UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA

La Universidad Católica de Loja

ÁREA BIOLÓGICA Y BIOMÉDICA

TÍTULO DE INGENIERO QUÍMICO

Estudio para la eliminación de Enterococos

presentes en aguas de la industria piscícola mediante

procesos de oxidación avanzada.

TRABAJO DE TITULACIÓN

Autora: Díaz Pardo, Thalía Monserrath

Director: Aguilar Ramírez, Silvio David Mgtr.

LOJA – ECUADOR

2018

Esta versión digital, ha sido acreditada bajo la licencia Creative Commons 4.0, CC BY-NY-SA: Reconocimiento-No comercial-Compartir igual; la cual permite copiar, distribuir y comunicar públicamente la obra, mientras se reconozca la autoría original, no se utilice con fines comerciales y se permiten obras derivadas, siempre que mantenga la misma licencia al ser divulgada. http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/deed.es

2018

http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/deed.es

ii

APROBACIÓN DEL DIRECTOR DE TRABAJO DE TITULACIÓN

Magister.

Silvio David Aguilar Ramírez.

DOCENTE DE LA TITULACIÓN

De mi consideración:

El presente trabajo de titulación: Estudio para la eliminación de Enterococos

presentes en aguas de la industria piscícola mediante procesos de oxidación

avanzada realizado por Thalía Monserrath Díaz Pardo, ha sido considerado y

revisado durante su ejecución, por cuanto se aprueba la presentación del

mismo.

Loja, febrero de 2018

f)…………………..………….

iii

DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS

“Yo Thalía Monserrath Díaz Pardo, declaro ser autora del presente

trabajo de titulación: Estudio para la eliminación de Enterococos

presentes en aguas de la industria piscícola mediante procesos de

oxidación avanzada, de la Titulación de Ingeniero Químico, siendo

Silvio David Aguilar Ramírez director del presente trabajo; y eximo

expresamente a la Universidad Técnica Particular de Loja y a sus

representantes legales de posibles reclamos o acciones legales.

Además certifico que las ideas, conceptos, procedimientos y

resultados vertidos en el presente trabajo investigativo, son de mi

exclusiva responsabilidad.

Adicionalmente declaro conocer y aceptar la disposición del Art. 88 del

Estatuto Orgánico de la Universidad Técnica Particular de Loja que en

su parte pertinente textualmente dice: “Forman parte del patrimonio de

la Universidad la propiedad intelectual de investigaciones, trabajos

científicos o técnicos y tesis de grado o trabajos de titulación que se

realicen con el apoyo financiero, académico o institucional (operativo)

de la Universidad”

f)……………………………………

Autor: Thalía Monserrath Díaz Pardo

Cédula: 1104070634

iv

DEDICATORIA

Dedico este trabajo principalmente a Dios, por haberme dado la vida y permitirme

el haber llegado hasta este momento tan importante de mi formación profesional.

A mi madre Bertha, por ser la persona que me ha acompañado durante todo mi

trayecto estudiantil, y que ha sabido formarme con buenos valores que me ha

ayudado a salir adelante en los momentos más difíciles.

A mi abuelita Luz, quien a pesar de haberla perdido, cuando aún era muy pequeña,

ha estado siempre cuidándome y guiándome desde el cielo.

A Karla, quien se ha convertido en mi familia y ha estado a mi lado durante la

realización de todo este trabajo brindándome todo su amor y apoyo incondicional.

v

AGRADECIMIENTO

Agradezco a Dios por protegerme durante todo mi camino y darme fuerzas para

para culminar esta etapa de mi vida.

A mi madre Bertha, quien a lo largo de mi vida me ha demostrado su amor,

corrigiendo mis faltas y celebrando mis triunfos; y me ha enseñado a no rendirme

ante nada.

Al Mgtr. Silvio Aguilar, director de tesis y Dr. Daniel Rosado, por su tiempo y

valiosas guías y asesoramientos en la realización de este trabajo.

A mis compañeros y amigos, Andrés Espinoza., Rebeca Curipoma, Daniela

Valarezo, Andrés Coronel, Alejandro Ordóñez y Alexander Chamba por la

motivación y ayuda brindada durante toda la carrera estudiantil, demostrándome

que siempre podré contar con ellos.

vi

INDICE DE CONTENIDOS

APROBACIÓN DEL DIRECTOR DE TRABAJO DE TITULACIÓN ......................................................... II

DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS ................................................................. III

DEDICATORIA ............................................................................................................................ IV

AGRADECIMIENTO ..................................................................................................................... V

INDICE DE CONTENIDOS ............................................................................................................ VI

INDICE DE TABLAS ................................................................................................................... VIII

INDICE DE FIGURAS ....................................................................................................................IX

NOMENCLATURA ........................................................................................................................X

RESUMEN .................................................................................................................................... 1

ABSTRACT ................................................................................................................................... 2

INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 3

OBJETIVOS .................................................................................................................................. 6

OBJETIVO GENERAL ...................................................................................................................... 6

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................................. 6

CAPITULO I .................................................................................................................................. 7

MARCO TEÓRICO ........................................................................................................................ 7

1.1 ACUICULTURA EN ECUADOR ..................................................................................................... 8

1.2 CALIDAD DEL AGUA DE MAR ..................................................................................................... 8

1.3 AGUA DE LASTRE .................................................................................................................... 9

1.4 ENTEROCOCCUS SPP. ............................................................................................................ 10

1.4.1 Microorganismos indicadores ....................................................................................... 10

1.4.2 E. faecalis como indicadores de contaminación fecal ................................................... 11

1.4.3 Nivel aceptable de E. faecalis en muestras de agua de mar ......................................... 11

1.5 EFECTOS SOBRE LA SALUD ...................................................................................................... 11

1.6 PROCESOS DE OXIDACIÓN AVANZADA (POA) ............................................................................. 12

1.6.1 Desinfección por UV (Fotólisis) ...................................................................................... 12

1.6.2 Proceso fotólisis (UV/H2O2) ............................................................................................ 12

1.6.3 Proceso Foto-Fenton (UV/H2O2/Fe) ............................................................................... 13

1.7 VENTAJA DE LOS POA ........................................................................................................... 13

CAPITULO II ............................................................................................................................... 15

MATERIALES Y MÉTODOS.......................................................................................................... 15

vii

2.1 UBICACIÓN DEL ÁREA DE ESTUDIO ............................................................................................ 16

2.1.1 Muestreo ....................................................................................................................... 17

2.2 ANÁLISIS FISICOQUÍMICOS Y MICROBIOLÓGICOS .......................................................................... 17

2.3 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS ......................................................................................... 19

2.4 MICROORGANISMO DE ESTUDIO .............................................................................................. 21

2.5 PROPAGACIÓN DE LA CEPA ..................................................................................................... 21

2.6 CONSERVACIÓN DE LA CEPA .................................................................................................... 21

2.7 CULTIVO DE LA CEPA EN AGAR INCLINADO ................................................................................. 22

2.7.1 Preparación de Agar inclinado ...................................................................................... 22

2.7.2 Inoculación de la cepa en Agar inclinado ...................................................................... 22

2.8 CRECIMIENTO DEL INÓCULO EN CALDO NUTRIENTE ....................................................................... 23

2.8.1 Preparación de caldo nutriente ..................................................................................... 23

2.8.2 Siembra del inóculo en caldo nutriente ......................................................................... 24

2.9 DIGESTIÓN ENZIMÁTICA DE PROTEÍNAS PARA EL MEDIO DE CULTIVO ................................................. 24

2.9.1 Peptonas Bacto .............................................................................................................. 24

2.10 REACTORES UV ................................................................................................................. 25

2.11 ENSAYOS.......................................................................................................................... 26

2.11.1 Preparación del agua de mar sintética ........................................................................ 26

2.12.2 Procedimientos de oxidación avanzada ...................................................................... 27

2.12.2.1 Tratamiento UV ........................................................................................................ 28

2.12.2.2 Tratamientos UV/H2O2 y UV/H2O2/Fe3+ .................................................................... 28

2.13 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO ............................................................................................. 28

2.13.1 Preparación de Agar KF Estreptococos y Cloruro de Tetrazolio para siembra en cajas

petri …………………………………………………………………………………………………………………………………..28

2.13.2 Análisis de E. faecalis en muestras de agua. .............................................................. 29

2.13.3 Recuento bacteriano ................................................................................................... 29

2.14 ANÁLISIS DE DATOS ............................................................................................................ 30

CAPITULO III .............................................................................................................................. 32

RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................................ 32

3.1 CARACTERIZACIÓN DEL AGUA .................................................................................................. 33

3.1.1 Comparación de resultados de análisis del agua Vs normativa. ................................... 33

3.2 EVOLUCIÓN DE LA CONCENTRACIÓN BACTERIANA ........................................................................ 36

3.3 CINÉTICA DE ELIMINACIÓN DE E. FAECALIS .................................................................................. 37

3.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO SPSS ................................................................................................... 39

CONCLUSIONES ......................................................................................................................... 43

RECOMENDACIONES ................................................................................................................. 44

BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................... 45

ANEXOS .................................................................................................................................... 32

viii

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Calidad bacteriológica de agua de mar para uso recreativo con contacto

primario considerando las bacterias E. faecalis como indicador bacteriológico . 11

Tabla 2. Análisis fisicoquímicos realizados ........................................................ 18

Tabla 3. Equipos usados en el laboratorio. ........................................................ 19

Tabla 4. Materiales usados ............................................................................... 20

Tabla 5. Reactivos usados ................................................................................ 20

Tabla 6. Metodología experimental aplicada ..................................................... 27

Tabla 7. Parámetros de calidad del agua de mar. Puerto Hualtaco y piscina

camaronera ....................................................................................................... 33

Tabla 8. Criterios de calidad de las aguas para sus distintos usos .................... 34

Tabla 9. Resultados de Análisis de varianza (ANOVA) de un factor ................. 39

Tabla 10. Resultados del Análisis Post hoc de Tukey ....................................... 39

Tabla 11. Resultados de grupos que presentan valores de las medias ............. 40

Tabla 12. Condiciones de trabajo para la lámpara reactor UV-C ....................... 33

ix

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Células de Enterococcos ssp ............................................................. 10

Figura 2. Provincia de El Oro, Cantón Huaquillas. Puerto Hualtaco .................. 16

Figura 3. Etiqueta de muestreo ......................................................................... 17

Figura 4. Preparación y conservación de la cepa E. Faecalis ........................... 21

Figura 5. Preparación de Agar inclinado ........................................................... 22

Figura 6. Inoculación de E. faecalis en agar inclinado ....................................... 23

Figura 7. Preparación de Agar inclinado y Crecimiento de bacteria .................. 24

Figura 8. Esquema general del reactor de flujo continuo .................................. 25

Figura 9. Agua de mar sintética, inoculada con E. faecalis. Concentración: 6X106

UFC/ml .............................................................................................................. 27

Figura 10. Siembra, incubación y conteo de colonias de Enterococcos faecalis 29

Figura 11. Diluciones decimales de E. faecalis 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4 sembradas

en placas ........................................................................................................... 30

Figura 12. Curvas eliminación de E. faecalis, evolución en el tiempo hasta 66

segundos ........................................................................................................... 36

Figura 13. Cinética de eliminación de E. faecalis .............................................. 38

x

NOMENCLATURA

ATT American Type Culture Collection

EPA Agencia de Protección Ambiental

Log10 Logaritmo decimal

ml Mililitro

L Litro

NMP Número más probable

OMI Organización Marítima Internacional

Ph Potencial de hidrógeno

POA Procedimientos de oxidación avanzada

S Segundos

µm Micrómetro

µl Microlitro

°C Grados Celsius

•OH Radical hidroxilo

UV Radiación ultra violeta

1

RESUMEN

En el presente trabajo se realizó el estudio de inactivación de Enterococcos

faecalis en agua de mar sintética a escala de laboratorio, utilizando un reactor de

flujo continuo de luz UV-C, a diferentes tiempos de exposición, se determinó la

cinética de eliminación; mediante procesos de oxidación avanzada (UV, UV/H2O2,

y UV/H2O2/Fe3+) a diferentes concentraciones. Los resultados sugieren una buena

eficiencia en cuanto a la desinfección microbiana; pero a nivel estadístico la

mayoría de los tratamientos no muestran diferencia significativa en la media

cinética, ya que la adición del reactivo catalizador en rangos pequeños, no

aumenta la cinética de eliminación. Sin embargo, realizando varios ensayos, la

reducción óptima se consigue con el tratamiento UV/H2O2/Fe3+ con

concentraciones de 30 ppm de H2O2 y 6 ppm de Fe3+, que logra reducir el 99,999%

de concentración bacteriana en un tiempo de 36 segundos y que presenta un

aumento significativo en la cinética de eliminación 0,41 s-1. Por ello este

tratamiento se considera idóneo para futuras evaluaciones de diferentes matrices

de agua.

PALABRAS CLAVE: Acuicultura, Enterococcos faecalis, oxidación avanzada y

desinfección microbiológica.

2

ABSTRACT

In the present work the study of inactivation of Enterococcos faecalis in synthetic

seawater at laboratory scale was carried out, using a continuous flow reactor of

UV-C light, at different exposure times, the kinetics of elimination was determined;

through advanced oxidation processes (UV, UV/H2O2, and UV/H2O2/Fe3+) at

different concentrations. The results suggest good efficiency in terms of microbial

disinfection; but at the statistical level most of the treatments did not show a

significant difference in the kinetic mean, since the addition of the reagent in small

ones does not increase the kinetics of elimination. However, performing several

tests, the optimal reduction is achieved with the UV/H2O2/Fe3+ treatment with

concentrations of 30 ppm of H2O2 and 6 ppm of Fe3+, which manages to reduce

99.999% bacterial concentration in a time of 36 seconds and that presents a

significant increase in elimination kinetics 0.41 s-1. Therefore, this treatment is

considered suitable for future evaluations of different water matrices.

KEY WORDS: Aquaculture, Enterococcos faecalis, advanced oxidation and

microbiological disinfection.

3

INTRODUCCIÓN

La acuicultura en Ecuador ha sido una de las principales actividades económicas

de mayor crecimiento productivo y económico durante los últimos años (Monteros

& Salvador, 2015) especialmente en la provincia de El Oro, donde la siembra y

cosecha de camarón es una de las principales actividades productivas; en esta

provincia se cosecha un 40% de todo el crustáceo que exporta el Ecuador

(Durazno, Jiménez, & Moral, 2007).

Por ello en la acuicultura la calidad del agua de mar es un factor muy importante

en el proceso de producción y expansión de sus sistemas, la salud de la población

y conservación del ecosistema (Jorquera et al., 2002; Ministerio del Ambiente,

2014). Sin embargo existen varios estudios que reportan altas concentraciones de

Enterococos Faecalis, Escherichia Coli, y algunos géneros de Vibrio. (Soler et al.,

2010; Larrea et al., 2013). Estos microrganismos patógenos se han ido

incrementado con la magnitud de siembra del camarón; y a pesar de ello, esta

actividad no ha sido ampliamente investigada en cuanto al tratamiento del recurso

hídrico (Saldias, 2001; Veuthey & Gerber, 2012) ocasionando impactos

ambientales.

Por tanto, es necesario aplicar metodologías orientadas a la desinfección de

cargas contaminantes en los suministros de agua, o que eviten el desarrollo de

microorganismos potencialmente patógenos (Pozo & Velasteguí, 2012).

Los tratamientos destinados al agua de mar se encuentran poco desarrollados en

la actualidad (Penru et al,. 2012). Por ello, muchos tratamientos tradicionales no

pueden ser utilizados en el tratamiento de aguas contaminadas, ya que algunos

de estos métodos no son capaces de eliminarlos completamente, o causan

efectos contrarios sobre lo que se quiere llegar, considerándose ineficientes (Liu,

Qiu, & Huang, 2011); como el uso de la cloración que presenta numerosos

inconvenientes, como la producción de tóxicos, subproductos cancerígenos y

junto con altos costes de mantenimiento. (Ortega., et al 2013). Por esta razón, se

han buscado nuevas tecnologías aplicadas que sean económicas y efectivas, en

4

términos de disminución de microrganismos patógenos de manera permanente y

eficiente (Garcia, 2014).

Una alternativa viable para tratar este tipo de microrganismos son los procesos de

oxidación avanzada (POA), que se basan en la oxidación química del

contaminante mediante un proceso en donde se forman radicales (•OH), que

atacan las moléculas orgánicas de forma rápida, además poseen una alta

reactividad e inmediatamente desaparecen después de reaccionar

(Muruganandham et al., 2014). Estos métodos se pueden desarrollar a escala de

laboratorio en reactores de tipo continuo, obteniendo agua libre de contaminantes

orgánicos, sin representar un mayor costo o riesgo para la salud; utilizando

organismos indicadores de calidad (González-Bahamón et al., 2011).

Los organismos indicadores de calidad de aguas son organismos cuyas

densidades o concentraciones en el agua, pueden ser relacionadas con el riesgo

a la salud que implica el uso de esta (Rodríguez., et al 2012); por ello, E. faecalis

es un indicador de contaminación fecal para aguas costeras (Vergaray et al,. 2007)

y de gran importancia por su por su resistencias a condiciones salinas y a varios

tratamientos de desinfección (Larrea-Murrell., et al 2013)

El uso de estas tecnologías (POA) para el tratamiento de aguas marinas implican

un monitoreo y control constante de las variables físico-químicas y sanitarias del

agua, degradación eficaz de componentes recalcitrantes sin generar un flujo de

residuos secundario, con la propósito de reutilizar el agua, para nuevas

producciones de camarón o uso recreativo (Galli, & Sal, 2007; Dewil et al., 2017).

Dentro de las nuevas tecnologías que cumplan con los criterios mencionados, se

ha planteado el uso de tratamientos UV (Fotólisis) radiación ultravioleta, Fotólisis

(UV/H2O2) y Foto-Fenton (UV/H2O2/Fe3+), que utilizan reactivos como peróxido de

hidrógeno (H2O2) para que actúe como promotor de los procesos (Moreno-andrés

et al., 2015) y cloruro de hierro hexahidratado que funciona como catalizador para

la formación de radicales (•HO) y radiación UV para una mejor eficiencia en la

reducción de contaminantes orgánicos (González-Bahamón et al., 2011).

5

Por ello, la finalidad de esta investigación radica en el estudio del efecto de una

matriz de agua sobre el proceso de inactivación de E. faecalis mediante procesos

de oxidación avanzada con el objetivo de determinar la cinética de eliminación.

6

OBJETIVOS

Objetivo general

Evaluar la inactivación de Enterococos faecalis mediante los procesos UV,

UV/H2O2, y UV/H2O2/Fe3+, en agua de mar proveniente de la industria acuícola.

Objetivos específicos

Ubicar el área de estudio donde se va a llevar a cabo la investigación.

Caracterizar el agua de mar destinada a la industria acuícola.

Analizar las alternativas (UV, UV/H2O2, y UV/H2O2/Fe3+), para la

eliminación de la bacteria Enterococos faecalis en agua de mar sintética.

Establecer el mejor proceso para el tratamiento de agua de mar

Determinar la cinética de eliminación de Enterococcos

CAPITULO I

MARCO TEÓRICO

8

1.1 Acuicultura en Ecuador

De acuerdo a los datos proporcionados por la Cámara Nacional de Acuacultura,

Ecuador produce cerca del 60% del camarón de América, donde se registran 187

empresas destinadas a la producción y exportación de camarón, que ocupan en

la actualidad, alrededor de 210.000 hectáreas, donde solo en el primer semestre

del año 2016 se produjo 154.885 toneladas de camarón, equivalentes a US $

1.116,314 millones en valor FOB (Libre a bordo), generando plazas de empleo y

contribuyendo con la economía nacional (Bernabé, 2016; Muñoz et al., 2017).

Sin embargo, el cultivo intensivo del camarón excede la capacidad de cargas de

los estanques, o piscinas camaroneras, ocasionando el deterioro de piscinas,

sistemas de cultivo y brote de enfermedades tanto al camarón como al ser humano

(Veuthey & Gerber, 2012); puesto que el agua contiene, nutrientes empleados

para acelerar y aumentar el crecimiento del camarón, drogas y antibióticos que

generan mayor resistencia en el camarón, dando lugar a que formen

microrganismos patógenos (García, 2003), que sin la revisión necesaria de las

normas de protección del medio ambiente, constituyen un potencial

contaminación, considerado como el mayor problema ambiental en el cultivo de

camarón (Boyd, 2001; Moreno, 2010).

1.2 Calidad del agua de mar

La calidad del agua de mar depende de muchas variables, como elementos

químicos contenidos, organismos biológicos, materias en suspensión, y las

características físicas y estéticas, como el color, sabor y olor (Ramírez, et al.,

2017); de ahí su aprovechamiento, utilización y mantenimiento constituye

elementos esenciales en cualquier estrategia en el desarrollo. De manera que la

importancia de establecer la calidad de agua se constituye en mantener las

características físicas, químicas y microbiológicas; y que no se vea afectada por

contaminaciones químicos, residuos industriales u otros. (Guzman & Narvaez,

2010).

A diferencia de los derrames y otras contaminaciones causadas por el tráfico

marítimo; las especies y organismos biológicos, no pueden ser desinfectados

9

mediante medios físicos artificiales, ni absorbidos o eliminados de forma natural

por los océanos. Una vez asentados son casi imposibles de erradicar, pudiendo

causar daños muy graves en el hábitat natural. (P. González & Salamanca, 2013).

1.3 Agua de lastre

El agua de lastre se bombea en los buques con el fin de proporcionar estabilidad

y maniobrabilidad cuando estos se transportan sin el peso suficiente de la carga

(Jung, 2013).

Los buques pesqueros utilizan una red lastrada que barre el fondo del mar

capturando todo lo que encuentra a su paso (MAE, 2013); donde además de agua,

hay partículas de sedimentos y organismos, que se liberaran cuando se descarga

el agua de lastre, a través de sistemas de bombeo y tuberías (Moreno-Andrés et

al., 2016); y que además, se encuentran en constante aumento debido a que el

comercio internacional se realiza a través del transporte marítimo (Martiínez et al.,

2015)

Algunos de los organismos que se liberan provienen de los efluentes de las

piscinas de camaroneras, que como ya se mencionó, contienen residuos de

alimentos, fertilizantes, microrganismos etc. (Moreno, 2013). Estos organismos

transportados con agua de lastre han encontrado una forma para desarrollarse y

propagarse en el nuevo hábitat, convirtiéndose en especies invasoras (Moreno-

Andrés et al., 2016), que pueden generar cambios en los ecosistemas marinos y

costeros por desplazamiento de las especies nativas, así como daños en la salud

del hombre y las actividades económicas (Velalcázar, 2015).

Por ello, la OMI (Organización Marítima Internacional) ha implementado un

Convenio Internacional para el manejo de las aguas de lastre y sedimento de los

buques, adoptado en el 2004 y que entra en vigencia a partir del 2017, en donde

se establece que los buques deben implementar un sistema progresivo de gestión

de aguas de lastre, con el objetivo de prevenir, reducir los riesgos para el medio

ambiente y la salud de los seres humanos; por lo tanto, los organismos indicares

de contaminación E. faecalis, forman parte de los organismos que deben ser

10

controlados a la hora de descargar las aguas de lastre, y que deben cumplir con

límites máximos permisibles (OMI, 2004; Moreno, 2013).

1.4 Enterococcus spp.

Los Enterococcus spp son células esféricas u ovoides, de tamaño 0,6 – 2 × 0,6 –

2,5 µm (Díaz et al., 2010). Son cocos gram positivos ubicuos, que se encuentran

aislados, de a pares, o formando cadenas cortas tal como se muestra en la Figura

1, (Rodríguez, 2001; Acosta-Gnass, 2005 y Ortega, 2010). Diferenciados en 1899

de otros cocos que se disponían en cadenas por su bajo poder patógeno,

pertenecían al grupo D de la clasificación de Lancefield; sin embargo, a mediados

de la década de 1980 fueron clasificados en su propio género. (Lopardo, 2004).

Figura 1. Células de Enterococcos spp Fuente: Revista chilena de Infectología. Retrato microbiológico (2007) Elaboración: Revista chilena de Infectología. Retrato microbiológico (2007)

1.4.1 Microorganismos indicadores

Para determinar la calidad bacteriológica del agua se utilizan organismos como

indicadores bacteriológicos, que evalúan la presencia y abundancia de bacterias

(Kacar & Omuzbuken, 2017). La evaluación del potencial de riesgo para la salud

se basa en datos de concentración del indicador bacterias, que indica

indirectamente la presencia de microorganismos patógenos (Lušić et al., 2017).

11

1.4.2 E. faecalis como indicadores de contaminación fecal

En 2003, la Secretaría de Salud introdujo a los Enterococos como indicador

bacteriológico de contaminación fecal para aguas marinas de uso recreativo con

contacto primario (Silva et al., 2007), por su habilidad para crecer a 6.5% NaCl,

pH 9.6, temperaturas que oscilan entre 10 – 45 ºC; y la relación directamente con

enfermedades gastrointestinales, respiratorias y dermatológicas (Rodríguez,

2012). Por ello son considerados como el indicador más eficiente para evaluar la

calidad de agua de mar. (Secretaría de Salud, 2004)

1.4.3 Nivel aceptable de E. faecalis en muestras de agua de mar

Los criterios de calidad microbiológica de aguas costeras para uso

recreativo según, (Secretaría de Salud, 2004) establece, Tabla 1.

Tabla 1. Calidad bacteriológica de agua de mar para uso recreativo con contacto primario considerando las bacterias E. faecalis como indicador bacteriológico.

Según (NMX-AA-120-SCFI-2016, 2016), la calidad bacteriológica del agua

de mar deberá ubicarse dentro del límite de 100 Enterococcos NMP/100

ml.

1.5 Efectos sobre la salud

La presencia de Enterococcos fecales en agua insinúa la contaminación fecal y

una posible presencia de patógenos entéricos como consecuencia (Martzy et al.,

2017). Se relacionan directamente con gastroenteritis, conjuntivitis, dermatitis,

Fuente: Secretaria de Salud, 2004 Elaboración: Secretaria de Salud, 2004

12

entre otras; ocasionadas por ingestión, contacto e inhalación de estos

microorganismos a través del agua. (Vergaray et al., 2007; Díaz et al., 2010)

1.6 Procesos de oxidación avanzada (POA)

Los procesos de oxidación avanzada (POA), son métodos de oxidación en fase

acuosa recomendadas en el tratamiento de agua residual (Dewil et al., 2017). Su

acción se basa en la producción del radical hidroxilo extremadamente oxidante

(•OH), que se obtiene mediante reacciones fotoquímicas homogéneas de H2O2

irradiada con UV (Sauer et al., 2006); estos atacan la estructura química de

algunos compuestos orgánicos y la pared celular de los microorganismos

presentes en aguas (Giannakis et al., 2015), es decir son capaces de destruir los

contaminantes orgánicos y los gérmenes patógenos (Rodríguez-Chueca etal.,

2015).

1.6.1 Desinfección por UV (Fotólisis)

La radiación UV es un tratamiento físico sin dosis químicas, que transfiere energía

electromagnética desde una lámpara de vapor de mercurio al material genético

del organismo (Zhang, Hu, & Shan, 2014). Cuando la radiación UV penetra en las

paredes de la célula de un organismo y alcanza su núcleo, ésta destruye la

capacidad de reproducción de la célula al distorsionar parte de su ADN. La eficacia

del sistema de desinfección con luz ultravioleta depende de las características del

agua, la intensidad de la radiación, el tiempo de exposición de los

microorganismos a la radiación y la configuración del reactor (EPA, 1999; Nebot

et al., 2007).

1.6.2 Proceso fotólisis (UV/H2O2)

Las radiaciones ultravioletas tienen un fuerte potencial de desinfección y algunas

propiedades oxidativas que en combinación con hidrógeno peróxido (UV/H2O2)

conducen a un avanzado proceso de oxidación mejorado debido a la formación

de hidroxilos radicales (Penru et al., 2012) de acuerdo con la (reacción 1).

H2O + hv 2 °OH (reacción 1)

13

1.6.3 Proceso Foto-Fenton (UV/H2O2/Fe)

En el caso de la fotocatálisis homogénea, el proceso foto–Fenton ha sido uno de

los más profundamente ensayados y es el más efectivo en la eliminación de

contaminantes orgánicos en soluciones acuosas (González, 2015). En este

proceso el reactivo de Fe(II) se oxida a Fe(III) descomponiendo el peróxido de

hidrógeno para formar radicales hidroxilo (reacción 2), el empleo de la radiación

UV incrementa el poder de oxidación principalmente por la foto-reducción de

Fe(III) a Fe(II) la cual produce más radicales hidroxilo (reacción 3) y de esta forma

se establece un ciclo en el reactivo de Fenton y se producen los radicales hidroxilo

para la oxidación de compuestos orgánicos (reacción 4) (Hincapié-Mejía et al.,

2011); además la velocidad de disminución de contaminantes orgánicos con la

reacción Fenton, se aumenta cuando el sistema es irradiado con luz UV visible

(Oquendo, 2011)

Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH° + OH- (reacción 2)

Fe3+ + H2O + hv → Fe2+ + OH° + H+ (reacción 3)

RH + OH° → fotoproductos + H2O (reacción 4)

El uso de esta tecnología tiene como ventaja que el hierro es abundante y no

tóxico, el peróxido de hidrógeno es fácil de manejar y ambientalmente benigno, no

se forman compuestos clorados y no existen limitaciones de transferencia de

masa por tratarse de un sistema homogéneo. (Domènech & Jardim, 2000; Litter,

2005)

1.7 Ventaja de los POA

Degradación efectiva de componentes insistentes sin originar una corriente

secundaria de residuos (Pablos et al., 2013).

El uso de catalizadores tales como óxidos de metales aceleran las

reacciones de oxidación parcial, llevando una mineralización más completa

del efluente; además alteran la distribución de subproductos y favorecen

la formación de compuestos menos tóxicos (Quintanilla et al., 2006).

CAPITULO II

MATERIALES Y MÉTODOS

16

En este apartado se describe la ubicación del área de estudio, materiales y

metodología utilizados en la inactivación de E. faecalis. Los ensayos se realizaron

a escala de laboratorio con agua de mar sintética contaminada con cepa pura de

la bacteria, a la cual se somete a los procesos de oxidación avanzada descritos y

se evalúa el grado de inactivación de la misma, para ello se utilizó los materiales

y reactivos descritos en las Tablas 3,4 y 5.

2.1 Ubicación del área de estudio

El área de estudió se situó en una camaronera ubicada en Puerto Hualtaco, del

Cantón Huaquillas (Lat. 3º 28’ 52.97” S y Long. 80º 14’ 36” O), provincia de El Oro,

al sur del país. Véase Figura 2.

Figura 2. Provincia de El Oro, Cantón Huaquillas. Puerto Hualtaco Fuente: Google Mapas, 2017 Elaboración: Google Mapas, 2017

17

2.1.1 Muestreo

Mediante convenios se tuvo acceso a una camaronera ubicada en el Puerto

Hualtaco, en donde se identificó los puntos de muestreo mediante coordenadas

geográficas, se realizó la colección dentro y fuera de las piscinas camaroneras

siguiendo la Norma: INEN 2169:98 AGUA. CALIDAD DEL AGUA. MUESTREO.

MANEJO Y CONSERVACION DE MUESTRAS.

Las muestras fueron recolectadas en galones de 20 L para análisis fisicoquímicos

y frascos de 250 ml estériles para microbiológicos, todos etiquetados de forma

detallada, con número de muestra, sitio de muestra, fecha y hora, tal como se

muestra en Figura 3.

Figura 3. Etiqueta de muestreo Fuente: Autora Elaboración: Autora

2.2 Análisis fisicoquímicos y microbiológicos

Los análisis se llevaron a cabo en el laboratorio acreditado de aguas de la sección

Ingeniería Ambiental de la UTPL, todos los parámetros fueron basados en la

metodología “Standard Methods of Water 22nd edition” de acuerdo a las técnicas

estandarizadas.

Algunos parámetros fueron medidos in situ como: pH, oxígeno disuelto,

temperatura y conductividad mediante un multiparámetro HQ40D marca HACH.

Las muestras fueron llevadas al laboratorio donde se culmina su análisis con los

parámetros que se muestran en la Tabla 2.

MUESTRA #1

Piscina Camaronera: Entrada

12/09/2016

09:00 AM

18

Tabla 2. Análisis fisicoquímicos realizados

Parámetro Unidades

Sólidos totales Mg/L

Nitritos mg/L

Nitratos mg/L

Coliformes totales UFC/100 ml

Enterococcos faecalis UFC/ml

Cloruro mg/L Fuente: Autora Elaboración: Autora

La cantidad de Nitritos se determina por espectrofotometría, usando el método

diazotización. En celdas de 25 ml se añade la muestra de agua (blanco), y en otra

celda, la muestra de agua y el reactivo NITRIVER3. Se agita para homogenizar y

finalmente medir. Así mismo la cantidad de nitratos por el método de reducción de

Cadmio; en una celda de 25 ml se añade agua desionizada (blanco), y en otra

celda, la muestra de agua; el reactivo NITRIVER5 se añade a los dos celdas; se

agita y se mide la concentración.

El cloruro total se mide por volumetría, que consiste en añadir 50 ml de la muestra

en un vaso de precipitación de 250 ml y agregar 5 gotas de cromato de potasio

(K2CrO4) al 10%, para titular con nitrato de plata (AgNO3) 0,0141N, hasta observar

un viraje de amarillo claro a ligeramente rojizo; y calcular la concentración.

La presencia de coliformes totales se determinó mediante la técnica normativa de

Filtración por membrana, que consiste en la filtración de un volumen medido de

muestra (100 ml) a través de una membrana de nitrato de celulosa y su incubación

en un medio de cultivo selectivos a 44.5 ºC (APHA/AWWA/WEF, 2012).

19

2.3 Equipos, materiales y reactivos

Tabla 3. Equipos usados en el laboratorio.

Equipos

Modelo

Función

Lámpara UV (254nm)

OPP-625, 1.0GPM

eliminación bacteriana

Bomba peristáltica

Masterflex® L/S®

(600RPM)115/230 VAC 0,

07523-80

Control del caudal

Estufa de cultivo Serie CL

STD – Control estándar digital

Mantener a una

temperatura controlada

Autoclave vertical

automática de 50 litros

CVQ-B50L

Esterilización de

material

Contador de colonias

manual

Quebec®

Facilitar el conteo de colonias bacterianas

Cámara de flujo laminar

vertical – CHC LAB

CHC-CLB-201-04

Proporcionar un ambiente estéril para el

cultivo de microrganismos

Mechero de alcohol

Asegura condiciones de esterilidad

Freezer LabTech

Congeladores Haier -86° ULTDW-86L959

Preservación de microorganismos

Fuente: Autora Elaboración: Autora

20

Tabla 4. Materiales usados

Materiales Función

Frascos boeco de tapa rosca Guardar y mezcla de muestras

Tubos de ensayo con tapa rosca Toma de muestras y diluciones

Balones de aforo de 1000 ml Preparación de muestras

Pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml Toma de muestras

Probetas de 100 y 200 ml Distribución homogénea de agua

Manguera Conductor del medio líquido

Pinzas universales Sujetar la lámpara UV

Pinzas doble nuez Sujetador de pinza universal

Soporte universal Soporte al reactor

Fuente: Autora Elaboración: Autora

Tabla 5. Reactivos usados

Fuente: Autora Elaboración: Autora

Reactivos

Marca Función

KF Streptococcus Agar, 500 Gr

DIFCOTM

Medio de crecimiento de bacteria E. faecalis

Caldo Nutriente Agar Nutriente

DIFCOTM

Medio de conservación y enriquecimiento bacteriano

Peptonas DIFCOTM

Medio de cultivo bacteriano

Cepa de referencia E. faecalis

ATCC® 19433™ Medio para inocular las muestras

Cloruro de Sodio NaCl

MERCK Compuesto del agua de mar sintética

Solución de peróxido de

hidrógeno al 30%

HX0640 EMD MILLIPORE

Medio para generar radicales hidroxilo para los procesos oxidación avanzada

Hierro (III) Cloruro hexahidratado

EMSURE® ACS Catalizador para los procesos oxidación

avanzada

Agua destilada Medio para preparar

21

2.4 Microorganismo de estudio

Se utilizó la cepa comercial E. faecalis ATCC® 19433™ de ATCC Company

(E.E.U.U), organización global de recursos y estándares de materiales biológicos

destinado a fines de investigación de laboratorio.

2.5 Propagación de la cepa

Se agregó 5 ml de agua destilada estéril al vial que contiene la cepa replicada y

seguidamente incubar por 24 horas a 37°C. Para una mayor propagación se

realizó una siembra en cajas petri con Agar BHI (Infusión cerebro corazón), de

igual manera por 24 horas a 37°C.

2.6 Conservación de la cepa

La preservación de la cepa de E. faecalis, se realizó por congelación a -76°C para

reducir su metabolismo hasta prácticamente anularlo. Para ello se preparó DMSO

(dimetilsulfóxido) al 10%, que según (Waites et al., 2001) neutraliza los efectos de

las sales. Posteriormente se preparó en microtubos roscados de 0,5 ml, 900 µl de

cepa E. faecalis con 100µl de DMSO; se llevó a congelación en el Deep freezer,

hasta el momento de realizar la inoculación. Este proceso de conservación

mantiene la bacteria aproximadamente 2 años, Figura 4.

Figura 4. Preparación y conservación de la cepa E. faecalis Fuente: Autora Elaboración: Autora

22

2.7 Cultivo de la cepa en Agar inclinado

2.7.1 Preparación de Agar inclinado

Se pesó 2,3 gramos de agar nutriente y se mezcla hasta disolver en 100 ml de

agua destilada en un frasco de tapa rosca de 250 ml. Una vez disuelto, se calienta

a ebullición y se esteriliza en autoclave por 15 minutos a 120°C. Se distribuyen 5

ml del medio de cultivo líquido en tubos de ensayo de 16 x 100 mm, en un total de

20 tubos, se verifica que se realice una distribución homogénea evitando pérdidas

del medio y colocando los tubos en una posición inclinada sobre una superficie

recta, tal como se muestra en la Figura 3, dejar enfriar hasta solidificación del

medio, quedando listos para la siembra. Se preparan varios tubos conforme al

número de experimentos, Figura 5.

Figura 5. Preparación de Agar inclinado Fuente: Autora Elaboración: Autora

2.7.2 Inoculación de la cepa en Agar inclinado

Acondicionar la cepa que se encuentra en estado de congelación, hasta

temperatura ambiente; con un asa estéril a temperatura ambiente, se realiza la

inoculación en cada uno de los tubos. La forma de realizar la siembra consiste en

introducir el asa en el fondo del tubo y trazar en toda la superficie, procurando no

desgarrar el agar. El procedimiento se repite para los 20 tubos de ensayo y se

23

procede a incubar durante 24 – 48 horas a 37 °C, para finalmente llevar a

refrigeración entre 1 – 3°C; en estas condiciones su tiempo de vida útil es de

aproximadamente 15 días desde su refrigeración. De igual manera se preparan

varios tubos conforme al número de experimentos y sus réplicas, Figura 6.

Figura 6. Inoculación de E. faecalis en agar inclinado Fuente: Autora Elaboración: Autora

2.8 Crecimiento del inóculo en Caldo nutriente

2.8.1 Preparación de caldo nutriente

Se pesó 1,2 gramos de Caldo nutriente y se disuelven en 150 ml de agua destilada

en un frasco de tapa rosca de 250 ml, se calienta hasta ebullición para disolver

completamente el caldo y esterilizar en autoclave por 15 minutos a 120°C. Se

Distribuye el caldo en tubos de ensayos de 16 x 150 mm, 15 ml por cada tubo en

un total de 10 tubos de ensayo; a manera que la distribución sea homogénea y no

exista pérdidas. Se preparan varios tubos acorde al número de experimentos, y

se mantienen en refrigeración a 3°C para la conservación del medio.

24

2.8.2 Siembra del inóculo en caldo nutriente

Se toman 10 ml caldo nutriente en un tubo de ensayo de 16 x 100 mm, y mediante

un asa bacteriológica estéril y un mechero de alcohol, repitiendo el mismo proceso

de esterilización; se introduce el asa en el agar inclinado que contiene la cepa

bacteriana en refrigeración, se toma una asada para depositarla en el tubo que

contiene el caldo nutriente. Este proceso se repite hasta obtener una turbidez de

4 según la escala de Mc Farland; obteniendo una concentración nominal

bacteriana inicial de 1.2x109 UFC/ml (OMS 2004) de E. faecalis. Se deja incubar

a 37°C durante aproximadamente 8 horas para un mejor crecimiento, Figura 7.

Figura 7. Preparación de Agar inclinado y Crecimiento de bacteria Fuente: Autora Elaboración: Autora

2.9 Digestión enzimática de proteínas para el medio de cultivo

2.9.1 Peptonas Bacto

Se pesó 1 gr de peptona bacto y se diluye en 1 litro de agua destilada, para

distribuir a tubos de ensayos de 16 x 100 mm, 9 ml de la mezcla a cada uno de

los tubos en un total de 50 o cuantos sean necesarios, esterilizar en autoclave por

15 minutos a 120°C. Se disponen de varios tubos conforme a las réplicas de los

experimentos, y se mantienen en refrigeración a 3°C.

25

2.10 Reactores UV

Los ensayos se realizaron en un reactor tubular o de flujo continuo a escala de

laboratorio; este consiste en una bomba peristáltica con un caudal regulable de

máximo de 36 ml/s y un reactor lámpara de fuente de luz UV-C (254 nm), con

capacidad de volumen irradiado de 143 ml a 0,177 W/m2. El diseño está

conformado por un sistema de entrada que contiene la muestra a tratar, la cual es

aspirada por la bomba peristáltica que se calibra a diferente flujo en función del

ensayo, luego pasa al reactor donde se aplica diferentes tratamientos (UV,

UV/H2O2, y UV/H2O2/Fe3+), y finalmente una salida del sistema donde se colectan

las muestras para evaluar la eficiencia en la inactivación del microorganismo,

Figura 8.

Figura 8. Esquema general del reactor de flujo continuo Fuente: Autora Elaboración: Autora

26

2.11 Ensayos

El procedimiento experimental consistió en aplicar tratamientos UV, UV/H2O2, y

UV/H2O2/Fe3+, a diferentes dosis de UV-C utilizando un reactor lámpara de flujo

continuo, a una matriz de agua inoculada con cultivo puro de E. faecalis a escala

de laboratorio; añadiendo diferentes concentraciones de H2O2, catalizador Fe3+

(FeCl3 6H2O), con el objetivo de optimizar los tratamientos.

Durante los ensayos, la irradiación del reactor lámpara se mantiene constante,

siendo flujo y tiempo de incidencia las únicas variables; es decir, después de

recolectar el primer volumen de muestra, el flujo se reduce y el tiempo aumenta;

repitiendo el mismo procedimiento para cada muestra.

De los volúmenes colectados se realiza las diluciones decimales necesarias, para

la siembra y análisis microbiológico, por duplicado; y conteo de colonias

sobrevivientes.

La eficiencia de desinfección se determinó por reducción logarítmica Log (N/N0),

donde N es la concentración de la bacteria a un tiempo (t) del tratamiento y N0 la

concentración inicial de la bacteria antes del tratamiento; donde el límite de

detección fue en 6 unidades logarítmicas de reducción, ya que la concentración

inicial se encontraba en 106 CFU/mL, en todos los ensayos.

Los resultados experimentales obtenidos se ajustaron con una herramienta de

Microsoft Excel, GInaFiT aplicando el modelo “log-linear + tail”, para determinar la

cinética de eliminación; y finalmente se aplicó un análisis multifactorial de varianza

(ANOVA) para determinar si existe diferencia significativa entre los tratamientos

aplicados.

2.11.1 Preparación del agua de mar sintética

En un litro de agua destilada se agregó 35 gr de cloruro de sodio (NaCl), se agita

durante 1 minuto y esteriliza en autoclave. Se procede a inocular con E. faecalis,

agregando los 10 ml del inóculo que se encuentra en el caldo nutriente y se agita

durante 30 segundos y se mide pH, medir la concentración inicial de

27

microorganismos, donde en base a la experimentación, la concentración inicial

real promedio de todos los experimentos fue aproximadamente de 6,13x106

UFC/ml, Figura 9.

Figura 9. Agua de mar sintética, inoculada con E. faecalis. Concentración: 6X106 UFC/ml Fuente: Autora Elaboración: Autora

2.12.2 Procedimientos de oxidación avanzada

Consiste en la exposición de luz UV-C a las muestras inoculadas de agua de mar

sintética, aplicando los tratamientos establecidos en diferentes dosis y tiempo,

según Tabla 6. El flujo según el tiempo de exposición se establece en el Anexo 1.

Tabla 6. Metodología experimental aplicada

Fuente: Autora Elaboración: Autora

Microorganismo

de estudio

pH

Tratamientos

UV-C

Concentración (ppm)

Tiempo de exposición

(seg) H2O2 FeCl3 6H2O

Enterococcos faecalis

6x106 (UFC/ml)

7

UV

Si

0

0

0,

26, 36,

46, 56,

66

UV/H2O2

Si 10 0

Si 20 0

Si 30 0

UV/H2O2/Fe3+

(5:1)

Si 10 2

Si 20 4

Si 30 6

28

2.12.2.1 Tratamiento UV

En la muestra inoculada (1L) se determina la concentración real bacteriana y se

hace pasar por el reactor UV, teniendo en cuenta que se cumpla con los tiempos

de residencia según Tabla 5, por cada tiempo se colecta un volumen 10 ml en

frascos pyrex, (en total 6 frascos). Finalmente realizar la siembra de estas

muestras y el análisis microbiológico.

2.12.2.2 Tratamientos UV/H2O2 y UV/H2O2/Fe3+

Para la muestra de agua inoculada (1L) se determina la concentración real

bacteriana y se divide en volúmenes iguales de 200 ml, para cada frasco, se

calcula las concentraciones a añadir de H2O2 y FeCl36H2O respectivamente según

el tratamiento, tal como se muestra en la Tabla 5; y Anexo 2.

Para estos tratamientos tener en cuenta que antes de aplicar radiación UV-C, se

agrega el volumen calculado de H2O2 a cada muestra para el tratamiento UV/H2O2

y para UV/H2O2/Fe3+, añadir primero H2O2 y después la solución de FeCl36H2O

para mejorar la acción del catalizador. Todas las muestras se homogenizan

durante 15 segundos y se hacen pasar por el reactor UV. De igual forma que en

el ensayo UV-C se colectan muestras de 10 ml en frascos pyrex, para concluir

con el análisis microbiológico de las muestras en cada tratamiento.

2.13 Análisis microbiológico

2.13.1 Preparación de Agar KF Estreptococos y Cloruro de

Tetrazolio para siembra en cajas petri

Pesar 15,28 gr de Agar Estreptococos diluir en 200 ml de agua destilada

y colocar en frascos con tapa rosca de 250 ml, preparar un total de 4

frascos, calentarlos a ebullición. Nota para evitar que el caldo se solidifique

se mantiene en baño maría a 45°C, hasta que se realice la siembra con

las muestras de agua.

Cloruro de Tetrazolio, pesar 1 gr, diluir con agua destilada y aforar a 100

ml d homogenizar durante 15 segundos y mantenerlo hasta realizar la

siembra

29

2.13.2 Análisis de E. faecalis en muestras de agua.

A partir de los volúmenes colectados a la salida del reactor, se toma 1 ml por cada

frasco y se realizan las diluciones decimales necesarias de la muestra, utilizando

la peptona Bacto preparada anteriormente, las muestras se deben realizar, por

duplicado para cada ensayo. Seguidamente se siembran en las cajas petri,

utilizando pipetas estériles, se agregan entre 18 a 20 ml del medio de cultivo Agar

KF Estreptococos con 1 ml de Cloruro de Tetrazolio. Una vez que se realiza la

mezcla, se homogeniza mediante movimientos de derecha a izquierda y de arriba

hacia abajo, sobre una superficie lisa y horizontal. Las placas se solidifican y se

incuban de forma invertida a 37°C por 24 horas. Transcurrido el tiempo de

incubación se cuenta las colonias que crecen en la membrana de la placa

mediante un contador de colonias, Figura 10.

Figura 10. Siembra, incubación y conteo de colonias de Enterococcos faecalis Fuente: Autora Elaboración: Autora

2.13.3 Recuento bacteriano

Después del periodo de incubación se determina el número de colonias de E.

faecalis, utilizando la técnica de recuento bacteriano por placas, que se basa en

contar las unidades formadoras de colonias (UFC) presentes en un mililitro de

muestra (UFC/ml), mediante un contador de colonias. Cuando la cantidad de

bacterias es demasiado alta, se realizan las diluciones decimales, de manera que

permita el conteo confiable, tal como se muestra en la Figura 11.

30

Figura 11. Diluciones decimales de E. faecalis 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4 sembradas en placas Fuente: Autora Elaboración: Autora

2.14 Análisis de datos

El análisis de resultados se realiza en hojas de cálculo en el Software Microsoft

Excel, donde se determina la desviación típica, coeficiente de variación y promedio

de las corridas. Estos datos estadísticos nos permiten expresar la cantidad de

bacterias en unidades logarítmicas (Log10).

Seguidamente utilizamos la herramienta GInaFiT, que es una extensión freeware

para Microsoft Excel, donde se ajusta los datos a un modelo logaritmo lineal + cola

y se calcula la cinética de la población bacteriana en base al tratamiento y tiempo

de exposición. El comportamiento de la bacteria se describe mediante curvas de

inactivación en función de la ecuación 1, donde se hace presente el fenómeno de

Incontable Moderadamente contable

Contable Contable

31

cola después de un descenso logarítmico lineal, por ende la ecuación 1 se

renombra en base a logaritmo tal como se muestra en la ecuación 2; además se

muestran las medidas estadísticas de cinética expresada como Kmax, coeficiente

de regresión lineal (R2) y tiempo de eliminación.

N= (N0- Nres) * e (-kmax * t) + Nres (ec.1)

LOG10(N)= LOG10 (10LOG10 (N0) – 10LOG10 (Nres)) * e (-kmax*t) + 10LOG10 (Nres) (ec.2) Se realiza un análisis en SPSS, que es un software de análisis estadístico de

datos; que incluye la prueba de análisis de varianza ANOVA de un factor, que

compara varios grupos de variables para saber si existe diferencia significativa

entre ellos, considerando que el nivel de significancia o el P valor debe ser menor

a 0,05. Para este caso se ha aplicado dos variables tipo numéricas, la cinética que

es la variable dependiente o la que se quiere comparar y el tratamiento que es el

factor o variable de agrupamiento con la que se forman los grupos de cinética.

Una vez que se ha determinado que existen diferencias significativas entre sus

tratamientos se aplica la prueba de Post hoc Tukey, que permite determinar qué

grupos específicamente se diferencian entre sí, con respecto a la variable

dependiente (cinética); para finalmente identificar subconjuntos homogéneos de

los tratamientos que no se diferencian entre sí, y grupos que si tienen diferencia

significativa; para ordenarlos de menor a mayor eficiencia.

CAPITULO III

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

33

En este apartado se presenta el análisis de resultados obtenidos en este estudio.

3.1 Caracterización del agua

En la tabla 7, se presentan los datos obtenidos del análisis físico, químico y

microbiológico del agua de estudio Puerto Hualtaco y camaronera estudiada.

Tabla 7. Parámetros de calidad del agua de mar. Puerto Hualtaco y piscina camaronera

Fuente: Autora Elaboración: Autora

3.1.1 Comparación de resultados de análisis del agua Vs

normativa.

Los parámetros de calidad según el Reglamento de Prevención y Control de la

Contaminación Ambiental en lo relativo al recurso agua (Ministerio del Ambiente

Ecuador, 2015) para Criterios de calidad admisible para la vida acuática y silvestre

en agua dulce, marina y estuarios; y Límite de descarga a un cuerpo de agua

marina establecen lo siguiente, Tabla 8.

Parámetros

Unidades

Piscina camaronera

Puerto

Hualtaco Entrada

Dentro

Salida

Temperatura ºC 28,40 29,60 28,50 27,70

pH adimensional 7,50 8,75 8,55 7,67

Sólidos totales

mg/L 1656,00 35438,00 35696,00 1050,00

Oxígeno Disuelto

mg/L 6,15 11,29 6,27 6,53

%Saturación 79,20 148,70 80,70 85,00

Nitrito mg/L 0,15 0,33 0,28 0,15

Nitrato mg/L 11,00 1,00 2,00 15,00

Cloruro mg/L 818,01 19254,67 19758,06 812,97

Conductividad eléctrica

uS/cm 2431,64 44236,50 44503,50 1339,73

Coliformes Totales

NMP/100 ml 2258,99 1715,11 2258,99 5522,32

E. Faecalis NMP/100 ml 778,24 3816,56

34

Tabla 8. Criterios de calidad de las aguas para sus distintos usos

Fuente: Autora Elaboración: Autora

Los resultados obtenidos según el análisis fisicoquímico muestran un pH medio

dentro del límite (6,5 – 9,5) de 8,1, una temperatura media de 28,55 °C que se

encuentra dentro del rango (< 35°C) y la concentración de Nitritos de 0,22 mg/L y

Nitratos de 7,25 mg/L se encuentran dentro del límite permisible (200 mg/L).

La concentración de oxígeno disuelto, tanto en el puerto como en la camaronera,

se encuentra en un nivel aceptable según la normativa >60% de saturación y >5

mg/L, presentando valores promedio de 98% de saturación y 7,56 mg/L de

oxígeno disuelto.

La cantidad de cloruro en agua de mar según (Grau & Muñoz, 2013), es de 19440

mg/L; y la cantidad promedio de cloruros de las muestras en estudio es de

10160,92 mg/L, lo cual se debe a que en este sector hay la influencia del río

Zarumilla de agua dulce que se mezcla con las aguas marinas y provoca

disminución en la concentración de cloruros.

Parámetros

Criterios de calidad

admisible para la vida acuática y silvestre en agua

dulce, marina y estuarios

Límite de descarga a un cuerpo de agua marina

Unidades Criterio de calidad

Unidades Criterio de calidad

pH - 6,5 - 9,5 - 6 – 9

Oxígeno disuelto

% saturación > 60

mg/L > 0,05

Nitritos y Nitratos

mg/L 200

Coliformes totales

NMP/100 ml

10000

Sólidos suspendidos

totales

mg/L

250

Temperatura °C < 35

35

La concentración de Coliformes totales se encuentran dentro del rango

establecido (10000 NMP/100), siendo un valor medio de 2938,85 NMP/100; sin

embargo con respecto a E. faecalis, se determinaron concentraciones muy

considerables tanto en la camaronera con 778,24 NMP/100, como en el Puerto

Hualtaco con 3816,56 NMP/100; valores que sobrepasan por mucho el límite

permisible, como se puede apreciar en Tabla 1, según (Secretaría de Salud,

2004), que establece los criterios para clasificar las playas, en la cual se establece

que una concentración >500 NMP/100, no es apta para el uso recreativo y requiere

registro sanitario; además, según Norma Mexicana (NMX-AA-120-SCFI-2016,

2016), que fijan los requisitos y especificaciones de sustentabilidad de calidad de

playas, considera que la calidad bacteriológica del agua de mar deberá ubicarse

dentro del límite de 100 NMP/100ml.

36

3.2 Evolución de la concentración bacteriana

A continuación se presenta los resultados de la eliminación de E. faecalis, con luz

UV-C 254 nm e irradiación de 0,177 W/m2, a una concentración inicial 6,13X106

UFC/ml expresados mediante el logaritmo del cociente entre la concentración de

bacterias en un tiempo (t) y la concentración inicial, Log (N/N0), en función del

tiempo de exposición, Figura 12.

Figura 12. Curvas eliminación de E. faecalis, evolución en el tiempo hasta 66 segundos Fuente: Autora Elaboración: Autora

Se fijan los ejes de la gráfica, donde “x”, corresponde al tiempo de exposición de

la bacteria en segundos y “y” la concentración de la bacteria resultante expresada

en logaritmo; es decir la eliminación de la bacteria, que indica que si la curva tiene

un mayor descenso, se ha eliminado mayor cantidad de bacterias.

Los puntos que se observan en la gráfica son los datos experimentales que se

obtuvieron según el tratamiento y tiempo de exposición; y las curvas, representan

el ajuste de los datos experimentales al modelo matemático de regresión

“logaritmo lineal + cola” de GInaFiT, que como su nombre lo indica, consta de dos

partes, la primera es la eliminación de la bacteria (curva lineal inclinada) y la

segunda es la concentración residual de la bacteria (curva horizontal).

37

El modelo adoptado fue el que mejor ajuste tuvo con respecto al coeficiente de

regresión lineal (R2) con valores entre 0,9919 – 0,9932.

De acuerdo a la gráfica se puede apreciar que el tratamiento más eficiente es

UV/H2O2(30ppm)/Fe3+(6ppm), debido a que su pendiente (celeste) presenta mayor

inclinación y descenso, inactivando aproximadamente a los 36 segundos 6

unidades logarítmicas (99,9999%), en donde posterior a este tiempo llega a un

estado constante donde la inactivación es casi nula. Comparando este tratamiento

con el de UV-C se puede observar que la curva de eliminación (verde), tiene menor

pendiente lo implica una reducción bacteriana mucho más lenta, por lo que tarda

más tiempo en obtener la concentración residual de la bacteria aproximadamente

55 segundos hasta volverse constante. De la gráfica podríamos concluir que la

adición de peróxido y hierro ayudan a mejorar la cinética de inactivación ya que

aumentan la pendiente y disminuyen los tiempos de exposición, pero se debe

tener en cuenta que para cada tratamiento hay un óptimo que permite llegar a

reducir el máximo de microorganismo E. faecalis.

3.3 Cinética de eliminación de E. faecalis

En la siguiente gráfica se observa las medias cinética de eliminación (s-1), entre

tratamientos, en función de la variación de UV y concentraciones de peróxido y

hierro aplicados, para E. faecalis, Figura 13.

38

Figura 13. Cinética de eliminación de E. faecalis Letras mayúsculas indican los grupos formados en base a las diferencias significativas obtenidas en el análisis ANOVA. Fuente: Autora

Las medias entre cinéticas de eliminación de cada tratamiento en la mayoría no

muestran diferencias significativas, ya que se encuentran muy próximas unas de

otras y las desviaciones típicas (líneas sobre las barras) en algunos tratamientos

son muy grandes, sim embargo hay un tratamiento que presenta mayor cinética y

deferencia significativa entre los demás.

La media de la cinética en el tratamiento UV, es la menor de todos los tratamientos

aplicados. En el tratamiento UV/H2O2 al añadir H2O2 y aumentar las

concentraciones entre 10, 20 y 30 ppm, si bien es cierto se logra un pequeño

aumento entre la media de la cinética pero sin embargo no presenta diferencia

significativa ni entre tratamientos ni en concentraciones. En el tratamiento

UV/H2O2/Fe3+ se logra determinar diferencia significativa al aplicar una

concentración de H2O2 30 ppm y Fe3+ 6 ppm. En los análisis realizados se puede

notar que las dispersiones entre las desviaciones típicas son considerables, esto

se debe al hecho que al trabajar con microorganismos estos tienen

comportamientos distintos y poca repetitividad entre tratamientos frente a un

39

análisis químico, por lo cual la variabilidad es mayor cuando se realiza este tipo

de estudios.

3.4 Análisis estadístico SPSS

El análisis ANOVA realizado para las medias cinéticas de los tratamientos

determina que existe diferencia significativa ya que el valor P o Sig obtenido es de

0,000, siendo menor que el valor del nivel crítico de 0,05, tal como se muestra en

la tabla 9.

Tabla 9. Resultados de Análisis de varianza (ANOVA) de un factor

A continuación los resultados del Análisis específico, Post hoc de Tukey,

Tabla 10, en el cual se realiza la comparación entre las medias cinéticas de

los tratamientos.

Tabla 10. Resultados del Análisis Post hoc de Tukey

El análisis de las diferencias de medias mediante la prueba de Tukey señala que

el tratamiento cuyas medias cumplen con el nivel de significación establecido

(

40

Seguidamente la clasificación en subconjuntos homogéneos realizado por el

método de Tukey, Tabla 11.

Tabla 11. Resultados de grupos que presentan valores de las medias

Se forman dos grupos en base a la media de cinética de los tratamientos. En el

primer subconjunto homogéneo se puede apreciar que los tratamientos UV,

UV/H2O2 de 10, 20 y 30 ppm, UV/H2O2(10ppm)/Fe3+(2ppm) y UV/H2O2(20ppm)/Fe3+(4ppm)

ppm tienen una media de cinética similar, que demuestra que a pesar de que se

aumente las concentraciones de H2O2 y Fe3+ en los rangos establecidos, no

existen diferencias significativa entre los tratamientos. El segundo subconjunto

muestra a UV/H2O2(30ppm)/Fe3+(6ppm) con un aumento en la media cinética,

concluyendo que se debería trabajar con concentraciones de Fe3+ más altas, para

mejorar la media cinética de los tratamientos y que exista diferencias significativas.

Comparando nuestros estudios con los realizados por (Ortega-Gómez et al., 2012)

sobre el efecto de la temperatura para la inactivación bacteriana de E. faecalis

mediante foto-Fenton, donde todos los experimentos se trabajaron una

concentración bacteriana inicial (106 CFU/ml) en solución salina estéril (NaCl, 9

gr/L) con 20 mg (Carbono orgánico disuelto) DOC/L de resorcinol, cámara de

lámpara solar con un detector UV-A rango de 320-400 nm e irradiación de luz UV-

Fuente y elaboración: Software estadístico SPSS

41

A 32 W/m2 a 120 min por cada tratamiento. Se usaron diferentes concentraciones

de peróxido de hidrógeno 30% en peso (20, 70 y 120 ppm) y 10 ppm de

heptahidrato de sulfato de hierro (II) (FeSO4 7H2O) como reactivo catalizador. Las

temperaturas a evaluar fueron de 10, 20, 30 y 40 °C.

Los resultados obtenidos determinaron la concentración óptima de inactivación

aplicando foto-Fenton con UV-A/Fe2+(10 ppm)/H2O2(120 ppm); además la constante

cinética, kmax, aumenta con la temperatura (0,11 – 0,27 min-1), siguiendo una

ecuación de tipo Arrhenius que permite predecir la tasa de desinfección en el

rango de temperaturas estudiadas; donde solo se necesitaron de 40 min a 40 °C

para eliminar las 6 unidades logarítmicas . Esto se debe a que a temperaturas

cercanas a 37 °C (temperatura óptima de crecimiento), la bacteria entra a su

actividad metabólica completa, y por lo tanto es más vulnerable al ataque de

radicales hidroxilo.

Paralelamente a los resultados obtenidos en esta investigación, como se observa

en la figura 11, donde foto-Fenton UV/H2O2(30ppm)/Fe3+(6ppm) logra una disminución

de 6 unidades logarítmicas en 36 segundos, con una cinética de eliminación, kmax

de 0,41 s-1, usando luz UV-C 254 nm e irradiación de 0,177 W/m2, concentraciones

e irradiación menores por mucho, en comparación al estudio evaluado. Por tanto,

el uso de luz UV-C como fuente de luz implica mayor efectividad en el proceso, en

contraste con UV-A; además las condiciones del aumento de temperatura, se

prestan para la aplicación en experimentos usando luz UV-C, donde el tiempo y

las concentraciones de trabajo pueden mejorarse obteniendo un tratamiento

óptimo para E. faecalis.

Otro estudio similar (Lanao, Ormad, Mosteo, & Ovelleiro, 2012), de Inactivación

de Enterococcus sp por fotólisis y fotocatálisis de TiO2 con H2O2 en agua natural,

donde todos los experimentos se trabajaron una concentración aproximada de

108CFU/100 ml, cámara solar con una lámpara de xenón y un filtro adicional para

aplicar longitudes de onda de luz UV-B (290 – 800 nm) y UV-A (320 – 800 nm)

con un rango de irradiación de 500 W/m2; la concentración de TiO2 fue de 1 g/L y

42

de H2O2 0.04 mM (1,36 ppm) y los tiempos máximos de irradiación fueron de 30

minutos con un recuento microbiológico cada 5 min para todos los experimentos.

Los resultados obtenidos aplicando luz UV-A, muestran que el tratamiento al

UV/H2O2(1,36 ppm), reduce una cantidad mínima de concentración bacteriana,

inactivando 0.4 unidades logarítmicas, UV/TiO2(1g/L) reduce 2,3 unidades log y por

último UV/TiO2(1 g/L)/H2O2(1,36 ppm) logra reducir 1.9 unidades logarítmicas.

Usando luz UV-B, los tratamientos UV/TiO2(1g/L) y UV/TiO2(1 g/L)//H2O2(1,36 ppm)

obtienen reducciones de 5.5 y 5.9 unidades log respectivamente; UV-B logra

reducir 7.6 unidades logarítmicas y UV/H2O2(1,36 ppm) alcanza 8.2 log; por ende la

irradiación de luz UV-B resulta mucho más efectivo en Enterococcus sp; sin

embargo el uso de TiO2 no logra obtener buenos resultados esperados, a pesar

de cambiar el tipo de luz.

Comparando con los resultados obtenidos de esta investigación, como ya se

mencionó el uso de luz UV-A no obtiene resultados satisfactorios y en este caso

para UV/TiO2 y UV/TiO2/H2O2, no es la excepción, donde la reducción logarítmica

es casi mínima (1,9 – 2,3) en 30 minutos; en comparación con tan solo el primer

tratamiento empleado en este estudio, UV-C reducción logarítmica de 6 unidades

logarítmicas en 55 segundos, como se observa en la figura 11. Sin embargo el

cambio de luz a luz UV-B, muestra resultados significativos, donde los

tratamientos UV/TiO2 y UV/TiO2/H2O2, reducen mayor cantidad de concentración

bacteriana, pero no son los resultados esperados, por tanto el uso de TiO2 como

reactivo catalizador no es apto para reducir la concentración bacteriana de

Enterococcus sp; pero cuando se aplica los tratamientos UV y UV/H2O2 reducen

(7-6 – 8,2) unidades log en 30 minutos, respectivamente. Estos resultados

favorables con luz UV-B, se pueden considerar para aplicar a foto-Fenton, usando

las concentraciones óptimas de esta investigación.

43

CONCLUSIONES

La caracterización de las aguas del Puerto Hualtaco y camaronera

permitieron determinar la presencia de microrganismos patógenos como

E. faecalis con 778,24 NMP/100 dentro de la camaronera y 3816,56

NMP/100 en el puerto; y Coliformes totales con 3816,56 NMP/100 en la

camaronera y 5522,32 NMP/100 en el puerto.

La inactivación de E. faecalis aplicando procesos oxidación avanzada UV,

UV/H2O2, y UV/H2O2/Fe3+ demostraron un alto grado de eficiencia en torno

a las condiciones de trabajo, donde todos los experimentos condujeron a

la inactivación de 4,9 – 6 unidades logarítmicas, respectivamente.

Los tratamientos UV-C, fotólisis UV-C/H2O2 (10, 20, 30) ppm y foto-Fenton

UV/H2O2(10ppm)/Fe3+(2ppm) y UV/H2O2(20ppm)/Fe3+(4ppm) probaron que la cinética

de eliminación a nivel estadístico, no tiene diferencia significativa, por

tanto, agregar cantidades de reactivo en rangos pequeños, no muestran

resultados característicos.

El tratamiento óptimo en nuestro estudio para este tipo de bacterias es UV-

C/H2O2/Fe3+ con una concentración de 30 ppm de H2O2 y 6 ppm Fe3+,

siendo el tratamiento que consigue inactivar 6 unidades logarítmicas

(99,999%) en 36 segundos.

La cinética de eliminación UV-C/H2O2(30ppm)/Fe3+(6ppm) es 0,413 s-1, cantidad

superior en cuanto a todos los demás tratamientos realizados en nuestro

estudio. En consecuencia, el tratamiento foto-Fenton es una opción

atractiva para realizar pruebas en una matriz de agua de mar real.

44

RECOMENDACIONES

En función de los resultados obtenidos se recomienda continuar la

investigación en este tema agregando concentraciones mayores tanto de

Peróxido (H2O2) y Hierro III (Fe3+) ya que en nuestro estudio no se pudo

realizar experimentación a estos niveles.

Probar con otra cepa bacteriana con características similares a E. faecalis

y evaluar la eficiencia de inactivación, a las condiciones trabajadas por este

estudio.

Probar la eficiencia de inactivación de E. faecalis en una matriz de agua

de mar real.

Para cada ensayo trabajar con todo el material esterilizado y equipos

calibrados.

Debido a que se realiza varios ensayos, se debe administrar correctamente

los extractos Agares.

Evitar el riesgo de contaminación exterior, cuando se realice las siembras

microbiológicas.

Eliminar los desechos microbiológicos, después de autoclave.

45

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