Radicales libres Bioquimica

Prof. Alfonso R. Bravo Henríquez. 2014.

y Antioxidantes

Se consideran RL aquellas moléculas que en su estructura atómica presentan un electrón desapareado o impar en el orbital externo, dándole una configuración espacial que genera una alta inestabilidad. Son moléculas resultantes del rompimiento homolítico de un enlace químico.

¿Qué es un Radical Libre ?¿Qué es un Radical Libre ?

• Ruptura Homolítica:

• Ruptura Heterolítica:

Radicales de Carbono

Carbanión Carbacatión

y Antioxidantes¿Qué es un Radical Libre ?¿Qué es un Radical Libre ?

Es una entidad química que contrario a la normal tendencia espontánea de los electrones localizados en los átomos y moléculas a la formación de parejas, uno de estos se encuentra desapareado.

¡ No confundir un ¡ No confundir un RadicalRadical con un con un IónIón ! !

+

+


y AntioxidantesLas especies reactivas de Oxígeno (ERO):Las especies reactivas de Oxígeno (ERO):El término ERO describe los productos del oxígeno que no es utilizado para la síntesis de ATP.

• Radicales libres del oxígeno (RLO)

• Intermediarios reactivos del oxígeno (IRO)

Anión superóxido (O2.-)

Radical hidroxilo (OH.)Radical peroxilo (RO2

.)Radical alcoxilo (RO.)

Peróxido de hidrógeno (H2O2)Ácido hipocloroso (HOCl)Oxígeno singlete (1O2)Ozono (O3)

Orbital externo(6 e-)

Protones (+)

Orbital interno(2 e-)

Átomo de Oxígeno (O)


y AntioxidantesLas especies reactivas de Oxígeno (ERO):Las especies reactivas de Oxígeno (ERO):El oxígeno molecular (O2) es un birradical, ya que tiene 2 e- no apareados en su orbital externo, ambos con el mismo giro paralelo, impidiendo que capte 2 e- simultáneamente en las reacciones que interviene. El oxígeno solo puede intervenir en reacciones univalente y aceptar los e- de uno en uno.

O2 + 4H+ + 4e- → 2H2O

e- e- + 2H+ e- + H+ e- + H+

O2 → O2.- → H2O2 → OH. + H2O → H2O

e- = electrónH+ = hidrogenionesO2

.- = radical anión superóxido

H2O2 = peróxido de hidrógeno

OH. = radical hidroxiloH2O = agua


y AntioxidantesLas especies reactivas de Oxígeno (ERO):Las especies reactivas de Oxígeno (ERO):

Estados energéticos del oxígeno molecular



Células inflamatorias activadas

Xantina oxidasa, transporte de e- interrumpido

Hemo proteínas



Reacción de Fenton

Si sumamos y tenemos:

Reacción de Haber-Weiss


y AntioxidantesFuentes biológicas de ERO:Fuentes biológicas de ERO:

La sangre cumple la función de transportar el OXÍGENO desde los pulmones hasta los tejidos, y es aquí donde este actúa como sustrato en diversas reacciones bioquímicas intracelulares, resultando en una gran producción de H2O2 y superóxido, entre otras ERO.

• Fuentes Endógenas

• Fuentes Exógenas



Radical libre Radical

libre

Radical libre

Fuentes Endógenas Fuentes Exógenas

Cadena respiratoria

Enzimas oxidativas (xantina oxidasa)

Células fagocíticas (sistema inmune)

Alimentos

Contaminación atmosférica

Humo del cigarrillo

Medicamentos (paracetamol)

Radicales libres



• La Mitocondria

Cadena respiratoria



• En Células Hepáticas (Retículo Endoplasmático)

Reacción del Citocromo P450+



Ej.: Oxidación del Paracetamol

+ Paracetamol

Enlace covalente

Paracetamol

Oxidación(Citocromo P450)

Droga

Conjugación(Glucuronidación, etc.)

Conjugación

Metabolito Aductos estables

Especies no polares

Especies polares

Eliminación renal(orina)

Eliminación biliar(intestino)


y Antioxidantes

ISQUEMIA

ATP

Adenosina

AMP

ADP

Inosina

HipoxantinaXO

Xantina + H2O + O2

Calpaina

XDH

ACTIVACION DE PROTEASAS INTRACELULARES DEPENDIENTES

DE CALCIO

Ca2+ citosólico

XOAcido úrico + 2O2

.- + 2H+

Fuentes biológicas de ERO:Fuentes biológicas de ERO:• Reacción de la Xantino oxidasa

Aldehído oxidasaTriptófano dioxigenasaIndolamina dioxigenasaCiclooxigenasaLipooxigenasa

Otras enzimas que producen RL:


y AntioxidantesFuentes biológicas de ERO:Fuentes biológicas de ERO:• Los Leucocitos PMN y Macrófagos

Peróxido de hidrógeno

Radical hidroxilo

Ácido hipocloroso

Oxígeno singlete

Anión superóxido

En los procesos inflamatorios están muy activas las siguientes enzimas:

NADPH oxidasa y Mieloperoxidasa (MPO)


y AntioxidantesEnfermedades relacionadas con los RL:Enfermedades relacionadas con los RL:

Radical libre Radical

libre

Radical libre

Daño inflamatorio inmune

Cáncer

Reacciones inducidas por drogas

(hígado, riñón)

Formación de cataratas

Procesos de envejecimiento

Reperfusión después de isquemia

Aterosclerosis

Radicales libres


y AntioxidantesEnfermedades relacionadas con los RL:Enfermedades relacionadas con los RL:


y AntioxidantesDaños producidos por los RL:Daños producidos por los RL:El radical HIDROXILO (OH•) por ejemplo es muy inestable y reactivo, con una enorme capacidad para combinarse inespecíficamente en la mayoría de los casos, así como con la diversidad de moléculas de la estructura celular: lípidos, carbohidratos, proteínas, ácidos nucleicos y sus derivados.

OH•Prof. Alfonso R. Bravo Henríquez. 2014.

y AntioxidantesDaños producidos por los RL:Daños producidos por los RL:

Producción de RL

O2.-, H2O2

OH.

Peroxidación lipídica Modificación de las bases del ADN Daño a proteínas

Daño tisular

Fuentes ambientales• Humo del cigarrillo• Contaminantes• Luz UV• Radiaciones ionizantes• Xenobióticos

Fuentes endógenas• Mitocondrias• Estallido respiratorio• Reacciones enzimáticas• Reacciones de autooxidación

Metales de transiciónFe2+, Cu+


y AntioxidantesPeroxidación de lípidos:Peroxidación de lípidos:

1 Iniciación

2 Propagación

3 Terminación

4 Regeneración de la vitamina E

Vitamina C



Malondialdehído Endoperóxido Hidroperóxido

1)Iniciación

2)Propagación

3)Terminación

1)

2)3)

Dieno conjugadoÁcido graso

poliinsaturado (PUFA)

OH.

RL del PUFA

Radical peróxiloH

Otro PUFA !

Otro RL P

UFA !



Daño a membranas celulares

Shock osmótico

Muerte celular



LDL oxidada

LDL modificada

Aterogénesis

LDL nativa


y AntioxidantesMetabolismo de Lipoproteínas


y AntioxidantesEsquema de la ATEROGÉNESIS


y AntioxidantesEsquema de la ATEROGÉNESIS

Monocitos circulantes

Monocitos residentes

Macrófagos


y AntioxidantesLu

men

Pare

d va

scul

ar

Endotelio

Esquema de la ATEROGÉNESIS

Monocito

Lipoproteínas modificadas

LDLnativa

Células musculares lisas

Captación porreceptores scavenger

Formación de células

espumosas

MacrófagoActivación

celular

Daño

Moléculas de adhesión

(VCAM-1)

MCP-1

Engrosamiento de la placa


y AntioxidantesATEROGÉNESIS


y AntioxidantesOxidación de Azúcares (Glicoxidación):Oxidación de Azúcares (Glicoxidación):

Glucosa Enediol

H2O2

(Radical libre)

HO

Fe2+Fe3+

+ OH-

Radical del anión

de enediol

.

-


y AntioxidantesOxidación de Azúcares (Glicoxidación):Oxidación de Azúcares (Glicoxidación):

Glioxal y metilglioxal son agentes propagadores H


y AntioxidantesGlicosilación:Glicosilación: Se pueden glicosilar:

• Hemoglobina

• Enzimas antioxidantes

Pérdida de función o inactivación

Consecuencias:


y AntioxidantesDaño oxidación al ADN:Daño oxidación al ADN:



Bases Nitrogenadas Azúcares


Formación del ÓXIDO NÍTRICO:Formación del ÓXIDO NÍTRICO:

NADPH

O2

½NADPH

O2

+

L-arginina L-hidroxi-arginina L-citrulina

La reacción es catalizada por las enzimas ÓXIDO NÍTRICO SINTASAS (NOSs), únicas que requieren simultáneamente de 5 cofactores/grupos prostéticos: FAD, FMN, hemo, (BH4) y Ca2+- (CaM).

No. de residuosLocalización Subcelular

Regulación

1429-1433 Principalmente soluble (cerebro); principalmente particulada (músculo esquelético)

Ca2+/CaM

1144-1153 Principalmente soluble Citoquina inducible; Ca2+ independente

1203-1205 Principalmente particulada Ca2+/CaM

Enzima

nNOS

iNOS

eNOS

GenTipo

NOS1 Constitutiva

NOS2 Inducible

NOS3 Constitutiva

·N=O

y Antioxidantes


Formación del ÓXIDO NÍTRICO:Formación del ÓXIDO NÍTRICO:

NR = Nitrato Reductasa

Reacción importante en la industria de alimentos (productos cárnicos) por la formación de nitrosomioglobina.

y Antioxidantes


Funciones del ÓXIDO NÍTRICO:Funciones del ÓXIDO NÍTRICO:

Funciones asociadas con:

• Relajación del músculo liso

• Neurotransmisión

• Inhibición plaquetaria

• Anti-inflamación (IL10)

Proteína quinasa G (PKG)Fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos (PDE2, PDE3)Canales iónicos

El NO es un potente vasodilatador

Parece tener una función especialmente relevante en el cerebro, en el sistema vascular y en el sistema inmune.

y Antioxidantes


El NO puede actuar también a través de la nitrosilación de ciertas proteínas, de la interacción con metales de transición u otros radicales libres, de la modificación directa del DNA, etc.

·N=O

y AntioxidantesFunciones del ÓXIDO NÍTRICO:Funciones del ÓXIDO NÍTRICO:


Metabolismo Oxidativo de la HOMOCISTEÍNA:Metabolismo Oxidativo de la HOMOCISTEÍNA:

Homocisteína Homocisteína-homocisteína disulfuro(Homocistina)

+ O22 H2O2+ O2.-

Elevados niveles de Homocisteína en sangre se han asociado con:

• Aterosclerosis • Trombosis venosa• Defectos del tubo neural• Infartos de placenta• Abortos inexplicados• Daño celular endotelial• Daño oxidativo• Promoción de trombogénesis• Regulación alterada de la vasoconstricción• Estimulación de la proliferación celular del músculo liso

Muerte celular

GSH Catalasa

Otros antioxidantes

Replicación del ADN

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AntioxidantesAntioxidantesSon sustancias que cuando están presentes retardan o inhiben la oxidación de sustratos susceptibles al ataque de las EROs.

La acción del ANTIOXIDANTE es de sacrificio de su propia integridad molecular para evitar alteraciones de moléculas (lípidos, proteínas, ADN, etc.) funcionalmente vitales o más importantes.

y Antioxidantes


y Antioxidantes


Clasificación de los ANTIOXIDANTESOrigen Acción

1. Exógenos

Vitamina E - Neutraliza el oxígeno singlete- Captura radicales libres hidroxilo- Captura O2

.-

- Neutraliza peróxidos

Vitamina C - Neutraliza el oxígeno singlete- Captura radicales libres de hidroxilo- Captura O2

.-

- Regenera la forma oxidada de la vitamina E

Betacarotenos Neutraliza el oxígeno singleteFlavonoides, Licopenos

2. Endógenos

Enzimáticos CofactorSuperóxido dismutasa (SOD) Cobre, zinc, manganesoCatalasa (CAT) HierroGlutatión peroxidasa (GPx) Selenio

No enzimáticosGlutatión Barreras fisiológicas que enfrenta el oxígeno a su

paso desde el Coenzima Q hasta las células

y Antioxidantes


Sistemas de defensa antioxidante:Sistemas de defensa antioxidante:

y Antioxidantes

PRIMER NIVEL:

Consiste en evitar la reducción univalente del O2 mediante sistemas enzimáticos capaces de efectuar la reducción tetravalente consecutiva sin liberar los intermediarios parcialmente reducidos. Esto se logra con la Citocromo Oxidasa.

Existen 5 niveles de defensa antioxidante.


y Antioxidantes

SEGUNDO NIVEL:

Enzimas especializadas en captar el radical anión superóxido (O2.-).


Superóxido Dismutasa (SOD)

Puede ser dimérica o tetramérica. Se conocen tres formas de SOD según el metal que utilizan como cofactor: CuZn-SOD, Mn-SOD y Fe-SOD.

2 O2.- + 2 H+ H2O2 + O2

SOD


y Antioxidantes

TERCER NIVEL:

Enzimas que neutralizan el peróxido de hidrógeno. Entre ellas está la Catalasa, que se encuentra en los peroxisomas y que catalizan la reacción de dismutación siguiente:


Catalasa (CAT)

2 H2O2 2 H2O + O2

CAT

Es tetramérica y contiene un núcleo de hierro como grupo hemo unido a cada cadena polipeptídica.


y Antioxidantes

TERCER NIVEL:

Enzimas que neutralizan el peróxido de hidrógeno. Entre ellas está la Glutatión Peroxidasa que catalizan la siguiente reacción:


Glutatión Peroxidasa (GPX)

Es tetramérica, cada unidad contiene un residuo de selenocisteína. Se conocen 5 isoenzimas: GPX citosólica ó mitocondrial (GPX1), GPX2 citosólica (o GPX-G1) y la GPX3 extracelular (o GPX-P), la GPX4 (PHGPX o fosfolípido hidroperóxido GPX), GPX5, que es independiente de selenio.

H2O2 + 2 GSH GSSG + 2 H2OGPX


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TERCER NIVEL:


La Glutatión Peroxidasa (GPX) también puede neutralizar hidroperóxidos lipídicos.

ROOH + 2 GSH ROH + GSSG + H2OGPX

La molécula de glutatión oxidada (GSSG) es regenerada a la forma reducida (GSH) en otra reacción catalizada por la enzima Glutatión Reductasa (GR).

GRHidroperóxido lipídico

Alcoxilo del ácido graso


y Antioxidantes


TERCER NIVEL:


y Antioxidantes


INTEGRACIÓN DEL SEGUNDO/TERCER NIVEL:


y Antioxidantes


IMPORTANCIA DEL GLUTATIÓN:


y Antioxidantes


IMPORTANCIA DEL GLUTATIÓN:

GSH en diabetes


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PAPEL DE LOS MINERALES EN LAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES:

Mn3+ + O2•- Mn2+ + O2

Mn2+ + O2•- + 2H+ Mn3+ + H2O2

H2O2 + Fe(III)-E → H2O + O=Fe(IV)-E

H2O2 + O=Fe(IV)-E → H2O + Fe(III)-E + O2

Los minerales actúan como cofactores enzimáticos, participando activamente en reacciones de oxido-reducción.

En la Superóxido dismutasa: En la Catalasa:


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CUARTO NIVEL:

El radical libre puede ser neutralizado por la vitamina E o alfa-tocoferol, un antioxidante efectivo que por su hidrofobicidad se encuentra en las membranas biológicas donde su protección es particularmente importante.


Radical libre Tocoferoxilo(vitamina E oxidada)

Alfa-Tocoferol(vitamina E)



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CUARTO NIVEL:

La vitamina C o ácido ascórbico es un agente reductor o donador de electrones y puede reacciona rápidamente con el radical libre.


Ácido ascórbico(Vitamina C)

Ácido Ascórbico

(Vitamina C)

Dehidroascorbato(Vitamina C oxidada)

Dehidroascorbato reductasa

(Glutatión reducido)(Glutatión oxidado)2


y Antioxidantes


Radical libre Tocoferoxilo(vitamina E oxidada)


Vitamina C(reducida)

CUARTO NIVEL:

La vitamina C también permite la regeneración de la vitamina E.

Vitamina C(oxidada)

(Glutatión reducido)2 GSH

GSSG(Glutatión oxidado)


y Antioxidantes

Sistemas de defensa antioxidante:Sistemas de defensa antioxidante:CUARTO NIVEL:

Radical peroxilo


y Antioxidantes

QUINTO NIVEL:

Una vez producido el daño molecular, existe un quinto nivel de defensa que consiste en la REPARACIÓN. Los RL pueden inducir mutagénesis, pero existen mecanismos enzimáticos de reparación del DNA que permiten restablecer la información genética. También los PUFAs peroxidados pueden ser eliminados para reparar los fosfolípidos lesionados.


Fosfolipasa A2

PUFA peroxidado


y Antioxidantes

Los antioxidantes más importantes son:

La Vitamina CLos Beta-carotenosLos flavonoidesLa Vitamina EEl selenioEl cobreEl cincEl manganeso

Los antioxidantes en los alimentos: Los antioxidantes en los alimentos:


El desbalance entre la producción de EROS y la defensa antioxidante provoca un daño orgánico conocido como ESTRÉS OXIDATIVO, que lleva a una variedad de cambios fisiológicos y bioquímicos los cuales ocasionan el deterioro y muerte celular.

ESTRÉS OXIDATIVO

y Antioxidantes

Antioxidantes Prooxidantes


ESTRÉS OXIDATIVO BIOMOLÉCULAS MÉTODOS

Lípidos QuimioluminiscenciaMDA (malondialdehído)Dienos conjugadosPeróxidosPentano, etano

Proteínas Compuestos carbonilosGrupos sulfhidrilosFragmentación de proteínasActividad de enzimasGrupo aminos libres

ADN Bases modificadas (8-OxoG)

y Antioxidantes

El estrés oxidativo se puede medir mediante Métodos Directos e Indirectos.


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