestos no identificados

Compuestos no identificados

Ácidos orgánicos Fenólicos Ácidos

orgánicos Fenólicos

4-CF 7 15 30 30 10 10 12 8 30 30 5 5

2,4-DCF 7 8 30 30 8 5 12 5 20 15 5 5

62

así encontrar las condiciones que favorezcan mayoritariamente el tratamiento

biológico. Así mismo, se sabe por bibliografía que los clorofenoles son

altamente tóxicos y potencialmente inhibitorios de los procesos biológicos, por

lo que es necesario conocer el tiempo necesario para su descomposición total

(>99%) para considerarlo al momento del tratamiento combinado posterior.

3.2 Biodegradación de clorofenoles sin pre-tratamiento químico

Así como se realizó la ozonación de ambos clorofenoles, se llevó a cabo

individualmente la biodegradación de cada uno de los compuestos de estudio. A

continuación se presentan los resultados concernientes a la oxidación biológica

de los clorofenoles.

3.2.1 Aclimatación de microorganismos a fuentes de carbono no ozonadas

Tal como se explicó en el capítulo 2, al principio del trabajo se contaba sólo con

un consorcio aclimatado a fenol (CAF) y a partir de éste se prepararon otros

consorcios capaces de degradar tanto a los compuestos iniciales como a los

principales productos resultantes de la ozonación.

En la sección anterior se verificó que los principales intermediarios formados en

la ozonación de los clorofenoles estaban divididos en dos grupos: compuestos

fenólicos, dentro de los cuales se encuentran principalmente fenol, catecol e

hidroquinona, así como ácidos orgánicos tales como el fórmico y el oxálico que

para todas las condiciones de ozonación estudiadas constituyó el producto final

que se acumuló a lo largo de toda la reacción.

Se hicieron pruebas de biodegradación con el CAF para verificar los

compuestos que era capaces de degradar (tanto los clorofenoles iniciales como

63

los principales intermediarios identificados en la ozonación). Se encontró que

éste era capaz de degradar fenol, catecol e hidroquinona, sin embargo no se

observó degradación para ninguno de los clorofenoles ni para los ácidos oxálico

y fórmico, por lo que, a partir del CAF se prepararon otros tres consorcios, a los

cuáles se les aclimató a estos compuestos. La metodología se explica en el

capítulo 2. La tabla 3.1 muestra los consorcios adaptados a las diferentes

fuentes de carbono sin ozonar.

Tabla 3.6 Compuestos capaces de degradar por los consorcios adaptados a fuentes de carbono sin ozonar

Fuente de carbono

adaptada Abreviatura Compuestos capaces de degradar

Fenol CAF Fenol

Catecol Hidroquinona

Mezcla de ácidos oxálico y fórmico CAA Ácido Oxálico

Ácido Fórmico

4-Clorofenol CA4CF 4-Clorofenol

2,4-Diclorofenol CA24DCF 2,4-Diclorofenol

En función de lo anterior, estos compuestos fueron sometidos al proceso de

biodegradación en cultivos en lote con el consorcio correspondiente, acorde a la

tabla 3.6, para estudiar su comportamiento en el proceso de biodegradación.

Las pruebas de biodegradación se realizaron después de verificar que cada

consorcio era capaz de degradar los sustratos a los que se estaba aclimatando

3.2.1 Biodegradación del 4-Clorofenol Se realizaron cultivos en lote usando el consorcio adaptado al 4-clorofenol

(CA4CF) en medio mineral. A lo largo del proceso se realizó la medición de la

concentración del 4-clorofenol para verificar la evolución del proceso. La figura

64

3.18 muestra la descomposición del sustrato en cuestión por efecto del

tratamiento biológico.

Figura 3.18 Perfil de biodegradación del 4-clorofenol (120 ppm).

De acuerdo a la figura 3.1 se puede observar el efecto de la toxicidad del 4-

Clorofenol. A pesar de que el consorcio utilizado se aclimató previamente a este

compuesto a una concentración de 40 mg/L, cuando el mismo se pone en un

medio con una concentración de 120 mg/L, el proceso se inhibe debido a la

toxicidad provocada por la alta concentración del sustrato y no se observa una

degradación significativa.

3.2.2 Biodegradación del 2,4-Diclorofenol

Al igual que en el caso anterior, se realizaron cultivos en lote donde se

proporcionó el 2,4-Diclorofenol como única fuente de carbón y energía de los

microorganismos constituyentes del consorcio previamente adaptado a éste

(CA24DCF). De igual manera, a lo largo del tiempo se realizaron mediciones de

la concentración del contaminante en cuestión para monitorear el proceso; en la

figura 3.19 se puede apreciar el consumo de sustrato por los microorganismos.

65

Figura 3.19 Perfil de biodegradación del 2,4-Diclorofenol (120 ppm).

En este caso se puede observar que la toxicidad del 2,4-Diclorofenol es menor

con respecto a la del 4-Clorofenol, ya que el primero puede ser utilizado por los

microorganismos y después de 10 días se observa una descomposición del

60%, mientras que el caso anterior se observó la inhibición del proceso. A pesar

de que ambos consorcios fueron aclimatados bajo las mismas condiciones y a

las mismas concentraciones del clorofenol correspondiente (40 mg/L).

Lo anterior coincide con estudios que han encontrado un efecto inhibitorio

provocado por el 4-Clorofenol a concentraciones menores al 2,4-Diclorofenol,(50)

lo cual está relacionado con los metabolitos formados en el proceso de

biodegradación; los cuales pueden ser más tóxicos que los compuestos

originales, tales como los clorocatecoles que, dependiendo de la posición del

cloro con respecto a los grupos OH, pueden ser letales para los

microorganismos y por consiguiente, provocar inhibición del proceso (43,44).

Estos resultados muestran que para los clorofenoles el proceso de

biodegradación por sí solo resulta insuficiente, ya que después de 10 días de

tratamiento biológico no es posible eliminar más del 60% de este tipo de

sustratos, a pesar de incluir la etapa de aclimatación a cada sustrato antes del

biotratamiento, que por bibliografía se sabe que es un factor de suma

66

importancia para reducir los tiempos de degradación y evitar la inhibición de la

misma (46).

Los resultados expuestos hasta el momento ponen en evidencia los

inconvenientes de aplicar solamente tratamientos biológicos para la eliminación

de este tipo de compuestos, que implica grandes tiempos de tratamiento

traducidos a grandes volúmenes de reactores, así como los respectivos

inconvenientes derivados de éstos. Por otro lado, la aplicación de un proceso

químico como etapa previa del biológico en el caso específico estudiado

(tratamiento de clorofenoles en fase acuosa) representa ventajas tales como

descomposición rápida de los contaminantes, así como la formación de

productos menos tóxicos. En función de lo anterior (recordando que en el

presente trabajo se pretende acoplar el proceso de ozonación como etapa

previa al de biodegradación), es necesario verificar si es factible la

biodegradación de los intermediarios formados en el proceso de ozonación.

3.2.3 Biodegradación de los principales intermediarios del proceso de ozonación de clorofenoles

Se realizaron cultivos en lote de los principales intermediarios identificados en la

ozonación de los clorofenoles para comprobar que fuera factible eliminarlos por

biodegradación. Como se explicó en la tabla 3.6, para los compuestos fenólicos

el CAF fue capaz de utilizar fenol, catecol como la hidroquinona (ambos a una

concentración inicial de 120 mg/l) como fuentes de carbono y energía, por ser

estos últimos de estructura muy similar al fenol y carecer de cloros que pudieran

dar lugar a metabolitos tóxicos que inhibieran el proceso.

Para los ácidos orgánicos se utilizó el consorcio adaptado a éstos (CAA). Se

realizaron los cultivos en lote donde los ácidos oxálico y fórmico (ambos a una

67

concentración inicial de 100 mg/l) constituyeron la única fuente de carbón y

energía.

Las figuras 3.20 y 3.21 muestran la variación de la concentración normalizada

de cada compuesto con respecto al tiempo, por efecto de la biodegradación.

Figura 3.20 Perfil de biodegradación de compuestos fenólicos formados en la ozonación.

Como se puede observar, tanto el fenol, catecol e hidroquinona pueden ser

consumidos por el CAF, los tiempos requeridos para este fin son 14 h, 19 h y 6

días, respectivamente. Es evidente que el tiempo para degradar los compuestos

dihidroxilados es mayor al requerido para la degradación del fenol ya que el

consorcio originalmente estaba adaptado al fenol. Adicionalmente, el fenol es

degradado por los microorganismos por la ruta del catecol, donde éste es el

primer intermediario formado para la asimilación del fenol(30), por lo que no es

de extrañarse que sea tan similar el comportamiento de ambos sustratos con el

mismo consorcio.

68

Por otro lado, aunque la hidroquinona requiere tiempos relativamente largos

para su descomposición, cabe resaltar que durante la ozonación se acumulan

cantidades menores a 10 mg/L (tablas 3.2 y 3.3). Con estos resultados,

solamente se comprobó que los intermediarios fenólicos pudieran ser utilizados

por el CAF como fuente de carbono y energía.

Figura 3.21 Perfil de biodegradación de ácidos orgánicos formados en la ozonación.

De acuerdo a la figura 3.21 se puede apreciar que los ácidos oxálico y fórmico

son compuestos de fácil eliminación por bioproceso después del periodo de

aclimatación del consorcio, en alrededor de dos días de tratamiento.

Con la presencia de dos sustratos en el medio, claramente se puede observar

la competencia que existe entre ambos. Al principio del proceso, el ácido

oxálico es asimilado más rápido que el ácido fórmico, al ser el sustrato preferido

por los microorganismos, conforme la disponibilidad en el medio de este

sustrato disminuye, se observa el consumo del segundo sustrato (ácido

fórmico), el cual una vez que el ácido oxálico ha sido eliminado en su totalidad

69

(después de 29 horas) es consumido de manera acelerada, observándose el

mayor consumo de ácido fórmico a partir de este punto (entre 29 y 32 horas).

Conclusiones previas de la biodegradación de los clorofenoles sin ozonar

y los principales intermediarios identificados en la ozonación

En base a los resultados presentados se puede concluir que la biodegradación

de los clorofenoles mostró no ser efectiva porque se presenta la inhibición del

proceso (en el caso del 4-Clorofenol) así como una eliminación muy lenta (10

días para eliminar 60% del 2,4-Diclorofenol), a pesar de que se contaba con

consorcios específicamente aclimatados a cada compuesto.

Por otro lado, cuenta con consorcios que son capaces de metabolizar a los

principales compuestos que se encuentran presentes después de la ozonación

de los clorofenoles en cuestión: 2,4-Diclorofenol, 4-Clorofenol, fenol, catecol,

hidroquinona, ácido oxálico y ácido fórmico (tabla 3.6).

Contrario a lo observado con los clorofenoles, los productos de la ozonación

mostraron un buen desempeño en el tratamiento biológico, desde los

compuestos fenólicos que se acumulan en cantidades relativamente bajas

hasta los ácidos orgánicos, que son los que tienden a acumularse hasta el final

del proceso, como es el caso del ácido oxálico (tablas 3.2 y 3.3).

De acuerdo a los resultados obtenidos hasta esta etapa del trabajo existe un

gran interés en utilizar la ozonación como etapa previa al proceso de

biodegradación y descomponer (parcial ó totalmente) a los contaminantes en

cuestión y dar lugar a productos que sea posible eliminar en el bioproceso.

70

3.3 Selección de las condiciones de ozonación para el tratamiento acoplado (químico-biológico)

Tomando en cuenta la información presentada en las secciones anteriores se

hizo un análisis de los resultados obtenidos en ambos procesos (ozonación y

biodegradación) llevados a cabo de manera individual, con el objetivo de

disminuir en el tratamiento combinado las desventajas de ambos. Se eligieron

diferentes condiciones para estudiar la combinación de tratamientos y evaluar la

influencia de factores como la abundancia de los diferentes compuestos

involucrados de la ozonación al momento de acoplar el bioproceso

correspondiente.

3.3.1 Selección de los tiempos para suspender la ozonación previo a la biodegradación

Como se explicó previamente, los clorofenoles son altamente tóxicos, por lo que

su degradación por métodos puramente biológicos no es una tarea sencilla, lo

cual se traduce en largos tiempos de tratamiento y bajas eficiencias. En este

trabajo después de 10 días de biotratamiento no se observó degradación del 4-

Clorofenol, debido a su alta toxicidad, mientras para el 2,4-Diclorofenol se logró

eliminar en un 60% a lo largo de ese tiempo (figuras 3.18 y 3.19).

Por bibliografía se verificó que la aclimatación previa de los microorganismos a

la fuente de carbono es una etapa clave para reducir los problemas de

inhibición que generalmente se presentan en la biodegradación de compuestos

recalcitrantes.

Por otro lado, la eliminación de ambos clorofenoles por medio de la ozonación

se puede hacer en cuestión de minutos (tabla 3.5), dependiendo del pH, bajo el

cual se lleve a cabo la reacción, ya que éste factor ejerce una fuerte influencia

en la constante de reacción de estos compuestos con el ozono (tabla 3.1).

71

A pesar de que con la ozonación es posible eliminar estos compuestos en

cuestión de minutos, se pudo observar que a lo largo del proceso se forman

diferentes productos, cuyas tendencias y abundancias dependen del pH de la

reacción. Algunos de éstos se identificaron y cuantificaron, mientras que los que

no fue posible identificar se monitoreó su dinámica a lo largo del proceso

(Anexo C).

Con respecto a los productos de la ozonación que sí se identificaron, se pudo

observar que los compuestos que se acumularon en cantidades más

significativas fueron los ácidos fórmico y oxálico; en todos los casos se observó

una tendencia similar. El ácido fórmico tiende a acumularse desde el inicio del

proceso para después descomponerse en su totalidad, mientras que el ácido

oxálico es el compuesto que mantiene la tendencia de acumulación a lo largo

de toda la reacción. Adicionalmente, se acumularon pequeñas cantidades de

hidroquinona (< 10 mg/L) y trazas (< 1 mg/L) de catecol y ácidos fumárico y

maleico. La distribución de estos compuestos estuvo, por supuesto, en función

de las condiciones de ozonación.

Toda la información recabada de las secciones anteriores se tomó en cuenta

para establecer los criterios de selección de los tiempos de ozonación, en los

cuáles suspender ésta y acoplar el biotratamiento subsecuente. Cabe resaltar,

en función de lo antes expuesto, que dada la toxicidad de los clorofenoles se

buscaron tiempos donde la concentración de éstos fuera pequeña. Así mismo,

se tomaron en cuenta las dinámicas de formación y/o descomposición de los

productos de ozonación en cada uno de los casos previamente presentados.

Para estudiar el efecto en la biodegradación de los compuestos no identificados

durante la ozonación, se escogieron tiempos donde la acumulación de éstos

fuera la máxima.

72

En la tabla 3.7 se presentan los tiempos en los que se suspendió la ozonación

para acoplar el proceso biológico, los cuales constituyeron los casos de estudio

de biodegradación de clorofenoles preozonados.

Tabla 3.7 Tiempos de ozonación previa a la biodegradación

Compuesto pH

ozonación t (min)

4-Clorofenol 7 10, 15, 30

12 5

2,4-Diclorofenol 7 5, 8

12 5

A continuación se presentan los criterios tomados en cuenta para la selección

de los tiempos especificados en la tabla 3.7, de acuerdo a cada caso de

estudio.

3.3.1.1 Criterios tomados en cuenta para suspender la ozonación del 4-clorofenol previo a la biodegradación

Criterios (pH 7):

• 10 min:

• Eliminación del contaminante mayor al 90%.

• Acumulación máxima de los compuestos fenólicos no

identificados.

• Acumulación máxima de los ácidos orgánicos no

identificados

• Acumulación máxima del ácido fórmico

• 15 min:

• Degradación del 4-CF mayor al 99%

• Acumulación máxima de la hidroquinona

73

• 30 min:

• Descomposición del 70% de la hidroquinona formada.

• Descomposición del 80% del ácido fórmico formado.

• Descomposición total ó nivel mínimo de la mayoría de las

especies no identificadas.

Criterios (pH 12):

• 5 min:

• Descomposición del 85% del compuesto inicial.

• Máxima concentración de compuestos no identificados

3.3.1.2 Criterios tomados en cuenta para suspender la ozonación del 2,4-diclorofenol previo a la biodegradación:

Criterios (pH 7):

• 5 min:

• Degradación del 84% del 2,4-DCF.

• Máxima acumulación de compuestos fenólicos no

identificados

• 8 min:

• Degradación del 2,4-DCF mayor al 99%

• Acumulación máxima de la hidroquinona

• Máxima acumulación de ácidos orgánicos no identificados

Criterios (pH 12):

• 5 min:

• Degradación del 2,4-DCF mayor al 99%

• Máxima acumulación del ácido fórmico

• Máxima concentración de compuestos no identificados

Las tablas 3.8 - 3.10 muestran la descripción del efluente de la ozonación (que

corresponde al influente de biodegradación) en cada uno de los casos de

estudio para los tratamientos combinados (tabla 3.7). Por un lado se muestran

las concentraciones (sólo aquellas que son ≥ 1 mg/L) de los compuestos

identificados (tabla 3.7). Por otro lado, se muestran las concentraciones

74

relativas (normalizadas con respecto al máximo) de los compuestos fenólicos y

ácidos orgánicos que se observaron y no fue posible identificar, (tablas 3.8 y

3.9, respectivamente).

Tabla 3.8. Concentración de los productos de ozonación identificados antes del proceso de biodegradación

Compuesto/ Tiempo de

Retención (min)

Concentración de los compuestos después de ozonar (mg/L)

Tiempo de ozonación (min)

4-CF 2,4-DCF

pH7 pH 12 pH 7 pH 12

10 15 30 5 5 8 5 4-Clorofenol 8.8 - - 18.4 - - -

2,4-Diclorofenol - - - - 17.8 - - Hidroquinona 6.4 7.9 2.6 - 2.2 2.8 2.3 Ácido Oxálico 9.7 15.1 26.8 30.0 6.3 9.4 47.6 Ácido Fórmico 153.8 137.1 42.6 39.0 36.3 50.5 54.0 Ácido Maleico - - - - 1.5 1.5 1.0

Tabla 3.9. Concentración relativa (normalizada) de los compuestos fenólicos no identificados, presentes en los clorofenoles ozonados

Compuesto/ Tiempo de Retención

(min)

Concentración relativa de los compuestos después de ozonar

Tiempo de ozonación (min)

4-CF 2,4-DCF

pH7 pH 12 pH 7 pH 12

10 15 30 5 5 8 5 AF / 2.0 1.00 0.64 0.31 1.00 0.90 1.00 1.00 BF / 2.3 0.81 0.52 0.32 1.00 1.00 0.81 1.00 CF / 2.5 0.99 - - - 0.68 0.88 - DF / 2.8 0.87 1.00 0.34 - 0.60 0.95 - EF / 3.0 1.00 0.90 0.25 - 0.72 0.94 - FF / 3.6 1.00 0.84 - - - - - GF / 7.3 0.13 - - - 0.61 0.18 - HF / 1.7 - - - 0.83 - - 1.00 IF / 4.3 - - - 1.00 0.73 -

KF / 15.8 - - - - 1.00 0.22 -

75

Tabla 3.10. Concentración relativa (normalizada) de los ácidos orgánicos no identificados, presentes en los clorofenoles ozonados

Compuesto/ Tiempo de Retención

(min)

Concentración relativa de los compuestos después de ozonar

Tiempo de ozonación (min)

4-CF 2,4-DCF

pH7 pH 12 pH 7 pH 12

10 15 30 5 5 8 5 AA /1.7 0.72 1.00 - - 1.00 0.00 - BA / 2.7 0.86 0.55 0.09 1.00 0.85 1.00 1.00 CA / 3.1 1.00 0.94 0.64 0.81 0.77 1.00 1.00 DA / 3.3 1.00 0.96 0.64 0.71 0.71 0.90 0.64 EA / 3.6 1.00 0.85 0.30 - 0.60 0.85 0.91 FA / 4.7 0.90 0.38 - 1.00 - - - JA / 8.2 0.70 - - - 0.90 1.00 - KA / 8.4 1.00 0.79 0.23 - - - - LA / 10.3 0.34 0.09 - - - - - MA / 14.6 - 0.40 - - 0.86 1.00 - HA / 5.5 - - - 1.00 - - - IA / 7.1 - - - 1.00 - - -

Las tablas 3.8 – 3.10 muestran las condiciones iniciales del bioproceso descrito

a continuación. En el proceso conjunto (ozonación-biodegradación) se desea

conocer el efecto de la presencia y abundancia de los diferentes compuestos

formados en el pretratamiento químico durante el bioproceso posterior, ya que

estos factores pueden controlarse de acuerdo a las condiciones de operación

del tratamiento químico. Los factores a estudiar fueron los siguientes:

1. Presencia de los contaminantes después de la ozonación. Se eligieron

condiciones de ozonación previa donde hubiera:

• Descomposición parcial del contaminante: 4CF (pH 7) 10 min, 4CF

(pH 12) 5 min, 2,4-DCF (pH 7) 5 min

• Descomposición total (mayor al 99%) del mismo: 4CF (pH 7) 15 min,

2,4-DCF (pH 7) 8 min, 2,4-DCF (pH 12) 5 min.

76

2. Abundancia máxima o mínima de los intermediarios no identificados.

• Se seleccionaron condiciones de ozonación donde la abundancia de

las especies no identificadas fuera máxima: 4CF (pH 7) 10 min, 4CF

(pH 12) 5, 2,4-DCF (pH 7) 5 min, 2,4-DCF (pH 7) 8 min, 2,4-DCF (pH

12) 5 min.

• Adicionalmente se estudió un caso donde además de descomponer

completamente al contaminante de interés, la ozonación se prolongó

para descomponer también a los intermediarios acumulados en el

proceso y llevarlos a un nivel mínimo de abundancia: 4CF (pH 7) 30

min.

3.3.2 Aclimatación de los microorganismos a clorofenoles ozonados

Una vez hecha la elección de los tiempos del pretratamiento químico, se

prosiguió a adaptar un consorcio para cada uno de las condiciones de

ozonación seleccionadas para el tratamiento combinado (tabla 3.7). Como se

puede observar en las tablas 3.8 – 3.10, en cada uno de los casos de estudio,

los compuestos presentes, así como su proporción es diferente, por lo que los

sustratos en cada proceso de biodegradación fueron diferentes, siendo

necesario contar con grupos de microorganismos aclimatados a las diferentes

fuentes de carbono específicas a degradar.

3.3.2.1 Preparación del inóculo. De acuerdo a los intermediarios identificados en la ozonación de los

clorofenoles (sección 3.1), antes de preparar los consorcios a utilizar en el

tratamiento combinado, se verificó que se dispusiera de consorcios microbianos

con la capacidad de degradar los compuestos que se sabía que estaban

77

presentes después de la ozonación de los mismos: 4-clorofenol, 2,4-

diclorofenol, fenol, catecol, hidroquinona, ácidos oxálico y fórmico. Los

consorcios en cuestión son: CAF, CAA, CA4CF, CA24DCF. Los primeros dos

son capaces de degradar compuestos fenólicos y ácidos orgánicos,

respectivamente, y los dos últimos a los contaminantes iniciales: 4-clorofenol y

2,4-diclorofenol, respectivamente, tal como se detalló en la tabla 3.6.

Para adaptar grupos de microorganismos a las fuentes de carbono ozonadas,

se prepararon cultivos mixtos a partir de los cuatro consorcios adaptados a las

fuentes de carbono no ozonadas, de tal forma que en cada consorcio se

contara con diversidad microbiana con la capacidad de metabolizar los

diferentes tipos de compuestos (aromáticos y alifáticos) que se encuentran

presentes después de la ozonación.

Se verificaron los compuestos que estaban presentes después de la ozonación

y se mezclaron proporciones iguales de los consorcios adaptados a fuentes de

carbono no ozonadas que tuvieran las capacidades de metabolizar a estos

compuestos. Para los casos del 4-clorofenol se mezclaron CAF, CAA, CA4CF y

para los del 2,4-diclorofenol se mezclaron CAF, CAA, CA4CF y CA24DCF,

como se muestra en tabla 3.11.

Durante el proceso de aclimatación, sólo se proporcionó el efluente de

ozonación en cuestión para inducir estrés en los microorganismos al tener

disponibles en el medio nuevos sustratos y que se generaran las enzimas

necesarias para la introducción de los mismos en su metabolismo, con la

intención de que las especies microbianas capaces de realizar sus funciones

metabólicas en el nuevo medio, proliferaran. En la tabla 3.12 se muestran los

consorcios que se aclimataron a las fuentes de carbono ozonadas.

78

Tabla 3.11. Fuentes de inóculo para la adaptación de los consorcios a los clorofenoles ozonados

Tabla 3.12. Consorcios adaptados a fuentes de carbono ozonadas

Fuente de carbono adaptada

Abreviatura Compuesto pH Ozonación

Tiempo de ozonación

(min)

4-Clorofenol 7

10 CA4_7_10

15 CA4_7_15

30 CA4_7_30

12 5 CA4_12_5

2,4-Diclorofenol 7

5 CA2_7_05

8 CA2_7_08

12 5 CA2_12_5

Como se describió en el capítulo 2, la aclimatación a las fuentes de carbono

ozonadas se hizo por el método fill-and-draw,(x) donde para cada consorcio se

prepararon soluciones con un contenido entre el 10% y el 100% del efluente de

ozonación (fuente de carbono) en cuestión. El suministro de sustrato se hizo en

orden creciente de concentración, haciendo el aumento de ésta en periodos de

tiempo comprendidos entre 1 y 3 días. Así, gradualmente (en intervalos de 10%

de sustrato inicial) fue aumentando la concentración en el medio de los

Compuesto preozonado

Consorcios mezclados para preparar el inóculo

4-CF CAF CAA

CA4CF

2,4-DCF

CAF CAA

CA4CF CA24DCF

79

compuestos a los cuáles se deseaba aclimatar a los microorganismos. A lo

largo de este proceso se verificó el crecimiento microbiano reflejado en la

densidad óptica (600nm), lo cual se muestra a continuación.

3.3.2.2 Aclimatación de los microorganismos al 4-Clorofenol preozonado.

En las figuras 3.22 - 3.25 se muestra el crecimiento microbiano de los

consorcios alcanzado por la adición del porcentaje de sustrato correspondiente,

durante el proceso de aclimatación al 4-Clorofenol ozonado bajo diferentes

condiciones.

Figura 3.22 Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA4_7_10.

80

Figura 3.23. Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA4_7_15.

Figura 3.24. Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA4_7_30.

81

Figura 3.25. Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA4_12_5.

En las figuras 3.22 – 3.25 se puede observar que bajo las cuatro condiciones de

ozonación, cuando se suministra la fuente de carbono menos concentrada

(10%) no se alcanza un crecimiento significativo, lo cual es comprensible,

tomando en cuenta que los microorganismos se pusieron en contacto con

nuevos sustratos y deben generar las condiciones necesarias para incluirlos en

su metabolismo. Sin embargo, cuando la fuente de carbono contiene el 20% del

efluente, el crecimiento provocado por el sustrato es significativo en todos los

casos, el cual se sostiene conforme se añade más sustrato. Esto es un buen

indicio, ya que los microorganismos de cada nuevo consorcio son capaces de

incluir los productos de ozonación en su metabolismo y generar nuevas células

con la capacidad de sobrevivir en ese ambiente.

3.3.2.3 Aclimatación de los microorganismos al 2,4-Diclorofenol pre-ozonado.

De manera similar a los casos anteriores, en las figuras 3.26 - 3.28 se muestra

el crecimiento microbiano de los consorcios alcanzado por la adición del

82

porcentaje de sustrato correspondiente, durante el proceso de aclimatación al

2,4-Diclorofenol ozonado bajo diferentes condiciones.

Figura 3.26. Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA2_7_05.

Figura 3.27 Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA2_7_08.

83

Figura 3.28. Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA2_12_5.

Los resultados observados en las figuras 3.26 – 3.28 mantienen una tendencia

similar a la observada en los casos referentes al 4-Clorofenol. La primera

adición de sustrato no produce un efecto significativo en el crecimiento de los

consorcios, ya que los consorcios se ponen en contacto con nuevas fuentes de

carbono, sin embargo, conforme se añade sustrato más concentrado, se

incrementa el crecimiento de los microorganismos. Para el caso de las

aclimataciones a los productos de ozonación bajo pH 7, se puede observar un

mayor crecimiento con los primeros porcentajes de sustrato que para el caso de

pH 12. Sin embargo, en los 3 casos se puede observar que los porcentajes más

altos de sustrato propician un crecimiento significativo de los microorganismos,

lo cual, de manera similar al 4-Clorofenol, indica que los microorganismos son

capaces de sobrevivir y generar nuevas células en el medio deseado.

En los 7 casos estudiados (4-Clorofenol y 2,4-Diclorofenol preozonados), se

pudo observar una tendencia de crecimiento microbiano en el proceso de

aclimatación a los compuestos deseados, sobre todo en los últimos días,

84

cuando los consorcios han estado en contacto por más tiempo con los nuevos

sustratos y por ende se observa que conforme aumentan paralelamente el

porcentaje de sustrato proporcionado y los días de adaptación, el crecimiento

hace lo propio de manera considerable. Este aumento en el crecimiento es

reflejo de que los microorganismos se han ido adaptando a la fuente de carbono

proporcionada en cada caso.

Cabe resaltar que después de este periodo de aclimatación, siguió un periodo

de 6 meses de mantenimiento de los consorcios donde sólo se proporcionaron

como sustratos las fuentes de carbono a las que éstos estaban aclimatados.

Para evitar el desgaste y eventual desactivación de las cepas, cada dos

semanas se hizo el resembrado de cada uno de los consorcios, para

asegurarse de que los microorganismos mantuvieran las capacidades

metabólicas desarrolladas. Después de esta etapa, al contar con consorcios

aclimatados a las fuentes de carbono específicas a tratar (productos de

ozonación), los consorcios se utilizaron en los procesos de biodegradación

descritos a continuación.

3.4 Biodegradación de los clorofenoles pre-ozonados. Una vez concluida la etapa de aclimatación de los consorcios, se procedió a

realizar los respectivos procesos de biodegradación para cada caso elegido,

usando el consorcio correspondiente en cada prueba (Tabla 3.12).

Se monitorearon las dinámicas de los compuestos formados en la ozonación

(Tablas 3.8 -3.10) durante cada bioproceso correspondiente. Cabe resaltar que

la señal analítica (arrojada por el HPLC) de algunos compuestos después de la

ozonación era pequeña, por lo que, debido a interferencias analíticas, no fue

posible darles seguimiento durante el bioproceso.

85

En las siguientes secciones se presentan las dinámicas (construidas a partir de

las alturas leídas en los cromatogramas, normalizadas con respecto a la señal

máxima) de los compuestos (identificados y no identificados) observados

durante el bioproceso seguido de la ozonación. Por otro lado, se presenta el

perfil de crecimiento microbiano para cada consorcio expresado como el

aumento normalizado de la densidad óptica (leída a 600nm).

Como una medida global de la descomposición de los productos de ozonación

a lo largo de los biotratamientos se cuantificó el área total de los

cromatogramas obtenidos en el HPLC (para las dos condiciones de análisis:

compuestos fenólicos y ácidos orgánicos) a lo largo de todo el proceso. Se

muestra la variación normalizada del área total obtenida en los cromatogramas

con respecto al tiempo de biodegradación. Por otro lado, de manera cualitativa

se muestra la variación en los espectros UV de las pruebas en cuestión,

después de ozonar y después del tratamiento combinado.

3.4.1 Biodegradación del 4-clorofenol previamente ozonado bajo pH 7. Descomposición parcial del contaminante – 10 min de ozonación.

De acuerdo a la tabla 3.8, para el 4-clorofenol ozonado 10 minutos bajo pH 7, la

descomposición del contaminante es parcial, después de la ozonación aun se

deben eliminar 8.8 mg/L de este compuesto durante el bioproceso. En las

figuras 3.29 y 3.30 se muestran las dinámicas a lo largo de la biodegradación

de los compuestos fenólicos, así como las de los respectivos ácidos orgánicos

formados en la ozonación bajo las condiciones previamente descritas.

86

Figura 3.29 Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la

ozonación del 4-CF (pH 7, 10 min).

Figura 3.30. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación

del 4-CF (pH 7, 10 min).

A partir de la figura 3.29 se puede observar que el 4-clorofenol residual de la

ozonación es asimilado por los microorganismos durante el primer día del

bioproceso. Situación que se ve acompañada por la producción de un

metabolito que se asimila en el día 2 (MFA), el cual tiene un tiempo de retención

cercano al 4-clorofenol, por lo que puede asumirse que su estructura es similar

87

a la del 4-clorofenol. Por otro lado, los intermediarios fenólicos acumulados

durante la ozonación tienen una tendencia a descomponerse a lo largo del

bioproceso. Se puede observar que a pesar de que todos los intermediaros

comienzan a ser asimilados desde el primer día, existe una preferencia por el

consumo de algunos compuestos como: hidroquinona, DF, EF, los cuales son

consumidos mayoritariamente durante los primeros dos días. Cuando la

abundancia de éstos en el medio disminuye considerablemente, o bien es

consumido por completo (como la hidroquinona), el consumo del compuesto GF

se acelera hasta el día 4, entre el día 4 y 5 no se presenta mayor actividad, sin

embargo, entre el día 5 y 7 se consumen completamente los compuestos DF,

EF y FF. Cabe resaltar que el consumo del compuesto FF comienza el día 5

que es el día en el que se deja de consumir el compuesto AF.

Con respecto a los ácidos orgánicos, debe resaltarse el comportamiento de los

ácidos oxálico y fórmico, recordando las condiciones iniciales (tabla 3.8), la

concentración del ácido fórmico es mucho mayor que la del oxálico y durante el

bioproceso se observa una preferencia de los microorganismos por consumir el

ácido fórmico con respecto al oxálico. Adicionalmente, estos ácidos son

excretados como metabolitos de la degradación de otros compuestos presentes

en el medio en los días finales del biotratamiento, o bien, podría ser como

producto de la lisis celular de algunas células.

Por otro lado, observando el comportamiento de los otros sustratos (ácidos

orgánicos), también se aprecian consumos en serie de las diferentes fuentes de

carbono presentes en el medio. En los primeros días se consumen los

compuestos que son preferidos por los microorganismos y conforme la

concentración de éstos disminuye, se acelera el consumo de los otros

compuestos presentes en el medio.

El efecto presentado de los consumos en serie de los diferentes sustratos es

atribuido a la aclimatación previa de los consorcios a todos los sustratos

disponibles. Ya que previamente se indujeron las condiciones de estrés

88

necesarias para hacer proliferar especies microbianas capaces de realizar sus

funciones metabólicas en el medio proporcionado. En el medio están presentes

microorganismos con la capacidad de degradar a todos los compuestos

existentes medio, por supuesto, que entre ellos hay algunos que son preferidos

por su riqueza energética y facilidad de degradación, pero cuando esas fuentes

de carbono llegan a concentraciones bajas, los microorganismos son capaces

de metabolizar a los otros compuestos.

Lo anterior se confirma con la figura 3.31, donde se presenta de manera

normalizada el incremento en la densidad óptica del medio que representa el

crecimiento microbiano. Así como el consumo se sustratos se hace en manera

escalonada, el crecimiento de los microorganismos hace lo propio. Se observan

diferentes etapas; entre el día 0 y 4, que es cuando se consumen

mayoritariamente los ácidos orgánicos y es la primera sección de consumo

importante de los compuestos fenólicos. Por otro lado, entre el día 4 y 5, casi no

hay consumo de compuestos fenólicos, pero sí de ácidos orgánicos que son los

que dan lugar a esta segunda etapa del crecimiento, lo cual continúa entre los

días 5 y 7, donde se consumen ambos tipos de compuestos.

Figura 3.31. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la

biodegradación del 4-CF pre-ozonado (pH 7, 10 min).

89

Como medida global de la eficiencia del bioproceso, se presenta en la figura

3.31 la disminución normalizada de las áreas totales observadas en los

cromatogramas de los compuestos fenólicos y ácidos orgánicos,

respectivamente. Se puede observar que, aunque ambas tendencias son

similares al principio, después del día 2 se presenta una marcada preferencia

hacia el consumo de los ácidos orgánicos (90% de eliminación) sobre los

compuestos fenólicos (70% de eliminación). Finalmente, se presenta de manera

cualitativa el efecto global de la biodegradación en la eliminación de los

compuestos formados durante la ozonación bajo las condiciones previamente

especificadas (figura 3.32).

Figura 3.32. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 4-

CF ozonado 10 min (pH 7). En la figura 3.32 se muestran los espectros UV del 4-clorofenol después de

ozonar (0hb) (10 min, pH 7), así como el espectro obtenido después de 5 días

de bioproceso (5db). Cualitativamente se puede observar una disminución

significativa en la absorbancia, sobre todo en las regiones bajas de éste (200 –

220nm) que es donde mayoritariamente absorben los ácidos orgánicos.

Adicionalmente, se muestra como referencia el espectro UV del medio de

cultivo (Mmin); a pesar de tener una disminución importante de los diferentes

90

productos de ozonación, aún quedan presentes en el medio algunas especies

que producen mayor absorbancia que el medio de cultivo.

El análisis detallado que se presentó para el tratamiento combinado del 4-

clofofenol ozonado 10 minutos bajo pH 7 se realizó también para los otros

casos de estudio realizados, y se obtuvieron tendencias muy similares en la

biodegradación de los productos de ozonación, por lo que en esta sección se

omitirán las gráficas correspondientes a las dinámicas de la biodegradación de

los compuestos fenólicos, así como las de los respectivos ácidos orgánicos

formados en la ozonación, sin embargo, éstas pueden ser consultadas en el

Anexo D.

Descomposición total de contaminante - 15 minutos de ozonación Bajo estas condiciones de ozonación se obtiene una eliminación mayor al 99%

de este compuesto, por lo que en la biodegradación no se observa la aparición

de metabolitos relacionados con su consumo. En la figura 3.33 se presenta la

biodegradación global de los compuestos fenólicos y ácidos orgánicos

(expresada en función del área normalizada de los cromatogramas), así como

el crecimiento microbiano a lo largo del proceso.

Figura 3.33. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la

biodegradación del 4-CF pre-ozonado (pH 7, 15 min).

91

Con respecto al crecimiento microbiano (Figura 3.33) se puede observar que

similarmente al consumo de sustratos, éste se da por etapas; comienza entre

los días uno y dos por efecto del consumo de los compuestos de fácil

degradación, mantiene una tendencia lenta entre los días dos y cuatro, y de ahí

al día 7 se acelera el crecimiento por efecto los sustratos mencionados con

anterioridad. También se puede observar, que durante los primeros dos días, el

consumo de compuestos fenólicos y ácidos orgánicos tiene una tendencia

similar, sin embargo, a partir del día dos se observa una preferencia por el

consumo de los ácidos orgánicos (81% de eliminación) sobre los compuestos

fenólicos (71% de eliminación).

En la figura 3.34 se muestra de manera cualitativa el efecto de la

biodegradación durante cinco días (5db) en el 4-clorofenol pre-ozonado 15

minutos (pH7) (0hb), el cual, también, es significativo, especialmente en la

región baja del espectro (200 – 220nm), sin embargo la absorbancia después

del bioproceso aun está alejada del espectro UV del medio de cultivo (Mmin),

que es la referencia sin contaminantes.

Figura 3.34 Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 4-

CF ozonado 15 min (pH 7).

92

Descomposición total de contaminante - 30 minutos de ozonación En la figuras 3.35 se muestran las dinámicas de biodegradación globales

(expresadas por el área normalizada de los cromatogramas) de los compuestos

fenólicos y ácidos orgánicos formados en la ozonación del 4-clorofenol bajo pH

7 durante 30 minutos. Cabe resaltar que la dinámica de los ácidos oxálico y

fórmico muestra un comportamiento opuesto al presentado en el primer caso

(10 min, pH 7). Se observa un consumo preferente del ácido oxálico sobre el

fórmico ya que a diferencia del primer caso, en este, las concentraciones del

ambos ácidos al inicio del bioproceso son similares (Anexo D).

Figura 3.35. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la

biodegradación del 4-CF pre-ozonado (pH 7, 30 min).

En la figura 3.45 se pueden observar 3 etapas claramente identificables del

crecimiento microbiano. La primera comprende al día uno, donde casi no hay

crecimiento, la segunda comprendida entre los días uno y cuatro y la tercera

comprendida entre los días cuatro y siete. Estas tres etapas corresponden a los

consumos en serie de los sustratos presentes en el medio.

Observando la disminución de las áreas cromatográficas para cada tipo de

compuesto, se puede ver que el primer día se presenta la mayor disminución

93

para ambos tipos, y sus dinámicas son muy similares. Después de ese día,

como en todos los casos, se observa una preferencia de los ácidos orgánicos

(85% de eliminación) sobre los compuestos fenólicos (78% de eliminación).

Figura 3.36. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 4-

CF ozonado 30 min (pH 7).

En la figura 3.36 se puede observar el espectro después de 5 días de

biodegradación del 4-clorofenol ozonado 30 minutos bajo pH 7 (5db). La

diferencia con respecto al inicio del proceso (0db) es muy marcada, y al

comparar el primero con el espectro del medio de cultivo (Mmin), se puede

apreciar claramente la gran similitud entre ambos, por lo que, bajo estas

condiciones de preozonación, cuando se ha logrado una gran descomposición

de los intermediarios fenólicos no identificados por efecto del ozono, se logra

una apreciable disminución del espectro UV en el tratamiento combinado, lo

cual significa que hay menor cantidad de compuestos que producen

absorbancia.

94

3.4.2 Biodegradación del 4-clorofenol previamente ozonado bajo pH 12. Descomposición parcial del contaminante – 5 min de ozonación.

De acuerdo a la tabla 3.12, este es el único caso estudiado para el 4-clorofenol

ozonado bajo pH 12 y la descomposición del contaminante es del 85%. En el

primer día de biodegradación se asimila el 4-clorofenol residual de la ozonación

y se excreta el metabolito MFA que es asimilado en el día siguiente.

En la figura 3.37 se presenta de manera similar a las secciones anteriores el

consumo de los compuestos fenólicos y ácidos orgánicos durante el bioproceso,

así como el crecimiento microbiano. En dicha figura se puede observar la

dinámica global del proceso, durante el primer día se logra la mayor reducción

en el área cromatográfica, y se acentúa el consumo de ácidos orgánicos

(eliminación del 86%) por encima de los compuestos fenólicos (eliminación del

70%) así mismo, el crecimiento microbiano corresponde con el consumo de

sustratos en el medio.

Figura 3.37. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la

biodegradación del 4-CF pre-ozonado (pH 12, 5 min).

95

Por otro lado, en la figura 3.38 se puede apreciar de manera cualitativa la

disminución en el espectro UV por efecto de 5 días de biodegradación (5db). A

pesar de que no se alcanzan los niveles del reducción de espectro, aún existe

una amplia diferencia entre los espectros del medio de cultivo y el espectro

después de la biodegradación.

Figura 3.38. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 4-

CF ozonado 5 min (pH 12).

Conclusiones previas del tratamiento combinado (ozonación-

biodegradación del 4-clorofenol)

De acuerdo a lo presentado en esta sección, se observan varios aspectos a

destacar, como es el consumo en serie de los diferentes sustratos presentes en

el medio, lo cual es atribuido al efecto de la aclimatación previa de los

microorganismos a todos los compuestos del medio. Se observa una

preferencia por el consumo de algunas especies al principio del bioproceso,

pero cuando la concentración de éstas disminuye considerablemente, los

microorganismos del consorcio son capaces de utilizar los otros sustratos para

continuar la actividad metabólica que finalmente se ve reflejada en el

96

crecimiento microbiano el cual no detiene hasta el final del proceso. Este

crecimiento, al igual que el consumo de sustratos, se presenta por etapas.

Por otro lado, los ácidos oxálico y fórmico presentan un comportamiento

singular. En el primer caso de estudio (10 minutos, pH 7) el ácido fórmico está

en un gran exceso con respecto al oxálico y el consumo del primero es

preferido con respecto al segundo; conforme aumenta la concentración de ácido

oxálico y disminuye la de ácido fórmico (después de la ozonación) este papel se

invierte.

En general se obtienen altas tasas de disminución del área de los

cromatogramas de compuestos fenólicos y ácidos orgánicos, siendo más

abundante el consumo de los últimos por ser especies de más fácil asimilación

para los microorganismos. Se logran obtener entre un 80 y un 90% de

eliminación en las áreas cromatográficas de los ácidos orgánicos, después de

una semana de biotratamiento. Cabe resaltar que en los primeros días es

cuando se lleva a cabo la mayor eliminación de éstas. Así mismo, las especies

que perduran después del bioproceso, en todos los casos son AF, DF, DA y los

ácidos oxálico y fórmico que se excretan como metabolitos de la degradación

de otros sustratos, o bien producto de lisis de algunas células.

3.4.3 Biodegradación del 2,4-diclorofenol previamente ozonado bajo pH 7 Descomposición parcial del contaminante – 5 min de ozonación.

De acuerdo a la tabla 3.8, para el 2,4-diclorofenol pre-ozonado bajo pH 7, se

cuenta con un caso donde la descomposición del contaminante es parcial (5

min) y otro donde la descomposición del mismo es total, es decir, >99% (8 min).

A continuación se describe el primero.

97

En la figura 3.39 se puede observar el crecimiento microbiano acorde al

consumo de sustratos presentado, con respecto a la disminución de los

compuestos fenólicos y los ácidos orgánicos se observa una marcada

preferencia por el consumo de los ácidos orgánicos (74% de eliminación) con

respecto a los compuestos fenólicos (47% de eliminación). Bajo estas

condiciones, se logra la menor remoción de compuestos fenólicos, ya que éstos

se encuentran en su nivel máximo de concentración después de la ozonación.

Figura 3.39. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la

biodegradación del 2,4-DCF pre-ozonado (pH 7, 5 min)

98

Figura 3.40. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 2,4-

DCF ozonado 5 min (pH 7). En la figura 3.40 se muestra la comparación de los espectros UV del 2,4-

diclorofenol después de ozonar (0db) y después de 5 días de bioproceso (5db),

con la respectiva referencia del medio de cultivo (Mmin), en este caso no se

observa una disminución tan significativa del espectro ya que éste aún dista del

espectro del medio de cultivo.

Descomposición total de contaminante - 8 minutos de ozonación.

Cuando el 2,4-diclorofenol es ozonado bajo pH 7 durante 8 minutos, se logra

una remoción mayor al 99% de este compuesto. En la figura 3.41 se presenta el

consumo global de los compuestos fenólicos y los ácidos orgánicos en el

biotratamiento, así como el crecimiento microbiano.

99

Figura 3.41. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la

biodegradación del 2,4-DCF pre-ozonado (pH 7, 8 min).

La primera etapa, comprendida entre los días 1 y 4 corresponde al consumo

preferente de los ácidos los primeros días y la segunda etapa comprendida

entre los días 4 y 7 es propiciada por el metabolismo de los compuestos

fenólicos, así como algunos otros ácidos presentes en el medio. Así mismo, se

presenta la disminución de las áreas cromatográficas inherentes a los

compuestos involucrados. Los ácidos orgánicos son asimilados

preferentemente, haciendo una marcada diferencia desde el inicio del proceso,

en este caso se alcanza un 78% de eliminación de estos compuestos, mientras

que para los fenólicos se alcanza una disminución del 64%. Este caso es mejor

que el anterior, donde sólo se alcanza un 47% de eliminación de estos

compuestos.

En la figura 3.42 se muestra la comparación cualitativa de los espectros UV

antes (0db) y después de 5 días de bioproceso (5db), a pesar de observarse

una significativa reducción del espectro, este último dista bastante del espectro

del medio de cultivo (Mmin).

100

Figura 3.42. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 2,4-

DCF ozonado 8 min (pH 7).

3.4.4 Biodegradación del 2,4-diclorofenol previamente ozonado bajo pH 12. Descomposición total del contaminante – 5 min de ozonación.

De acuerdo a la tabla 3.8, este es el único caso estudiado para el 2,4-

diclorofenol ozonado bajo pH 12 y la descomposición del contaminante es

>99%.

En la figura 3.43 se puede observar l tendencia de las áreas cromatográficas, la

cual tiene un comportamiento parecido al observado en el 4 –clorofenol, al

principio las tendencias de los ácidos orgánicos y los compuestos fenólicos son

muy simlares, pero después del día dos, se hace notoria la preferencia por el

consumo de los ácidos orgánicos (80% de eliminación) sobre los compuestos

fenólicos (69% de eliminación) en el bioproceso. El perfil de crecimiento es

acorde al perfil de los sustratos; en los primeros dos días hay una etapa donde

se consumen mayoritariamente los ácidos; entre dos y tres días se consume el

compuesto EA, mientras que en los últimos dos días se presenta el

metabolismo de los compuestos residuales, que a su vez producen ácido

101

fórmico, el cual en esa etapa es excretado significativamente al medio (Anexo

D).

Finalmente, de manera cualitativa se presentan en la figura 3.62 los espectros

UV del 2,4-diclorofenol ozonado 5 minutos bajo pH 12, antes (0hb) y después

de 5 días de biotratamiento (5db). L disminución del espectro es significativa y

está más cerca del espectro del medio de cultivo (Mmin) que los dos casos

anteriores estudiados del 2,4-diclorofenol.

Figura 3.43. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la

biodegradación del 2,4-DCF pre-ozonado (pH 12, 5 min).

102

Figura 3.44. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 2,4-

DCF ozonado 5 min (pH 12).

Comparación de las diferentes condiciones de ozonación en el proceso

combinado

En todas las condiciones estudiadas se puede apreciar una disminución de la

absorbancia por efecto del bioproceso seguido de la biodegradación, aunque

algunas son más significativas que otras. Por otro lado, en todos los casos se

presentan significativas disminuciones en las áreas cromatográficas tanto de los

compuestos fenólicos, como de los ácidos orgánicos; siendo estos últimos los

consumidos más significativamente.

Por otro lado, los consumos en serie de los diferentes sustratos, así como del

crecimiento microbiano son un indicio del efecto y por ende, la gran importancia

de la etapa de aclimatación para el proceso de biodegradación, lo cual fue una

observación general, independientemente del compuesto o las condiciones de

ozonación (pH y tiempo de reacción).

103

Así mismo, se verificó que los ácidos orgánicos son compuestos de más fácil

degradación, comparados con los compuestos fenólicos, ya que los primeros se

eliminan en mayor proporción que los segundos a lo largo del bioproceso. En

todos los casos se observó que los ácidos oxálico y fórmico fungieron no sólo

como fuente de carbono, sino que en diferentes etapas del bioproceso fueron

producidos como metabolitos de la degradación de otros compuestos sustratos,

o bien, por lisis celular.

En la figura 3.45 se muestra la gráfica comparativa de las áreas

cromatográficas obtenidas al inicio y al final del bioproceso, se muestran en

unidades de área (mV-s). Se puede observar que las áreas al final del

bioproceso son más pequeñas, conforme mayor sea el tiempo de ozonación.

Así mismo, son preferibles los tiempos de ozonación donde se tenga una mayor

descomposición de los intermediarios, especialmente los fenólicos, que son los

que tienden a perdurar a lo largo del proceso. Por otro lado, la descomposición

total del contaminante representa ventajas, ya que se obtiene menor área

cromatográfica al final del bioproceso que cuando no se remueve

completamente el compuesto inicial, por la inminente reducción de

intermediarios que implica descomponer el compuesto totalmente.

Figura 3.45. Áreas cromatográficas obtenidas al final del bioproceso.

104

El mejor resultado (menor área cromatográfica al final del tratamiento

combinado) se obtuvo con el 4-clorofenol ozonado 30 minutos bajo pH 7, ya

que en este tiempo se ha descompuesto el compuesto inicial y la mayoría de

los intermediarios (fenólicos y ácidos orgánicos) han llegado a sus niveles

mínimos de concentración durante la ozonación. Entonces a lo largo del

bioproceso están presentes especies de más fácil degradación (como los

ácidos orgánicos).

Las condiciones de preozonación donde se contaba con la mayor concentración

de compuestos fenólicos no identificados fueron los que arrojaron al final del

tratamiento combinado áreas más grandes: 4_7_10, 4_12_5, 2_7_05. Cabe

resaltar que estos tres casos corresponden a descomposiciones parciales del

contaminante, por lo que estos casos no son deseables. En los casos donde se

presentó la máxima acumulación sólo de los ácidos orgánicos no identificados

(2_7_08 y 2_12_05) se obtuvieron resultados intermedios que seguramente

podrían mejorarse aumentando el tiempo de ozonación (y descomponiendo, por

ende, estos ácidos), como es el caso del 4_7_30.

Así mismo, los ácidos oxálico y fórmico mostraron buenas tendencias de

descomposición desde el principio del proceso, por lo que en el pretratamiento

químico es deseable buscar la acumulación de éstos (sobre todo el ácido

oxálico que es el compuesto que tiende a acumularse en el proceso de

ozonación), y la descomposición de los compuestos fenólicos, se pueden

mejorar los resultados del tratamiento combinado.

105

CONCLUSIONES

Tomando en cuenta los resultados obtenidos en este trabajo se obtuvieron las

siguientes conclusiones:

1.- La biodegradación de clorofenoles no resultó un tratamiento efectivo:

después de 10 días de tratamiento no se observó una descomposición

significativa del 4-clorofenol y sólo se logró eliminar 60% del 2,4-diclorofenol.

Debido a la toxicidad mayor que presentó el primero con respecto al segundo

compuesto para los microorganismos utilizados.

2.- El tiempo de descomposición completa (>99%) de los clorofenoles en la

ozonación depende fuertemente del pH de la solución. Bajo pH básico la

descomposición es más rápida (por la generación de radicales hidroxilo) que

bajo pH neutro. Los tiempos de descomposición para el 4-clorofenol son 15 y 8

minutos bajo pH 12 y 7, respectivamente, y para el 2,4-diclorofenol son 8 y 5

minutos.

3.- Los productos principales de ozonación son los ácidos oxálico y fórmico, los

cuales tienen tendencia de acumulación desde el principio del proceso. Sin

embargo, el acido fórmico cambia su tendencia en tiempos cercanos a la

descomposición completa del clorofenol y se descompone completamente, lo

cual se puede interpretar como mineralización parcial.

4.- Durante la ozonación los compuestos no identificados tienden a acumularse

también desde el principio del proceso, alcanzan un máximo de su

concentración alrededor del tiempo de descomposición del contaminante inicial,

y después éstos tienden a descomponerse.

106

5.- En los tratamientos combinados, la tendencia de descomposición de los

ácidos orgánicos fue mejor que la de los compuestos fenólicos.

6.- Los compuestos fenólicos no identificados disminuyen la eficiencia de la

biodegradación cuando su concentración es la máxima (4-CF, pH 7, 10 min; 24-

DCF, pH 7, 5 min). Por el contrario, si la ozonación se suspende cuando estos

compuestos se descomponen (4-CF, pH 7, 30 min), la eficiencia de

biodegradación se ve favorecida. Éste último fue el mejor resultado en el

tratamiento combinado.

7.- Los ácidos oxálico y fórmico presentaron una buena dinámica de

descomposición a lo largo del bioproceso, por lo que, para favorecer el

tratamiento conjunto se deben seleccionar las condiciones de ozonación, las

cuales favorezcan la producción de estos ácidos.

8.- El consorcio se aclimató con diferentes sustratos y fue capaz de degradar

los diferentes compuestos formados durante la ozonación.

9.- Para mejorar los resultados del tratamiento combinado en el caso de

clorofenoles es importante cumplir con el siguiente criterio:

- Descomposición total del compuesto inicial y aproximadamente el 60%

de los compuestos fenólicos, los cuales resultaron tóxicos para el

consorcio microbiano. Cumpliendo esta condición, automáticamente se

favorece la formación del ácido oxálico.

107

RECOMENDACIONES

En función de lo expuesto anteriormente se recomienda:

1.- Probar la metodología desarrollada para el tratamiento de mezclas más

complicadas de clorofenoles, aplicando el criterio propuesto para mejorar el

tratamiento combinado.

2.- Probar diferentes tiempos de ozonación bajo pH 12, donde la concentración

relativa de los compuestos fenólicos disminuya y por consiguiente, aumente la

cantidad de ácido oxálico, el cual demostró una buena tendencia de

descomposición en el bioproceso.

3.- Hacer una caracterización de las especies microbianas que proliferan en

cada uno de los consorcios aclimatados a las diferentes fuentes de carbono

ozonadas.

4.- Continuar con el proceso de aclimatación (aproximadamente un año) del

consorcio obtenido con la mezcla de productos de ozonación como fuentes de

carbón y verificar si las velocidades de consumo de los diferentes sustratos

presentes en el medio, se modifican. Con el fin de reducir los tiempos de

biotratamiento.

108

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114

ANEXOS

ANEXO A. CURVAS DE CALIBRACIÓN DEL ESPECTROFOTÓMETRO UV-VIS Se realizó la calibración del espectrofotómetro UV-Vis de Perkin Elmer Lamba

2s los 2 clorofenoles estudiados, a sus longitudes de onda características. En

las figuras A.1 Y A2 se muestran las curvas de calibración de estos

compuestos.

LEY DE BEER PARA 4-CLOROFENOL

Figura A0.1. Curva de calibración para el 4-Clorofenol (279.9 nm).

115

LEY DE BEER PARA 2,4-DiCLOROFENOL

Figura A0.2. Curva de calibración para el 2,4-Diclorofenol (284.4 nm)

116

ANEXO B CURVAS DE CALIBRACIÓN DEL HPLC

Se realizó la calibración de los compuestos por HPLC, tomando en

cuenta las alturas de los picos de los cromatogramas

correspondientes a los compuestos en cuestión. A continuación se

muestran las curvas de calibración de cada compuesto:

Figura B0.3. Curva de calibración (HPLC) para 4-clorofenol.

117

Figura B0.4. Curva de calibración (HPLC) para 2,4-diclorofenol.

Figura B0.5. Curva de calibración (HPLC) para el fenol.

118

Figura B0.6. Curva de calibración (HPLC) para el catecol.

Figura B0.7. Curva de calibración (HPLC) para la hidroquinona.

119

Figura B0.8. Curva de calibración para el ácido oxálico.

Figura B0.9. Curva de calibración para el ácido fórmico.

120

Figura B0.10. Curva de calibración para el ácido fumárico.

Figura B0.11. Curvas de calibración para el ácido maleico.

121

ANEXO C. DISTRIBUCIÓN DE PRODUCTOS DE LA OZONACIÓN DE CLOROFENOLES NO IDENTIFICADOS.

A continuación se presentan las dinámicas de acumulación y/o

descomposición de los compuestos que se observaron por HPLC,

pero que no fue posible identificar.

Figura C0.1. Distribución de compuestos fenólicos no identificados a lo largo

del proceso de ozonación del 4-CF (pH 12).

122

Figura C0.2. Distribución de compuestos ácidos orgánicos no identificados a lo

largo del proceso de ozonación del 4-CF (pH 12).

Figura C0.3. Distribución de compuestos fenólicos no identificados a lo largo

del proceso de ozonación del 2,4-DCF (pH 7).

123

Figura C0.4. Distribución de ácidos orgánicos no identificados a lo largo del

proceso de ozonación del 2,4-DCF (pH 7).

Figura C0.5. Distribución de compuestos fenólicos no identificados a lo largo

del proceso de ozonación del 2,4-DCF (pH 12).

124

Figura C0.6. Distribución de ácidos orgánicos no identificados a lo largo del

proceso de ozonación del 2,4-DCF (pH 12).

125

ANEXO D. DINÁMICAS DE LA BIODEGRADACIÓN DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS Y ÁCIDOS ORGÁNICOS FORMADOS EN LA OZONACIÓN DE LOS CLOROFENOLES.

Figura D0.1. Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 7, 15 min).

Figura D0.2. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 7, 15 min).

126

Figura D0.3. Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 7, 30 min).

Figura D0.4. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 7, 30 min).

127

Figura D0.5. Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 12, 5 min).

Figura D0.6. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 12, 5 min).

128

Figura D0.7. Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 7, 5 min).

Figura D0.8. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 7, 5 min).

129

Figura D0.9. Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 7, 8 min).

Figura D0.10. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 7, 8 min).

130

Figura D0.11. Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 12, 5 min).

Figura D0.12. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 12, 5 min).