Agresividad MV y MVZ Stephane Meder Vincileoni, FMVZ, UNAM y FMV, Quebec, Canadá.
Raúl Rosadio, Ph.D FMV, UNMSM CONOPA - … · TESIS EJECUTADAS Y CONGRESOS Nivel Sustentadas Por...
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Toxinas α y β del Clostridium perfringens en Enterotoxemia de las alpacas Raúl Rosadio, Ph.D FMV, UNMSM Instituto CONOPA CONOPA
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Toxinas α y β del Clostridium perfringens en Enterotoxemia de las alpacas
Raúl Rosadio, Ph.DFMV, UNMSM
Instituto CONOPA
CONOPA
Producción alpaquera
1. Alta mortalidad
Enfermedades infecciosas: Enterotoxemia
2. Bajo índice de fertilidad
3. Inexistencia de un Programa Nacional de
Mejoramiento Genético
• Clostridium perfringens tipo A• Bacteria Gram positiva, anaerobia
tolerante, esporulante
• Animales afectados de 2 a 7 semanas de edad
• Brotes epizoóticos
• Muerte súbita • Postración• Convulsiones
• Lesiones enteritis hemorrágica y/o necrótica.
Enterotoxemia en alpacas
Enterotoxemia44%
Inanición17%
Nacidas muertas7%
5%
5%
4%3%
3%3%
3%
6%
MORTALIDAD NEONATAL EN ALPACAS PUNO (1982-1988)
n = 41,569
Enterotoxemia Inanición Nacidas muertas Muertas al nacer
Colibacilosis Accidentes Neumonias Cólicos
Distocia Hipotermia Otros
Las enterotoxemia afecta principalmente a animales de comunidades campesinas
Muy poco acceso a tecnologia
Muertes neonatales debido a enfermedadesinfecciosas fluctuan entre 40 y 70%.
Muestreos en comunidades Muestreos en empresas asociativas
En busca de animales enfermos
Obtener muestras patologicas
IDENTIFICACIÓN DEL Clostridium perfringens
Crecimiento en anaerobiosis
Morfología de la colonia en agar
sangre
Morfología microscópica y
afinidad a la Tinción Gram
Negatividad a la prueba de
catalasa
Actividad Lecitinasa
(Reacción de Nagler)
Capacidad de reducción de
sulfito
DIAGNOSTICO RAPIDO MOLECULAR
TIPIFICACION Y SUBTIPIFICACION:PCR MÚLTIPLE
β2
ι
ε
CPE
β
α
toxina
200CAAGCAATTGGGGGAGTTTAGCAGAATCAGGATTTTGACCA
CPB2LCPB2Rcpb2
293AAACGCATTAAAGCTCACACCCTGCATAACCTGGAATGGCT
CPILCPIRiap
396TGGGAACTTCGATACAAGCATTAACTCATCTCCCATAACTGCAC
CPETXLCPETXRetx
506GGGGAACCCTCAGTAGTTTCAACCAGCTGGATTTGAGTTTAATG
CPELCPERcpe
611TCCTTTCTTGAGGGAGGATAAATGAACCTCCTATTTTGTATCCCA
CPBLCPBRcpb
900AGTCTACGCTTGGGATGGAATTTCCTGGGTTGTCCATTTC
CPA5LCPA5Rcpa
Longitud del producto amplificado (pb)
Secuencia5´ 3´IniciadoresGen
β2
ι
ε
CPE
β
α
toxina
200CAAGCAATTGGGGGAGTTTAGCAGAATCAGGATTTTGACCA
CPB2LCPB2Rcpb2
293AAACGCATTAAAGCTCACACCCTGCATAACCTGGAATGGCT
CPILCPIRiap
396TGGGAACTTCGATACAAGCATTAACTCATCTCCCATAACTGCAC
CPETXLCPETXRetx
506GGGGAACCCTCAGTAGTTTCAACCAGCTGGATTTGAGTTTAATG
CPELCPERcpe
611TCCTTTCTTGAGGGAGGATAAATGAACCTCCTATTTTGTATCCCA
CPBLCPBRcpb
900AGTCTACGCTTGGGATGGAATTTCCTGGGTTGTCCATTTC
CPA5LCPA5Rcpa
Longitud del producto amplificado (pb)
Secuencia5´ 3´IniciadoresGen
Extracción de ADN
PCR Múltiple
Visualización
Electroforesis
• Patogenia no bien ENTENDIDA.
• Transición alimentaria: leche a forraje– Disbiosis intestinal ---> Proliferación de C. perfringens
• En los 50´s se propuso a la toxina alfa: Cp-PLC (C. perfringens PhosphoLipase C) como factor de virulencia responsable (Moro, 1950).
• En los 80´s la CPE (C. perfringensenterotoxin) fue descrita como la toxina causante de la enfermedad (Ramirez, 1985)
• Recientes estudios moleculares muestran la ausencia del gen cpe (Pérez, 2006).
• Todos los aislamientos poseen el gen cpacodificante la Cp-PLC (Pérez, 2006).
CONCEPTOS ETIOPATOGENICOS
Purificación de la Cp‐PLC
Saturado al 50% con (NH4)2SO4Centrifugado 15 000 x g durante 30 ´
Ajustado a pH 5.5
Sobrenadante ELIMINADO
PRECIPITADO AL 50% Resuspendido y dializado en Tris-HCl 50mM
Sobrenadante saturado al 85% con (NH4)2SO4Centrifugado 15 000 x g durante 30 ´
PRECIPITADO AL 85% Resuspendido y dializado en Tris-HCl 50mM Sobrenadante saturado al 100 % con (NH4)2SO4
Centrifugado 15 000 x g durante 30 ´
PRECIPITADO AL 100% Resuspendido y dializado en Tris-HCl 50mM
CULTIVO BACTERIANO DE C. perfringens3 L medio BHI, inoculados al 1%
EXTRACTO CRUDOSobrenadante de cultivo
Cp‐PLC (Toxina alfa)
Actividades biológicas:
LECITINASA
LETALIDAD
MIOTOXICA
HEMOLÍTICA
CITOTÓXICA
AGREGACIÓN PLAQUETARIA
ALTERACIONES SISTEMICAS
Caracterización Toxigénica de Cp‐ PLC
ACTIVIDAD HEMOLITICA (Titball et al., 1999)
• Solución de eritrócitos de carnero al 1% en Buffer Borato Isotônico (pH 7.5)
INCUBACION
37° C durante 1hora4° C durante 1 horaHEMOLISIS Hot Cold
Centrifugación2 000 x g/min /4° C
50 μLSolucioneritrocitos
150 μLH2O 100 μL
muestras
100 μLSolucion deeritrocitos
MUESTRA50% Hemolisis
LECTURAOD550nm
La actividad hemolítica fue expresada como unidades arbitrarias hemolíticas (u.a.h.) por mililitro y correspondió a la dilución en la
cual resulto un incremento do 50% de hemólisis
DILUCIONES1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024
50% turbidez
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
ACTIVIDAD LETAL:
Caracterización Toxigénica de la Cp‐PLC
ACTIVIDAD CITOPATICA:
Caracterización Toxigénica de Cp‐PLC Células Hep
0 u.a.y./mL
25.6 u.a.y./mL
12.8u.a.y./mL
6.4u.a.y./mL
3.2u.a.y./mL
1.6u.a.y./mL
EFECTO CITOTOXICO EFECTO CITOPATICO
EFECTO CITOPATICOEFECTO CITOPATICOEFECTO CITOPATICO
NORMALES
4. Caracterización Toxigénica de Cp‐ PLC
ACTIVIDAD ENTEROTOXICA• Prueba de asa intestinal ligada en conejos
TRATAMIENTOAntiparasitarios y restriccion alimenticia
PRE‐ANESTESIA Y ANESTESIA
OPERATORIOPreparación de asas intestinales ligadas e Inoculacion de muestras
1. Acumulación de Fluido intestinal2. Cambios macroscópicos3. Cambios microscópicos
ACTIVIDAD ENTEROTOXICA
AIL
AIL
AIL
E. ACTIVIDAD ENTEROTÓXICA:
Caracterización Toxigénica de la Cp‐PLC
0 u.a.y./mL
32 u.a.y./mL
16u.a.y./mL 4
u.a.y./mL
PREPARACION DE SOBRENADANTES BACTERIANOS
CULTIVO BACTERIANOaislados reactivados inoculados en
Caldo BHI al 1%
INCUBACION37° C durante bajo anaerobiosis
SOBRENADANTECentrifugación 13 000 x g/ 10 min/4° C
CONSERVACIÓN Suplementado con PMSF 1mM y
almacenado a ‐20° C
Caracterización Toxigénicade los Aislados C. perfringens Asociados a su Capacidad de Producción de Cp‐PLC
ESTADO BACTERIANOColoración Gram
ESTADO VEGETATIVO
ESTADO ESPORULADO
Actividade lecitinasa
(u.a /mL)=
OD 620nm (MUESTRA) ‐ OD 620nm (BLANCO)
OD 620nm (BLANCO)
INCUBACIÓN37° C durante 3 horas
Lectura OD620nmCapacidad de producción de Cp‐PLC:
BAJA : < 1 u.a./mL
MEDIANA : 1 a 3 u.a./mL
• ALTA : > 3 u.a./mL
ACTIVIDAD LECITINASA‐ Método Directo
• Emulsión yema de huevo al 10% en PBS
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Muestras1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11Blanco
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Caracterización Toxigénicade los Aislados C. perfringens Asociados a su Capacidad de Producción de Cp‐PLC
100 μLemulsion
MUESTRABLANCO
100 μLBHI 100 μL
muestra
100 μLemulsion
Caracterización toxigénicade los aislados de C. perfringens de casos de enterotoxemia en alpacas
NUEVA CODIFICACIÓN AISLADO
AISLADO ESTADO BACTERIANO GENOTIPO SUBTIPOCAPACIDAD DE
PRODUCCION DE Cp‐PLC 3
Ev‐1a L1‐2008 Vegetativo A cpe‐cpb2‐ ALTAEv‐2a L21‐2008 Vegetativo A cpe‐cpb2‐ ALTAEv‐3a L24‐2008 Vegetativo A cpe‐cpb2‐ ALTAEv‐4a L26‐2008 Vegetativo A cpe‐cpb2‐ ALTAEv‐5a DA6‐2008 Vegetativo A cpe‐cpb2‐ ALTAEv‐1m L10‐2008 Vegetativo A cpe‐cpb2‐ MEDIANAEv‐2m L12‐2008 Vegetativo A cpe‐cpb2‐ MEDIANAEv‐3m DA3‐2008 Vegetativo A cpe‐cpb2‐ MEDIANAEv‐1b A4‐2006 Vegetativo A cpe‐cpb2‐ BAJAEv‐2b L22‐2008 Vegetativo A cpe‐cpb2‐ BAJA
Ev(β2)‐1b 19‐2005 Vegetativo A cpe‐cpb2+ BAJAEv(β2)‐2b A17‐2006 Vegetativo A cpe‐cpb2+ BAJAEs‐1b 41‐2005 Esporulado A cpe‐cpb2‐ BAJAEs‐2b A8‐2005 Esporulado A cpe‐cpb2‐ BAJAEs‐3b P4b‐2007 Esporulado A cpe‐cpb2‐ BAJAEs‐4b P9b‐2007 Esporulado A cpe‐cpb2‐ BAJAEs‐5b PH1b‐2007 Esporulado A cpe‐cpb2‐ BAJAEs‐6b A1a‐2007 Esporulado A cpe‐cpb2‐ BAJAEs‐7b A12a‐2007 Esporulado A cpe‐cpb2‐ BAJAEs‐8b C13b‐2007 Esporulado A cpe‐cpb2‐ BAJA
Es(β2)‐1m 15‐2005 Esporulado A cpe‐cpb2+ MEDIANAEs(β2)‐1b 18‐2005 Esporulado A cpe‐cpb2+ BAJAEs(β2)‐2b 25‐2005 Esporulado A cpe‐cpb2+ BAJAEs(β2)‐3b A13b‐2007 Esporulado A cpe‐cpb2+ BAJA
CAPACIDAD DE PRODUCCION DE Cp‐PLC
Los C. perfringens aislados de casos de enterotoxemia en alpacas poseen diferentes capacidades de producción de Cp‐PLC in vitro sin aparente relación a características
toxigénicas
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
BAJA MEDIANA ALTA
Pcrcen
tajes
Niveles de producción de toxina alfa
Distribución de genotipos y subtipos de 307 cepas de C. perfringens aislados de alpacas muertas por enterotoxemia
(años 2005-2008)
CUSCO
(n = 50)
GENOTIPO A48 cepas (96%)
GENOTIPO A β21 cepa (2%)
GENOTIPO C1 cepa (2%)
PUNO
(n = 200)
GENOTIPO A185 cepas (92.5%)
GENOTIPO A β215 cepas (7.5 %)
HUANCAVELICA
(n = 5)
GENOTIPO A:5 cepas (100 %)
AREQUIPA
(n = 52)
GENOTIPO A49 cepas (94.2%)
GENOTIPO A β23 cepas (5.8 %)
TOXINA ALFATOXINA BETA2
NO ENTEROTOXINA
Productos de investigación
• C. perfringens, Tipo A principal agente de la enfermedad– Toxina es la más prevalente– Presencia de toxina secundaria: 2 (10%)
– Toxina cpe, al parecer, no implicada en la patogénesis
• Prueba diagnóstica rápida para toxinotipificación clostridial
• Posibilidad de desarrollar vacunas
ENTEROTOX ALPACA (Bacterina & toxoide): Vacuna Multivalente disponible para CSA en el Peru
TIPO ORIGEN
A (30%)
A(β2) (30%)
B (20%)
C (10%)
D (10%)
Alpaca
Alpaca
ovino
Alpaca
Ovino
APLICACIÓN PRÁCTICA DE ENTEROTOX ALPACA EN EL CAMPO
Índices de mortalidad neonatal total (IMNT) y mortalidad neonatal debido a enterotoxemia (IMNE) durante los años 2000‐2006 (En prensa).
Año Crías nacidas IMNT IMNE IC
N % % al 95 %
2000 3224 37.41 19.45 0.18 – 0.21
2001 2952 25.17 7.18 0.06 – 0.08
2002 2647 23.72 9.10 0.08 – 0.10
2003 2760 9.38 0.98 0.00 – 0.01
2004 2600 12.1 0.12 0.00 – 0.01
2005 2470 15.1 2.1 0.03 – 0.04
2006 2326 14.3 3.9 0.04 – 0.06
PRODUCTOS DE LA INVESTIGACION
1. La Cp.PLC parcialmente purificada posee in vitro actividades hemolíticas, agregación plaquetaria y citotóxicas para células Hep2; enterotoxicas en inoculaciones intraintestinales en conejos y moderada a severa letalidad en ratones.
2. Extractos crudos de C. perfringens aislados de casos de enterotoxemia en alpacas poseen diferentes capacidades de producción de Cp‐PLC in vitromostrando, principalmente las cepas de mediana y alta producción, moderadas capacidades hemolíticas, citotóxicas y ligeras actividades enterotoxicas pero nula capacidad letal en ratones.
3. Las formas nativas de Cp‐PLC no participaría exclusiva y directamente en la producción de lesiones entéricas compatibles con las descritas en enterotoxemia de alpacas.
4. La enterotoxemia de la alpaca, aparentemente, es una entidad compleja asociada a posibles interacciones patogénicas.
MADRE NO VACUNADA
TEMPRANO CONSUMO DE FORRAJES
C. perfringens AMBIENTE
INGRESO DEL C. perfringens AL INTESTINO
BAJOS NIVELES DE ANTICUERPOS PROTECTIVOS EN CRIAS
POBRE TOMA DE CALOSTRO (CRIA)
PROLIFERACION Y PRODUCCION DE TOXINAS (C. perfringens)
DAÑO INTESTINAL
ABSORCION DE TOXINAS (TOXEMIA)
COLICOS
MUERTE
ENTEROTOXEMIA EN ALPACAS
COINFECCIÓN E. MAC
y/O CEPAS PATÓGENAS DE E. COLI?
CAMBIOS EN LA FLORA Y pH INTESTINAL
Identificación E. macusaniensis: 108 muestrasintestinales de crías afectadas por Enterotoxemia
2005 2006 2007 2008 Total
Muestras (n)
E. mac (n)
E. mac (%)
28
09
32.1
19
05
26.3
40
15
33.3
21
04
19.0
108
33
30.6
Eimeria macusaniensis associated lesions in neonate alpacas dying from enterotoxemiaRosadio et al., Vet Parasitology 2010
Eimeriosis en Alpacas
E. punoensisE. LamaeE. alpacae
E. macusaniensisE. ivitaensis
Productos de Investigación
• Coinfección coccidial posible factor desencadenante– E. mac, E. ivitaensis?
• Presencia de algunas cepas E. coli virulentas:– EHEC (Shiga toxinas)?
• Virus?
Tratamiento estratégicoAnticoccidial
• Toltrazuril (Anticox 5%)
• 4 ml para crías de 10 kg
• Prevención y/o tratamiento
Formación de investigadores jóvenes
TESIS EJECUTADAS Y CONGRESOS
Nivel Sustentadas Por sustentarse
Pre‐grado 2 2
Pos‐grado 3 2
Nacionales 4
Internacionales 4
PUBLICACIONES
TIPO PUBLICADAS POR PUBLICARSE
Indexadas internacionales 03 02
Arbitradas nacionales 02 06
Difusión 03 02
Publicaciones InternacionalesVeterinary Parasitology, 2010
Small Ruminant Research Journal, 2011
ESTUDIO DE TOXINAS DE Clostridium perfringens INVOLUCRADAS EN ELDESARROLLO DE LA ENTEROTOXEMIA DE CRÍAS DE ALPACAS – Nº 008‐FINCyT‐PIBAP‐2007
IDENTIFICACIÓN Y SELECCIÓN DE MARCADORES MOLECULARES DE RESISTENCIA GENÉTICA A ENTEROTOXEMIA Y NEUMONÍA EN CRÍAS DE ALPACAS” ‐ Nº 2006–00286‐AG‐INCAGRO/FDSE
CONOPA
