QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL...El presente proyecto se desarrolló en el Laboratorio de...

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Efecto del resveratrol sobre la toxicidad

espermática inducida por cadmio en

ratones

PROYECTO DE INVESTIGACION (CURRICULAR)

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL

PRESENTA

AGLAE PAOLA CAÑAS PÉREZ

ASESOR: M. en C. GERARDO N. ESCALONA

CARDOSO

COASESORA: Dra. NORMA PANIAGUA CASTRO

México, D.F. 2014

El presente proyecto se desarrolló en el Laboratorio de Farmacología

del Desarrollo del Departamento de Fisiología de la ENCB, Campus

Zacatenco.

Bajo la dirección de

M. en C. Gerardo Norberto Escalona Cardoso y

Coasesoría de

Dra. Norma Paniagua Castro.

Índice General

Pág.

i. Abreviaturas i

ii. Índice de Tablas y Figura iii

I. INTRODUCCIÓN 1

1. Espermatogénesis 1

1.1 Fases de la espermatogénesis 2

1.1.1 Espermacitogénesis 2

1.1.2 Espermiogénesis 4

1.2 Factores que afectan la espermatogénesis 6

1.3 Anormalidades de los espermatozoides en humano 7

1.4 Espermatogénesis en el ratón 8

2. Cadmio 10

2.1 Efectos adversos 11

2.2 Efectos del cadmio en el sistema reproductor masculino 11

2.3 Mecanismos tóxicos del cadmio 12

2.4 Especies reactivas del oxigeno 12

2.5 Estrés oxidativo

2.6 Lipoperoxidación

2.7 Antioxidantes

2.7.1 Enzimas antioxidantes

2.7.2 Antioxidantes no enzimaticos

13

13

15

15

15

3. Resveratrol 15

II. JUSTIFICACIÓN 18

III. HIPÓTESIS 18

IV. OBJETIVOS

General 18

Específicos 18

V. MATERIAL 19

VI. METODOLOGÍA 20

VII. RESULTADOS 23

VIII. DISCUSIÓN

IX. CONCLUSIONES

32

36

X. BIBLIOGRAFÍA

XI. ANEXO

37

41

Página i

I. Abreviaturas

Ad

Ap

ANOVA

Cd

CdCl2

CMC

CdS

DNA

EG

ERO

FSH

g

HDL

H2O2

kg

L

LDL

LPO

min

mg

Espermatogonias oscuras

Espermatogonias pálidas

Análisis de varianza

Cadmio

Cloruro de cadmio

Carboximetíl celulosa

Sulfuro de cadmio

Ácido desoxirribonucleico

Células germinales embrionarias

Especies reactivas de oxigeno

Hormona folículo estimulante

Gramos

Colesterol de alta densidad

Peróxido de hidrógeno

Kilogramos

Litro

Colesterol de baja densidad

Lipoperoxidación

Minutos

Miligramo

Página ii

nm

·OH

O2·

1O2

PGC

pH

rpm

RSV

SSI

VIH

°C

µg

µL

Nanómetro

Radical hidroxilo

Superóxido

Singulete de oxigeno

Células germinales primordiales

Potencial de hidrogeno

Revoluciones por minuto

Resveratrol

Solución salina isotónica

Virus de inmunodeficiencia humana

Grados Celsius

Microgramo

Microlitro

Página iii

ii. Índice de Tablas y Figuras

Pág.

Figura 1 Diagrama esquemático de los componentes del aparato genital

masculino.

1

Figura 2 Comparación entre la mitosis y la meiosis en células germinales. 4

Figura 3 Diagrama esquemático de la espermatogénesis humana. 5

Figura 4 Malformaciones de los espermatozoides. 8

Figura 5 Espermatogénesis en el ratón. 9

Tabla 1 Efectos adversos de la exposición al cadmio. 11

Figura 6 Reacciones de la iniciación y propagación de la lipoperoxidación. 14

Figura 7 Estructura química del resveratrol. 16

Figura 8. Registro de peso promedio ganado de ratones que fueron

sometidos a distintos tratamientos.

Figura 9. Comparación del peso relativo promedio de testículo izquierdo de

ratones sometidos a diferentes tratamientos.

23

24

Figura 10. Comparación del peso relativo promedio de testículo derecho de

ratones sometidos a diferentes tratamientos.

24

Figura 11. Comparación del peso relativo promedio de la vesícula seminal

de ratones sometidos a diferentes tratamientos.

25

Figura 12. Porcentaje de espermatozoides de ratones sometidos a

diferentes tratamientos que presentan movimiento continuo (A), in situ (B)

e inmóviles (C).

26

Figura 13. Promedio de espermatozoides expresado en millones de

espermatozoides por mililitro de ratones sometidos a diferentes

tratamientos.

27

Figura 14. Viabilidad espermática de ratones sometidos a diferentes

tratamientos.

28

Figura 15. Morfología espermática de ratones sometidos a diferentes

tratamientos.

Figura 16. Niveles de lipoperoxidación en espermatozoides de ratones

29

30

Página iv

sometidos a diferentes tratamientos.

Figura 17. Niveles de lipoperoxidación en testículo de ratones sometidos a

diferentes tratamientos.

Figura 18. Niveles de testosterona en suero de ratones sometidos a

diferentes tratamientos

30

31

I. INTRODUCCIÓN.

La fertilidad en los humanos, así como en animales de experimentación, es

susceptible a los efectos tóxicos del medioambiente, productos químicos

industriales y fármacos. Entre los agentes más tóxicos se encuentran las

hormonas esteroidales, agentes quimioterapéuticos, metales, pesticidas, aditivos

de comida y alimentos contaminados.

Metales como cobalto, cadmio, mercurio, molibdeno y plata, pueden afectar la

espermatogénesis y la función de órganos accesorios (Thomas y Thomas J.,

2001).

1. ESPERMATOGÉNESIS.

Las dos funciones primarias del testículo (Figura 1) son la producción de gametos

masculinos o espermatozoides (espermatogénesis) y la síntesis de hormonas

sexuales masculinas o andrógenos (esteroidogénesis).

Figura 1. Diagrama esquemático de los componentes del aparato genital masculino.

En la pubertad la secreción de testosterona inicia la producción de

espermatozoides, la secreción de las glándulas sexuales anexas y el

desarrollo de las características sexuales secundarias.

En el adulto la secreción de testosterona es indispensable para el

mantenimiento de la espermatogénesis y de las características sexuales

secundarias, el buen funcionamiento de las vías espermáticas y de las

glándulas sexuales anexas.

Por lo tanto la espermatogénesis es el proceso por el cual se producen los

gametos sexuales masculinos. Comienza poco antes de la pubertad con la

influencia de las gonadotrofinas hipofisiarias y continúa durante toda la vida

reproductiva.

1.1 Fases de la espermatogénesis.

La espermatogénesis se inicia con la división de las células madre

(espermatogonias tipo Ad) y finaliza con la formación de espermatozoides

maduros.

1.1.1 Espermatocitogénesis (reducción cromosómica).

Fase proliferativa.

Durante esta fase se produce la continua repoblación de células madre que

finalmente se diferenciarán en espermatozoides maduros.

Las espermatogonias son células diploides situadas en la base del epitelio

seminífero. En el hombre, se han descrito tres tipos de espermatogonias: las

espermatogonias oscuras (Ad), que se consideran las células madre de la

espermatogénesis; no presentan actividad proliferativa en condiciones normales,

pero entran en mitosis cuando se reduce drásticamente la población total de

espermatogonias; como por ejemplo tras la radioterapia; las espermatogonias

pálidas (Ap), que dan lugar, al dividirse a dos espermatogonias de tipo B (Gill

Salmon y col., 2004).

Durante estas divisiones mitóticas, las células conservan un complemento diploide

de cromosomas. Después de una división por mitosis, las espermatogonias B

producen espermatocitos primarios; los cuales están destinados a entrar a la fase

meiótica de la espermatogénesis, cuya duración en el ser humano es alrededor de

24 días ( Drucker, 2005).

Fase meiótica.

En esta fase, los espermatocitos primarios sintetizan de manera activa DNA,

siendo las últimas células germinales en llevar este proceso. Después de duplicar

su contenido de DNA, los espermatocitos inician la profase de la división meiótica,

durante la cual las células experimentan diversos cambios en su cromatina.

Después de esta fase, las células entran con rapidez a los estados subsecuentes

de la meiosis, para originar los espermatocitos secundarios (con un número

haploide de cromosomas). La segunda división meiótica es precedida por un

periodo de interfase breve, esta fase es similar a la mitosis, con excepción de que

las células mantienen un número haploide de cromosomas; está división da origen

a las espermátides (Figura 2).

1.1.2 Espermiogénesis (diferenciación de espermátidas).

Fase de Golgi: condensación Nuclear, gránulos pro-acrosómicos,

formación del axonema por el centríólo maduro.

Figura 2. Comparación entre la mitosis y la meiosis en células germinales. Los dos

pares de cromosomas (2n) de origen materno y paterno están ilustrados en rojo y azul,

respectivamente. La división mitótica produce células hijas que son genéticamente

idénticas a la célula progenitora (2n). la división meiótica, que tiene dos componentes

(división reduccional y ecuacional), producen células que poseen solo la mitad de la

cantidad de cromosomas (n). Además, durante el apareamiento de los cromosomas en la

profase I de la meiosis se intercambian segmentos cromosómicos (recombinación o

crossing-over) para crear la diversidad genética. En los seres humanos el primer cuerpo

polar no se divide, pero si lo hace en otras especies. (Martini, 1998).

Fase de Casquete: formación de la vesícula acrosómica sobre el núcleo,

desaparición de poros nucleares.

Fase de Acrosoma: Orientación en células de Sertoli hacia lámina basal,

desplazamiento de citoplasma, formación del manguito de microtúbulos, el

centriolo inmaduro forma el cuello o piezas de conexión (9 fibras densas).

Las mitocondrias se desplazan a la región del cuello y forman la vaina

helicoidal en el cuello.

Fase de Maduración: Cuerpos Residuales con puentes citoplásmicos,

liberación de las células de Sertoli a la luz del túbulo seminífero Figura 3).

Figura 3. Diagrama esquemático de la espermiogénesis humana. Se ilustran las

modificaciones básicas en la estructura de los orgánulos fundamentales de la

espermátide. (Modificada de Dym M., 1988).

1.2 Factores que afectan a la espermatogénesis.

Las células espermatogénicas son muy sensibles a agentes nocivos, se detectan

algunas alteraciones degenerativas como la apoptosis, exfoliación prematura o la

formación de células gigantes multinucleadas. Entre los factores que afectan

negativamente la espermatogénesis pueden mencionarse las deficiencias

alimentarias, debido a que las vitaminas, coenzimas y los oligoelementos (vitamina

A, B12, C y E, ß-caroteno, zinc y selenio) son una fuente importante en la

formación de espermatozoides. También destacan los factores ambientales/estilo

de vida, en un estudio realizado en Dinamarca se observó que el recuento de

espermatozoides de varones de zonas rurales es más alto que los de zonas

urbanas debido a las constantes situaciones de estrés provocadas por el tráfico,

trabajo o simplemente la vida acelerada de la ciudad provocan la muerte de los

espermatozoides. Los trastornos del desarrollo embrionario, cabe mencionar que

la criptorquidia, el hipospadías y el bajo peso al nacer son factores de riesgo

importantes de cáncer testicular asociados con la disminución de la calidad del

semen y la reducción de la fertilidad. Las enfermedades sistémicas o infecciones

locales, las infecciones que afectan a los testículos son conocidas como orquitis.

Las enfermedades sistémicas que pueden alteran la espermatogénesis

comprenden la fiebre, nefropatías, infección por VIH y otras infecciones virales. La

temperatura testicular elevada, la temperatura es uno de los factores clave en la

producción de espermatozoides. Hay que tener en cuenta que los testículos están

separados del resto del cuerpo para mantener una temperatura ligeramente

inferior, entre uno y dos grados menos. Todo lo que suponga que esos testículos

estén unidos al cuerpo y suba la temperatura puede ser perjudicial para la

producción de espermatozoides. Las hormonas esteroides y fármacos

relacionados, la exposición a estrógenos sintéticos (dietilestilbestrol) y a otros

esteroides sexuales puede ejercer un retrocontrol negativo sobre la secreción de

FSH, con la consiguiente reducción de la espermatogénesis. La radiación

ionizante y agentes alquilantes, se ha comprobado que el gas mostaza

nitrogenado y la procarbazina ejercen efectos tóxicos sobre los espermatogonios.

Las radiaciones electromagnéticas y las microondas también afectan la cantidad y

la movilidad de los espermatozoides. Finalmente los agentes tóxicos, los agentes

mutagénicos, antimetabolitos, pesticidas, productos de la combustión, etc. pueden

afectar drásticamente la producción de espermatozoides normales, por lo tanto se

ve afectada la fertilidad. (Health.com).

1.3 Anormalidades de los espermatozoides en humano.

Los espermatozoides que presentan anomalías morfológicas carecen de movilidad

normal y es probable por ello que no lleguen a fecundar a los ovocitos. Las

anomalías pueden ser de la cabeza o de la cola; los hay gigantes y pequeños, en

ocasiones están unidos.

Hay datos que sugieren que un 10% de los espermatozoides pueden ser

anormales sin que ello represente una disminución de la fertilidad. Sin embargo,

cuando existen anomalías en un 25 % o más, la fecundidad suele estar disminuida

(Sadler, 1988).

Las anormalidades que se presentan en los espermatozoides del ser humano,

pueden presentarse de igual forma en los espermatozoides de ratón (Figura 4).

1.4 Espermatogénesis en el ratón.

En el ratón el proceso de la producción de gametos se inicia en la fase

embrionaria alrededor de los 11 días y medio después de la fecundación, cuando

las células germinales primordiales (PGC), localizadas en el saco vitelino adosado

al alantoides, colonizan la cresta genital. Las PGC proliferan, algunas sufren

apoptosis, y el resto llega a la fase de células germinales embrionarias (EG). Éstas

se mantienen quiescentes como T-proespermatogonias hasta después del

nacimiento, cuando son reactivadas e inician la espermatogénesis (McLaren &

Southee, 1997). La primera ola de espermatogénesis empieza cuando las

T-proespermatogonias se diferencian en espermatogonias Ais (isolated), entre el

nacimiento y el día 3 en el ratón (Vergouwen y col., 1993).

A: Espermatozoide normal.

B: Espermatozoide con dos cabezas.

C: Espermatozoide con dos colas.

D: Espermatozoide con atrofia de la cabeza.

E: Espermatozoide con la cola rizada.

F: Espermatozoide con atrofia de la cola.

G: Espermatozoide con malformación de la

cabeza.

H: Espermatozoide con cola flexionada.

I: Espermatozoide con hipertrofia de la

cabeza.

Figura 4. Malformaciones de los espermatozoides.

El resto se diferencian en espermatogonias A1, las cuales sufren cinco divisiones

mitóticas generando secuencialmente espermatogonias A2-A4, intermedias, y tipo

B. Después de la última división de las espermatogonias de tipo B, empieza la

meiosis dando lugar a los espermatocitos en preleptoteno (día 10), que se

diferencian sucesivamente en espermatocitos en leptoteno, zigoteno, paquiteno y

diploteno, completándose así la profase.

Las células en diploteno se dividen para formar los espermatocitos secundarios

(primera división meiótica) que rápidamente dan lugar a las espermátidas de tipo I

(segunda división meiótica). Éstas marcan el inicio de la espermiogénesis (Figura

5). En el ratón, las primeras espermátidas haploides aparecen alrededor del día 20

y hacia el día 35 ya se pueden detectar los primeros espermatozoides en el lumen

de los túbulos seminíferos (Vergouwen y col., 1993). En función de la morfología

de las espermátidas, la espermatogénesis se puede subdividir en diferentes

asociaciones celulares denominadas estadios. En el ratón casero se han descrito

16 tipos de espermátidas y 12 estadios.

El ciclo espermatogénico en el ratón tiene una duración de 36 días y en el hombre

es de 74 días (Roberts, 1990).

Figura 5. Espermatogénesis en el ratón (Whittingham, 1990).

2. CADMIO.

Es un elemento metálico, de color blanco brillante, dúctil, maleable y persistente a

la corrosión. Es un metal pesado que produce efectos tóxicos en los organismos

vivos, aún en concentraciones muy pequeñas, se encuentra ampliamente

distribuido en la corteza terrestre en una concentración promedio de 0.1 mg/kg

(Vallejo, 2001).

La exposición al cadmio en los humanos se produce generalmente a través de dos

fuentes principales: la primera es la vía oral (por agua e ingestión de alimentos

contaminados) y la segunda vía es por inhalación (Chang, 1996).

Por vía oral se absorbe del 5 al 10% del total de cadmio en el organismo. Aunque,

con excepción del sulfuro de cadmio (CdS), los compuestos de cadmio iónico son

altamente solubles en agua, los humanos sólo ingieren una pequeña cantidad

directamente del agua potable o del aire. La exposición humana proviene

principalmente de los alimentos, mariscos y vísceras, particularmente riñón.

La segunda vía es por inhalación; en este caso la absorción depende del tamaño

de las partículas y su composición química. La cantidad de cadmio inhalado

depende de la concentración del metal en el aire, la retención y tamaño de las

partículas en los pulmones, del compuesto químico inhalado, las condiciones

fisiológicas del sistema respiratorio y en el caso de los fumadores, de la intensidad

del hábito, pues por esta vía se absorbe del 15 al 20% del cadmio que pasa a la

sangre.

La población fumadora es la más expuesta al cadmio; ya que el cigarro es una

fuente importante del metal. Como muchas plantas, el tabaco contiene cadmio,

algo del cual es inhalado en el humo. Muchos fumadores tienen alrededor del

doble de cadmio en sus órganos que los no fumadores (Al-Bader y col., 1999).

2.1 Efectos adversos.

Aunque las exposiciones prolongadas son extremadamente raras actualmente, la

ingestión de altas dosis es causa de severas irritaciones del estómago, vómito y

diarrea y su inhalación causa graves irritaciones en los pulmones.

Algunos efectos adversos de la exposición crónica a Cadmio se presentan en la

Tabla 1 (Saldivar y col., 1997):

2.2 Efectos del Cadmio en el sistema reproductor masculino.

En los años 50´s se reportó por primera vez el efecto adverso del cadmio sobre la

reproducción. Cuando la concentración de cadmio en sangre es superior a 1.5

mg/L, hay reducción significativa en la densidad de los espermatozoides,

sugiriendo un posible efecto del cadmio en la espermatogénesis (Parizek y Zahor,

1956).

La inyección de cadmio en los testículos de ratas, causa atrofia testicular y

producción de anticuerpos antiespermatozoide por ser inductor de cambios

vasculares que llevan a la isquemia.

Tabla 1. Efectos adversos de la exposición al cadmio.

El cadmio contenido en el humo del cigarro daña la función de los

espermatozoides a través de sus efectos citotóxicos.

2.3 Mecanismos tóxicos del Cadmio.

Produce modificaciones oxidativas del DNA, tal como la formación de 8-

hydroxiguanosina, e inmoviliza e interrumpe cambios bioquímicos en diferentes 18

tipos de células; por ejemplo en las células del hígado y riñón (Fernández y col.,

2003).

Los daños oxidativos sobre el DNA se han asociado con un incremento de

producción de especies reactivas de oxigeno (ERO) e interacciones entre este

metal y enzimas que participan en la reparación de las cadenas de DNA. A nivel

celular, el cadmio también induce diferentes cambios bioquímicos, los cuales se

asocian con el proceso de apoptosis (Fernández y col., 2003).

2.4 Especies Reactivas de Oxígeno.

Los radicales libres son cualquier especie química que contenga uno o más

electrones no apareados. Prácticamente todas los radicales libres que se

producen en el organismo derivan del oxígeno y del nitrógeno por la ganancia o

pérdida de un electrón (González, 2010).

Las especies reactivas del oxígeno (ERO) como el radical hidroxilo (·OH),

superóxido (O2·), singlete (1O2), peróxido de hidrógeno (H2O2), son iones de

oxígeno, radicales libres y peróxidos, son moléculas muy pequeñas altamente

reactivas, debido a la presencia de una capa de electrones de valencia no

apareada que se forman de manera natural como subproductos del metabolismo

normal del oxígeno. Su presencia puede inducir estrés oxidativo (Halliwell y col.,

1989).

Se sabe que las ERO y el estrés oxidativo son dos de las mayores causas en la

infertilidad masculina y defectos de la función espermática. Se ha observado la

formación de radicales libres en espermatozoides humanos y el daño oxidativo en

el DNA del esperma, lo que provoca alteraciones funcionales y estructurales,

además de que existe una gran relación entre la lipoperoxidación y la infertilidad

masculina (Shen y col., 2000).

2.5 Estrés oxidativo.

De manera natural, a concentraciones moderadas los radicales libres son

benéficos para determinados procesos celulares, pero a concentraciones elevadas

pueden desencadenar daños irreparables en la celula, a esta alteración se le

conoce como “estrés oxidativo”.

El estrés oxidativo es una situación en la que existe tanto un aumento en la

velocidad de generación de ERO como una disminución de los sistemas de

defensa, lo que resulta en una mayor concentración de estas (Shen y col., 2000).

2.6 Lipoperoxidación.

La lipoperoxidación (LPO) es el deterioro oxidativo de lípidos polinsaturados

(Tappel et al., 1989), es una reacción autocatalítica donde las ERO o radicales

libres sustraen átomos de hidrógeno a las moléculas de los lípidos polinsaturados

y por lo tanto se deterioran. La lipoperoxidación puede dañar lípidos y proteínas de

las membranas biológicas (Ibrahim y col., 2008).

La LPO se inicia cuando una especie reactiva reacciona con alguna parte de la

membrana formada por ácidos grasos polinsaturados y extrae un protón de un

metileno de la cadena, dejando un electrón sin aparear en este grupo, lo que

conllevará a un rearreglo molecular formando un dieno conjugado, el cual bajo

condiciones aeróbicas se unirá a oxígeno en el interior de la célula dando como

producto un radical peroxilo. El radical extraerá otro protón de otro ácido graso

entrando a una fase de propagación, formando otro dieno conjugado que

reaccionará con O2 y formará más radicales peroxilo. Los radicales peroxilo

también pueden reaccionar con los protones extraídos y formar un lípido

hidroperoxidado (Halliwell y col., 1989).

Figura 6. Reacciones de la iniciación y propagación de la lipoperoxidación. Se

observa la extración de protones y la inducción de una reacción en cadena (Halliwell y

col.,1989).

2.7 Antioxidantes.

Existen moléculas llamadas antioxidantes que se encargan de mantener el

equilibrio de radicales libres y por lo tanto el potencial oxido reducción. Estas

sustancias evitan el daño de las células al ceder electrones a los radicales libres

(Silverthorn, 2009).

2.7.1 Enzimas antioxidantes.

Superóxido-dismutasa y catalasa: La primera cataliza la dismutación del

superóxido a H2O2, el cual es neutralizado posteriormente por la catalasa.

Estas reacciones tienden a ser mayores en tejidos con elevada utilización

de O2 elevada como el hígado y los eritrocitos.

Glutatión-peroxidasa y glutatión-reductasa: Las primeras reducen

hidroperóxidos lipídicos y H2O2 al oxidar el glutatión, el glutatión oxidado se

reduce de nuevo por la glutatión reductasa (González, 2010).

2.7.2 Antioxidantes no enzimáticos.

Pueden ser de origen endógeno como el urato, la bilirrubina o proteínas como la

albumina. Otros pueden ser adquiridos en la dieta, como flavonoides o vitamina A,

C y E (González, 2010).

3. RESVERATROL.

El consumo de antioxidantes, parece prevenir o al menos disminuir el deterioro

funcional originado por un exceso de estrés oxidativo. Existe una gran diversidad

de antioxidantes los cuales tienen diferentes mecanismos de acción, entre ellos se

encuentra el resveratrol.

Figura 7. Estructura química del resveratrol.

El resveratrol se encontró por primera vez en la raíz de la planta Veratrum

grandiflorum. Años más tarde se descubrió que la uva, vino tinto y arándanos,

entre otros alimentos lo contenían.

El resveratrol (3,5,4-trihidroxiestilbeno) es un polifenol natural, pertenece a la

misma familia de los flavonoides y taninos, y se le han atribuido características

medicinales, debido principalmente a sus propiedades antioxidantes que reducen,

de manera importante, la probabilidad de padecer enfermedades cardiovasculares

y pueden ayudar a tratar otros problemas de salud.

Algunos efectos benéficos atribuidos al resveratrol son:

Reduce la inflamación causada por el exceso de grasa acumulada en las

paredes internas de las arterias. Esto impide que se formen placas de

grasas en dichas paredes.

Evita la adhesión de plaquetas en las paredes arteriales, evitando la mala

circulación o falta de irrigación sanguínea.

Disminuye la formación de radicales libres que pueden producir

enfermedades como el cáncer.

Mejora la respiración celular, aumentando el gasto energético a base de

tejido graso.

Reduce el colesterol LDL o malo y triglicéridos.

Aumenta el colesterol HDL o bueno.

http://www.abajarcolesterol.com/%C2%BFque-es-el-resveratrol/http://www.abajarcolesterol.com/que-alimentos-contienen-resveratrol-para-bajar-el-colesterol/http://www.plantasparacurar.com/flavonoides/

Mejora la utilización de glucosa, reduciendo la resistencia a la insulina.

Debido a su estructura química, el resveratrol es capaz de capturar radicales libres

y estabilizarlos por medio de resonancia de sus electrones y así poder ejercer su

efecto antioxidante (Quin y col., 2010).

II. JUSTIFICACIÓN.

La intoxicación con Cd se manifiesta por una variedad de patologías que incluyen

disfunción sexual y problemas de fertilidad. Al parecer la toxicidad del metal está

mediada por la producción de radicales libres que incrementan los procesos

oxidativos.

Por otro lado, el resveratrol ha mostrado actividad antioxidante en algunos

estudios experimentales, lo cual le proporciona un potencial farmacológico en la

prevención de los efectos tóxicos del cadmio.

III. HIPÓTESIS.

Si el CdCl2 provoca daño espermático por la inducción de radicales libres, al pre-

tratar a los ratones con un compuesto que ha mostrado tener una actividad

antioxidante como el resveratrol, entonces se podrá evitar la espermatotoxicidad

causada por el CdCl2.

IV. OBJETIVOS.

General.

Determinar la actividad protectora del resveratrol sobre la toxicidad aguda

del CdCl2 durante la espermatogénesis en ratón.

Específicos.

• Determinar si el resveratrol previene las alteraciones morfológicas de los

espermatozoides causadas por CdCl2 en ratones.

• Evaluar la toxicidad aguda del CdCl2 durante la espermatogénesis en ratón.

• Determinar si el resveratrol tiene efecto sobre los niveles de

lipoperoxidación, en los testículos de los ratones expuestos a CdCl2.

V. MATERIAL.

Material Biológico:

48 Ratones ICR macho.

Material y equipo:

Material de laboratorio Papel filtro

Pipetas Pasteur Porta y cubreobjetos

Micropipetas Cámara de Neubauer

Termómetro Microscopio compuesto

Equipo de disección Centrifuga

Viales Espectrofotómetro

Parrilla Sonicador

Goteros Balanza analítica

Balanza granataria Jaulas para ratón

Bebederos

Kit Testosterona EIA; Diagnostic Systems Laboratories. Inc.

Reactivos:

Preparación de la dilución espermática.

Formol al 10%.

Solución salina fisiológica.

Tinciones para evaluar la vitalidad y morfología de los espermatozoides.

Colorante Eosina-Nigrosina

Eosina 1% (Disolver en amortiguador de fosfatos).

Nigrosina 4% (Disolver en amortiguador de fosfatos).

Amortiguador de fosfatos pH 7.4 (13.4 g de Na2HPO4. 7H2O; 3.4 g

NaH2PO4. H2O / litro).

Determinación de niveles de lipoperoxidación (TBAR´S).

Ácido Tricloroacético 15%.

Ácido Tiobarbitúrico 0.375%.

Ácido clorhídrico 0.25N.

Reactivo de Bradford.

VI. METODOLOGÍA.

Se emplearon cinco lotes de seis ratones macho cada uno, de la cepa ICR con un

peso entre 20 a 30 g, y se mantuvieron bajo condiciones controladas de

temperatura (21+/- 2 °C) y humedad relativa del 50 %, ciclos de luz-oscuridad de

12 horas cada uno ( luz de 9:00am a 21:00pm) y alimentación ad libitum.

Los animales recibieron los siguientes tratamientos de acuerdo al lote

correspondiente:

A) SSI

B) CdCl2 0.6 mg/Kg

C) Resveratrol

D) CdCl2 0.6 mg/Kg + Resveratrol

E) Carboximetil celulosa 0.3% (Vehículo)

Se administró por vía intragástrica los diferentes tratamientos diariamente durante

30 días, durante este tiempo se pesaron los ratones cada 5 días para poder

calcular la dosis requerida conforme al peso; las interacciones con cadmio (lote D)

se realizaron administrando primero el antioxidante y una hora después el cloruro

de cadmio.

Al día 30 del tratamiento se eutanizaron los animales y se les extrajo las vesículas

seminales, el epidídimo y los testículos.

A un testículo se le determinaron los niveles de lipoperoxidación por medio de la

técnica de TBAR’s.

Se obtuvo un segmento de conducto de la cola del epidídimo y se introdujo en un

tubo con 1 mL de SSI a 37°C, se expulsó el líquido seminal formando una

suspensión espermática para su análisis posterior de viabilidad y morfología por la

tinción de Eosina-Nigrosina en donde los espermatozoides vivos no presentan

color y los muertos se tiñen de color fiusha; movilidad al microscopio y cuenta

espermática.

Análisis de movilidad.

Se colocó una gota de solución espermática sobre un portaobjetos atemperado y

se observó inmediatamente al microscopio, se determinó el porcentaje de células

espermáticas que presentaron movimiento progresivo y en línea recta, los que se

movían sin desplazarse y los que no presentaron movimiento.

Cuenta espermática.

Se realizó una dilución de 20 µL de la suspensión espermática con 200 µL de

formol. Se colocó una gota de esa dilución en cada compartimiento de la cámara

de Neubauer y se hizo el conteo de células. Para el cálculo final se promediaron

las cuentas de ambos compartimientos y se realizaron los cálculos para obtener

los millones de espermatozoides de acuerdo a las diluciones realizadas.

A = Cuenta * 5

Dónde:

Cuenta x = cuenta promedio de ambos compartimientos de la cámara de

Neubauer.

Determinación de los niveles de lipoperoxidación (Técnica TBAR´s).

Una vez extraído el testículo se homogeneizo con agua destilada. Se adiciono 1

mL del reactivo de TBAR´s y se sometieron a baño maría en ebullición por 30

minutos, se preparó un blanco de reactivos. Transcurrido el tiempo, se dejaron

enfriar las muestras y se centrifugaron a 3000 rpm durante 15 minutos. Se

determinó la absorbancia del sobrenadante en un espectrofotómetro a una

longitud de onda de 535 nm. Se calculó la cantidad de MDA utilizando un

coeficiente de extinción de 1.56 x 105 M-1 cm-1. Los resultados se reportaron como

mM de MDA/g de tejido. (Buege y Austin, 1998).

Determinación de proteínas (Técnica de Bradford).

Se determinaron las proteínas totales por la técnica de Bradford utilizando una

curva de albumina sérica bovina (Anexo 1).

Las concentraciones obtenidas se encontraban en µg, por lo que se convirtieron a

mg, después se obtuvieron las proteínas por muestra al multiplicar los mg por un

factor. Este resultado se dividió entre la absorbancia obtenida para determinar los

mg de proteína.

Se midieron los niveles de testosterona en suero mediante el uso del Kit

Testosterona EIA; Diagnostic System Laboratories.Inc.

Análisis estadístico.

Los datos se expresan como media +/- EEM o mediana. El análisis estadístico se

llevó acabo usando el programa Sigma Plot 12.5. el valor de P

Figura 8. Registro de peso promedio ganado de ratones que fueron

sometidos a distintos tratamientos. No hay una diferencia estadísticamente

significativa (P = 0,128).

SSI CdCl2 RSV CdCl2/RSV CMC

Pes

o c

orp

ora

l (g

)

0

10

20

30

40

VII. RESULTADOS.

En la figura 8, se muestra la ganancia de peso corporal de ratones sometidos a

diferentes tratamientos, en donde se puede observar que esta variable no se

modificó con ninguno de los tratamientos.

Registro de pesos.

Peso Relativo.

Testículos.

En la figura 9, 10 y 11 se muestran el peso relativo de los testículos izquierdo y

derecho y de la vesícula seminal respectivamente de ratones sometidos a

diferentes tratamientos, en las cuales no se observa diferencia significativa en

ninguna de estas variables.


Pes

o r

elat

ivo

de

test

icu

lo d

erec

ho

(%)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8


Pe

so

re

lati

vo

de

te

sti

cu

lo iz

qu

ierd

o (

%)

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

Figura 9. Peso relativo de testículo izquierdo de ratones sometidos a

diferentes tratamientos. No hay una diferencia estadísticamente significativa

(P=0.722). Se representa la media ± error estándar.

Figura 10. Peso relativo de testículo derecho de ratones sometidos a




Pe

so

re

lati

vo

de

ve

sic

ula

se

min

al (

%)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

Vesícula Seminal

Figura 11. Peso relativo de la vesícula seminal de ratones sometidos a




Es

pe

rma

toz

oid

es

inm

ov

iles

(%

)

0

10

20

30

40

50

60

70


Es

pe

rm

ato

zo

ide

s c

on

mo

vim

ien

to c

on

tin

uo

(%

)

0

20

40

60

80

100


Es

pe

rm

ato

zo

ide

s c

on

mo

vim

ien

to in

sit

u (

%)

0

10

20

30

40

50

60

70

Movilidad espermática.

En la figura 12, se muestra el porcentaje de movilidad espermática; en la movilidad

continua (A), se encontró que hay una disminución de esta en los ratones tratados

con cloruro de cadmio, así como un aumento en los lotes que fueron tratados

previamente con resveratrol. No hubo diferencia con los espermatozoides con

movimiento in situ (B), mientras que los inmóviles aumentaron con el cloruro de

cadmio y el co-tratamiento con resveratrol previno este incremento (C).

Figura 12. Porcentaje de espermatozoides de ratones sometidos a diferentes

tratamientos que presentan movimiento continuo (A), in situ (B) e inmóviles

(C) a: Diferencia significativa con respecto a CdCl2, b: Diferencia significativa con

respecto a CMC 0.3% y c: Diferencia significativa con respecto a SSI). (P =


Cu

en

ta e

sp

erm

ati

ca

(x

10

´6 e

sp

erm

ato

zo

ide

s/m

L)

0

20

40

60

80

100

Cuenta espermática.

La figura 13, muestra los valores de cuenta espermática de los ratones sometidos

a los diferentes tratamientos, se observa una disminución de este parámetro en

los ratones tratados con cloruro de cadmio y una ligera mejora en los lotes pre

tratados con resveratrol aunque no de manera significativa.

Viabilidad espermática.

La figura 14, representa el porcentaje de espermatozoides vivos de ratones

sometidos a diferentes tratamientos. Se observa una disminución de los

espermatozoides vivos en los ratones tratados con cloruro de cadmio y un efecto

protector en el valor de esta variable en el lote previamente tratado con resveratrol

aunque no de manera significativa.

Figura 13. Concentración de espermatozoides expresado en millones de

espermatozoides por mililitro de ratones sometidos a diferentes

tratamientos. No hay una diferencia estadísticamente significativa (P = 0,111).

Se representa la media ± error estándar.


Es

pe

rma

toz

oid

es

viv

os

(%

)

0

20

40

60

80

100

Morfología espermática.

En la figura 15 se presenta el porcentaje de espermatozoides con anormalidades

morfológicas observándose un aumento en esta variable en los ratones tratados

con cloruro de cadmio y un efecto protector en el lote tratado previamente con

resveratrol.

Figura 14. Viabilidad espermática de ratones sometidos a diferentes

tratamientos. a: Diferencia significativa con respecto a SSI, b: Diferencia

significativa con respecto a CdCl2; P = 0,015; Se representa la media ± error

estándar.

a

b


Es

pe

rma

toz

oid

es

an

orm

ale

s (

%)

0

10

20

30

40

Lipoperoxidación.

En la figura 16 y 17, se muestra el contenido de malonaldehído en la

determinación de lipoperoxidación en espermatozoides y testículo

respectivamente, en los ratones sometidos a diferentes tratamientos.

Figura 15. Morfología espermática de ratones sometidos a diferentes

tratamientos. a:Diferencia significativa con respecto al lote de SSI, P =


Lip

op

ero

xid

ac

ión

(n

M M

DA

/mL

)

0

5

10

15

20

Figura 16. Niveles de lipoperoxidación en espermatozoides de ratones

sometidos a diferentes tratamientos. a: Diferencia significativa con respecto a

CdCl2., P = 0,015. Se representa la media ± error estándar.

Figura 17. Niveles de lipoperoxidación en testículo de ratones sometidos a

diferentes tratamientos. a: Diferencia significativa con respecto a CMC., P =

0,021). Representando mediana y percentiles a 25% y 75%. Mann-Whitney.

a a

a


Lip

op

ero

xid

ació

n

(nM

DA

mg

/Tej

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)

0.0

2.0e-6

4.0e-6

6.0e-6

8.0e-6

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1.4e-5

1.6e-5

1.8e-5

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Co

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en

tra

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n d

e t

es

tos

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na

(

ng

/mL

)

0

5

10

15

20

Testosterona.

La concentración de testosterona en suero de ratones sometidos a los diferentes

tratamientos se muestra en la figura 18, no se observa diferencia significativa con

los diferentes tratamientos.

Figura 18. Niveles de testosterona en suero de ratones sometidos a


(P = 0,337). Representando media ± error estándar.

VIII. DISCUSIÓN.

Estudios previos indican que el cadmio induce daño testicular así como

alteraciones en los valores del análisis espermático en algunas especies de

animales incluyendo ratones, hamsters, marmotas, conejos, cuyos, perros y

ardillas (Xu, 1996), entre los que destacan disminución del tamaño de los

testículos y alteraciones en la calidad espermática, debido a la acumulación de

este metal sobre los tejidos, (Yang y col., 2003). También se ha observado el

aumento de estrés oxidativo que se manifiesta por el incremento en la generación

de radicales libres como son el anión superóxido (O2), hidroxilo (-OH) y el peróxido

de hidrogeno (H2O2), los cuales debido a su alta reactividad química pueden

aumentar la lipoperoxidación en la membrana de algunos tejidos como la del

testículo o de las células germinales y de este modo provocar daños significativos

en la función reproductiva que se traduce a problemas de fertilidad masculina

(Acharya y col.,2008).

En el presente estudio, se sometió a ratones macho a una exposición a cloruro de

cadmio por vía oral durante 30 días que es casi lo que dura un ciclo espermático

en ratón, durante todo el periodo de exposición se registraron los pesos de los

animales para determinar si el tratamiento altera la ganancia de peso en los

animales. En estudios realizados en pacientes que presentan intoxicación por

cadmio, se ha observado la disminución de peso corporal debido a los distintos

síntomas que se presentan como falta de apetito, nauseas, vómito y diarrea

principalmente (Marx JA, et al. 2009). De acuerdo a lo anterior en este estudio se

esperaría que hubiese una disminución del peso corporal en los animales que

fueron sometidos a cloruro de cadmio, sin embargo, se observa que el tratamiento

no afectó esta variable; esto se pudo deber a que el periodo de intoxicación al que

se sometieron los ratones fue insuficiente que no permitió observar los efectos

tóxicos en ellos, por lo que se sugiere una exposición prolongada.

Se hizo la determinación de los pesos relativos tanto de los testículos como de las

vesículas seminales y por los antecedentes se esperaba una disminución

significativa en los órganos de los ratones tratados con cloruro de cadmio, sin

embargo, no se presentó una diferencia significativa entre los ratones tratados. La

diferencia puede deberse al tiempo de tratamiento, si se realiza una administración

crónica de cloruro de cadmio probablemente se observe el cambio de tamaño de

dichos órganos.

En humanos, tras la exposición continua al cadmio se ha asociado un efecto sobre

los espermatozoides causando un daño en la fertilidad (Al-Bader y col., 1999);

este daño es consecuente de anormalidades morfológicas de los

espermatozoides, disminución de la cuenta y movilidad espermática comparado

con los resultados de hombres fértiles y sanos (Roste y col., 2003; Siam et al.,

2005). Los resultados en el presente estudio coinciden con lo reportado, en donde

el porcentaje de espermatozoides que presentan movilidad continua y que cruzan

el campo disminuyó significativamente en el lote tratado con cloruro de cadmio; así

mismo el porcentaje de espermatozoides inmóviles tuvo un incremento

significativo en comparación con los ratones testigo.

También se ha reportado que la exposición al cloruro de cadmio provoca

interacciones en el sistema endócrino que llevan a la disminución en la producción

o secreción de hormono luteinizante, folículo estimulante, hormona liberadora de

gonadotropinas y testosterona que están involucradas en la espermatogénesis y

por lo tanto provoca la disminución de la cuenta, movilidad y viabilidad

espermática (Shen y col., 2000). En este estudio se observó que tanto en la

cuenta como la viabilidad espermática hubo una disminución en el porcentaje de

estas variables en los ratones tratados con cloruro de cadmio. Sin embargo se

observó un incremento de movilidad espermática en los lotes donde se realizó el

pretratamiento con resveratrol. Este efecto protector se puede atribuir a las

propiedades antioxidantes que presenta el resveratrol, ya que, se ve

incrementada la concentración y la viabilidad de los espermatozoides de ratones;

además de que el vehículo utilizado no presento alguna alteración.

Con respecto a la morfología espermática, se encontró que existe un aumento en

el número de espermatozoides con algún tipo de anormalidad cuando se trataron

los ratones con cloruro de cadmio, por otra parte se mostró disminución con la

administración de resveratrol. Algunos autores an demostrado que las ERO

generadas en la catálisis metálica pueden incrementar errores meióticos y

deformación del esperma, se sabe también que la morfología del esperma es

controlada por el complejo autosomal y los genes específicos contenidos en el

cromosoma y por otro lado, mecanismos dependientes de oxigeno son claramente

importantes para inducir anormalidades espermáticas. (Acharya y col., 2008).

Por lo tanto, el aumento de espermatozoides morfológicamente anormales en

ratones tratados con cloruro de cadmio supone que las ERO generadas afectaron

alguna de las etapas de la división meiótica durante la espermatogénesis, y el

tratamiento con un antioxidante como el resveratrol tiene la capacidad de disminuir

este daño.

En otro estudio realizado donde se empleó CdCl2 como agente toxico, los

resultados demostraron que el CdCl2 incremento los niveles de oxidación testicular

(Oviedo, 2011). Los radicales libres pueden iniciar degradación peroxidativa de los

lípidos por abstracción de hidrógeno de los ácidos grasos (Zoltán, 2001),

destruyen a la membrana lipídica propiciando la formación de compuestos como el

malonaldehído los cuales pueden provocar mutagenesis o daño en el DNA.

Los peróxidos lipídicos derivados de acidos grasos poliinsaturados son inestables

y se descomponen para formar una serie de compuestos complejos. Entre estos

se incluyen compuestos carbonílicos, de los cuales el más abundante es el

malonaldehído, por esta razón el MDA es ampliamente usado como indicador de

peroxidación lipídica (Mallok y cols. 2011).

El resveratrol destaca por ser un polifenol que le atribuye su gran poder

antioxidante (Quin y col., 2010), lo que explica los resultados obtenidos, donde se

observó diferencia significativa en los niveles de MDA, entre los diferentes lotes de

ratones tratados.

En cuanto a los niveles de testosterona no se observó una diferencia significativa,

esto se pudo deber a que no fue el tiempo necesario del tratamiento para observar

alguna alteración que pudiera modificar la concentración de dicha hormona; pero

eso no descarta la variación de testosterona a otros niveles.

IX. CONCLUSIONES.

El CdCl2 disminuyó la cuenta, viabilidad y movilidad espermática.

El CdCl2 incrementó el número de espermatozoides anormales.

El CdCl2 produjo cambios en los niveles de lipoperoxidación de los

testículos.

El pre y co-tratamiento con el resveratrol en los ratones tratados con

cloruro de cadmio previno el daño espermático.

El efecto protector que mostro el resveratrol contra el CdCl2 en este

estudio se estima que es debido a su actividad antioxidante.

No se encontraron cambios en los niveles de testosterona.

X. BIBLIOGRAFÍA.

Acharya U.R., Misha M.,Patro J.,et al. (2008) Effect of vitamins C and E

on spermatogenesis in mice exposed to cadmio. Reproductive

Toxicology.25(1) 84-88.

Al-Bader A., Omu A. E. y Dashti H.(1999) Chronic cadmium toxicity to

sperm of heavy cigarette smokers: immunomodulation by Zinc. Archives

of Andrology, 43: 135-140.

Buege J.A. y Austin S.D. (1998) Microsomal lipid peroxidation. Methods

Enzyma, 52:307-310.

Chang L. W. (1996) Toxicology of metals. Lewis Publishers. United

States of America. pp: 83-87.

Dym M. en Weiss l, ed. Cell and Tissue Biology: A Textbook of

Histology. 6th. ed. Baltimore: Urban & Schwarzenberg, 1988).

Drucker C. R.(2005) Gónada masculina. En: Fisiología Médica. Drucker

C. R. El Manual Moderno, México, D.F. pp: 590-595.

Gill Salom M., Bellver J., Romero, J.L., Rossal L.P., Gutiérrez A.,

Escudero E., Simón C., Pellicer A. y Remohí J. (2004)

Espermatogénesis: conceptos básicos.

González H.A. (2010). Principios de bioquímica clínica y patología

molecular. Editorial Elsevier. España, pp.440-445.

Fernández E. L., Gustafson A., Andersson M., Hellman B. y Dencker

L.(2003) Cadmium-induced changes in apoptotic gene expression levels

and DNA damage in mouse embryos are blocked.Toxicological

Sciences, 76: 162-170.

Halliwell B., Gutteridge J. (1989) Free radicals in biology and medicine.

2a ed. Clarendon Press Oxford. pp: 188-23.

Health.com

Ibrahim S. F., Osman K., Das S., Othman A. M., Majid N. A., Rahman M.

P. A. A Study of the Antioxidant Effect of Alpha Lipoic Acid on Sperm

Quality. Clinics 63(4) 545-550. 2008.

Mallok, A., Flores Sanchez, R., et al. (2011): Desbalance redox en la

infertilidad masculine. Revista Cubana de Farmacia. 45(2): 283-296.

Martini, H.F. Fundamentals of Anatomy & Physiology, Chapter 28: The

reproductive system. Fourth Edition. New Jersey, United States of

America. Prentice Hall, 1998.

Marx JA, et al. Rosen's Emergency Medicine .7th ed. St. Louis, MO:

Mosby, Inc.; 2009.

Oviedo A. Evaluación del efecto protector del ácido α-lipoíco contra la

exposición crónica a cadmio durante la espermatogénesis en ratón.

Proyecto de Tesis. ENCB. Istituto Politécnico Nacional. 2011.

Parizek J, Zahor Z. (1956) Effects of Cd salts on testicular tissue.

Nature. 177:1036–7.

Roberts R. The Mouse: Its Reproduction and Development. USA. Oxford

University Press. pp 7-23, 282-289. 1990.

Roste S.L., Taubol E., Haugen T.B., Bjornenak T., Saetre.,Gjerstad L.

Alterations in Semen Parameters in Men. European Journal of

Neurology. 10 501- 506.2003.

Sadler T.W. Langman J. Embriología Médica. Quinta Edición. México,

Distrito Federal. Editorial Médica Panamericana. pp 25-27. 1988.

Saldivar O. L., Tovar T. A. y Fortoul V. T.(1997) Cadmio. En:

Introducción a la Toxicología Ambiental. Albert A. L. Centro

Panamericano de Ecología Humana y Salud. México, Estado de México.

pp: 211-226.

Shen H., Ong C. Detection of Oxidative DNA Damage in Human Sperm

and its Association with Sperm Function and Male Infertility. Free

Radicals in Biology and Medicine. 28 (4) 529-536. 2000.

Siam G.M., Aidaros A.M., Roshdy El-Nagar M. Alteration in Semen an

Adult Male Rats. Egyptian Journal, 42(1) 149 – 161. 2005.

Silverthorn, D.U. (2009). Fisiología humana: un enfoque integrado, 4°

edición. Argentina. Editorial Médica Panamericana, pp. 22.

Tappel A., Fraga C., Application of simulation modelings to lipid

peroxidation processes. Free Radical Biology & Medicine 7 361-368.

1989.

Thomas M. J. y Thomas J. A.(2001) Toxic responses of the reproductive

system. En: Casarett and Doull`s toxicology. The basic science of

poisons. Curtis D. K. 6a ed. Mc Graw Hill, United States of America. pp:

673-709.

Vallejo R. M. (2001) Toxicología de matales. En: Toxicología. Córdoba

D. P. 4a ed. El Manual Moderno, México, D.F. pp: 670.

Whittingham D.G. y Wood M. J. (1990) Reproductive physiology. En:

The mouse in biomedical research III. Foster H. L. Academic Press,

México, D.F. pp: 138-142.

Xu G, Jiang X-Z.(1996) Male reproductive toxicity of cadmium. J Chin.

Public Health. 15:17–8.

Yang J., Arnush M., Chen Q., Wu X. , Pang B. y Jiang X.(2003)

Cadmium-induced damage to primary cultures of rat leydig cells.

Reproductive Toxicology, 17: 553-560.

Zoltán G. y Curtis D. K. Mechanisms of toxicity.(2001) En: Casarett and

Doull`s toxicology. The basic science of poisons. Curtis D. K. 6a ed. Mc

Graw Hill, United States of America. pp: 46-47.

XI. ANEXO.

Proteínas Totales. Técnica de Bradford.

Se basa en el acoplamiento de un colorante con la proteína, donde existe una

relación directa entre el desarrollo del color y la concentración de proteínas.

Se utilizo una curva con albumina sérica bovina con concentraciones de o, 10,

20, 40 y 80 µg/mL.

Se empleó el colorante de Bradford para proteínas, 10 µL de muestra y 1 mL

del reactivo.

La absorbancia de las muestras se determinó a una longitud de onda de 595nm

y se interpolaron en la curva para obtener la concentración de proteínas.

QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL...El presente proyecto se desarrolló en el Laboratorio de...

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