FACULTAD DE MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

Docente: Mariella Guerrero Benavides Trabajo Practico No. 3TCNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS SLIDOS, SEMI-SLIDOS Y LQUIDOS - TCNICAS ASPTICASI.- INTRODUCCINCuando se trabaja con cultivos microbianos, la tcnica asptica se utiliza para prevenir la introduccin de organismos adicionales al cultivo.Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfeccin y esterilizacin para limitar o eliminar la presencia de microorganismos. La esterilizacin es un mtodo deeliminacin total de cualquier forma viviente, mientras que la desinfeccin es un procesoque elimina nicamente formas vegetativas de los microorganismos.La esterilizacin con calor seco y hmedo son los procedimientos de mayor utilizacin en microbiologa. El calor seco desnaturaliza las enzimas y destruye a los microorganismos por oxidacin, por ejemplo al ponerlos directamente a la flama de un mechero o en horno a 150-180 C durante 2 horas. Estos mtodos se aplican principalmente en la esterilizacin de asas de inoculacin y todo tipo de material de vidrio y quirrgico.Los procesos con calor hmedo se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones y cultivos bacterianos que se desechan. El ms recomendable es el autoclave en el que se utiliza vapor de agua a presin para alcanzar temperaturas de 121 C. El material se deja a esta temperatura durante 15 minutos para asegurarse de la destruccin de endosporas, que son las estructuras bacterianas ms resistentes al calor.Para el caso de materiales plsticos es recomendable el uso de gases como oxido de etileno o con radiaciones gamma. Las superficies generalmente se desinfectan con radiaciones U.V. o compuestos qumicos en forma lquida como: los fenoles, compuestos cuaternarios de amonio (alquildimetil bencilamonio), formaldehdo, alcoholes, halgenos y detergentes.El tipo de microorganismo que ser utilizado en este laboratorio sern bacterias. Lasbacterias se cultivan sobre materiales conocidos como medios de cultivo. La composicinqumica o nutricional de los medios es extremadamente variada (Prctica Medios deCultivo). Los medios ms comunes son los caldos (medios lquidos), tubos con agarinclinado, tubos con agar y cajas de Petri con agar o placas de agar. El agar es una sustancia derivada de un alga marina que se solidifica como un semislido tipo gelatina. Cuando se aaden nutrientes y otros factores de crecimiento, muchos tipos de bacterias pueden cultivarse en l.A menudo es necesario tomar una muestra de bacterias de un tubo y colocarlas en otro. El proceso requiere cuidado y precisin, y se lleva a cabo siguiendo la tcnica aspticapara evitar que la bacteria en el tubo contamine el rea de trabajo o a la persona que lleva a cabo la transferencia.

I.1.- OBJETIVO: Conocer los principios generales de las tcnicas de esterilizacin y entender la importancia de las condiciones de asepsia para el control de contaminaciones microbianas en el laboratorio.

II. REVISIN BIBLIOGRFICA

III.- MATERIAL Y METODOSIII.1.- MATERIALES:MATERIAL POR CADA GRUPO DE TRABAJO:- 1 caja de agar nutritivo ( preparado por alumno)- Marcador indeleble- 2 tubos con caldo nutritivo estril ( preparado por alumno)- 2 tubos con agar nutritivo inclinado estril ( preparado por alumno)- Gradilla- Asa de siembra- Encendedor- 1 tubo con cultivo en caldo- 1 tubo con cultivo en agar inclinado

III.2 MTODOS:PROCEDIMIENTO:a) Importancia de las condiciones de asepsia.

1. Marcar las cajas de la siguiente manera:Caja 1: Puntas de los dedos.Caja 2: Hablar frente a la placa.Caja 3: Abiertas.Caja 4: Caja control

2. Para la caja 1, toca suavemente la superficie del agar con las puntas de los dedos.Destapa la caja 2 y sostenla a una distancia de 10 a 15 cm de tu boca. Repite tres vecesel trabalenguas de Tres tristes tigres tragaban trigo en un trigal en tres tristes platos. Entres tristes platos, en un trigal, tragaban trigo tres tristes tigres. Tapa de nuevo las cajas.La caja 3 se dejar destapada durante toda la sesin de laboratorio.La caja 4 se conservar sin abrir.

3. Una vez que las placas han sido expuestas, deben colocarse en la incubadora enposicin invertida. La siguiente sesin examina las placas y registra los resultadosen la tabla. Regresa las cajas a la profesora para que se desechen adecuadamente.b) Transferencia tubo a tubo.Cada alumno sembrar 4 tubos practicando los diferentes tipos de transferencia (Fig. 1): Caldo-Caldo Caldo-Agar inclinado Agar inclinado-Caldo Agar inclinado-Agar inclinadoSiempre mantener los tubos con caldo en una gradilla. Nunca acostados en la mesa detrabajo, ni en la bata. Al acabar la prctica, coloca la gradilla con los tubos en la incubadora a 37 C hasta que te lo indique la docente.Rotular el tubo con el nombre de la cepa, la fecha y el nombre del alumno.Sostener los tubos con la mano no dominante. Si los tubos tienen un tapn en rosca, afljalo de manera que solo se necesite levantarlo para quitarlo. Si tiene un tapn de algodn, scalo un poco de manera que no est muy apretado.Flamear el asa en el mechero Bunsen. El asa se sostiene con la mano dominante,como sosteniendo un lpiz o una pluma. Dejar que el alambre del asa de kolle se ponga al rojo vivo. Dejar enfriar el asa unos breves segundos.Si estas compartiendo el mechero con algn compaero, debes tener cuidado de no flamear dos asas al mismo tiempo, ya que existe un alto riesgo de que alguien sufra quemaduras.

Retirar una tapa con el meique y la otra con el dedo anular, mientras sostienes el asa. Nunca poner las tapas sobre la mesa. Flamear la boca de ambos tubos para matar cualquier microorganismo presente en el aire y que pueda contaminar la parte superior del tubo durante las manipulaciones. Insertar el asa dentro del tubo que contiene a la bacteria a ser sembrada.Los tubos abiertos deben mantenerse en posicin inclinada para que el riesgo decontaminacin sea mnimo. Sembrar en el tubo estril un poco de inculo. En el caso de los caldos nicamente inserta el asa en el medio. En el caso del agar inclinado, dibuja con el asa un zig zag en la superficie del agar.

De nuevo flamea las bocas de los tubos y tpalos de nuevo. Asegrate de mezclar muy bien el inculo en los tubos que contienen caldo sembrado. Flamea el asa hasta el rojo vivo antes de que la coloques en la mesa.

Figura 1. Procedimiento de transferencia de inculo de tubo a tubo.

RESULTADOSRealiza la descripcin morfolgica de las colonias (si es que hay) obtenidas en las cajas con los distintos tratamiento en relacin a la caja control.

Registra la morfologa macroscpica del microorganismo sembrado en los tubos con agarinclinado y en los caldos de acuerdo a la gua de observacin.IV.- DISCUSIN________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________En esta seccin se analizarn los resultados obtenidos, tratando de dar respuesta a lassiguiente preguntas (entre otras): Debes tocar las placas de agar con tus manos? Puedes encontrar organismos en el aire? Qu resultados soportan tus conclusiones? Cundo trabajas con cultivos microbianos, puedes hablar? Por qu s o por qu no?

V.-RECOMENDACIONES ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________VI.- CONCLUSIONES________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________VII.- BIBLIOGRAFIA_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

VIII.- ANEXOSGUA DE OBSERVACINTubos con agar inclinado.Observa la figura 2, la cual muestra varias formas de crecimiento que se observan en tubos con agar inclinado y compralas con el tipo de crecimiento que ves en los tubos que sembraste.

CaldosA menos que tengas un cultivo fresco de 24 hrs directo de la incubadora, no vers muchostubos con turbidez. Esto es porque las bacterias tienden a depositarse o a precipitarsecuando se refrigeran por varios das. Despus de que te fijes si se form un anillo o unapelcula en la superficie del tubo (fig. 3), toma los tubos y observa si se presenta elfenmeno de precipitacin. Una vez que se complet este paso, mezcla las bacteriasagitando, dando golpecitos, rodando el tubo en la palma de tu mano. No agites el tubo demanera que la tapa se contamine con el caldo. Una vez mezclado, puedes observar turbidez, floculacin, o una apariencia de hilo dentro del caldo.

CUESTIONARIOContesta las siguientes preguntas relacionadas con la tcnica de transferencia:1. Por qu razn no debes compartir el mechero de Bunsen?

2. Cul es la razn para flamear los tubos antes y despus de cada transferencia?

3. Por qu debes evitar el usar el pulgar para sostener las tapas durante una transferencia?

4. Explica por qu debes evitar que el asa llena de inculo toque la boca del tubo fuente o del tubo a ser inoculado.

5. Cuando tomas un inculo de un tubo con agar inclinado. por qu es necesario tocar una parte estril del agar con el asa antes de tocar el crecimiento bacteriano?

6. Por qu el asa debe ser flameada antes y despus de todos los procedimientos de siembra?

7. Por qu las placas de agar deben mantenerse invertidas durante la incubacin? 8.- Haz un diagrama de flujo del procedimiento de transferencia microbiana de tubo a tubo..